ИММУНОГЕННАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИЛИ ПРОФИЛАКТИКИ CLOSTRIDIUM DIFFICILE, СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ И СПОСОБ ИНДУКЦИИ ИММУННОГО ОТВЕТА К C. DIFFICILE Российский патент 2015 года по МПК A61K39/08 C12N1/20 A61K47/00 

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к композициям, включающим анатоксины Clostridium difficile.

Предшествующий уровень техники

Токсины А и В Clostridium difficile (C. difficile) ответственны за заболевание, связанное с C. difficile (CDAD), которое само проявляется в виде внутрибольничной диареи и псевдомембранозного колита (Kuijper et al., Clinical Microbiology and Infection 12(Suppl. 6):2-18, 2006; Drudy et al., International Journal of Infectious Diseases 11(1): 5-10, 2007; Warny et al., Lancet 366(9491): 1079-1084, 2005; Dove et al., Infection and Immunity 58(2): 480-488, 1990; Barroso et al., Nucleic Acids Research 18(13): 4004, 1990). Обработка токсинов формальдегидом приводит к получению соответствующих анатоксинов А и В, которые полностью инактивированы и сохраняют, по меньшей мере, частичную иммуногенность (Torres et al., Infection and Immunity 63(12): 4619-4627, 1995). Было показано, что вакцинация с использованием обоих анатоксинов эффективна у хомячков, здоровых взрослых и пациентов с рецидивирующим CDAD (Torres et al., Infection and Immunity 63(12): 4619-4627, 1995; Kotloff et al., Infection and Immunity 69(2): 988-995, 2001 ; Sougioultzis et al., Gastroenterology 128(3): 764-770, 2005; Torres et al., Vaccine Research 5(3): 149-162, 1996). Кроме того, введение и свободного, и связанного с солью алюминия (адъювантного) анатоксинов ведет к соответствующим иммунным ответам (Torres et al., Vaccine Research 5(3): 149-162, 1996; Giannasca et al., Infection and Immunity 67(2): 527-538, 1999). Одновременное введение обоих анатоксинов более эффективно, чем введение каждого из белков по отдельности (Kim et al., Infection and Immunity 55(12): 2984-2992, 1987). Таким образом, и А, и В анатоксины являются кандидатами на создание вакцины. Для получения оптимальной устойчивости при хранении, желательно улучшение их конформационной целостности и/или снижения их тенденции к агрегации.

Краткое описание сущности изобретения

Изобретение предоставляет композиции, такие как фармацевтические композиции (например, вакцинные композиции), включающие токсин или анатоксин Clostridium difficile (e.g., анатоксин токсинов A и/или B C. difficile toxins; причем анатоксины А и В присутствуют в соотношении, например, от 5:1 до 1:5, например, 3:2 (A:B)), и один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов, которые снижают или задерживают агрегацию токсина и/или анатоксина, и/или увеличивают термическую устойчивость токсина или анатоксина относительно композиции, не содержащей один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов. В одном примере, один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов снижают или задерживают агрегацию токсина и/или анатоксина на 50% или более, относительно композиции, не содержащей один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов. В другом примере, один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов увеличивают термическую устойчивость токсина и/или анатоксина на 0,5°C или более, относительно композиции, не содержащей один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов. Необязательно, композиции по изобретению могут включать адъювант (например, соединение алюминия, такое как гидроксид алюминия, фосфат алюминия или соединение гидроксифосфат алюминия). Композиции могут быть представлены в жидкой форме, сухой порошкообразной форме, лиофилизированной форме, высушенной распылением форме или высушенной вспениванием форме.

Один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов могут быть, например, выбраны из группы, состоящей из буферов, агентов тоничности, простых углеводородов, сахаров, углеводородных полимеров, аминокислот, олигопептидов, полиаминокислот, многоатомных спиртов и их простых эфиров, детергентов, липидов, поверхностно-активных веществ, антиоксидантов, солей, человеческого сывороточного альбумина, желатинов, формальдегида или их комбинаций. В различных примерах, (i) буфер выбран из группы, состоящей из цитрата, фосфата, глицина, гистидина, карбоната и бикарбоната и содержится в концентрации от 5 до 100 мМ; (ii) агент тоничности представляет собой маннит в концентрации от 1 до 50 мМ; (iii) сахар выбран из сорбита, трегалозы и сахарозы в концентрации 1-30%; (iv) аминокислота, олигопептид или полиаминокислота присутствует в концентрации до 100 мМ; (v) многоатомный спирт выбран из группы, состоящей из глицерина, полиэтиленгликоля и их простых эфиров с молекулярной массой 200-10000 в концентрации до 20%; (vi) детергенты и липиды выбраны из группы, состоящей из деоксихолата натрия, Tween 20, Tween 80 и плюроникса в концентрации до 0,5%; (vii) углеводородные полимеры выбраны из декстрана и целлюлозы; (viii) соли выбраны из группы, состоящей из хлорида натрия, хлорида калия, хлорида магния и ацетата магния до 150 мМ; и (ix) формальдегид присутствует в количестве 0,001-0,02%.

Конкретные примеры таких эксципиентов включают те, которые перечислены в таблице 1, таблице 2, таблице 8 или таблице 9. В других примерах, композиции включают цитрат натрия или калия и/или фосфат натрия или калия, необязательно, в комбинации с сахарозой и/или альдегидом. Так, в различных примерах композиции включают анатоксины А и В Clostridium difficile, 5-100 мМ (например, 10-30 мМ или 20 мМ) цитрата (или фосфата) натрия или калия, 2-20% (например, 2-10% или 5%) сахарозы и <0,020% (например, 0,016%) формальдегида, pH 5,5-8,5 (например, 6,5-8,0, или 7,5). В других примерах используется комбинация сорбита, декстрозы и/или Tween 80.

