ШТАММ БАКТЕРИЙ BREVIBACTERIUM SP. - ПРОДУЦЕНТ ЛИЗИНА Российский патент 1995 года по МПК C12P13/08 C12N1/20 C12N1/20 C12R1/13 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения штамма-продуцента l-лизина - незаменимой аминокислоты, которую используют в качестве кормовой добавки.

В известных микробиологических способах получения лизина главным образом используются ауксотрофные по гомосерину мутанты бактерий Corynebacterium glutamicum и Brevibacterium flavum.

Известны также аналогорезистентные штаммы Brevibacterium lactofermentum, ауксотрофные по аланину и двойные ауксотрофы по серину и лейцину. Описанные штаммы на средах с мелассой (РВ - 11-13%) при выращивании в колбах на качалке накапливают лизин в количестве 38-50 г/л за 66-72 ч ферментации. При этом конверсия сахара в лизин составляет 32-41%.

По совокупности признаков и достигаемому эффекту в качестве штамма-прототипа выбран отечественный штамм - продуцент лизина Brevibacterium sp. СВ80 (Технология микробного синтеза, Рига, "Зинатне", 1978, с.16). Штамм-прототип продуцирует 40,2 г/л лизина на ферментационной среде с 22% мелассы (10% по сахару) и 3% кукурузного экстракта за 3 сут. ферментации в колбах на качалке. Конверсия источника углерода в лизин составляет 40%.

Недостатками штамма-прототипа являются низкий уровень накопления лизина и низкий коэффициент конверсии источника углерода.

Целью изобретения является получение штамма-продуцента с высоким коэффициентом конверсии сахара в лизин, способного накапливать высокий уровень целевого продукта на мелассных средах со сниженной концентрацией ростовых факторов в условиях умеренной аэрации.

Цель достигается созданием нового штамма Breviobacterium sp.90. Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов и имеет регистрационный номер ВКПМ В-5593.

Штамм получен путем многоступенчатой селекции с применением мутагена нитрозогуанидина из штамма Brevibacterium sp.22Л. На первом этапе были получены ревертанты исходного штамма, не нуждающиеся для роста в гомосерине. На втором этапе от одного из таких ревертантов получены мутанты, устойчивые к структурному аналогу лизина S-(2-аминоэтил)-цистеину. На третьем этапе селекции от одного из устойчивых мутантов был получен штамм 90, нуждающийся для роста в лейцине. Полученный штамм Brevibacterium sp.90 превышает по продуктивности штамм-прототип и другие известные штаммы. Конверсия сахара в лизин составляет 42-49%, уровень накопления лизина достигает 65 г/л за 68 ч.ферментации при культивировании в колбах на качалке.

Штамм Brevibacrerium sp.90 имеет сравнительно низкую потребность в ростовых факторах и способен накапливать высокий уровень лизина на мелассных средах без гидролизата БВК либо при небольшой добавке его (2-3%), что соответствует 0,4-0,5% по тех массе БВК. Высокие показатели по продуктивности достигаются при использовании небольших количеств кукурузного экстракта или, что более эффективно, гидролизата кукурузного экстракта (1,0-1,5% по тех. массе кукурузного экстракта).

Новый штамм Brevibacterium sp.90 имеет следующие культурально-морфологические и биохимические признаки.

Культурально-морфологические признаки.

Клетки овальные, размеры 1,0-1,5х0,6-0,6-0,8 мкм, неподвижные, грамположительные, спор не образуют.

Через 3-5 сут. роста при 30^оС на МПА и на агаре Хоттингера колонии диаметром 2-4 мм, желтовато-кремовые, поверхность гладкая, форма выпуклая, край ровный, структура однородная тестообразная. При посеве штрихом через 2 сут. рост умеренный, край гладкий, поверхность матовая. При посеве уколом рост в глубине агара слабый, на поверхности умеренный.

Через 3-5 сут роста при 30^оС на глюкозоминеральной среде Гловера, содержащей лейцин, биотин и тиамин, колонии 1-2 мм, край ровный, структура однородная, консистенция тестообразная, поверхность гладкая, цвет колоний светло-кремовый. Рост штриха на этой среде через 2 сут. умеренный.

Физиолого-биохимические признаки.

Аэроб. Желатину не разжижает.

Хорошо растет на глюкозе, сахарозе, мальтозе, фруктозе, маннозе, этаноле, уксусной кислоте. Не pастет на ксилозе, арабинозе, лактозе, раффинозе.

