СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕНТАХЛОРФЕНОЛА В КРОВИ МЕТОДОМ ГАЗОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО АНАЛИЗА Российский патент 2015 года по МПК G01N33/50 G01N1/28 

Изобретение относится к медицинским токсикологическим исследованиям, в частности к санитарной токсикологии, и может быть использовано для количественного определения пентахлорфенола в крови.

Известен способ определения концентраций хлорфенолов в водных растворах, включающий сорбционное концентрирование и высокоэффективное жидкостно-хроматографическое определение (Патент РФ №2461821), согласно которому производят проточное сорбционное концентрирование на полимерных сорбентах, десорбцию хлорфенолов водой при температурах 150-200°C и высокоэффективное жидкостно-хроматографическое определение хлорфенолов в водном концентрате. За счет десорбции водой при температурах 150-200°C и подачи всего концентрата на хроматографическую колонку полуширины пиков хлорфенолов на хроматограммах снижаются в 2-3 раза (до 6-8 с), а переделы обнаружения снижаются в 5 раз по сравнению с известными аналогами. Техническим результатом известного изобретения является разработка способа определения хлорфенолов в водах, характеризующегося высокой чувствительностью и малой шириной пиков на хроматограмме.

Недостатком указанного известного способа является высокая трудоемкость выделения пентахлорфенола из биосреды, в котором применяли при высокоэффективном жидкостно-хроматографическом определении насос высокого давления, и 10 мл раствора хлорфенолов прокачивали через стальную колонку (внутренний диаметр 3 мм, длина 40 мм), заполненную сверхсшитым полистирол-дивинилбензолом (площадь поверхности 860 м/г, размер частиц 75-125 мкм). Колонку нагревали в термостате до 150-200°C и прокачивали через колонку воду ВЭЖХ насосом высокого давления. На выходе из колонки был установлен капилляр-теплообменник для охлаждения концентрата до комнатной температуры и ограничитель давления для предотвращения закипания воды в колонке. Поток концентрата подавали в ВЭЖХ колонку, заполненную октадецилсиликагелем, при этом происходило сжатие зоны, содержащей хлорфенолы.

Для осуществления этого процесса используется дорогостостоящее оборудование - ВЭЖХ насос высокого давления, капилляр-теплообменник, а также требуются большие затраты времени на исследования ввиду сложности выполнения пробоподготовки.

Также известен способ определения полихлорфенола, в частности 2,4,6-трихлорфенола, в водных средах (Патент РФ №2021593), который заключается в концентрировании анализируемых веществ бутиловым спиртом в количестве 2,6-3,8 мас.% в присутствии 40,0-46,2 мас.% сульфата натрия в водной фазе и последующем потенциометрическом титровании экстракта в среде диметилформамида раствором щелочи в изопропиловом спирте. Однако и этот способ не лишен недостатков. Потенциометрическое титрование основано на определении точки эквивалентности по результатам потенциометрических измерений. При установлении точки эквивалентности возможны ошибки: за счет нечеткого установления конечной точки титрования; за счет невозможности установить точное положение точки эквивалентности из-за несимметричности реакции.

Вблизи точки эквивалентности происходит резкое изменение (скачок) потенциала индикаторного электрода. Это наблюдается, конечно, лишь тогда, когда хотя бы один из участников реакции титрования является участником электродного процесса. Реакции потенциометрического титрования должны протекать строго стехиометрически, иметь высокую скорость и идти до конца.

Потенциометрическое титрование используется в тех случаях, когда надо провести экспресс-анализ вещества, а необходимых реактивов и оборудования нет.

Также известен способ определения пентахлорфенола в пищевых продуктах (Методические указания. МУК 4.1.2479-09; утв. Роспотребнадзором 02.02.2009). Согласно этому способу навеску измельченного и перемешанного в блендере образца пищевого продукта помещают в коническую колбу, добавляют дистиллированную воду, концентрированную серную кислоту и смесь гексан-изопропанол (4:1). Смесь центрифугируют 15 мин при 2000 об/мин и отделяют органический супернатант. Экстракцию повторяют дважды. Гексановые экстракты объединяют. К экстракту добавляют 0,1 М раствор тетрабората натрия (бура), отделяют водную фазу и экстракцию повторяют еще дважды. Гексановый экстракт сушат над безводным сульфатом натрия и упаривают досуха в токе азота. К полученному сухому остатку добавляют насыщенный раствор диазометана в эфире.