Изобретение также предоставляет способы получения композиций, включающих токсин или анатоксин Clostridium difficile, и один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов, которые снижают или задерживают агрегацию токсина и/или анатоксина, и/или увеличивают термическую устойчивость токсина или анатоксина относительно композиции, не содержащей один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов. Эти способы включают предоставление токсина или анатоксина Clostridium difficile и смешивание токсина или анатоксина Clostridium difficile с одним или более фармацевтически приемлемым эксципиентом, таким как эксиципиенты, описанные в настоящей заявке. Композиции могут храниться в жидкой или лиофилизированной форме, как описано в настоящей заявке.

Изобретение, кроме того, предоставляет способы индукции иммунного ответа на C. difficile у индивидуума, которые включают введение индивидууму композиции, как описано в настоящей заявке. В одном примере, у пациента нет болезни, вызванной C. difficile, но есть риск ее развития, а в другом примере, у пациента имеется заболевание, вызванное C. difficile. Кроме того, изобретение включает применение композиций по изобретению при индукции иммунного ответа на C. difficile у индивидуума, или при получении лекарственных средств для применения с этой целью.

Изобретение обеспечивает несколько преимуществ. Например, применение описанных в настоящей заявке эксципиентов может привести к увеличенной физической устойчивости анатоксинов А и В C. Difficile и/или уменьшенной или отсроченной агрегации, которые важны для получения фармацевтических продуктов (например, вакцин), включая анатоксины. Кроме того, применение соотношений по изобретению (например, 3:2, А:В) и добавление адъюванта непосредственно перед введением (а не при составлении хранящейся вакцины) могут привести к увеличенной иммуногенности.

Другие признаки и преимущества изобретения будут очевидны из следующего подробного описания, чертежей и формулы изобретения.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Исследования воздействий растворенных веществ на структурную устойчивость анатоксина А (x) в присутствии 20% трегалозы (□), 20% сахарозы (■), 10% сорбита (o), 10% декстрозы (●), 20% глицерина (Δ), 0,05% tween 80 (A), 0,1% pluronic F68 (0): (a) сигнал CD (кругового дихроизма) при 208 нм; (c) интенсивность эмиссии ANS; (d) положение пика эмиссии ANS; и (b) термограмма DSC. Термические следы представляют среднюю величину двух измерений, где каждая точка данных имела стандартную ошибку менее чем 0,5.

Фиг. 2. Исследования воздействий растворенных веществ на структурную устойчивость анатоксина B (x) в присутствии 20% трегалозы (□), 20% сахарозы (■), 10% сорбита (o), 10% декстрозы (●), 20% глицерина (Δ), 0,05% tween 80 (A), 0,1% pluronic F68 (0): (а) сигнал CD при 208 нм; (c) интенсивность эмиссии ANS; (d) положение пика эмиссии ANS; и (b) термограмма DSC. Термические следы представляют среднюю величину 2 измерений, где каждая точка данных имела стандартную ошибку менее чем 0,5.

Фиг. 3. Исследования воздействий комбинаций растворенных веществ на термическую устойчивость анатоксина A (x) в присутствии 10% сорбита и 0,05% tween 80 (□), 10% декстрозы и 0,05% tween 80 (■), 10% сорбита, 10% декстрозы и 0,05% tween 80 (o), 10% декстрозы и 10% сорбита (●): (a) с мониторингом сигналом CD при 208 нм и (b) OD (оптическая плотность) 350 нм. Термические следы представляют среднюю величину 2 измерений, где каждая точка данных имела стандартную ошибку менее чем 0,05.

Фиг. 4. Исследования воздействий комбинаций растворенных веществ на термическую устойчивость анатоксина A (x) в присутствии 10% сорбита и 0,05% tween 80 (□), 10% декстрозы и 0,05% tween 80 (■), 10% сорбита, 10% декстрозы и 0,05% tween 80 (o), 10% декстрозы и 10% сорбита (●): (a) с мониторингом сигналом CD при 208 нм и (b) OD (оптическая плотность) 350 нм. Термические следы представляют среднюю величину 2 измерений, где каждая точка данных имела стандартную ошибку менее чем 0,05.

Фиг. 5. Исследования свойств tween 80 (□) в присутствии 10% декстрозы (■), 10% сорбита (o), 10% декстрозы и 10% сорбита (●) как функции температуры: сигнал CD при 208 нм 0,05% tween 80 (a) и 0,1% tween 80 (b); OD 350 нм для 0,05% tween 80 (c) и 0,1% tween 80 (d); гидродинамический диаметр и MSD (среднеквадратическое отклонение) на основании количества измерений (заштрихованный квадрат) и на основании логнормального количества измерений (заштрихованный ромб) для 0,05% tween 80 (e) и 0,1% tween 80 (f). Размеры >1 мкм неточные с учетом природы измерений DLS (темпа естественного искривления). Термические следы представляют среднюю величину 2 измерений, где каждая точка данных имела стандартную ошибку менее чем 0,5.

Фиг. 6. Исследования воздействия концентрации растворенных веществ на среднюю точку термического перехода (Tm) с мониторингом сигнала CD 208 нм для анатоксина A (a) и анатоксина B (b) в присутствии сорбита и 0,05% tween 80 (♦), декстрозы и 0,05% tween 80 (■), сорбита, декстрозы и 0,05% tween 80 (A), сорбита, декстрозы и 0,1% tween 80 (x), сорбита и декстрозы (0).

Фиг. 7. Гидродинамический диаметр как функция температуры для анатоксина A (a-c) и анатоксина B (d-f), где заштрихованные квадраты представляют диаметр MSD на основании количества измерений, и заштрихованные ромбы представляют диаметр на основании логнормального количества измерений. Размеры >1 мкм неточные с учетом природы измерений DLS. (a,d) один белок; (b,e) белок в присутствии 10% сорбита и 10% декстрозы; (c, f) белок в присутствии 10% сорбита, 10% декстрозы и 0,05% tween 80. Термические следы представляют среднюю величину 2 измерений, где каждая точка данных имела стандартную ошибку менее чем 0,5.

