СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ АНТИГИПОКСИЧЕСКОЙ И АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2002 года по МПК A61K38/05 A61P39/06 

Изобретение относится к медицине, а именно к средствам, обладающим антигипоксической и антиоксидантной активностью и являющимся производными L-карнозина.

Известны некоторые производные b-аланил-L-гистидина (L-карнозина). Описан его метиловый метиловый эфир (Pietta P.G., Chersi A., Gazz. Chim. Ital. , v. 98, 12, pp. 1503-1510, Yamashita S., Ishikawa N., Experientia, v. 24, 10, pp. 1079-1080, 1968), получены различные производные L-карнозина и его сложные эфиры и их соли, в том числе метиловый и этиловый эфиры (патент Испании ES 496892, кл. Cl C 07 C 103/52, 1981). Антигипоксическая и антиоксидантная активность метилового и этилового эфиров и их солей не описана.

L-карнозин является природным нейропептидом, который проявляет разнообразную биологическую активность. Показана его высокая эффективность по защите нейронов как в условиях in vitro (индивидуальные реакции повреждения макромолекул, суспензии изолированных нейронов или срезов мозга в условиях свободнорадикальной атаки), так и in vivo - на различных моделях экспериментальной ишемии мозга и сердца, гипобарической гипоксии (Болдырев А.А. Карнозин. Биологическое значение и возможности применения в медицине - М.: Изд-во МГУ, 1998, 320 стр.). Установлено, кроме того, что карнозин является важным природным фактором системы антиоксидантной защиты мозга в условиях окислительного стресса (Болдырев А.А. Карнозин и защита тканей от окислительного стресса - М.: Изд-во "Диалог - МГУ", 1999, 362 стр.).

Однако, одновременно было обнаружено, что L-карнозин, как природное активно метаболизирующее соединение, имеет ограниченное время жизни в организме, подвергаясь расщеплению специфическим ферментом карнозиназой. Через 15 мин после внутрибрюшинного введения крысам его содержание в крови достигает максимума, после чего сразу начинает снижаться, возвращаясь к исходному низкому уровню через 30 мин после введения. Мозг и печень характеризуются схожей кинетикой накопления карнозина, хотя время достижения максимума сдвинуто к 30 мин, а убыли до исходного уровня - к 45-60 мин (Гуляева Н.В., Обидин А. Б., Левшина И.П. и соавт. // Бюл. эксп. биол. мед. 1989. Т. 107. 2.С. 144-147).

При внутрижелудочном введении крысам (однократно в виде водного раствора через зонд в дозе 500 мг/кг веса тела) максимальный уровень карнозина в крови наблюдался через 1 час, к исходу суток препарат в крови не обнаруживался (по данным ВЭЖХ).

В то же время динамика изменения содержания в крови гистидина - одного из продуктов гидролиза карнозина - указывает на то, что в интервале от 30 мин до 3 ч после внутрижелудочного введения карнозина этот дипептид активно гидролизуется карнозиназой (фиг.1).

Задача изобретения - создать эффективное антигипоксическое и антиоксидантное средство с пролонгированным действием, расширить ассортимент таких средств.

Задача изобретения реализуется применением сложных эфиров карнозина или их солей в качестве антигипоксического и антиоксидантного средства.

Изобретение иллюстрируется графическими материалами:
Фиг.1 - фармакокинетика карнозина в крови крыс при однократном внутрижелудочном введении его водного раствора в дозе 500 мг/кг веса (n=5).

Фиг. 2 - зависимость степени ингибирования восстановления НСТ от концентрации исследуемых веществ.

Фиг. 3 - влияние карнозина и его эфиров на интенсивность окислительного гемолиза, индуцированного 0,5 мМ NaOCl.

и следующими примерами:
Пример 1. Ферментативный гидролиз карнозина и его эфиров.

Устойчивость исследуемых соединений к действию карнозиназы сыворотки донорской крови исследовали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Скорость накопления гистидина оценивали в ходе ферментативного гидролиза карнозина и его производных. Сыворотку получали из негемолизированной крови пациентов. Активность карнозиназы измеряли в соответствии с Lenney et al. (Lenney, R.P. George, A.M. Weiss, C.M. Kucera, P.W.H. Chan, G.S. Rinzler. // Clin. Chim. Acta. 1982. V. 123. P. 221-231. Roth M. // Analyt. Chem. 1971. V. 43. Р. 880-882).

