ШТАММ БАКТЕРИЙ CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM В-7198-ПРОДУЦЕНТ L-ГЛЮТАМИНОВОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 1998 года по МПК C12N1/20 C12P13/14 C12N1/20 C12R1/15 

Изобретение относится к области микробиологической промышленности и представляет новый промышленный непатогенный штамм бактерий Corynebacterium glutamicum (ВСБ-206л) ВКПМ В-7198, способный синтезировать L-глютаминовую кислоту. Характеризуется высокой продуктивностью при культивировании на сахарозе, глюкозо-мальтозном сиропе, гидролизате кукурузы. L-глютаминовая кислота находит широкое применение в пищевой промышленности в качестве вкусовой добавки, используется при лечении заболеваний центральной нервной системы, язвы желудка, входит в состав косметических средств: губной помады, лака для ногтей.

L-глютаминовая кислота синтезируется дикими штаммами бактерий Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum, с нарушенной ферментативной системой превращения α -кетоглутаровой кислоты в янтарную.

Известны продуценты L-глютаминовой кислоты Corynebacterium glutamicum с высокой супероксидисмутазной активностью (патент Японии 5-29436 C 12 P 13/14), продуцирующие до 100 г/л глютаминовой кислоты, получен мутант Corynebacterium glutamicum, содержащий рекомбинантную ДНК с фрагментом, несущим ген, кодирующий фосфоенолпируваткарбоксилазу из Escherichia coli (патент Японии 4-17639 C 12 P 13/14). Основным недостатком всех перечисленных штаммов и мутантов является непродуктивный расход углеродсодержащих субстратов на биосинтез молочной кислоты, при этом при культивировании всех приведенных штаммов выход глютаминовой кислоты от субстратов составлял не более 56%.

Наиболее близким по биосинтетической активности является штамм Corynebacterium glutamicum 541P [1] . Штамм микроорганизмов 5413 выращивали на лабораторной установке ФС-5, вмещающей 2,0 л среды. Степень аэрации обеспечивали путем изменения числа оборотов мешалки от 400 до 800 оборотов в мин, воздух подавали в количестве от 1 до 3 объемов воздуха на 1 объем питательной среды в 1 мин. Среда выращивания содержала: 10% сахара, 0,1% KH₂PO₄, 0,1% K₂HPO₄, 0,05% MgSO₄ • 7H₂O, 0,001% MnSO₄ • 4H₂O, 1,5% мочевины, 0,15% кукурузного экстракта. Выращивание вели 72 ч, при этом синтезировалось 46,9 г/л L-глютаминовой кислоты. Выход составил 47%. Недостатком этого штамма является низкий выход целевого продукта от поданных углеродсодержащих субстратов.

Задача изобретения заключалась в селекции активного непатогенного штамма бактерий, характеризуемого высокой продуктивностью по L-глютаминовой кислоте и высоким выходом углеродсодержащих субстратов (более 60%).

Предлагаемый новый штамм бактерий Corynebacterium glutamicum был получен мутацией штамма АТСС 4128, полученного из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов Государственного научно-исследовательского института генетики. Клетки исходного штамма подвергали УФ-мутагенному воздействию. Отбор проводили с помощью биоавтографического метода. Бактериальные клетки, выросшие на чашках, убивали УФ-облучением, после этого чашки заливали агаризованной средой, содержащей суспензию клеток штамма, нуждающегося в L-глютаминовой кислоте. Рост такой индикаторной бактерии подтверждал выделение исследуемым штаммом L-глютаминовой кислоты. Прямой отбор среди 100 вариантов, полученных после обработки клеток исходного штамма АТСС 4128, позволил выявить 8 штаммов, обладающих способностью к синтезу L-глютаминовой кислоты, далее мутанты отбирались по двум признакам: резистентности к Na-триевой соли ампициллина и выходу от поданного углеродсодержащего субстрата более 60%. При выращивании на жидкой синтетической питательной среде с добавлением источников N, P, K, Na, Mg, биотина, тиамина, содержащей сахарозу в количестве 40 г/л, был отобран штамм ВСБ-206л, способный к сверхсинтезу L-глютаминовой кислоты с выходом от потребленной сахарозы 63%. Отобранный штамм был идентифицирован в соответствии с определителем (Starr M.P., Stolp H., Trupper H.G. , Salows A., Schlegel H.G., (1981) The Prokaryotes A. Handbook on Habitats. Isolation and ldentification of Bacteria, Bd 1, 2, Springer Verlay, Berlin, New York) как Corynebacterium glutamicum.