Фиг. 8. Исследования связывания Alhydrogel® (адъюванта гидроксида алюминия): (a) изотерма адсорбции и (b) изотерма адсорбции в присутствии 2 M NaCl для анатоксина A (0) и анатоксина B (▲).

Фиг. 9. Исследование вторичной структуры анатоксина A спектроскопией кругового дихроизма (CD) по диапазону pH от 5,5 до 7,5.

Фиг. 10. Исследование вторичной структуры анатоксина В спектроскопией кругового дихроизма (CD) по диапазону pH от 5,5 до 7,5.

Фиг. 11. Исследование температуры плавления анатоксина A спектроскопией кругового дихроизма (CD) по диапазону pH от 5,5 до 8,0.

Фиг. 12. Исследование температуры плавления анатоксина В спектроскопией кругового дихроизма (CD) по диапазону pH от 5,0 до 7,5.

Фиг. 13. Исследование агрегации при различных величинах рН с течением времени при фиксированной температуре хранения.

Фиг. 14. Исследование зависимой от соли агрегации анатоксина A при 37°C с течением времени.

Фиг. 15. Исследование зависимой от соли агрегации анатоксина В при 37°C с течением времени.

Фиг. 16. Исследование параметров лиофилизации вакцинных препаративных форм.

Подробное описание

Изобретение предоставляет композиции, включающие токсины и/или анатоксины Clostridium difficile и один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов, которые обеспечивают композициям благоприятные свойства. Например, и как описано ниже, эксципиенты, включенные в композиции по изобретению, могут привести к повышенной устойчивости одного или более анатоксиновых компонентов композиций и/или уменьшенной или отсроченной агрегации анатоксинов.

Анатоксины C. Difficile, которые могут быть включены в композиции по изобретению, могут быть получены с использованием любого из ряда способов, известных в данной области. Например, могут использоваться способы, включающие инактивацию формальдегидом (см., например, Kotloff et al., Infection and Immunity 69(2):988-995, 2001). Предпочтительно, композиции включают и анатоксин А, и анатоксин В, но композиции, включающие только один из этих анатоксинов, также включены в изобретение. Иллюстративный штамм C. Difficile, который может использоваться в качестве источника токсинов, представляет собой ATCC 43255 (VPI 10463). Анатоксины могут присутствовать в композициях в варьирующихся соотношениях, например, от 5:1 (A:B) до 1:5 (A:B). В определенных примерах, соотношения могут составлять 2:1, 3:1 или 3:2 (A:B). Общее количество анатоксина в композициях по изобретению может составлять, например, 100 нг - 1 мг, 100 нг - 500 мкг, 1-250 мкг, 10-100 мкг, 25-75 мкг или 50 мкг. Композиции могут необязательно храниться во флаконах в одной стандартной лекарственной форме.

Композиции по изобретению включают одно или более соединений, таких как, например, буферы (например, цитрат, фосфат, глицин, гистидин, карбонат или бикарбонат; 5-100 мМ; примеры цитратов, которые могут использоваться, включают цитрат натрия, калия, магния и цинка); агенты тоничности (например, маннит; 1-50 мМ); углеводороды, такие как сахара или сахарные спирты (например, сорбит, трегалоза или сахароза; 1-30%) или углеводородные полимеры (например, декстран и целлюлоза); аминокислоты, олигопептиды или полиаминокислоты (до 100 мМ); многоатомные спирты (например, глицерин, полиэтиленгликоли или их простые эфиры с молекулярной массой 200-10000 и концентрациями до 20%); детергенты, липиды или поверхностно-активные вещества (например, Tween 20, Tween 80 или pluronics, при концентрациях до 0,5%); антиоксиданты; соли (например, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид магния или ацетат магния, до 150 мМ); альбумин (например, человеческий сывороточный альбумин); желатины; формальдегид (0,001-0,02%); или их комбинации.

Примеры эксципиентов, которые могут использоваться в композициях по изобретению, включают те, которые перечислены ниже в таблицах 1, 2, 8 и 9. В различных примерах, эксципиенты могут представлять собой те, которые приводят к (i) увеличенной термической устойчивости (например, по меньшей мере, 0,5°C, например, 0,5-5°C, 1-4°C или 2-3°C), по данным измерения, например, анализами, описанными ниже (например, Дифференциальной сканирующей калориметрией (DSC)), и/или (ii) уменьшенной или отсроченной агрегации анатоксина A, анатоксина B, или и анатоксинов А, и В, например, 50% или более (например, 60% или более, 70% или более, 80% или более, 90% или более, 95% или более, 98% или более, 99% или более, или 100%), по данным измерения, например, описанными ниже анализами. В изобретение также включены композиции, включающие агрегаты анатоксинов.

Иллюстративные эксципиенты и буферы, таким образом, включают цитрат натрия (например, 0,01-0,2 M, например, 0,02-0,1 M), сахарозу (например, 1-20% или 5-10%), сорбит (например, 4-20% или 5-10%), трегалозу (например, 4-20% или 5-10%), tween 80 (например, 0,05-0,1%), диэтаноламин (например, 0,3 M), гистидин (например, 0,02-0,3 M)_, гуанидин (например, 0,3 M), декстрозу (например, 5-20%), глицерин (например, 20%), альбумин (например, 1-2,5%), лактозу (например, 10-20%), маннит (например, 10%), сахарозу (например, 5-20%), pluronic F-68 (например, 0,1%), 2-OH пропил β-CD (например, 5-10%), декстран T40 (например, 0,03-0,08 мг/мл), Brij (например, 0,01-0,1%), лизин (например, 0,3 M), Tween 20 (например, 0,01-0,05%) и аспарагиновую кислоту (например, 0,15 M) (см. таблицы 1, 2, 8 и 9). Эти эксципиенты могут использоваться в изобретении в концентрациях, перечисленных в таблицах. Альтернативно, количества могут варьироваться, например, в 0,1-10 раз, как известно в данной области. В композиции по изобретению могут быть также включены другие углеводороды, сахарные спирты, поверхностно-активные вещества и аминокислоты, которые известны в данной области.