Реакционную смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 15-20 мин, после обесцвечивания раствор досуха упаривают в токе азота. К сухому остатку добавляют стандартный раствор альдрина концентрацией, растворитель вновь упаривают досуха в токе азота и остаток растворяют в 0,2 куб. см гексана. И далее методом газожидкостной хроматографии определяют концентрацию пентахлорфенола в диапазоне 0,005-1,0 мг/кг. Недостатком указанного способа является низкая чувствительность.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ определения полихлорфенолов, в частности пентахлорфенола, в крови («Методические указания по идентификации гамма-ГХЦГ, его изомеров (альфа, бета и дельта-ГХЦГ) и метаболитов (полихлорированных фенолов) в биологических жидкостях (кровь), органах, тканях и субклеточных фракциях печени теплокровных животных методом тонкослойной хроматографии», утверждены Минздравом СССР 3 января 1985 г. N3194-85). Известный способ основан на тонкослойном хроматографическом определении гамма-гексахлорциклогексана, его альфа-, бета- и дельта-изомеров и метаболитов при совместном присутствии в биологическом материале теплокровных с пределом обнаружения 0,01 мг/л.

При реализации этого известного метода цельную кровь (1-5 мл) помещают в мерную пробирку на шлифе, приливают 3-5 мл органического экстрагента - н-гексана, перемешивают и далее экстрагируют на аппарате для встряхивания со средней интенсивностью в течение 5-7 мин. После разделения слоев гексановый экстракт отделяют с помощью пипетки и фильтруют через слой безводного сульфата натрия. Экстракцию повторяют, экстракты объединяют. Затем проводят хроматографирование в тонком слое сорбента. Аликвотную часть (0,1 мл) экстракта с помощью микропипетки (микрошприца) наносят на хроматографическую пластинку "Силуфол" или "Кизельгель 60" F. Рядом с пробой наносят различные количества стандартных растворов изомеров гексахлорциклогексан (ГХЦГ), хлорированных фенолов (по 0,2; 1; 2; 5 мкг каждого компонента). Пластинку помещают в камеру для хроматографирования, содержащую смесь н-гексана с ацетоном в соотношении 4:1 ("Силуфол") или 6:1 ("Кизельгель 60" F). Время насыщения камеры 30 мин. После хроматографирования (длина пробега растворителя 15-17 см) пластинку проветривают в горизонтальном положении, а затем обрабатывают одним из проявляющих реагентов с помощью пульверизатора, подключенного к воздушному компрессору. Зоны локализации гамма-, альфа-, бета- и дельта-ГХЦГ, пентахлорфенола и других полихлорфенолов обнаруживаются на хроматограммах после облучения УФ-светом в виде бурых пятен. Количественную оценку содержания изомеров ГХЦГ и полихлорированных фенолов в пробе проводят визуально или денситометрически на приборе типа "Оптон".

Недостатками указанного известного метода являются:

- сложность подготовки образцов крови к количественному определению, которую осуществляют путем длительной экстракции и перемешивания;

- недостаточная чувствительность, т.к. количественный анализ в тонкослойной хроматографии характеризуется только как полуколичественный.

Технический результат, достигаемый предлагаемым способом, заключается в упрощении стадии пробоподготовки, при одновременном повышении чувствительности.

Указанный технический результат достигается предлагаемым способом количественного определения пентахлорфенола в крови методом газохроматографического анализа, включающим отбор пробы крови, экстракцию органическим растворителем из указанной пробы пентахлорфенола и определение его количества методом газохроматографического анализа с использованием градуировочного графика, при этом новым является то, что после отбора пробы крови ее подкисляют до pH 2-3 водным раствором щавелевой кислоты, в качестве экстрагента используют толуол и экстракцию ведут в течение 5 мин, затем полученный экстракт центрифугируют в течение 60 мин. при 7000 об/мин, далее к полученному экстракту добавляют сульфат натрия для удаления воды, и затем - трифторуксусный ангидрид и ацетилируют в течение 3 часов при непрерывном перемешивании в среде пиридина, при этом пробу крови, толуол, трифторуксусный ангидрид и пиридин берут в следующем объемном соотношении 5:2,5:0,2:0,1 соответственно.

