Изобретение относится к биотехнологии и касается штаммов Corynebacterium glutamicum или Brevibacterium flavum, продуцирующих L-лизин, а также способа получения L-лизина с помощью ферментационного процесса с использованием бактерий-продуцентов L-лизина, устойчивых к фузидиновой кислоте.
L-лизин относится к группе незаменимых аминокислот и является наиболее востребованной кормовой добавкой для животноводства и птицеводства.
Основным способом получения L-лизина является ферментация сахаров с помощью бактерий, таких как Corynebacterium glutamicum (US 3687810, US 3929571), Brevibacterium sp. (US 3687810, US 3929571) и Escherichia coli (RU 2347807). В известных способах получения L-лизина используют, главным образом, различные генетически измененные штаммы бактерий с повышенной продуктивностью по L-лизину, полученные либо с помощью генетической инженерии, либо с помощью традиционных селекционных методов. Одним из подходов к повышению продуктивности штаммов является получение мутантных штаммов, устойчивых к клеточным метаболитам (антибиотикам).
Известны способы получения L-лизина, в которых используются бактерии, устойчивые к антибиотикам рифампицину (US 4623623), стрептомицину (US 3929571, US 4623623), канамицину (US 7736880, US 8361758) или одновременно к нескольким антибиотикам (US 3687810, US 4623623). Эти антибиотики относятся к группам ансамицинов и аминогликозидных антибиотиков, соответственно. О влиянии антибиотиков из других групп на продукцию L-лизина не сообщалось.
Задачей заявляемого изобретения является расширение арсенала бактерий, обладающих способностью повышать уровень синтеза L-лизина в результате приобретения устойчивости к антибиотику, и разработка способа микробиологического синтеза L-лизина с использованием этих бактерий.
Задача решена путем:
- получения L-лизин-продуцирующего штамма Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-11609, устойчивого к фузидиновой кислоте;
- получения L-лизин-продуцирующего штамма Brevibacterium flavum ВКПМ B-11635, устойчивого к фузидиновой кислоте;
- получения L-лизин-продуцирующего штамма Brevibacterium flavum ВКПМ В-11404, устойчивого к фузидиновой кислоте;
- разработки способа микробиологического синтеза L-лизина путем культивирования в подходящих условиях L-лизин-продуцирующих бактерий Corynebacterium glutamicum или Brevibacterium flavum, устойчивых к фузидиновой кислоте.
Характеристика заявляемых штаммов:
Штамм Brevibacterium flavum ВКПМ В-11635
Мутант штамма Brevibacterium flavum 90 ВКПМ В-5593, устойчивый к фузидиновой кислоте и обладающий повышенной продуктивностью по L-лизину, депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) как Brevibacterium flavum ВКПМ В-11635.
Культурально-морфологические признаки:
- клетки овальные, размером 1,0-1,5×0,6-0,6-0,8 мкм, неподвижные, грамположительные, спор не образуют;
- через 2-4 суток роста при 30°C на МПА (ГОСТ 29112-91) образует колонии диаметром 2-4 мм, желтовато-кремовые, поверхность гладкая, форма выпуклая, край ровный, структура однородная тестообразная;
- при посеве штрихом через 2-4 суток рост умеренный, край гладкий, поверхность матовая.
Физиолого-биохимические признаки:
- аэроб;
- хорошо растет на глюкозе, сахарозе, мальтозе, фруктозе, маннозе, этаноле, уксусной кислоте, не растет на ксилозе, арабинозе, лактозе, раффинозе;
- усваивает азот в форме солей аммония и мочевины;
- растет при температуре 24-37°C, оптимальная температура 30-32°C;
- растет на средах с pH от 6 до 8,5, оптимальное значение pH 6,8-7,2;
- при росте в минимальной среде нуждается в биотине, тиамине и L-лейцине;
- устойчив к аналогу лизина S-(2-аминоэтил)-L-цистеину (АЭЦ);
- устойчив к фузидиновой кислоте.
Штамм Brevibacterium flavum ВКПМ В-11404
Мутант штамма Brevibacterium flavum НФ410, устойчивый к фузидиновой кислоте и обладающий повышенной продуктивностью по L-лизину, депонирован в ВКПМ как Brevibacterium flavum ВКПМ В-11404.