Эксципиенты и буферы могут использоваться отдельно или в комбинации. В качестве примера комбинации, композиции могут включать цитрат натрия и сахарозу, которые, как было показано, обеспечивают благоприятные воздействия в отношении устойчивости анатоксина. Количества этих компонентов могут составлять, например, 10-30 мМ, 15-25 мМ или 20 мМ цитрата натрия; и 1-20% или 5-10% сахарозы. В дополнение к этим компонентам, такие композиции могут включать небольшое количество формальдегида, например, 0,001-0,020, 0,01-0,018 или 0,16% формальдегида. pH такой композиции может составлять, например, 5,5-8,0 или 6,5-7,5, и композиция может храниться, например, при 2-8°C, в жидкой или лиофилизированной форме. В вариантах этой композиции, цитрат натрия может быть замещен фосфатом натрия (10-30 мМ, 15-25 мМ или 20 мМ) и/или сахароза может быть замещена сорбитом (например, 4-20% или 5-10%), или трегалозой (например, 4-20% или 5-10%). В композицию включены другие варианта композиций и включают использование других перечисленных в настоящем описании компонентов. На основании изложенного выше, иллюстративная композиция по изобретению включает 20 мМ цитрата натрия, 5% сахарозы и 0,016% формальдегида, pH 7,5.

В другом примере, композиции включают сорбит, декстрозу и Tween 80, что представляет собой комбинацию, которая, как было показано, обеспечивает благоприятные воздействия в отношении агрегации и устойчивости (см. ниже). Количества этих компонентов могут составлять, например, 5-15%, 8-12% или 10% сорбита; 5-15%, 8-12% или 10% декстрозы; и 0,01-1%, 0,025-0,5% или 0,05-0,1% tween 80. Конкретный пример, в котором эти компоненты присутствуют в количестве 10% (сорбит и декстроза) и 0,05-0,1% tween 80), описан ниже. В другом примере, эксципиенты представляют собой декстрозу (10%) и сорбит (10%).

Композиции по изобретению могут храниться в жидкой или высушенной форме, причем последняя включает в качестве примеров форму лиофилизированного порошка, форму, высушенную замораживанием, форму, высушенную распылением, и форму, высушенную вспениванием. Таким образом, в дополнение к одному или более эксципиентов, как описано выше, композиции по изобретению могут включать жидкую среду (например, солевой раствор или воду), которая может быть забуферена, например, фосфатом натрия (например, 5 мМ), содержащим NaCl (например, 150 мМ). Иллюстративный диапазон pH композиций по изобретению составляет 5-10, например, 5-9, 5-8, 5,5-9, 6-7,5 или 6,5-7. Кроме того, композиции могут включать один или более стабилизирующих агентов. В других примерах, композиции представлены в лиофилизированной форме, и такие композиции могут восстанавливаться использованием жидкой среды (например, солевого раствора или воды) перед введением.

В дополнение к описанным выше анатоксинным или токсинным антигенам и эксципиенту (эксципиентам), композиции по изобретению могут необязательно включать один или более адъювантов. Адъюванты, которые могут применяться в изобретении, включают соединения алюминия, такие как гидроксид алюминия, фосфат алюминия и гидроксифосфат алюминия. Антиген может быть осажден соединением алюминия или адсорбирован на нем с использованием стандартных способов. В качестве конкретного примера, могут использоваться квасцы (например, Rehydragel LV®, Reheis, Inc., Berkeley Heights, New Jersey; например, до 2 мг AlOH/дозу, например, примерно 1,5 мг AlOH/дозу; Alhydrogel® (например, Alhydrogel® 2%; (адъювант в виде гидроксида алюминия)), Brenntag Biosectror, Frederickssund, Denmark (AlOH₃)). Количество используемого алюминия может составлять, например, 100-850 мкг/дозу, 200-600 мкг/дозу или 300-600 мкг/дозу.

Один подход к составлению композиции, включенный в настоящее изобретение, заключается во включении в состав вместе анатоксинов и эксципиентов, а затем добавлении адъюванта, такого как квасцовый адъювант, непосредственно перед введением. Было обнаружено, что этот подход увеличивает иммуногенность, как описано ниже. В другом подходе, адъювант включается в препаративную форму перед хранением (или в жидкой, или в лиофилизированной форме). Дополнительные адъюванты, которые могут использоваться в композициях и способах по изобретению, включают RIBI (ImmunoChem, Hamilton, MT), QS21 (Aquila), Bay (Bayer), и Polyphosphazene (Virus Research Institute, Cambridge, MA; WO 95/2415).

Изобретение также включает способы получения композиций, описанных в настоящей заявке, которые включают получение анатоксинов, как описано, например, Kotloff et al., Infection and Immunity 69(2):988-995, 2001, и объединение анатоксинов с одним или более эксципиентов. Как описано в настоящей заявке, используя стандартные способы составления фармацевтических композиций. Как описано выше, композиции могут храниться в жидкой или лиофилизированной форме. Лиофилизация может проводиться с использованием стандартных способов (см, примеры ниже), а лиофилизированный материал может восстанавливаться перед введением в стерильной жидкости (например, воде, солевом растворе или растворе, включающем любой желательный эксципиент(ы) с адъювантом или без него.