В качестве раствора щавелевой кислоты используют 3%-ный водный раствор.

Газохроматографическое определение пентахлорфенола в пробе крови осуществляют с использованием газового хроматографа с детектором электронного захвата на капиллярной колонке DB-XLB-30 м*0,32 мм*0,5 мкм при температурном режиме: капиллярная колонка -150°C-250°C; испаритель - 260°C; детектор - 280°C; расход газа-носителя - азота - 20 см³/мин, скорость газа - 30,0 см/с, время удерживания три-фторацетата пентахлорфенола - 6,77±0,04 мин, пентахлорфенола - 9,6±0,03 мин.

Поставленный технический результат достигается за счет следующего.

Экспериментальным путем обнаружено, что указанный технический результат обеспечивается именно совокупностью предложенных признаков, при реализации которых и достигается высокая чувствительность определения пентахлорфенола в пробе крови, а также упрощается способ.

При реализации предлагаемого способа подготовку пробы крови к газохроматографическому анализу проводят путем химической модификации пентахлорфенола, которая включает два этапа.

На первом этапе проводят экстракционное концентрирование пентахлорфенола из пробы крови методом жидкостной экстракции органическим экстрагентом в кислой среде. Эта стадия предназначена для перевода пентахлорфенола в более удобную для последующего газохроматографического анализа органическую фазу, для повышения его концентрации в экстракте и для отделения мешающих компонентов из биологической матрицы.

На втором этапе проводят химическую модификацию путем ацетилирования трифторуксусным ангидридом в среде органического растворителя - толуола в присутствии пиридина. Ацетилирование в среде органического растворителя устраняет гидролиз эфиров и улучшает газохроматографические характеристики образующегося трифторацетата пентахлорфенола.

Таким образом, пробоподготовка в предлагаемом способе является значительно более простой, чем в прототипе, как по времени, так и по трудоемкости.

Благодаря тому, что образующийся трифторацетат пентахлорфенола анализируют методом капиллярной газовой хроматографии с детектором электронного захвата, обеспечивается максимально возможное по чувствительности газохроматографическое определение. Получение трифторацетата пентахлорфенола улучшает его хроматографические характеристики (снижает температуру кипения, улучшается форма пика), увеличивает чувствительность (введение 3 атомов фтора) при определении галогенселективным детектором электронного захвата и позволяет снизить предел обнаружения в 100 раз.

В лабораторных условиях был проведен ряд опытов для установления существенности признаков, положенных в основу предлагаемого способа.

Пример. Согласно заявляемому способу берут анализируемую пробу крови объемом 5 см, помещают ее в пробирку вместимостью 13,0 см³, приливают 2,5 см³ бидистиллированной воды, 1 см³ 3%-ного водного раствора щавелевой кислоты до pH 2-3 и 2,5 см органического экстрагента - толуола и проводят экстракционное концентрирование в течение 5 мин.

Для отделения органического экстрагента - толуола, экстракт центрифугируют в течение 60 мин при 7000 об/мин и затем сушат сульфатом натрия массой 0,2-0,3 г.

Затем проводят дериватизацию вышеуказанного экстракта в эфиры путем ацетилирования с помощью трифторуксусного ангидрида (объем 0,2 см³) в среде пиридина (объем ОД см) в течение 3 часов. Полученный эфир (трифторацетата пентахлорфенол) в объеме 1 мм³ анализируют газохроматографическим методом с использованием детектора электронного захвата. Все исследования выполнялись на газовом хроматографе "Кристалл 5000" с применением капиллярной колонки серии DB-XLB- 30 м*0,32 мм*0,5 мкм при температурном режиме: колонка -150°C-250°C; испаритель - 260°C; детектор - 280°C; расход газа-носителя - азота - 20 см³/мин, скорость газа 3-30,0 см/с, времена удерживания: трифторацетата пентахлорфенола 6,77±0,04 мин, пентахлорфенола 9,6±0,03 мин (высокая эффективность метода определения пентахлорфенола в крови достигнута путем подбора оптимальных условий газохроматографического анализа) и проводят количественное определение анализируемого соединения в подготовленной пробе по градуировочному графику, который строится посредством использования стандартных растворов пентахлорфенола.

