СПОСОБ ОЦЕНКИ ИНДУЦИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ НА ФОРМИРОВАНИЕ ВОССТАНОВЛЕННОГО ГЛУТАТИОНА В ЭРИТРОЦИТАХ БЕРЕМЕННОЙ Российский патент 2015 года по МПК G01N33/49 

Цель работы - показать влияние цитомегаловирусной инфекции (ЦМВИ) на содержание восстановленного глутатиона в эритроцитах периферической крови в силу подавления активности глутатионредуктазы.

Глутатион - активное вещество, принимающее участие во многих окислительно-восстановительных процессах в организме. Он обеспечивает функционирование многих ферментов, содержащих SH группы. Восстановленный глутатион разрушает в эритроцитах H₂O₂ в ходе реакции, катализируемой глутатионпероксидазой GGSH+H₂O₂→GSSG+2H₂O.

Эта реакция подтверждает защитную роль глутатиона в эритроцитах против оксидантов [1, 2, 7, 12].

Больше всего глутатион находят в таких органах как почки, печень, головной мозг, эритроциты периферической крови [3]. Восстановление окисленного глутатиона происходит под влиянием глутатионредуктазы, что отчетливо наблюдается в эритроцитах периферической крови [9, 10]. Установлено, что восстановленный глутатион защищает гемоглобин эритроцитов от различных окислителей, поддерживая тем самым структурную устойчивость их мембран [2, 8]. Этот процесс протекает успешно в связи с включением в эту реакцию глутатионпероксидазы, катализирующей окисление восстановленного глутатиона и разрушая перекись водорода.

Гемолитическая анемия проявляется у новорожденных в связи с недостаточностью глутатионредуктазы, от которой зависит уменьшение содержания в эритроцитах G-SH. Нарушение реакций глутатионовой системы приводит к ряду острых интоксикационных воздействий на клеточные системы организма [4, 5].

Так, перекись водорода и активные радикалы, образующиеся в результате перекисного окисления липидов клеточных мембран, приводят к дестабилизации и делают их проходимыми для многих структур из окружающей среды.

Глутатионредуктаза очень специфична к глутатиону. Причины изменения интенсивности реакции с участием глутатионредуктазы до настоящего времени точно не установлены. Поэтому прототипа, освещающего механизм подавления активности глутатионредуктазы в эритроцитах, не имеется.

Заявленный способ имеет следующие приемы.

1. Исследования проводились на базе акушерского отделения ФГБУ Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания CO РАМН. Обследовано 25 рожениц в возрасте 18-25 лет с хронической цитомегаловирусной инфекцией в стадии обострения (основная группа) и 20 беременных без патологии (контрольная группа). Диагноз обострения хронической цитомегаловирусной инфекции устанавливался при комплексном исследовании периферической крови на наличие IgM или четырехкратного и более нарастания титра антител IgG в парных сыворотках в динамике через 10 дней, индекса авидности (65%), а также наличия ДНК к ЦМВ.

2. Исследования проводились с учетом требований Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных исследований с учетом человека» с поправками 2000 г. и правилами клинической практики в Российской Федерации, утвержденными приказом Министерства РФ №266 от 19.06.2003 г.

3. Верификация ЦМВ, определение типоспецифических антител, индекса авидности осуществлялись методами ИФА на спектрофотометре «Stat Fax 2100» (USA) с использованием тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск), методами ПНР на аппарате ДТ-96 (Россия) с использованием наборов НПО «ДНК-технология» (Москва).

4. Глутатион в эритроцитах периферической крови определяли гистохимическим методом путем помещения их в раствор 10% нитропрусида натрия с добавлением 2% аммиака, после чего изготовлялись мазки, фиксированные 1-2 мин в 96° этаноле. Количественное содержание восстановленного глутатиона в эритроцитах определяли компьютерным цитофотометрическим методом. Глутатионредуктаза определялась спектрофотометрическим методом с использованием набора реагентов «Sentinel Diagnostics» (Италия) на спектрофотометре «Stat-Fax-2100» (USA).

5. Содержание перекисей липидов в мембранах эритроцитов определяли по методу И.Д. Стальной, Т.Г. Гаришвили [11].

6. Статистическая обработка проводилась непарным параметрическим критерием Стьюдента и методом Фишера.