ВЭЖХ дипептидов и гистидина проводили на хроматографе "Altex"-334 с колонкой фирмы "Serva", использовали флуоресцентный детектор "Schoeffel GM970" (λ_возб 340 нм, λ_флуор 455 нм).

Полученные результаты представлены в таблице 1. Как показало проведенное сравнение, исследуемые производные карнозина - его синтетические этиловый и метиловый эфиры, в отличие от него самого, практически не подвергаются гидролизу карнозиназой.

Пример 2. Ингибирование хемилюминесценции липопротеинов сыворотки крови человека карнозином и его эстерифицированными производными.

Исследование антиоксидантной активности карнозина и его этилового и метилового эфиров проводили в сопоставлении с аналогичным действием препарата кавинтон, обладающим сосудорасширяющим действием. Для этого измеряли хемилюминесценцию (ХЛ) атерогенных липопротеинов (суммарная фракция липопротеинов низкой и очень низкой плотности) сыворотки крови человека, вызываемую процессом перекисного окисления липидов.

Исследованные соединения (за исключением кавинтона) сами по себе не влияли на спонтанное свечение. В то же время, при индукции ХЛ ионами железа такие параметры окисления липопротеинов, как начальная вспышка (h) и длительность латентного периода до развития основной вспышки ХЛ (τ), претерпевали в присутствии исследуемых соединений изменения, характеризующие их антиоксидантную активность. Результаты эксперимента представлены в таблице 2.

Из таблицы видно, что как карнозин, так и его производные снижали дозозависимым способом величину h, характеризующую уровень предобразованных гидроперекисей. Эффективность их действия была примерно одинаковой. Увеличение карнозином длительности латентного периода ХЛ (τ), характеризующего антиоксидантный статус сыворотки крови, было достоверно значимым и развивалось пропорционально повышению его концентрации - на 15, 90 и 190% при 0,5, 1 и 2,5 мМ соответственно. Метиловый эфир карнозина повышал длительность латентного периода ХЛ более чем вдвое при его концентрации в пробе, равной 2,5 мМ, хотя при концентрации 1 мМ он не оказывал статистически достоверного влияния на этот параметр. Этиловый эфир карнозина увеличивал длительность латентного периода ХЛ более эффективно (на 15, 65 и 194% при используемых концентрациях). В целом, этиловый эфир карнозина с наибольшей эффективностью подавлял индуцированную хемилюминесценцию, что указывает на его высокую антиоксидантную активность.

Кавинтон не проявлял антиоксидантного действия, он вызывал дозозависимое увеличение h и полностью подавлял последующий ХЛ сигнал (H). Эти данные показывают, что карнозин и его эфиры защищают липопротеины крови от окисления, а кавинтон не проявляет этого действия, поскольку повышает величину h.

Поскольку карнозин и его эстерифицированные производные значительно ингибируют развитие начальной вспышки ХЛ (h), можно сделать вывод об их способности нейтрализовать гидроперекиси липидов (Федорова Т.Н., Реброва О.Ю., Ларский Э.Г //Лаб. Дело. 1991. 3. С. 37-39). Удлинение латентного периода ХЛ (τ), присущее карнозину, и в еще большей степени его эфирам, показывает, что эти соединения способны препятствовать индукции перекисного повреждения липопротеинов.

Полученные данные свидетельствуют о том, что изучаемые вещества действуют на кинетические параметры ХЛ как ингибиторы свободнорадикальных реакций, препятствующие разветвлению цепной реакции перекисного окисления при введении инициатора реакции (ионов железа) в модельную систему, и тем самым тормозят окислительное повреждение липидов. Более того, подавление начальной вспышки ХЛ (h) указывает на их способность восстанавливать гидроперекиси, накапливающиеся в ходе окисления. Способность исследуемых веществ снижать уровень предобразованных продуктов окисления может оказаться особенно существенной, поскольку этот эффект может иметь определенное значение для их использования в медицинской практике.

Приведенные результаты в целом указывают на способность карнозина и его эфиров повышать окислительную устойчивость биологических структур, что особенно важно в условиях гипоксии.

Пример 3. Оценка супероксид перехватывающей активности карнозина и его метилового и этилового зфиров в присутствии ионов меди и цинка.

