СПОСОБ ОЦЕНКИ НАРУШЕНИЯ ОКСИГЕНАЦИИ ГЕМОГЛОБИНА В ЭРИТРОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ БЕРЕМЕННЫХ НА ТРЕТЬЕМ ТРИМЕСТРЕ ГЕСТАЦИИ ПРИ ОБОСТРЕНИИ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ Российский патент 2014 года по МПК G01N33/53 

Расщепление глюкозы в пентозном цикле, характерном для эритроцитов, начинается с глюкозо-6-фосфата. Путь окисления глюкозо-6-фосфата называется прямым, поскольку не происходит предварительного расщепления на 2 молекулы триозы [1, 6].

Дальнейший путь утилизации глюкозо-6-фосфата протекает в эритроцитах с участием кофактора фермента глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы - НАДФ, при этом НАДФ восстанавливается в НАДФ·Н [7]. В реакциях пентозного цикла происходит образование 2 молекул НАДФ·Н, которые в различных клетках могут участвовать в синтезе жирных кислот, холестерина и т.д.

Однако в эритроцитах важнейшая роль на долю НАДФ·Н выпадает в процессе регуляции оксигенации гемоглобина, поскольку от него зависит восстановительная функция метгемоглобина с помощью фермента метгемоглобин-редуктазы. В этом процессе НАДФ·Н выступает как переносчик электронов [2, 4].

Снижение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы подавляет выработку НАДФ·Н и опосредованный процесс восстановления метгемоглобина, снижая тем самым процесс оксигенации гемоглобина, что создает угрозу развития гемической анемии. В доступной литературе не освещается угнетающее действие цитомегаловирусной инфекции на подавление активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в эритроцитах периферической крови, приводящей к снижению НАДФ·Н, от чего угнетается оксигенация гемоглобина.

Цель, поставленная в данной работе, - показать, что обострение цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре гестации резко снижает содержание в эритроцитах активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, что приводит к повышению уровня метгемоглобина и снижает его оксигенацию, создавая угрозу развития гемической анемии.

Заявленный способ имеет следующие приемы:

1. Обследовано 45 беременных на сроке гестации 20-22 недели в возрасте 18-25 лет с хронической цитомегаловирусной инфекцией (ЦМВИ) в стадии обострения (основная группа) и 15 беременных на тех же сроках гестации без патологии (контрольная группа). У беременных симптоматически ЦМВИ проявлялась в виде острого респираторного заболевания, сопровождающегося ринофарингитом. Клинический диагноз - обострение ЦМВИ - устанавливался при комплексном исследовании периферической крови на наличие IgM или четырехкратного и более нарастания титра антител IgG в парных сыворотках в динамике через 10 дней, индекса авидности - более 65%, а также ДНК ЦМВ. Исследования проводились с учетом требований Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных исследований с учетом человека» с поправками 2000 г. и правилами клинической практики в Российской Федерации, утвержденными приказом Министерства РФ №266 от 19.06.2003 г.

Верификация ЦМВ, определение типоспецифических антител, индекса авидности осуществлялись методами ИФА на спектрофотометре «Stat Fax 2100» (USA) с использованием тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск); выявление ДНК ЦМВ методами ПЦР на аппарате ДТ-96 с использованием наборов НПО «ДНК-технология» (Москва).

2. Содержание метгемоглобина в эритроцитах периферической крови определяли спектрофотометрическим методом по Кушаковскому М.С. [2].

3. Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в эритроцитах периферической крови беременных определялась следующим образом: гепаринизированную кровь, взятую у беременной в третьем триместре на фоне обострения цитомегаловирусной инфекции до титра 1:1600 в количестве 0,5 мл, помещали в 0,5 мл инкубационного раствора (1М глюкозо-6-фосфат - 0,4 мл; НАДФ - 4 мг/2 мл; pH - 7,5) [3]. Смешивали и помещали на 15 минут в термостат при 37°C. Затем каплю взвеси помещали на предметное стекло, слегка покачивая, чтобы она растеклась и слегка подсохла, после чего наносили глицерин-желатину и накрывали покровным стеклом.