В процессе исследования были получены следующие результаты: при обострении цитомегаловирусной инфекции в периферической крови беременной наблюдалось снижение в эритроцитах периферической крови активности глутатионредуктазы: при титре антител 1:400 - до 7,82±0,18 Ед/гHb; при титре 1:800 - до 6,70±0,20 Ед/гHb, а при титре 1:1600 - до 4,48±0,22 Ед/гHb (контроль - 8,36±0,13 Ед/гHb). По мере снижения активности глутатионредуктазы в эритроцитах снижалось содержание восстановленного глутатиона: при титре антител 1:400 до 35,0±1,3 усл. ед. (фиг.1); при титре антител 1:800 - до 23,0±0,95 усл. ед. (фиг.2), а при титре антител 1:1600 - до 17,6±1,1 усл. ед. (фиг.3); контроль - 56,0±1,5 усл. ед. (фиг.4). Снижение восстановленного глутатиона приводило к нарастанию оксидативных процессов в мембранах эритроцитов до 30,25±1,3 ммоль/л (контроль - 22,5±1,7 мкмоль/л).

ЛИТЕРАТУРА

1. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. 1998. М.: Медицина. 750.

2. Владимиров Ю.А. Активные формы кислорода и азота: значение для диагностики, профилактики и терапии. Биохимия. 2004. 69. 1; 53-66.

3. Воробьев А.И. Руководство по гематологии. 2007. М.: «Ньюдиамед». 1275.

4. Глушков С.И., Куценко С.Л. Новикова Т.И., Аксенов В.В. Состояние системы глутатиона в тканях сердца крыс при острых отравлениях доксорубицином. Вопросы онкологии. 2005. 5 г.. 1; 108-112.

5. Глушков С.И. Нарушения системы глутатиона и их роль в патогенезе острых интоксикаций ксенобиотиками с различными механизмами токсического действия. С.П. 2007. Автореф… дисс. докторской. 35.

6. Зозуля Ю.А., Барабой В.А., Сутковой Д.А. Окислительный стресс. Биохимический и патофизиологический аспекты. 2001. М.: «Наука» / Интерпериодика. 343.

7. Кулинский В.И., Колесниченко Л.С. Биологическая роль глутатиона. Успехи биол. химии. 1990. 110. 1(4); 20-23.

8. Кулинский В.И., Колесниченко Л.С. Обмен глутатиона. Успехи биол. химии. 1990. 31; 157-179.

9. Луценко М.Т., Андриевская И.А. «Способ диагностики дыхательной функции эритроцитов беременных путем определения активности глутатионредуктазы в эритроцитах периферической крови при герпес-вирусной инфекции». Патент №2456613. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений РФ 20.07.2012.

10. Луценко М.Т., Андриевская И.А. «Способ определения изменений активности глутатионпероксидазы в эритроцитах периферической крови беременных при вспышке герпес-вирусной инфекции». Патент №2405149. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений РФ 27.11.2010.

11. Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г. Метод определения малонового альдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты. 1977. М.: «Медицина». 390.

12. Чоккинэ В.К., Граева С.Н., Невоя А.В., Граева О.И., Бешетя С.Т., Георгиу З.Б. Серосодержащие аминокислоты в диагностике, целенаправленном поддержании и формировании здоровья. Buletinul ASM. Stintele vietii. 2011. 3(315); 1-35.

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике, и может быть использовано для установления формирования восстановленного глутатиона в эритроцитах беременной при обострении цитомегаловирусной инфекции. Для этого в периферической крови измеряют титр антител к цитомегаловирусу и содержание глутатионредуктазы в эритроцитах и при титре антител к цитомегаловирусу 1:1600 и снижении активности глутатионредуктазы до 4,48±0,22 Ед/гHb устанавливают подавление формирования восстановленного глутатиона в эритроцитах. Способ позволяет установить нарастание оксидативных процессов в мембранах эритроцитов за счет определения снижения активности глутатионредуктазы в эритроцитах. 4 ил.

Способ установления подавления формирования восстановленного глутатиона в эритроцитах беременной при обострении цитомегаловирусной инфекции, включающий измерение в периферической крови титра антител к цитомегаловирусу и содержание глутатионредуктазы в эритроцитах, и при титре антител к цитомегаловирусу 1:1600 и снижении активности глутатионредуктазы до 4,48±0,22 Ед/гHb устанавливают подавление формирования восстановленного глутатиона в эритроцитах.