Характеристика штамма бактерий Corynebacterium glutamicum ВСБ-206л.

Культурные признаки: колонии на мясо-пептонном агаре при T 30 - 32^oC блестящие, желтого цвета, с ровным краем, размер колоний не превышает 5 мм через 3 сут после высева.

Морфологические признаки: форма клеток булавовидная, способны к ветвлению, размер клеток не превышает 2 - 3 мкм.

Физиолого-биохимические признаки: ассимилирует глюкозу, сахарозу, ацетат, этиловый спирт. Нуждается в добавках биотина, тиамина, способны к сверхсинтезу L-глютаминовой кислоты, обладает пониженной активностью лактатдегидрогеназы, что снижает затраты углерода субстрата на жизнедеятельность бактерий, уменьшает непродуктивный расход углерода на биосинтез молочной кислоты.

Штамм Corynebacterium glutamicum (ВСБ-206л) депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов Государственного научно-исследовательского института генетики под номером B-7198.

Среда для поддержания штамма: сахароза - 10%, KH₂PO₄ - 0,1%, K₂HPO₄ - 0,1%, MgSO₄ • 7H₂O - 0,05%, MnSO₄ • 4H₂O - 0,001%, мочевина - 1,5%, кукурузный экстракт - 0,25%.

Направленный биосинтез L-глютаминовой кислоты проводили в камеральных условиях в ферментере V=5л при перемешивании (1200 об/мин) и аэрации (0,6 м³/ч) на синтетической питательной среде при pH = 6,8 и T = 30^oC. Состав питательной среды для стадии направленного биосинтеза L-глютаминовой кислоты был следующим: сахароза - 8 - 15%, KH₂PO₄ - 0,1 - 0,2%, K₂HPO₄ - 0,1%, MgSO₄ • 7H₂O - 0,02%, MnSO₄ • 4H₂O - 0,001%, ZnSO₄ • 7H₂O - 0,01%, мочевина - 1%, кукурузный экстракт - 0,1%.

Засевную биомассу готовили путем выращивания односуточной культуры бактерий на вышеприведенной среде, поддерживали титрованием 5%-ным NaOH.

Штамм Corynebacterium glutamicum B-7198 выращивали в камеральных условиях, синтезировали максимально 67 г/л L-глутаминовой кислоты, при этом выход от поданной сахарозы составил 72%, что выше, чем в прототипе на 20%.

Пример 1. Штамм бактерий Corynebacterium glutamicum B-7198 культивировали в периодической культуре в лабораторном ферментере с рабочим объемом 5 л на питательной среде: сахароза - 10%, KH₂PO₄ - 0,1%, K₂HPO₄ - 0,1%, MgSO₄ • 7H₂O - 0,02%, MnSO₄ • 4H₂O - 0,001%, кукурузный экстракт - 0,2%, мочевина - 1,5% при pH = 6,9, T = 30^oC, аэрации 0,6 м³/ч, перемешивании 1200 об/мин. pH поддерживали титрованием 0,5%-ным NaOH, при этом было синтезировано 63 г/л L-глютаминовой кислоты и выход составил 63%.

Пример 2. Штамм бактерий B-7198 выращивали так же, как и в примере 1, но в качестве источника углерода использовали этиловый спирт в количестве 7%, было синтезировано 45 г/л глютаминовой кислоты, а выход составил 64%.

Таким образом, на основании проведенных исследований можно заключить, что предлагаемый штамм Corynebacterium glutamicum B-7198 является новым штаммом, обладающим способностью к сверхсинтезу L-глютамиовой кислоты, характеризующимся следующими отличительными признаками от прототипа:
синтезирует L-глютаминовую кислоту в количестве 60 - 70 г/л;
выход от поданного углеродсодержащего субстрата составил 61 - 67%;
обладает пониженным биосинтезом лактатдегидрогеназы.

На основании данных проведенных исследований штамм бактерий Corynebacterium glutamicum B-7198 рекомендован в качестве продуцента при производстве L-глютаминовой кислоты.

Штамм бактерий Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-7198 - продуцент L-глютаминовой кислоты позволяет увеличить выход целебного продукта от поданного углеродного субстрата. Бактерии штамма В-7198 способны синтезировать L-глютаминовую кислоту в количестве 60-70 г/л с пониженным биосинтезом лактатдегидрогеназы. Штамм стабилен и устойчив по своим морфологическим и физиологическим свойствам.

Штамм бактерий Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-7198 - продуцент L-глютаминовой кислоты с пониженным биосинтезом лактатдегидрогеназы.