Для построения калибровочного графика использовали следующую методику. Градуировочные характеристики устанавливали на градуировочных растворах пентахлорфенола методом абсолютной градуировки. Приготовленные растворы хроматографировали на капиллярной колонке не менее 5 раз. На полученной хроматограмме определяли площади пиков определяемых компонентов и по средним результатам измерений по 5 концентрациям для градуировки строили градуировочную характеристику. Она выражает зависимость площади пика исследуемых веществ на хроматограмме (мВ - при автоматическом обсчете с использованием программно-аппаратного комплекса) от содержания (мкг/см³).

В пробирки, куда предварительно было введено 5,0 см³ бидистиллированной воды, вводят микрошприцем различные объемы рабочих растворов пентахлорфенола для градуировки согласно таблице 1. Каждая серия состоит из 5 растворов для градуировки.

Затем каждый раствор обрабатывают согласно предлагаемому способу и полученный эфир (трифторацетата пентахлорфенол) анализируют газохроматографическим методом. Процедуру повторяют аналогично для каждого градуировочного раствора. На полученной хроматограмме определяют площади пиков определяемых компонентов и по средним результатам из 5 серий строят градуировочный график. Для получения достоверных результатов анализ каждой градуировочной смеси проводят не менее 2-х раз. Процедуру повторяют аналогично для каждого градуировочного раствора.

При проведении исследований была изучена эффективность извлечения пентахлорфенола из крови путем применения органических экстрагентов гексана и толуола. Средние значения полноты экстракции пентахлорфенола из крови представлены в таблице 2.

n - число серии опытов; p - вероятность

Установлено, что наибольшее извлечение пентахлорфенола из крови достигается экстракцией его толуолом - 84,9%. Время экстракции составляет 5 мин. Для достижения области максимума экстракции пентахлорфенола из крови достаточно 5 минут. При этом pH среды находится в интервале 2-3 и используемый для экстракции органический растворитель толуол обеспечивает при этих условиях максимальную полноту извлечения пентахлорфенола из биосреды. При длительности экстракции более или менее 5 минут область максимума экстракции пентахлорфенола сдвигается в сторону снижения количественного извлечения пентахлорфенола из крови.

Определение пентахлорфенола в крови включает экстракционное концентрирование его из проб крови толуолом при pH=2-3 и последующем определении на газовом хроматографе с детектором электронного захвата. Наибольшая степень экстракции при подобранных оптимальных условиях газохроматографического анализа и органического растворителя была достигнута при использовании толуола и 3%-ного раствора щавелевой кислоты при pH=2-3.

В процессе исследований были отработаны условия ацетилирования при различных объемах трифторуксусного ангидирида (V=0,1 и 0,2 см³) и времени дериватизации, которые обеспечивают количественный выход деривата (трифторацетата пентахлорфенол - дериват пентахлорфенола, который определяем в крови) (таблица 3 и таблица 4).

Было установлено, что при использовании ацетилирующего реагента трифторуксусного ангидрида в объеме 0,1 см³ замедляется процесс дериватизации и максимальный количественный выход эфирного производного пентахлорфенола 97,8% наблюдается только через 24 часа, после чего происходит снижение его концентрации (таблица 3).

Результаты выполненных исследований (табл.3 и табл.4) позволяют рекомендовать при выполнении ацетилирования использовать 0,2 см³ трифторуксусного ангидрида в среде пиридина в течение 3 часов, т.к. при таком режиме полнота экстракции составляет 98,6%.

Наибольшее влияние на выход эфирного производного пентахлорфенола оказывает ацетилирование в органическом растворителе (толуол), при объеме трифторуксусного ангидрида 0,2 см³ в среде пиридина в течение 3 часов с количественным выходом 98,6%, (таблица 4).