Усваивает азот в форме солей аммония и мочевины. Не усваивает нитратный азот.

Растет при температуре 24-42^оС. Оптимальная температура 32^оС.

Растет на средах с рН от 6 до 8,5. Оптимальное значение рН 6,8-7,2.

Для роста в минимальной среде нуждается в биотине, тиамине и L-лейцине.

Устойчив к аналогу лизина S-(2-аминоэтил)-цистеину (АЭЦ).

Штамм хранится при 4^оС на косяках с агаром Хоттингера в течение 6 мес. или в лиофильно высушенных ампулах в течение 1 г.

Лизин с использованием штамма Brevibacterium sp.90 получают следующим образом.

Клетки штамма выращивают на агаризованной полноценной среде, затем засевают колбы с посевной средой. Колбы устанавливают на круговую качалку (220-240 об/мин) и инкубируют в течение 18-24 ч при 30^оС. Выращенный посевной материал вносят в колбы с ферментационной средой, содержащей источник углерода, минеральные соли и ростовые факторы. Ферментацию проводят в колбах на качалке при 30-32^оС в течение 50-70 ч. Уровень накопления лизина в культуральной жидкости составляет 50-65 г/л. Конверсия сахара в лизин 42-49%.

Препарат L-лизина из ферментационного раствора готовят в виде кормового концентрата или выделяют как кристаллический продукт известными способами.

П р и м е р 1. Клетки штамма Brevibacterium sp.90 при 30^оС в течение 1-2 сут. на МПА, петлей засевают колбы объемом 250 мл с 15 мл посевной среды следующего состава, %: меласса 3; кукурузный экстракт 6; хлорид аммония 0,5; мел 0,8. Все компоненты посевной среды стерилизуются совместно. Колбы помещают на круговую качалку (220 об/мин) и выращивают в течение 24 ч при 32^оС. Готовым посевным материалом в количестве 5% засевают колбы на 750 мл, содержащие 20 мл ферментационной среды следующего состава, %: меласса 24 (РВ-11%); сульфат аммония 3,5; гидрофосфат калия 0,1; сульфат магния семиводный 0,05; мел 3. В состав ферментационной среды в качестве стимулирующих рост факторов вводят 1,5% кукурузного экстракта (среда 1) или 0,5% по тех. массе БВК гидролизата БВК (среда 2). Ферментацию проводят в течение 64 ч. при 32^оС на круговой качалке (250 об/мин). Результаты ферментаций приведены в табл.1.

Как видно из результатов табл.1, предлагаемый штамм Brevibacterium sp. 90 на среде с 1,5% кукурузного экстракта накапливает 50,3 г/л лизина, конверсия при этом составляет 45,2%.

На среде 2 с гидролизатом БВК (0,5% по БВК) штамм 90 накапливает лизин в концентрации 52,0 г/л. Конверсия составляет 48,4%.

П р и м е р 2. Выращивание посевного материала штамма 90 проводят по примеру 1. Ферментационная среда имеет следующий состав, % меласса 28, (РВ-13%) сульфат аммония 4; гидролизат КЭ 2,0 (в расчете на технический вес КЭ; гидрофосфат аммония 0,2; сульфат магния семиводный 0,05; дистиобиотин 100 мкг/л. Ферментацию проводят в колбах на качалке (250 об/мин) при 32^оС в течение 72 ч. Для создания разной аэрации использовали колбы Эрленмейера емкостью 750 мл с объемом среды 20 и 30 мл, а также колбы Эрленмейера объемом 250 мл без отбойников (объем среды 10 и 15 мл) и с четырьмя отбойниками (объем среды 15 мл). Интенсивность кислородного массообмена (сульфитные числа, г О₂/л ˙ ч) и результаты по уровню накопления лизина приведены в табл.2.

Как видно из табл.2, снижение аэрации с 5,5 до 4,5 г О₂/л ˙ ч, т.е. на 18% , сопровождается уменьшением уровня лизина с 65,3 до 60,0 г/л, т.е. на 8%. При этом конверсия снижается с 49,2 до 47,1, т.е. на 5%. При дальнейшем уменьшении аэрации отрицательный эффект проявляется более сильно.

