СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ЛИЗИНА ПОСРЕДСТВОМ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ШТАММА БАКТЕРИЙ Российский патент 1997 года по МПК C12P13/08 C12N1/20 

Изобретение касается способа получения L-лизина посредством культивирования в питательной среде штамма бактерий, принадлежащего к видам Corynebacterium glutamicum и Brevibacterium lactofermentum.

L-лизин представляет собой важную аминокислоту, используемую в качестве пищевой добавки для бройлеров, свиней и т.д. поскольку L-лизин является недостаточным веществом в пищевых культурах, таких как кукуруза. Настоящее изобретение относится к способу получения L-лизина ферментацией.

Известные способы получения L-лизина ферментацией включают придание свойств, необходимых для приобретения продуктивности L-лизина, таких как, например, ауксотрофность к гомосерину, устойчивость к S-(2-аминоэтил)-L- цистеину (см. патент США N 3707441), устойчивость к α-хлоркапролактаму и т.д. микроорганизмам, принадлежащим к роду Brevibacterium или роду Corynebacterium, которые выделены из природной среды (далее упоминаются как "дикие" штаммы), культивирование микроорганизмов в среде, содержащей источники углерода и источники азота, и т.д. а также сбор L-лизина, продуцированного и аккумулированного в культуральной жидкости, путем адсорбции смолой и т.д. Кроме того, изучен также способ с использованием усовершенствованных штаммов этих L-лизин-продуцирующих микроорганизмов, например ауксотрофов L-аланина, фторопируват-чувствительных штаммов, штаммов, устойчивых к аналогам L-лейцина, однако ферментационный выход L-лизина еще не достиг удовлетворительного уровня. Поэтому желательно разработать более эффективный способ получения L-лизина при более низкой стоимости, нежели в традиционных способах, с использованием L-лизин-продуцирующих микроорганизмов или их мутантов, имеющих более высокую производительность L-лизина и более высокий выход ферментации.

Задачей настоящего изобретения является создание эффективного способа получения L-лизина при более низкой стоимости, нежели в традиционных способах, путем дальнейшего повышения производительности L-лизин-продуцирующих микроорганизмов или их усовершенствованных мутантов, и с повышенным ферментационным выходом.

С целью дальнейшего повышения производительности L-лизина в отношении L-лизин-продуцирующих микроорганизмов или их усовершенствованных мутантов, а также с целью повышения ферментационного выхода, заявитель осуществил интенсивные исследования и в результате их обнаружил, что L-лизин-продуцирующие мутанты, которые приобрели резистентность к ацил-лизину и/или метилированному ацил-лизину, пригодны для достижения поставленной цели. На этом открытии и основано настоящее изобретение.

Настоящее изобретение предлагает способ получения L-лизина посредством культивирования бактерий вида Brevibacterium lactofermentum или Corynebacterium glutamicum, обладающих резистентностью к ацил-лизину и/или метилированному ацил-лизину и способных продуцировать L-лизин. L-лизин, продуцированный в культуральной жидкости, извлекают известными способами.

Ацил-лизин, используемый по изобретению, относится к соединениям, содержащим остаток жирной кислоты, имеющий от 5 до 20 атомов углерода, связанных в a-положении и/или -e-положении L- или DL-лизина посредством ацильной связи.

Примерами таких соединений являются N^a-стеароил-L-лизин, N^ε-деканоил-L-лизин, N^ε-миристоил-L-лизин, N^ε-пальмитоил-L-лизин, N^α,N^ε-октаноил-L-лизин, N^α,N^ε-дилауроил-L-лизин и т.д. Метилированный ацил-лизин относится к ацил-лизинам, которые метилированы у аминогруппы α-положения. Примеры таких соединений включают N^a-метил-N^ε-стеароил-L-лизин, N^α,N^α-диметил-N^ε-деканоил-DL-лизин, N^α,N^α-диметил-N^ε-пальмитоил-DL-лизин, N^α,N^α,N^α-триметил-N^ε-миристоил-DL-лизин, N^α,N^α,N^α-триметил-N^ε-пальмитоил-DL-лизин и т.д.