Штамм НФ410 в свою очередь получен с помощью генетических методов из штамма Brevibacterium flavum 90 (ВКПМ В-5593). Штамм НФ410, в отличие от штамма ВКПМ В-5593, не способен использовать ацетат в качестве единственного источника углерода и обладает повышенной активностью аспартаткиназы и диаминопимелатдегидрогеназы.
Культурально-морфологические признаки:
- клетки овальные, размером 1,0-1,5×0,6-0,6-0,8 мкм, неподвижные, грамположительные, спор не образуют;
- через 2-4 суток роста при 30°C на среде МПА образует колонии диаметром 2-4 мм, желтовато-кремовые, поверхность гладкая, форма выпуклая, край ровный, структура однородная тестообразная;
- при посеве штрихом через 2-4 суток рост умеренный, край гладкий, поверхность матовая.
Физиолого-биохимические признаки:
- аэроб;
- хорошо растет на глюкозе, сахарозе, мальтозе, фруктозе, маннозе, не растет на ксилозе, арабинозе, лактозе, раффинозе и ацетате;
- усваивает азот в форме солей аммония и мочевины;
- растет при температуре 24-37°C, оптимальная температура 30-32°C;
- растет на средах с pH от 6 до 8,5, оптимальное значение pH 6,8-7,2;
- при росте в минимальной среде нуждается в биотине, тиамине и L-лейцине;
- устойчив к аналогу лизина S-(2-аминоэтил)-L-цистеину (АЭЦ);
- устойчив к фузидиновой кислоте;
- обладает повышенной, по сравнению со штаммом Brevibacterium flavum ВКПМ В-5593, активностью аспартаткиназы и диаминопимелатдегидрогеназы.
Штамм Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-11609
Мутант штамма Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-11608, устойчивый к фузидиновой кислоте и обладающий повышенной продуктивностью по L-лизину, депонирован в ВКПМ под номером ВКПМ В-11609.
Штамм Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-11608 в свою очередь получен из штамма Corynebacterium glutamicum АТСС 13032 как устойчивый к S-(2-аминоэтил)-цистеину.
Культурально-морфологические признаки:
- клетки овальные, размером 1,0-1,5×0,6-0,6-0,8 мкм, неподвижные, грамположительные, спор не образуют;
- через 1-3 суток роста при 30°C на МПА образует колонии диаметром 2-4 мм, кремовые, поверхность гладкая, форма выпуклая, край ровный, структура однородная тестообразная;
- при посеве штрихом через 1-2 суток рост умеренный, край гладкий, поверхность матовая.
Физиолого-биохимические признаки:
- аэроб;
- хорошо растет на глюкозе, сахарозе, мальтозе, фруктозе, маннозе и ацетате, не растет на ксилозе, арабинозе, лактозе, раффинозе;
- усваивает азот в форме солей аммония и мочевины;
- растет при температуре 24-40°C, оптимальная температура 32-34°C;
- растет на средах с pH от 6 до 8,5, оптимальное значение pH 6,8-7,2;
- при росте в минимальной среде нуждается в биотине и тиамине;
- устойчив к аналогу лизина S-(2-аминоэтил)-L-цистеину (АЭЦ);
- устойчив к фузидиновой кислоте.
Штаммы, устойчивые к фузидиновой кислоте, получают путем высева на агаризованную питательную среду, содержащую фузидиновую кислоту, интактных L-лизин-продуцирующих клеток Corynebacterium glutamicum или Brevibacterium flavum, либо L-лизин-продуцирующих клеток Corynebacterium glutamicum или Brevibacterium flavum, предварительно обработанных любым известным мутагеном (в частности, нитрозогуанидином), с последующим инкубированием при 30°C в течение 72 ч. Среди мутантов, устойчивых к фузидиновой кислоте, штаммы с повышенной продуктивностью по L-лизину составляют не менее 20%.