Получение трифторацетата пентахлорфенола оптимизирует его хроматографические характеристики (улучшает форму пика), снижает температуру кипения, увеличивает чувствительность (введение 3 атомов фтора) при определении галогенселективным детектором электронного захвата и позволяет снизить предел обнаружения в 100 раз.

Таким образом, на основании результатов проведенных исследований установлено, что в качестве экстрагента при экстракции трифторацетата пентахлорфенола из крови может быть использован толуол, в качестве ацетилирующего реагента - трифторуксусный ангидрид, катализатора - пиридина, при объемных соотношениях проба крови:экстрагент:ацилирующий реагент:пиридин как 5:2,5:0,2:0,1 и центрифугировании биопробы при 7000 об/мин в течение 60 мин. Оптимальное время экстракции и дериватизации при определении пентахлорфенола в крови составляет 3 часа. При изменении этого соотношения в большую или меньшую стороны полнота экстракции снижалась.

Отделение толуола от экстракта производится центрифугированием при 7000 об/мин в течение 60 мин. Центрифугирование в течение меньшего диапазона времени недостаточно для устранения матричного эффекта и оптимизации количественного определения пентахлорфенолов в биопробе.

Нижний предел определения пентахлорфенола в анализируемом объеме образца крови составляет 0,0021 нг. Предлагаемый способ позволяет увеличить чувствительность определения пентахлорфенола в крови по сравнению с прототипом (0,005-1,0 мг/кг) в 2,5 раза.

Изобретение относится к медицинским токсикологическим исследованиям, в частности к санитарной токсикологии, и может быть использовано для количественного определения пентахлорфенола в крови. Для осуществления предлагаемого способа количественного определения пентахлорфенола в крови методом газохроматографического анализа производят отбор пробы крови, подкисляют ее до pH 2-3 водным раствором щавелевой кислоты, проводят экстракцию толуолом в течение 5 мин, полученный экстракт центрифугируют в течение 60 мин при 7000 об/мин, далее к полученному экстракту добавляют сульфат натрия для удаления воды и проводят ацетилирование в течение 3 часов введением трифторуксусного ангидрида при непрерывном перемешивании в среде пиридина. Пробу крови, толуол, трифторуксусный ангидрид и пиридин берут в объемном соотношении 5:2,5:0,2:0,1 соответственно. Способ обеспечивает упрощение стадии пробоподготовки при одновременном повышении чувствительности определения пентахлорфенола. 2 з.п. ф-лы, 4 табл., 1 пр.

1. Способ количественного определения пентахлорфенола в крови методом газохроматографического анализа, включающий отбор пробы крови, экстракцию органическим растворителем из указанной пробы пентахлорфенола и определение его количества методом газохроматографического анализа с использованием градуировочного графика, отличающийся тем, что после отбора пробы крови ее подкисляют до pH 2-3 водным раствором щавелевой кислоты, в качестве экстрагента используют толуол и экстракцию ведут в течение 5 мин, затем полученный экстракт центрифугируют в течение 60 мин при 7000 об/мин, далее к полученному экстракту добавляют сульфат натрия для удаления воды, и затем - трифторуксусный ангидрид и ацетилируют в течение 3 часов при непрерывном перемешивании в среде пиридина, при этом пробу крови, толуол, трифторуксусный ангидрид и пиридин берут в следующем объемном соотношении 5:2,5:0,2:0,1 соответственно.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве раствора щавелевой кислоты используют 3%-ный водный раствор.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что газохроматографическое определение пентахлорфенола в пробе крови осуществляют с использованием газового хроматографа с детектором электронного захвата на капиллярной колонке DB-XLB-30м*0,32мм*0,5мкм при температурном режиме: капиллярная колонка - 150°C-250°С; испаритель - 260°С; детектор - 280°С; расход газа-носителя - азота - 20 см³/мин, скорость газа - 30,0 см/с, время удерживания трифторацетата пентахлорфенола - 6,77±0,04 мин, пентахлорфенола - 9,6±0,03 мин.