Кроме того, изобретение включает применение композиций при профилактике и лечении инфекции или заболевания, вызванного C. difficile. Таким образом, изобретение включает введение композиций по изобретению для предотвращения или лечения заболеваний, связанных с C. difficile (CDAD), таких как рецидивирующие CDAD, а также признаков CDAD, включая диарею (например, внутрибольничную диарею) и псевдомембранозный колит. Как известно в данной области, CDAD часто связано с лечением индивидуумов антибиотиками, таких как госпитализированные индивидуумы. Таким образом, способы лечения по изобретению могут использоваться при лечении таких пациентов. Кроме того, лечение в соответствии с изобретением может комбинироваться с лечением антибиотиком (например, ванкомицином и/или метронидазолом) и/или пассивной иммунотерапией (см., например, патент США № 6214341). Способы введения по изобретению могут также использоваться при генерировании иммуноглобулина C. difficile для использования при пассивной иммунизации пациентов (см., например, патент США № 6214341).

Изобретение также включает способы идентификации эксципиентов, которые могут использоваться для генерирования композиций, включающих токсины или анатоксины C. Difficile, которые имеют улучшенные свойства. Эти способы включают скрининговые анализы, такие как анализы, описанные ниже, которые облегчают идентификацию условий, приводящих к сниженной или отсроченной агрегации, и/или к увеличенной устойчивости одного или более токсинных и/или анатоксинных компонентов композиций. Эти способы включают анализы агрегации и анализы устойчивости, как описано ниже. Кроме того, изобретение включает использование других анализов для идентификации желательных препаративных форм, включающих анализы растворимости, иммуногенности и вязкости.

Композиции по изобретению могут вводиться, например, чрескожным (например, внутримышечным, внутривенным или внутрибрюшинным) путем в количествах и по схемам, определенным как целесообразные специалистами в данной области. Например, может вводиться 100 нг - 1 мг, 100 нг - 500 мкг, 10-100 мкг, 25-75 мкг или 50 мкг анатоксина. В целях профилактики или лечения, вакцина может вводиться, например, 1, 2, 3 или 4 раза. Когда вводятся множественные дозы, то они могут быть отделены друг от друга, например, периодом от одной недели до месяца. В другом примере, 4 дозы по 50 мкг каждая могут быть введены внутримышечно в течение любого восьминедельного периода.

Пример 1

Для идентификации условий, которые усиливают физическую устойчивость анатоксинов А и В Clostridium difficile, выполняли скрининг стабилизирующих соединений. Скрининг 30 GRAS (в целом расцениваемых как безопасные) соединений в различных концентрациях и в нескольких комбинациях выполняли в двух частях. Сначала, анализ агрегации с высокой пропускной способностью использовали для скрининга соединений, которые задерживают или предотвращают агрегацию анатоксинов в условиях стресса (анатоксины при рН 5-5,5 инкубировали при 55°C в течение 55 или 75 минут). Соединения, которые стабилизировали оба белка, далее исследовали для выявления их способности задерживать развертывание в условиях, ведущих к предположительно подобному нативному свернутому состоянию (рН 6,5). Мониторинг термической устойчивости анатоксинов на поверхности Alhydrogel^® (адъювант в виде гидроксида алюминия) проводили DSC, и также проявилось ее существенное повышение в присутствии определенных эксципиентов. Соединения, которые эффективно ингибировали агрегацию обоих анатоксинов, далее исследовали для выявления их способности усиливать структурную устойчивость белков. Для идентификации стабилизирующих агентов для связанных с адъювантами анатоксинов, выбранные эксципиенты далее исследовали для выявления их способности усиливать термическую устойчивость связанных с адъювантами анатоксинов. В заключение, в данном исследовании была собрана информация, относящаяся к поведению свободных и связанных с адъювантами анатоксинов в диапазоне условий (температур и растворенных веществ), которую можно использовать для создания фармацевтических препаративных форм с повышенной физической устойчивостью.

Экспериментальные материалы и методы

Материалы

Анатоксины А и В получали в высоко очищенной форме с использованием описанных выше способов (Kotloff et al., Infection and Immunity 69(2):988-995, 2001). Концентрацию белков определяли спектральной поглощающей способностью УФ при 280 нм с использованием единиц поглощающей способности 1,173 для анатоксина А и 0,967 для анатоксина В в концентрациях соответственно 1 мг/мл. Все использованные реагенты были аналитического сорта и были закуплены у компании Sigma (St. Louis, MO). Для скрининговых исследований эксципиентов использовали буфер фосфата натрия (5 мМ, рН 2,0, 5,5 и 6,5), содержащий 150 мМ NaCl. Для исследований с перемешиванием и адъювантом использовали буфер фосфата натрия (5 мМ, рН 6,5), содержащий 150 мМ NaCl. Для обмена буфера, белок диализировали при температуре в холодильнике, используя кассеты для диализа Slide-A-Lyzer^® Dialysis Cassettes, 10 кДа MWCO (Pierce, Rockford, IL).

Скрининговые исследования эксципиентов

Анализ агрегации. Скрининг приблизительно 30 GRAS (в целом расцениваемых как безопасные) соединений в 58 вариантах концентрации и в нескольких комбинациях выполняли для выявления их способности ингибировать агрегацию анатоксинов. Мониторинг агрегации белка проводили измерениями оптической плотности при 350 нм ((OD 350 nm) с использованием считывающего устройства 96-луночных планшетов (Spectra Max M5, Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Анализ агрегации выполняли при рН 5,5 для анатоксина А (1,2 мг/мл) и при рН 5,0 для анатоксина В (0,5 мг/мл) при 55°C. В этих условиях, белки частично развернуты и спонтанно ассоциируются. Таким образом, потенциально можно выявить любое стабилизирующее влияние эксципиентов, которые нарушают эти два процесса. Белок добавляли в лунки 96-луночного планшета, содержащие эксципиент(ы) с соответствующим рН, и образцы инкубировали при 55°C в течение 75 минут в случае анатоксина А и 55 минут для анатоксина В. Мониторинг оптической плотности растворов проводили при 350 нм через каждые 5 минут. Одновременно исследовали контроли растворов белка без добавления соединения и один буфер с эксципиентом (эксципиентами) («пустышки»). Измерения корригировали на эндогенное поведение буфера-эксципиента вычитанием «пустышки» перед анализом данных. Каждый образец оценивали в трех повторениях. Ингибирование агрегации в процентах рассчитывали, используя следующее выражение:

% ингибирования агрегации = 100 - [ $$\frac{\Delta O{D}_{350}(Е)}{\Delta O{D}_{350}(C)}$$ × 100],

где ΔOD₃₅₀ (E) представляет изменение OD 350 нм белка в присутствии эксципиента, ΔOD₃₅₀ (C) - изменение OD 350 нм белка без эксципиента (Peek et al., Journal of Pharmaceutical Sciences 96(l):44-60, 2006).