П р и м е р 3. Выращивание посевного материала штамма 90 и состав ферментационной среды как в примере 1. Отличием является то, что в ферментационную среду вместо гидролизата кукурузного экстракта добавляетcя L-лейцин в концентрации 0,03%. Ферментацию проводят в колбах Эрленмейера объемом 250 мл с отбойником. Объем ферментационной среды 15 мл. Через 68 ч ферментации содержание лизина достигает 59,7 г/л. Конверсия углеводов в лизин составляет 48%.

П р и м е р 4. Выращивание посевного материала штамма Brevibacterium sp. 90 и условия проведения ферментации по примеру 1, но используется ферментационная среда следующего состава, %: сахар-сырец 12; сульфат аммоний 4; гидрофосфат калия 0,2; сульфат магния семиводный 0,05; мел 3; L-лейцин 0,05; дестиобиотин 200 мкг/мл; тиамин 100 мкг/мл. Через 72 ч ферментации содержание лизина в культуральной жидкости 50 г/л. Конверсия углеводов в лизин 42%.

П р и м е р 5. выращивание посевного материала и условия ферментации по примеру 3, но в составе ферментационной среды вместо L-лейцина содержится лейцинсодержащая культуральная жидкость с концентрацией в ней l-лейцина 21 г/л. Концентрация лейцина в приготовленной таким образом ферментационной среде 0,3 г/л. Через 68 ч ферментации содержание лизина в культуральной жидкости 56,6 г/л, конверсия углеводов в лизин 47%.

П р и м е р 6. Выращенным посевным материалом штамма Brevibacterium sp. 90 в посевной среде, как это показано в примере 1, в объеме 1 л засевают 2,5 м³ посевной среды того же состава, помещенной в ферментер емкостью 5 м³. Ферментер оборудован барботером для распределения воздуха и рубашкой для охлаждения. Выращивание культуры проводят при 30-32^оС в течение 21 с непрерывной аэрацией (2-3 м³ воздуха в 1 мин). Выращенной культурой объемом 2,5 м³ засевают 30 м³ ферментационной среды, приготовленной в ферментере емкостью 50 м³. Ферментер оборудован барботажным воздухораспределением. Ферментационная среда имеет следующий состав, %: меласса 25, (РВ-12,5) хлорид аммония 1,3; гидрофосфат аммония 0,1; гидролизат БВК 4 (в пересчете на технический вес продукта 0,8), пропинол 0,1.

Значение рН в ходе ферментации поддерживается на уровне 6,8-7,0 путем автоматической подачи водного аммиака (25%) по датчику рН. Скорость подачи воздуха 1 объем на 1 объем ферментационной среды в 1 мин. Через 58 ч ферментации концентрация лизина составила 56 г/л. Конверсия углеводов в лизин 46,3%.

Представленные примеры показывают, что при использовании нового штамма Brevibacterium sp. 90 высокий выход лизина (до 65 г/л) и высокий уровень конверсии углеводов в лизин (до 49%) достигается при использовании ферментационных сред с низким содержанием ростовых факторов - кукурузного экстракта (1,5-2,0%) или гидролизата БВК (0,5-0,8%).

По сравнению со штаммом-прототипом новый штамм имеет более высокий уровень накопления лизина (50,2-65,0 г/л против 40,2 г/л), а также более высокий коэффициент конверсии (45-49% против 40%).

При применении нового штамма в промышленности имеется возможность использования ферментеров с малой интенсивностью аэрации, не оборудованных мешалками. В условиях умеренной аэрации уменьшается также и тепловыделение, борьба с которым связана с определенными трудностями из-за недостатка воды на охлаждение.

Использование: биотехнология. Сущность изобретения: получен новый штамм - продуцент лизина Brevibacterium sp. 90 с высоким коэффициентом конверсии сахара в лизин, способный накапливать высокий уровень целевого продукта на мелласных средах со сниженной концентрацией ростовых факторов. При выращивании на среде с мелассой (РВ - 12 - 13%) штамм накапливает лизин в концентрации до 65 г/л за 72 ч в условиях колб на качалке и до 56 г/л за 60 ч в промышленных аппаратах в процессе без подпитки. Конверсия сахара в лизин составляет 45 - 49%. Штамм не требует высокой концентрации ростового фактора (лейцина), что позволяет осуществлять процесс на мелассе без использования гидролизата БВК. Штамм обладает сниженной потребностью в аэрации. 2 табл.

ШТАММ БАКТЕРИЙ BREVIBACTERIUM SP - ПРОДУЦЕНТ ЛИЗИНА.

Штамм бактерий Brevibacterium sp. ВКПМ В-5593 - продуцент лизина.