Мутанты, используемые по изобретению, принадлежат к виду Brevibacterium lactofermentum или к виду Corynebacterium glutamicum и имеют устойчивость к ацил-лизину и/или метилированному ацил-лизину, то есть, могут хорошо вырастать в присутствии ацил-лизина даже при концентрации 25 мг/л и/или в присутствии метилированного ацил-лизина, даже при концентрации 25 мг/л имеют известные свойства, требуемые для эффективного производства L-лизина, например ауксотрофность к гомосерину, резистентность к S-(2-амино-этил)-L-цистеину, резистентность к α-хлоркапролактаму и т.д. или их комбинации. В данном описании свойство хорошего роста означает, что степень относительного роста составляет по меньшей мере 50, когда рост составляет 100 в отсутствии ацил-лизина и метилированного ацил-лизина.

Специфические примеры мутантов включают:
Brevibacterium lactofermentum A 12592 (F ERM BP 3239)
Brevibacterium lactofermentum A 12593 (F ERM BP 3240).

Corynebacterium glutamicum A 12596 (F ERM BP 3242).

Описанные выше штаммы депонированы в соответствии с Будапештским соглашением 24.01.91 г в Институте по Исследованию Ферментации, Министерство Международной Торговли и Промышленности (FR1), расположенном в 1 3, Higashi 1 chome, Tsukuba shijbaraki Ken 305, Япония.

В качестве родительских штаммов, используемых для получения этих мутантов, применяют микроорганизмы, принадлежащие к роду Brevibacterium или Corynebacterium. Кроме того, в качестве родительских штаммов можно использовать дикие штаммы, например, такие как:
Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869.

Corynebacterium glutamicum ATCC 13032.

После придания L-лизин-производительности этим диким штаммам также можно придать им резистентность к ацил-лизину и/или метилированному ацил-лизину. Альтернативно, резистентность к ацил-лизину и/или метилированному ацил-лизину можно придать этим диким штаммам вначале, а затем придать L-лизин-производительность.

Для того, чтобы подвергнуть эти родительские штаммы мутационной обработке, можно использовать традиционные методы, такие как взаимодействие с N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидином (далее упоминается в сокращении как NG).

С целью защиты ацил-лизин и/или метилированный ацил-лизин-резистентных штаммов от этих мутантов, можно использовать способ, предусматривающий сбор мутантов, которые хорошо растут в среде, содержащей ацил-лизин и/или метилированный ацил-лизин при такой концентрации, которая заметно ингибирует рост родительских штамов. Более конкретный пример сбора резистентных штаммов приведен ниже.

Жизнеспособные клетки Brevibacterium lactofermentum AJ 12435 (F ERM BR - 2294), который представляет собой L-лизин-продуцирующий микроорганизм, резистентный к S-(2-аминоэтил)-L-цистеину, обрабатывают 250 мкг/мл NG при температуре 30^oC в течение 30 мин. Клетки, проявляющие выживаемость, равную 1,0% инокулируют на агаровой среде, которая является минимальной средой, приведенной в табл. 1, и пополнена 50 мг/л N^a,N^e-диоктаноил-L-лизином, который является одним из ацил-лизинов. После культивирования при температуре 30^oC в течение недели растущую колонию собирают.

Концентрацию ацил-лизина или метилированного ацил-лизина, дополненного в среду, выбирают в зависимости от минимальной концентрации, ингибирующей рост, используемого родительского штамма, и которую устанавливают на таком уровне, чтобы эффективно собрать желательные резистентные штаммы. Одним из резистентных штаммов является Brevibacterium lactofermentum AJ 12592 (F ERM BP 3239), который предлагается для следующего эксперимента. Аналогичным образом Brevibacterium lactofermentum AJ 12593 (F ERM BP 3240) получают в качестве N^α,N^α,N^α-триметил-N^ε-пальмитоил-DL-лизин-резистентного штамма.