Способ в общем виде
Способ микробиологического синтеза L-лизина осуществляют путем культивирования L-лизин-продуцирующего штамма бактерий Corynebacterium glutamicum или Brevibacterium flavum, устойчивого к фузидиновой кислоте. В качестве питательной среды для культивирования используют минеральную среду, включающую фосфаты натрия или калия, соли магния, а при необходимости соли марганца и железа, и содержащую в качестве источника углерода любые сахара, например глюкозу, глюкозные сиропы или сахарозу, в качестве источника азота - аммонийные соли или мочевину, а также необходимые для роста аминокислоты и витамины. В качестве компонентов, ускоряющих рост бактерий, дополнительно добавляют кукурузный экстракт, гидролизаты глютена или сои. Культивирование бактерий проводят при 24-42°C, преимущественно при 30-32°C, и pH среды в интервале 6,0-8,5, преимущественно в интервале 6,8-7,2.
Культивирование бактерий осуществляют в пробирках, колбах или специальных реакторах при аэробных условиях.
Заявляемый способ микробиологического синтеза позволяет выделять синтезированный L-лизин из культуральной жидкости одним из известных способом, включая добавление к культуральной жидкости серной или соляной кислоты, использование ионообменной хроматографии, кристаллизации и т.д.
Пример 1. Получение L-лизин-продуцирующего штамма Brevibacterium flavum ВКПМ В-11635, устойчивого к фузидиновой кислоте
Отбор устойчивых к фузидиновой кислоте мутантов L-лизин-продуцирующего штамма бактерий Brevibacterium flavum ВКПМ В-5593 осуществляют путем высева культуры на агаризованную среду LB следующего состава (мас.%): триптон - 1,0, дрожжевой экстракт - 0,5, хлорид натрия - 0,5, вода - остальное, с добавлением биотина до 0,00001%, глюкозы до 0,5% и фузидиновой кислоты до 0,0005%. Культуры штамма Brevibacterium flavum ВКПМ В-5593 предварительно выращивают на качалке (250 об/мин) при 30°C в течение 24 ч в жидкой среде LB с добавлением биотина до 0,00001% и глюкозы до 0,5%.
Через 3-5 суток инкубирования чашек при 30°C на поверхности агаризованной среды вырастают колонии клонов, устойчивых к фузидиновой кислоте. Уровень биосинтеза L-лизина у отобранных клонов тестируют в чашечном тесте (модифицированный ауксанографический метод) (Методы общей бактериологии в 3-х томах, 1984), который основан на способности штаммов, продуцирующих L-лизин, обеспечивать на агаризованной минимальной среде рост ауксотрофных по L-лизину штаммов, например штамма E. coli ВКПМ В-558. С этой целью биомассу штамма ВКПМ В-558, выращенную предварительно при 37°C на среде LB при перемешивании (240 об/мин) в течение 18 ч, отделяют центрифугированием, дважды промывают 0,9% раствором NaCl, суспендируют в 0,9% растворе NaCl и затем 0,1 мл полученной клеточной суспензии высевают на чашку с минимальной средой следующего состава (мас.%): фосфат калия однозамещенный - 0,1, фосфат калия двузамещенный - 0,6, сульфат магния семиводный - 0,05, хлорид аммония - 0,5, глюкоза - 2,0, биотин - 0,00001, тиамин - 0,00002, L-лейцин - 0,025, агар - 1,5, вода - остальное, pH 7,2-7,4. На эту же чашку зубочисткой переносят клетки мутантных клонов Brevibacterium flavum ВКПМ В5593, выросших на среде, содержащей фузидиновую кислоту (около 25 шт. на чашку). В качестве контроля на чашку зубочисткой переносят клеточный материал исходного штамма Brevibacterium flavum ВКПМ В-5593. Чашки инкубируют при 30°C в течение 2 дней.
В результате теста отобран устойчивый к фузидиновой кислоте (5 мкг/мл) мутант штамма Brevibacterium flavum ВКПМ В-5593, вокруг колоний которого в чашечном тесте наблюдали максимальную зону роста штамма E. coli ВКПМ В-558. Полученный мутант депонирован в ВКПМ как Brevibacterium flavum ВКПМ В-11635.