4. Полученный препарат изучали с помощью цифрового микроскопа МТ (Япония) и по компьютерной программе «Scion Image» выполняли подсчет интенсивность реакции на глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу приходящуюся на 1 эритроцит (как среднюю на 100 обработанных эритроцитов).

5. Содержание оксигемоглобина определяли по методу Эвелина и Мэллой [5].

На основании полученных данных было установлено, что при обострении цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре беременности в эритроцитах периферической крови резко снижается до 15,0±0,8 усл.ед. активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Фиг.1), контроль - 55,0±0,75 усл.ед. (Фиг.2). Одновременно отмечено нарастание в эритроцитах периферической крови содержания метгемоглобина до 1,7±0,09% (контроль - 0,6±0,03%). На этом фоне отчетливо нарушается процесс оксигенации гемоглобина и составляет 90,0±1,3% (контроль - 96,5±1,5%), что создает угрозу формирования у беременных гипоксии.

На фигуре 1 изображена гистохимическая реакция на активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в эритроцитах периферической крови беременной на третьем триместре гестации при обострении цитомегаловирусной инфекции при титре антител к цитомегаловирусу 1:1600. Интенсивность реакции снижена до 15,0±0,8 усл.ед. Увеличение 10×90.

В эритроците в силу снижения активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы подавляется восстановление НАДФ.

На фигуре 2 изображена гистохимическая реакция в эритроцитах периферической крови беременной на третьем триместре, не болевшей на протяжении всего периода гестации. Интенсивность реакции глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы - 55,0±0,75 усл.ед. Увеличение 10×90.

Литература

1. Воробьев А.И. Руководство по гематологии // М.: Изд. «Ньюдиамед», 2007. - С.1275.

2. Кушаковский М.С. Клинические формы повреждения гемоглобина // Лен. Отделение. - «Медицина». - 1968. - С.324.

3. Лойда З., Госсрау Р., Шиблер Т. Гистохимия ферментов // Лабораторные методы. М.: Изд. «Ньюдиамед», - 2007. - С.259.

4. Новицкий В.В., Сопрыкина Э.В. и др. Механизмы повреждения эритроцитов при токсическом действии метгемоглобинообразователей // Бюллетень Сибирской медицины. - 2006. - №1. - С.32-37.

5. Покровский А.А. Биохимические методы исследования // справочник М.: «Медицина», 1969. - С.337.

6. Федоров Н.А. Нормальное кроветворение и его регуляция // М.: - «Медицина». - 1976. - С.543.

7. Энгельгардт В.А., Саков Н.Е. О механизме пастеровского эффекта // «Биохимия». - 1943. - Т.8. - С.9-12.

Изобретение относится к области медицины, в частности к лабораторной диагностике, и может быть использовано для оценки угрозы формирования гипоксии у беременных с обострением цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре гестации. Сущность способа: определяют титр антител к цитомегаловирусу, оценивают нарушение оксигенации гемоглобина в эритроцитах, гистохимическим методом определяют активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и содержание метгемоглобина в эритроцитах, и при титре антител к цитомегаловирусу 1:1600, снижении активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы до 15,0±0,8 усл.ед. и увеличении содержания метгемоглобина в эритроцитах до 1,7±0,09% и снижении оксигемоглобина в периферической крови до 90,0±1,3% оценивают угрозу формирования гемической гипоксии. 2 ил.

Способ оценки угрозы формирования гипоксии у беременных с обострением цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре гестации, характеризующийся тем, что определяют титр антител к цитомегаловирусу, оценивают нарушение оксигенации гемоглобина в эритроцитах, гистохимическим методом определяют активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и содержание метгемоглобина в эритроцитах, и при титре антител к цитомегаловирусу 1:1600, снижении активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы до 15,0±0,8 усл.ед., увеличении содержания метгемоглобина в эритроцитах до 1,7±0,09% и снижении оксигемоглобина крови до 90,0±1,3% оценивают угрозу формирования гемической гипоксии.