Исследования структурной устойчивости. Растворы анатоксина исследовали в концентрации 0,2 мг/мл для измерений CD и 0,1 мг/мл для анализа флюоресценции и УФ абсорбции. В этом диапазоне не наблюдалась зависимость от концентрации. Каждый образец оценивали в двух повторениях для обеспечения воспроизводимости измерений.

Спектроскопия кругового дихроизма (CD) в дальней УФ-области. Спектры CD получали, используя спектрополяриметр Jasco J-810, оборудованный регулятор температуры Peltier с 6 положениями. Спектры CD получали от 260-190 нм со скоростью сканирования 20 нм/минуту, накоплением 2 и временем реакции 2 секунды. Мониторинг сигнала CD при 208 нм проводили через каждые signal 0,5°C в диапазоне температур от 10 до 85°C, используя постепенно повышение температуры со скоростью 15°C/час, для исследования термических переходов (кривых плавления) белков (в герметично закрытых кюветах с длиной прохода 0,1 см). Сигнал CD превращали в молярную эллипсность с помощью программного обеспечения Jasco Spectral Manager. Температуру средней точки термического перехода получали по подгонке к сигмоиде кривых плавления с использованием программного обеспечения Origin.

Спектроскопия флюоресценцией ANS. Мониторинг доступности аполярных участков на белках проводили эмиссией флюоресценции экзогенного зонда 8-Анилин-1-нафталинсульфоната (ANS). Каждый образец содержал 20-кратный молярный избыток ANS к белку. Эмиссионные спектры собирали от 400 до 600 нм при размере шага 2 нм и времени интеграции 1 секунда после возбуждения ANS при 372 нм. Эмиссионные спектры собирали через каждые 2,5°C с 5 минутами уравновешивания в диапазоне температур от 10 до 85°C. Исходную величину ANS-буфера при каждом соответствующем рН вычитали из эмиссионных спектров неочищенного материала. Положения пиков спектров эмиссии получали по полиномиальным подгонкам с использованием программного обеспечения Origin.

Высокоразрешающая спектроскопия УФ спектральной поглощательной способности. Спектры высокоразрешающей УФ спектральной поглощательной способности получали, используя спектрофотометр УФ-видимого спектра Agilent 8453. Агрегацию белков исследовали мониторингом OD при 350 нм через каждые 2,5°C в диапазоне температур от 10 до 85°C с 5-минутной инкубацией (достаточной для достижения равновесия) при каждой температуре.

Динамическое рассеивание света. Средний гидродинамический диаметр белков при pH 6,5 (отдельно и в присутствии эксципиентов) анализировали, используя прибор для измерения динамического рассеивания света (Brookhaven Instrument Corp., Holtzille, NY). Прибор был оборудован лазером 50 мВт с накачкой светодиодами (λ=532 нм), и мониторинг рассеивания света проводили под углом 90° к падающему пучку лучей. Функции аутокорреляции генерировали, используя цифровой автокорректор (BI-9000AT). Гидродинамический диаметр рассчитывали по коэффициенту диффузии уравнением Стокса-Эйнштейна с использованием способа накопителей (на основе логнормального числа). Данные подгоняли к не отрицательно ограниченному минимальному квадратическому алгоритму для получения мультимодальных распределений (MSD). Прибор был оборудован водяной баней с циркулирующей водой регулируемой температуры RTEl 11 (Neslab, Newington, NH), и мониторинг гидродинамического диаметра проводили по диапазону температур от 10 до 85°C.

Дифференциальная сканирующая калориметрия (DSC). DSC выполняли, используя устройство MicroCal VPDSC с приспособлением для автоматического отбора проб (MicroCal, LLC; Northampton, MA). Термограммы анатоксинов (0,5 мг/мл) отдельно и в присутствии эксципиента (эксципиентов) получали по диапазону температур 10-90°C, используя скорость сканирования 60°C/час. Заполненные ячейки уравновешивали в течение 15 минут при 10°C перед началом сканирования. Термограммы одного буфера вычитали из скана каждого белка перед анализом.

Исследования перемешивания. Растворы анатоксина в концентрации 0,4 мг/мл исследовали в присутствии и отсутствие эксципиентов. Белковые образцы (0,4 мл) помещали в 1,5 мл центрифужные пробирки и встряхивали в ротаторе (Thermomixer R, Eppendorf AG, Hamburg, Germany) при 200 об/мин в течение 72 часов при постоянной температуре 4°C. Концентрацию белка и OD при 350 нм измеряли перед и после вращения для оценки адсорбции к стенкам сосуда и агрегации. Образцы центрифугировали в течение 10 минут при скорости 10000×g при 4°C, и концентрацию и OD при 350 нм супернатанта измеряли для выявления образования нерастворимых агрегатов. Структуры белков оценивали CD. Каждый образец измеряли в двух повторениях.