Пример 2. Получение L-лизин-продуцирующего штамма Brevibacterium flavum ВКПМ В-11404, устойчивого к фузидиновой кислоте
Получение мутантов осуществляют как описано в примере 1, но с использованием в качестве исходного штамма Brevibacterium flavum НФ410.
Один из мутантов штамма Brevibacterium flavum НФ410, устойчивый к фузидиновой кислоте (5 мкг/мл) и формирующий максимальную зону роста штамма E. coli ВКПМ В-558 при совместном культивировании на минимальной среде в чашечном тесте, депонирован в ВКПМ как штамм Brevibacterium flavum ВКПМ В-11404.
Пример 3. Получение L-лизин-продуцирующего штамма Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-11609, устойчивого к фузидиновой кислоте
Получение мутанта осуществляют как описано в примере 1, но с использованием в качестве исходного штамма Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-11608, который в свою очередь получен из штамма C. glutamicum АТСС13032 как устойчивый к аналогу лизина S-(2-аминоэтил)-цистеину.
Один из мутантов штамма Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-11608, устойчивый к фузидиновой кислоте (5 мкг/мл) и формирующий максимальную зону роста штамма Е. coli ВКПМ В-558 при совместном культивировании на минимальной среде в чашечном тесте, депонирован в ВКПМ как штамм Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-11609.
Пример 4. Оценка уровня синтеза L-лизина полученными штаммами
Оценку проводят в пробирочных тестах. Для этого 0,3 мл культуры одного из заявляемых штаммов, предварительно выращенной в течение 22 ч с перемешиванием (240 об/мин) при 30°C, вносят в пробирки с 3 мл среды следующего состава (мас.%): глюкоза - 10,0 хлорид аммония - 2,5, фосфат калия однозамещенный - 0,1, сульфат магния семиводный - 0,1, мел - 2,5, биотин - 0,00001, тиамин - 0,00002, с добавлением кислотного гидролизата пшеничного глютена* 50,0 мл/л, вода - остальное. *Гидролизат пшеничного глютена получают путем гидролиза пшеничного глютена серной кислотой согласно известным способам гидролиза различного сырья с целью получения источника ростовых факторов при микробиологическом производстве аминокислот (Биотехнология и биоинженерия, Рига, 1978). Перед внесением в среду гидролизат нейтрализуют концентрированным аммиаком. Пробирки с культурами инкубируют в течение 24 или 48 ч с перемешиванием (250 об/мин) при 30°C и затем в культуральной жидкости определяют уровень накопления L-лизина методом тонкослойной хроматографии. Результаты представлены в таблице.
ВКПМВ-5593 (родительский штамм)
Из результатов, представленных в таблице, следует, что устойчивые к фузидиновой кислоте мутанты L-лизин-продуцирующих штаммов Brevibacterium flavum и Corynebacterium glutamicum обладают повышенным уровнем синтеза L-лизина по сравнению с родительскими штаммами не менее чем на 9%.
Пример 5. Синтез L-лизина путем культивирования штамма Brevibacterium flavum ВКПМ В-11635 в ферментере
Синтез L-лизина осуществляют путем культивирования штамма Brevibacterium flavum ВКПМ В-11635 в ферментере объемом 3 л. Для этого в ферментер, содержащий 0,600 л ферментационной среды, вносят 0,450 л 70% стерильного раствора глюкозы и 0,15 л культуры, предварительно выращенной при 31°C в течение 16 ч. Состав ферментационной среды (мас.%): фосфат калия однозамещенный - 0,90, сульфат магния семиводного - 0,32, сульфат аммония - 5,5, биотин - 0,000045, тиамин - 0,000045, сульфат железа семиводный - 0,0045, сульфат марганца пятиводный - 0,0045, пеногаситель пропинол Б-400 - 0,10, с добавлением кислотного гидролизата пшеничного глютена - 167 мл/л, остальное - вода, pH среды доведен до 7,0 добавлением 16% аммиака. Культивирование в ферментере проводят при 32°C, с перемешиванием (900 об/мин), аэрацией 1,2 л/мин и pH 7,0, который поддерживают добавлением 16% аммиака.