Поскольку Сu, Zn - супероксид-дисмутаза (СОД) имеет в активном центре ионы меди и цинка, связанные координационными связями с остатками гистидина, можно полагать, что карнозин в присутствии этих ионов будет проявлять активность, подобную СОД. Существуют экспериментальные данные, подтверждающие, что комплексы карнозина с ионами меди и цинка могут обладать эффективной супероксид-перехватывающей активностью (СПА), которая играет существенную роль в антиоксидантном действии этого дипептида in vivo (Misra H.P., Fridovich J. // J. Biochem. 1972. V. 247. N 12. Р. 3170-3175. Гуляева Н.В. //Биохимия. 1987. Т. 52. Вып. 7. С. 40-46). Эксперименты проводили по стандартной методике, используя ферментную систему ксантин-ксантиноксидаза в качестве источника свободных радикалов (Misra H.P., Fridovich J. // J. Biochem. 1972. V. 247. N 12. Р. 3170-3175) и нитросиний тетразолий (НСТ) в качестве субстрата окислительно-восстановительной реакции. Исследовали СПА исследуемых соединений в фосфатном буфере (0,15 М, рН 7,8) в конечной концентрации 20, 40, 60 и 150 мкМ. На фиг.2 представлена зависимость СПА от концентрации исследуемых веществ.

Было выяснено, что в концентрации 150 мкМ карнозин и его эстерифицированные производные после преинкубации с эквимолярными концентрациями меди и цинка практически полностью ингибируют восстановление НСТ, что свидетельствует о наличии выраженной СПА у исследуемых соединений. К_0,5 для карнозина составляет 30 мкМ, а для этилового и метилового эфиров - 25 и 60 мкМ соответственно.

Таким образом, эффективность СПА для этих комплексов значительно различается в области концентраций 20-60 мкМ. Высокая СПА отмечена у этилового эфира карнозина и более низкая - у карнозина и его метилового эфира.

Пример 4. Исследование протекторного действия карнозина и его метилового и этилового эфиров на устойчивость эритроцитов к окислительному гемолизу.

Измерение устойчивости эритроцитов к гемолитическому воздействию является информативным методом характеристики эритроцитов и может служить тест-системой для характеристики повреждающего действия, оказываемого на клетки окислителями и свободными радикалами. Мы использовали этот метод для оценки мембранопротекторной активности исследуемых соединений. В работе использовали кровь крыс (самцы 200-250 г), отобранную в день эксперимента из хвостовой вены и стабилизированную 0,38% цитратом натрия. Гемолитическую устойчивость эритроцитов измеряли по величине светопропускания суспензии эритроцитов с помощью фотоэлектроколориметра, гемолиз индуцировали добавлением гипохлорита натрия (конечная концентрация 0,5 мМ), рН суспензии эритроцитов подводили к 8,2 ед. (Reiter, J.M. Guerrero, J.J. Garcia, D. Acuna-Castroviejo // Ann. N. J. Acad. Sci. 1998. V. 854. P.410-424. Гительзон И.И., Терсков И.А. Эритрограммы как метод клинического исследования крови. Изд-во Сибирского отд. АН СССР, 1959).

В присутствии карнозина и его эфиров в конечной концентрации 10 мМ окислительной гемолиз под действием 0,5 мМ гипохлорита натрия полностью подавлялся. Для сравнения эффективности исследуемых соединений как антигемолитиков мы исследовали их протекторное действие в концентрациях 0,15, 0,25 и 1 мМ. Исследуемые соединения растворяли в физиологическом растворе (0,9% раствор NaCl, рН растворов доводили до величины 8,2). В этих условиях гемолиз суспензии протекал медленно и был неполным. Для оценки антиоксидантного действия исследуемых соединений рассчитывали процент клеток, гемолизированных через 6 мин после добавления окислителя. Полученные результаты представлены на фиг.3.

Из фиг.3 видно, что в этих условиях гемолиз суспензии протекал медленно и был неполным. Карнозин и его эфиры даже в концентрациях, в 2-3 раза меньших, чем концентрация гемолитика, оказывали протекторное действие на эритроциты в ходе их окислительного повреждения. В присутствии 0,15 и 0,25 мМ этих соединений полного гемолиза не наблюдалось даже в течение 20 мин. В концентрации 1 мМ эфиры карнозина препятствовали гемолизу более эффективно, чем карнозин. При уменьшении концентрации карнозина и его эфиров до 0,15 мМ их протекторное влияние все еще сохранялось, хотя эфиры были менее эффективны.

Таким образом, полученные в экспериментах in vitro результаты указывают на высокую антиоксидантную активность этилового и метилового эфиров карнозина, превышающую аналогичные эффекты карнозина, при этом эффективность этилового эфира в целом была выше, чем у метилового.