Исследования адъювантов

Адсорбция к гидроксиду алюминия (Alhydroger®) (адъюванту в виде гидроксида алюминия). Способность анатоксинов адсорбироваться к Alhydrogel^® (Brenntag Biosectror, Frederickssund, Denmark; адъюванту в виде гидроксида алюминия) в различных концентрациях (0,025-1 мг/мл) определяли построением изотермы связывания. Растворы белка в присутствии 0,4 мг/мл Alhydrogel^® (адъюванта в виде гидроксида алюминия) обрабатывали в барабане трубчатого ротатора с соединением трубок конец в конец при температуре в холодильнике в течение 20 минут. Образцы центрифугировали при 14000×g в течение 30 секунд для осаждения адъюванта. Величину концентрации белка, остающегося в супернатантах, использовали для построения кривых связывания. Способность белка связываться с Alhydrogel^® (адъювантом в виде гидроксида алюминия) в присутствии эксципиентов определяли такой же процедурой. В этом случае, Alhydrogel^® (адъювант в виде гидроксида алюминия) добавляли к раствору белка-эксципиента.

Десорбция анатоксинов от Alhydrogel ^® (адъювант в виде гидроксида алюминия). Десорбцию анатоксинов от Alhydrogel^® (адъюванта в виде гидроксида алюминия) оценивали в присутствии NaCl. Лепешки осадка анатоксина Alhydrogel^® (адъювант в виде гидроксида алюминия) получали, как описано выше. Лепешки промывали буфером (pH 6,5) для удаления белка, присутствовавшего в супернатанте, перед добавлением раствора NaCl. Растворы Alhydrogel^® (адъюванта в виде гидроксида алюминия) обрабатывали в барабане трубчатого ротатора с соединением трубок конец в конец при температуре в холодильнике в течение 20 минут. Образцы центрифугировали при 14000×g в течение 30 секунд для осаждения адъюванта. Величину концентрации белка, остающегося в супернатантах, использовали для построения кривых изотерм десорбции.

Устойчивость анатоксинов, связанных с Alhydrogel ^® (адъювантом в виде гидроксида алюминия). Мониторинг термической устойчивости анатоксинов, связанных с Alhydrogel^® (адъювантом в виде гидроксида алюминия), проводили DSC с использованием устройства MicroCal VP-AutoDSC (MicroCal, LLC, Northampton, MA). Анатоксины в концентрации 0,5 мг/мл связывали с 0,4 мг/мл Alhydrogel^® (адъюванта в виде гидроксида алюминия) процедурой, описанной выше. Термограммы анатоксинов были получены при температурах от 10 до 90°C при скорости сканирования 60°C/час. Образцы уравновешивали в течение 15 минут при 10°C перед каждым сканом. Термограммы Alhydrogel^® (адъюванта в виде гидроксида алюминия) отдельно вычитали из каждого скана белка/адъюванта перед анализом.

Результаты и обсуждение

Скрининговые исследования эксципиентов

Для исследования способности соединений GRAS предотвратить/отсрочить агрегацию, анатоксины инкубировали отдельно и в присутствии эксципиентов в условиях стресса (инкубация при 55°C). Мониторинг агрегации анатоксинов проводили при высокой пропускной способности путем мониторинга изменений OD при 350 нм в течение времени инкубации. Изменения мутности далее использовали для расчета % ингибирования агрегации и суммированы в таблице 1 для анатоксина А и таблице 2 для анатоксина В.

Анализы агрегации с высокой пропускной способностью анатоксина А обнаружили, что более половины эксципиентов или задерживали, или предотвращали увеличение OD 350 нм с течением времени и вели к ингибированию агрегации на 90% или более (таблица 1). Среди исследованных эксципиентов, 2,5% альбумин, 2,5% α-циклодекстрин, 0,1% tween 80, 0,3 M гистидин и 0,3 M лизин немедленно привели к высоким величинам OD 350 нм, что свидетельствует о том, что анатоксин А нерастворим в этих условиях. Агрегация анатоксина А также значительно увеличивалась в присутствии 16 других эксципиентов, среди которых особенно мощными были смесь 25 и 50 мМ аргинина/глутамина, 0,3 M аргинина и 0,3 M пролина.

Ингибирование агрегации анатоксина В на 90% или более происходило в присутствии 15 эксципиентов (таблица 2). Присутствие 0,3 M гистидина или 0,2 M цитрата натрия вела к немедленно высокой OD при 350 нм. Другие 20 соединений более постепенно вызывали агрегацию в течение времени мониторинга. Крайне высокие увеличения OD при 350 нм наблюдались в присутствии 0,015 M хлорида кальция, 0,15 M аскорбиновой кислоты и 0,3 M аргинина.

Во многих случаях, те же эксципиенты содействовали агрегации обоих анатоксинов (таблицы 1 и 2). Напротив, 5% 2-OH пропил γ-CD, 0,01% и 0,1% tween 20, 0,15 M аспарагиновая кислота и 0,3 M гуанидин содействовали агрегации одного анатоксина В. Кроме того, агрегация в присутствии 0,015 M хлорида кальция была гораздо больше для анатоксина В, чем анатоксина А. Это может быть связано с известной повышенной термической устойчивостью С-концевого домена токсина А в присутствии хлорида кальция (Demarest et al., Journal of Molecular Biology 346(5): 1 197-1206, 2005). Различия между анатоксинами в их реакциях на вызванную растворенными веществами агрегацию, предположительно связано со структурными различиями между соответствующими токсинами (Warny et al., Lancet 366(9491): 1079-1084, 2005; Just et al., Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology 152:23-47, 2005). Отсутствие инозитолфосфатов среди исследованных соединений свидетельствует о том, что наблюдавшаяся агрегация анатоксинов не вовлекает аутокаталитическое расщепление (Reineke et al., Nature (London, United Kingdom) 446(7134):415-419, 2007). Большинство исследованных углеводородов, детергентов и циклодекстринов ингибировали агрегацию анатоксинов. Было обнаружено, что следующие эксципиенты эффективно ингибируют агрегацию обоих анатоксинов: 20% трегалоза, 20% сахароза, 10% сорбит, 10% декстроза и 20% глицерин.