Культивирование завершают при полном исчерпании глюкозы в культуральной жидкости. Уровень накопления L-лизина в культуральной жидкости определяют с помощью тонкослойной хроматографии.
Через 70 час культивирования концентрация L-лизина в культуральной жидкости составляла 115 г/л.
Пример 6. Синтез L-лизина путем культивирования штамма Brevibacterium flavum ВКПМ В-11404 в ферментере
Синтез L-лизина осуществляют путем культивирования штамма Brevibacterium flavum ВКПМ В-11404 в ферментере объемом 3 л. Для этого в ферментер, содержащий 0,550 л ферментационной среды, вносят 0,15 л культуры, предварительно выращенной при 31°C в течение 16 ч в посевном ферментере. Состав ферментационной среды (мас.%): фосфат калия однозамещенный - 0,90, сульфат магния семиводный - 0,32, сульфат аммония - 5,50, глюкоза - 2,50, биотин - 0,000045, тиамин - 0,000045, сульфат железа семиводный - 0,0045, сульфат марганца пятиводный - 0,0045, пеногаситель пропинол Б-400 - 0,10, с добавлением кислотного гидролизата пшеничного глютена - 167 мл/л, вода - остальное, pH среды доведен до 7,0 добавлением 16% аммиака. Культивирование в ферментере проводят при 32°C, с перемешиванием (900 об/мин), аэрацией 1,2 л/мин и pH 7,0, который поддерживают добавлением 16% аммиака.
В ходе ферментации остаточную концентрацию глюкозы в культуральной жидкости поддерживают в диапазоне от 5 до 60 г/л добавлением подпитки, содержащей глюкозу и гидролизат пшеничного глютена. Суммарная подача глюкозы (с учетом исходной концентрации) составляет 310 г/л, а гидролизата пшеничного глютена - 45 мл/л.
Культивирование завершают при полном исчерпании глюкозы в культуральной жидкости. Уровень накопления L-лизина в культуральной жидкости определяют с помощью тонкослойной хроматографии.
Через 70 час культивирования концентрация L-лизина в культуральной жидкости составляла 150 г/л.
Пример 7. Получение L-лизин моногидрохлорида из культуральной жидкости штамма Brevibacterium flavum ВКПМ В-11635 или штамма Brevibacterium flavum ВКПМ В-11404
К 1 л содержащей L-лизин культуральной жидкости, полученной как описано в примерах 5 или 6, добавляют концентрированную серную кислоту в количестве? необходимом для доведения pH до 1,5. Затем культуральную жидкость пропускают через колонну с сульфокатионитом КУ-2-8 (ГОСТ 20298-74) в аммонийной форме. После абсорбции L-лизина колонну сразу промывают деминерализованной водой комнатной температуры. Сорбированный на сульфокатионите L-лизин элюируют раствором, содержащим 2,0 моль/л гидроксида аммония. Фракции, содержащие L-лизин, концентрируют упариванием в вакууме, подкисляют концентрированной соляной кислотой до pH 4,5 и охлаждают до 10°C. Выпавшие кристаллы отделяют от маточного раствора центрифугированием, промывают небольшим количеством деминерализованной воды и высушивают. Полученный продукт содержит не менее 98% L-лизин моногидрохлорида.
В случае использования 1 л культуральной жидкости, получение которой описано в примере 5, получено 103 г L-лизин моногидрохлорида, а в случае культуральной жидкости, полученной как описано в примере 6, - 135 г L-лизин моногидрохлорида.
Пример 8. Получение L-лизин сульфата из культуральной жидкости заявляемых штамма Brevibacterium flavum ВКПМ В-11635 или штамма Brevibacterium flavum ВКПМ В-11404
К 1 л содержащей L-лизин культуральной жидкости, полученной как описано в примерах 5 или 6, добавляют 3,5 мл концентрированной серной кислоты до pH 5,0. Затем полученную жидкость направляют на распылительную сушку. Сушку проводят при температуре входящего воздуха 120°C в течение 3 часов.
В результате получают продукт, содержащий 65% L-лизин сульфата. В случае использования 1 л культуральной жидкости, полученной как описано в примере 5, получено 157,5 г продукта, а в случае использования 1 л культуральной жидкости, полученной как описано в примере 6, - 205 г продукта.