На экспериментальных животных были получены данные, указывающие на способность этилового и метилового эфиров карнозина обеспечивать антиоксидантную защиту организма и в условиях in vivo.

Пример 5. Антигипоксическое действие эфиров карнозина в модели гипобарической гипоксии.

В работе использовали самцов взрослых крыс линии Wistar весом 180-220 г. Моделирование гипобарической гипоксии осуществляли в барокамере. Эксперименты выполняли при разрежении атмосферы, которое вызывает гибель до 100% животных за 30 мин; для крыс этот показатель составляет 175 мм рт.ст.

В первой серии экспериментов животных (n=8 в каждой группе) выдерживали в барокамере до момента остановки дыхания. Для большинства животных гибель носила обратимый характер при условии восстановлении нормального атмосферного давления. За 1 ч до начала "подъема на высоту" вводили исследуемые вещества в дозе 100 мг/кг или соответствующий объем физиологического раствора. Выбор дозы для карнозина и его эфиров был сделан на основе известных данных об эффективности карнозина в различных моделях in vivo (рентгеновское облучение, электроболевой шок, переохлаждение и др.) и данных о его малой токсичности (LD₅₀ для лабораторных животных при внутрибрюшинном и пероральном введении по разным данным превышает 17 г/кг веса тела) (Boldyrev A.A., Formaziuk V.E., Sergienko V.I. // Sov. Sci. Rev. D: Physicochem. Biol. 1994. V. 13. P. 1-60).

Регистрировали время реституции - время от прекращения гипоксии до момента восстановления активной позы (ВР). Полученные данные представлены в таблице 3.

Полученные результаты демонстрируют значительное снижение времени реституции у животных, которым до начала гипоксии были введены исследуемые соединения. Более выраженный эффект наблюдается при введении животным этилового и метилового эфиров карнозина (время реституции составляет 18 и 37% от контрольного соответственно, у карнозина - 56%), при этом минимальным временем реституции характеризовались животные, получавшие перед гипоксическим воздействием этиловый эфир карнозина.

Во 2 серии экспериментов крыс выдерживали при давлении 175 мм рт.ст. в камере 15 мин. Регистрировали количество погибших животных в соответствующих группах, количество животных, демонстрировавших в барокамере судорожную активность, и, используя условную систему баллов (табл. 4), оценивали физиологическое состояние выживших животных.

За 1 ч до начала "подъема на высоту" крысам вводили в 0,9-1,1 мл физиологического раствора (в зависимости от веса животного) исследуемые вещества: карнозин и его этиловый эфир в стабилизированной сульфат-анионами форме - в дозе 100 мг/кг; кавинтон - в дозе 2,5 мг/кг (эффективная доза при экспериментах на животных: см. Кавинтон в эксперименте и клинической практике. Методические рекомендации. Под ред. академика РАМН Е.И. Гусева. Гедеон Рихтер А. О. M., 1998, 56 стр.). Кавинтон использовали в качестве препарата сравнения, учитывая его широкое применение в клинике в качестве противоишемического и антигипоксического средства (там же). Сульфат этилового эфира карнозина использовали в связи с его более высокой устойчивостью при хранении и удобством для препаративного использования, благодаря его низкой гигроскопичности и хорошей сыпучести. (Могут быть использованы и другие соли эфиров). Контрольным крысам вводили соответствующий их весу объем физиологического раствора (из расчета 1 мл/200 г веса тела). Полученные данные представлены в таблице 5.

Применение сульфата этилового эфира карнозина повышало выживаемость животных до 75%, значительно снижало проявление неврологической симптоматики но сравнению с контрольной группой, что выражалось в двукратном (25 и 55%, соответственно) уменьшении судорожной активности и существенном повышении балльной оценки состояния животных, которая била сравнима с кавинтоном или даже превышала ее.

Таким образом, эфиры карнозина и их соли, предлагаемые в качестве антиоксидантного и антигипоксического средства, в отличие от карнозина, практически не подвергаются гидролизу карнозиназой, что пролонгирует их действие, проявляет высокую антиоксидантную и антигипоксическую активность, которая сравнима с активностью кавинтона, но в отличие от него лучше предохраняют животных от проявлений судорожной активности.

Изобретение относится к медицине. Предложено применение метилового и этилового эфиров карнозина или их солей в качестве антиоксидантного и антигипоксического средства. Средство повышает окислительную устойчивость биологических структур. 5 табл., 3 ил.

Применение метилового и этилового эфиров карнозина или их солей в качестве антиоксидантного и антигипоксического средства.