Компонент Концентрация
Глюкоза 20 г/л
Аммония сульфат 10 г/л
KH₂PO₄ 1 г/л
MgSO₄ • 7H₂O 0,4 г/л
FeSO₄ • 7H₂O 10 мг/л
MnSO₄ • 4H₂O 10 мг/л
Биотин 50 мкг/л
Хлоргидрат тиамина 100 мкг/л
Мочевина 2 г/л
Агар 20 г/л
С использованием Corynebacterium glutamicum AJ 3463 (F ERM P 1987) в качестве родительского штамма, Corynebacterium glutamicum AJ 12596 (F ERM BP - 3242) получают в качестве N^α,N^α,N^α-триметил-N^ε-пальмитоил-DL-лизин-резистентного штамма.

Резистентность каждого из полученных таким образом штаммов, резистентных к ацил-лизину или метилированному ацил-лизину определяют, как указано ниже, и сравнивают с резистентностью родительского штамма. Ацил-лизин или метилированный ацил-лизин прибавляют в среду, приведенную в табл. 2, при каждой концентрации, и 4 мл среды отдельно загружают в маленькую пробирку. После стерилизации испытуемый штамм инокулируют на среду. После встряхивания культуры при температуре 30^oC в течение 24 ч измеряют мутность при длине волны 562 нм, а относительную скорость роста вычисляют на основе этих значений в среде без добавления ацил-лизина или метилированного ацил-лизина. Результаты испытания приведены в табл. 3. Мутанты по изобретению проявляют относительную скорость роста, равную 50, в присутствии ацил-лизина или метилированного ацил-лизина при концентрации 25 мг/л, тогда как родительские штаммы проявляют очень низкую относительную скорость роста, менее 10. Как указано выше, мутанты по изобретению четко отличаются от родительских штаммов, так как мутанты являются резистентными к ацил-лизину или метилированному ацил-лизину.

Компонент Концентрация
Сахароза 20 г/л
Аммоний сульфат 5 г/л
KH₂PO₄ 1 г/л
MgSO₄ • 7H₂O 0,4 г/л
FeSO₄ • 7H₂O 10 мг/л
MnSO₄ • 4H₂O 10 мг/л
Биотин 100 мкг/л
Хлоргидрат тиамина 200 мкг/л
Никотинамид 5 мг/л
Гидролизат белка 1 г/л (вычислено как азот)
Мочевина 3 г/л
С использованием указанных резистентных штаммов L-лизина можно получить ферментативно в обычной питательной среде, содержащей источники углерода, источники азота, неорганические ионы, факторы роста и питательные вещества, требуемые микроорганизмом, используемым традиционным способом. В качестве источников углерода можно использовать сахара, такие как глюкоза, сахароза, меласса, гидролизаты крахмала и так далее, органические кислоты, такие как уксусная кислота, пропионовая кислота и так далее, спирты, такие как этанол, пропанол и так далее. В качестве источников азота можно использовать сульфат аммония, нитрат аммония, хлорид аммония, мочевину, аммиак и так далее.

Что касается условий культивирования штаммов, то культивирование в воздушной атмосфере осуществляют при температуре ферментации от 24 до 37^oC, предпочтительно от 30 до 34^oC. Количество дней, требуемых для фрагментации, как правило, составляет от 2 до 7 дней, pH в начале или в течение ферментации составляет диапазон от 5,0 до 8,5, предпочтительно 6,0-7,5. Для регулировки pH можно использовать неорганические или органические кислые или щелочные вещества, а также мочевину, карбонат кальция, газообразный аммиак или тому подобное.

После осуществления ферментации L-лизин собирают из культуральной жидкости известными способами с использованием ионообменной смолы, кристаллизации и так далее, или применяя комбинацию этих способов.

Ниже настоящее изобретение описывается более подробно на следующих примерах.

Пример 1.