Таким образом, введение в L-лизин-продуцирующие штаммы Corynebacterium glutamicum или Brevibacterium flavum мутаций устойчивости к фузидиновой кислоте приводит к повышению уровня продукции L-лизина не менее чем на 9%. Заявляемый способ синтеза L-лизина, с использованием L-лизин-продуцирующих штаммов Corynebacterium glutamicum или Brevibacterium flavum, устойчивых к фузидиновой кислоте, позволяет получать две наиболее распространенные товарные формы L-лизина - лизин гидрохлорид и лизин сульфат.
Источники информации
1. Методы общей бактериологии. Под ред. Ф. Герхардта, в 3-х томах, 1984.
2. Биотехнология и биоинженерия, Рига, 1978.
3. US 3687810.
4. US 3929571.
5. RU 2347807.
6. US 4623623.
7. US 7736880.
8. US 8361758.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| L-Лизин-продуцирующая коринеформная бактерия с мутантным геном fusA и способ получения L-лизина с использованием этой бактерии | 2015 |
|
RU2612159C1 |
| L-Лизин-продуцирующая коринеформная бактерия с инактивированным геном ltbR и способ получения L-лизина с использованием этой бактерии | 2016 |
|
RU2639247C1 |
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ЛИЗИНА ПОСРЕДСТВОМ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ШТАММА БАКТЕРИЙ | 1992 |
|
RU2099424C1 |
| ШТАММ БАКТЕРИЙ BREVIBACTERIUM SP. - ПРОДУЦЕНТ ЛИЗИНА | 1991 |
|
RU2027761C1 |
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ЛИЗИНА | 2000 |
|
RU2264461C2 |
| Бактерия Corynebacterium glutamicum с повышенной способностью продуцировать L-валин и способ получения L-валина с использованием этой бактерии | 2020 |
|
RU2753996C1 |
| Способ получения L-лизина с использованием микроорганизмов, обладающих способностью продуцировать L-лизин | 2012 |
|
RU2616870C1 |
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ЛИЗИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МИКРООРГАНИЗМОВ, ОБЛАДАЮЩИХ СПОСОБНОСТЬЮ ПРОДУЦИРОВАТЬ L-ЛИЗИН | 2012 |
|
RU2588665C2 |
| СПОСОБ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КОРИНЕФОРМНЫХ БАКТЕРИЙ | 2000 |
|
RU2247778C2 |
| ШТАММ БАКТЕРИЙ CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM В-7198-ПРОДУЦЕНТ L-ГЛЮТАМИНОВОЙ КИСЛОТЫ | 1996 |
|
RU2107723C1 |
Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии и представляет собой способ получения бактерии Corynebacterium glutamicum или Brevibacterium flavum с повышенным уровнем синтеза L-лизина, включающий высев культуры бактерии Corynebacterium glutamicum или Brevibacterium flavum, способной продуцировать L-лизин, на среду, содержащую фузидиновую кислоту, и отбор среди выросших колоний таких, которые обладают повышенным уровнем синтеза L-лизина. Изобретение относится также к способу микробиологического синтеза L-лизина путем культивирования бактерии, полученной указанным способом. Изобретение позволяет получать L-лизин с высокой степенью эффективности. 2 н.п. ф-лы, 1 табл., 8 пр.
1. Способ получения бактерии Corynebacterium glutamicum или Brevibacterium flavum с повышенным уровнем синтеза L-лизина, включающий высев культуры бактерии Corynebacterium glutamicum или Brevibacterium flavum, способной продуцировать L-лизин, на среду, содержащую фузидиновую кислоту, и отбор среди выросших колоний таких, которые обладают повышенным уровнем синтеза L-лизина.
2. Способ микробиологического синтеза L-лизина путем культивирования бактерии, полученной способом по п. 1, в подходящих условиях на минеральной среде, содержащей источники углерода, азота, а также необходимые для роста бактерий аминокислоты и витамины.
| US 8361758 B2, 29.01.2013 | |||
| US 4623623 A1, 18.11.1986 | |||
| RU 2000117837 A, 27.12.2002 |