Среду, содержащую 36 г/л глюкозы, 20 г/л хлорида аммония, 1 г/л KH₂PO₄, 400 мг/л MgSO₄ • 7H₂O, 10 мг/л FeSO₄ • 7H₂O, 8 мг/л MnSO₄ • 4H₂O, 3 мг/л гидролизата соевого белка (вычислено в пересчете на азот), 0,1 мг/л хлоргидрата тиамина и 0,3 мг/л биотина (pH 7,0), отдельно загружают 20 мл каждого во встряхиваемую колбу объемом 500 мл. После стерилизации нагреванием при температуре 115^oC в течение 10 мин в колбу прибавляют 1 г ранее стерилизованного сухим паром карбоната кальция. Каждый штамм инокулируют в среду с последующим культивированием при температуре 31,5^oC в течение 48 ч при одновременном встряхивании. Количество аккумулированного в культурной жидкости L-лизина определяют количественно кислотно-медной нингидрин- колориметрией. Результаты приведены в табл. 4. В любом из резистентных штаммов аккумуляция L-лизина заметно возрастает по сравнению с соответственным родительским штаммом.

Пример 2.

Среду, содержащую 80 г/л мелассы в пересчете на сахар, 50 г/л сульфата аммония, 1 г/л KH₂PO₄, 1 г/л MgSO₄ • 7H₂O, 10 мг/л гидролизата сои культурной (в пересчете на азот), 0,1 мг/л хлоргидрата тиамина и 0,3 мг/л биотина (pH 7,0), отдельно загружают 20 мл каждого во встряхиваемую колбу объемом 500 мл. После стерилизации нагреванием при температуре 120^oC в течение 10 мин в колбу прибавляют 1 г карбоната кальция, предварительно стерилизованного сухим нагреванием при температуре 180^oC в течение 2 ч. Каждый штамм инокулируют в среду с последующим культивированием при температуре 31,5^oC в течение 72 ч при одновременном встряхивании. Количество аккумулированного в культуральной жидкости L-лизина анализируют, Результаты приведены в табл. 5. В резистентном штамме аккумуляция L-лизина заметно возрастает по сравнению с родительским штаммом.

Пример 3.

Эксперимент по определению эффективности "родительских" штаммов.

а) Brevibacterium lactofermentum AJ 12435 (F ERM BP 2294, резистентный к AEC) и,
б) Corynebacterium glutamicum AJ 3463 (F ERM P 1987, резистентный к AEC).

Жизнеспособные клетки Brevibacterium lactofermentum AJ 12435 или Corynebacterium glutamicum AJ 3463 обрабатывают 250 μ/мл (микрограмм на миллилитр) N-метил-N'-нитро-Т-нитрозогуанидина при 30^oC в течение 30 мин. Клеточную суспензию, продемонстрировавшую степень выживаемости 1,0% инокулируют в чашку с минимальной агаровой средой, показанной в табл. 1 описания, в которую было добавлено 50 мг/л N,N-диоктаноил-L-лизина (DOL) или N,N,N-триметил-N-пальмитоил-DL-лизина (TMPL). Для сравнения (контроль), ту же клеточную суспензию инкубируют на той же среде без добавления DOL и TMPL. После выращивания при 30^oC в течение одной недели, собирают выросшие колонии. Производство L-лизина исследуют с использованием 75 штаммов, наугад выбранных из колоний, выросших на каждой среде, согласно методике, описанной в примере 1 описания.

Количество штаммов, показавших повышенное производство L-лизина, то есть тех штаммов, которые продуцировали L-лизина на 10% больше, чем их родительские штаммы, показаны в нижеприведенной табл. 6.

Штаммы, продемонстрировавшие повышенное производство L-лизина, были получены с наибольшей частотой (вероятностью) на среде, содержащей ацил-лизин или метилированный ацил-лизин. Эти результаты означают, что имеется прямая зависимость между наличием резистентности к (метилированному) ацил-лизину и повышенным производством лизина.

Использование: биотехнология. Сущность изобретения: способ получения L-лизина посредством культивирования штамма бактерий, принадлежащего к видам Corynebacterium glutamicum и Brevibacterium lactofermentum в питательной среде, при этом используют штамм, обладающий резистентностью к ацил-лизину и/или к металированному ацил-лизину. 6 табл.

Способ получения L-лизина посредством культивирования штамма бактерий, принадлежащего к виду Corynebacterium glutamicum или Brevibacterium lactofermentum, в питательной среде, отличающийся тем, что используют штамм, имеющий резистентность к ациллизину и/или к метилированному ациллизину.