Указанные выше углеводороды, сорбит, глицерин и два поверхностно-активных вещества (0,05%/0,1% Tween 80 и 0,1% pluronic F-68) далее исследовали на их способность стабилизировать вторичную и третичную структуру белков при pH 6,5 путем мониторинга флюоресценции ANS, изменений сигналов CD после нагревания, и DSC (Фиг. 1 и 2). Анатоксин А в присутствии 20% сахарозы и 20% трегалозы вызывал раннее начало изменения вторичной структуры, тогда как остальные эксципиенты задерживали термический переход ~2°C (Фиг. 1a). К удивлению, анатоксин В проявлял более раннее начало изменения вторичной структуры только в присутствии 20% сахарозы, хотя остальные эксципиенты задерживали термический переход ~1°C (Фиг. 2a). Раннее начало изменения вторичной структуры анатоксинов в присутствии трегалозы и/или сахарозы могло бы объясняться стабилизацией растворенными веществами частично развернутого состояния (состояний). Кроме того, нельзя исключить возможность того, что анатоксины частично разворачиваются полисахаридами после связывания с повторами их С-концевой последовательности распознавания углеводородов (Greco et al., Nature Structural & Molecular Biology 3(5):460-461, 2006). В случае структурной дестабилизации вторым механизмом, различие поведения двух анатоксинов в присутствии трегалозы могло быть связано со структурными различиями между анатоксинами (С-концевой домен имеет 30 повторов в анатоксине А и 19 повторов в анатоксине В; Just et al., Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology 152:23-47, 2005). Интересно отметить, что моносахарид (декстроза) оказывала стабилизирующий эффект на вторичную структуру обоих анатоксинов. Присутствие соединений не влияло на вызванное температурой разворачивание обоих анатоксинов и ассоциированное связывание ANS (Фиг. 1b, 2b). Мониторинг воздействия детергентов на вызванное температурой разворачивание анатоксинов проводили DSC, и оно не представляется значительным (Фиг. 1c, 2c, и таблица 3). Эти наблюдения свидетельствуют о том, что эксципиенты не сильно стабилизируют структуру анатоксинов достаточно детально описанным механизмом предпочтительного исключения, а скорее ингибируют их агрегацию другими механизмами, такими как прямое блокирование взаимодействий между белками, которые ответственны за ассоциацию белков (Timasheff, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99(15):9721-9726, 2002; Timasheff, Advances in Protein Chemistry 51 (Linkage Thermodynamics of Macromolecular Interactions):355-432, 1998).

Для исследования воздействия комбинации более активных агентов на вторичную структуру, результаты использования смеси сорбита, декстрозы и Tween 80 характеризовали мониторингом термических переходов анатоксинов CD и агрегацией OD при 350 нм (Фиг. 3 и 4). Нагревание растворов Tween 80 (0,05% или 0,1%) отдельно или в присутствии сорбита и/или декстрозы приводило к изменениям их мицеллярной структуры, которые проявлялись уменьшением сигнала CD и увеличивали рассеивание света, по данным мониторинга OD при 350 нм (Фиг. 5). Концентрация эксципиентов оказывала приблизительно линейный эффект на температуру термических переходов (фиг. 6). Это подтверждает гипотезу, что эксципиенты предотвращают агрегацию прямым ингибированием ассоциации белка. Воздействия эксципиентов на термический переход суммированы в таблицах 4 и 5. Комбинация 10% декстрозы и 10% сорбита в присутствии или отсутствие 0,05% Tween 80 имеет тенденцию отсрочки достижения средней точки термического перехода обоих анатоксинов в самой большой степени (~4°C для анатоксина A и ~10°C для анатоксина B) (Фиг. 3). Это можно объяснить или синергическим эффектом, и/или более высокой общей концентрацией стабилизирующих соединений. В случае анатоксина В, достижение температуры начала перехода не задерживалось в присутствии комбинации агентов, но происходила значительная задержка достижения средней точки термического перехода. Это могло быть связано с более постепенным разворачиванием анатоксина В в присутствии двух или более эксципиентов. Анатоксин А проявлял значительную задержку агрегации (с мониторингом OD при 350 нм) в присутствии стабилизирующих соединений (фиг. 4a). Мониторинг гидродинамического диаметра анатоксинов в присутствии и отсутствие эксципиентов также проводили DLS (Фиг. 7). Анатоксин А проявлял отсроченное начало ранее наблюдавшегося увеличения гидродинамического диаметра в присутствии эксципиентов (Фиг. 7 a-c), тогда как меньший эффект наблюдался при анатоксине В (Фиг. 7 d-f). Эти наблюдения свидетельствуют о том, что определенная комбинация потенциальных тестированных эксципиентов вакцины стабилизирует белковую структуру и механизмом предпочтительной гидратации, и прямым ингибированием белковой ассоциации. Применение таких стабилизирующих соединений могли потенциально увеличить физическую устойчивость анатоксинов во время хранения.

Исследования перемешивания

Воздействие перемешивания на физическую устойчивость анатоксина исследовали мониторингом адсорбции белка к стенкам флаконов для хранения, образованием нерастворимых агрегатов и изменениями термической устойчивости белка. Незначительное изменение концентрации белка, OD при 350 нм и расплавов CD в присутствии и отсутствие эксципиентов указывало на то, что анатоксины не подвергаются большим физическим изменениям после приложения этого стресса на основе перемешивания.

Исследования адъювантов

Изотермы связывания адъювантов выявили, что анатоксины эффективно связываются с Alhydrogel^® (адъюванта в виде гидроксида алюминия) при низких концентрациях при связывании, насыщаемом при более высокой концентрации белка (Фиг. 8а). Анатоксины в концентрации 0,5 мг/мл на 95% или более связаны с Alhydrogel^® (адъювантом в виде гидроксида алюминия), что обеспечивает возможность применения DSC для непосредственного мониторинга устойчивости белка на поверхности адъюванта. Отсутствие десорбции анатоксинов после добавления 2 M NaCl указывает на то, что взаимодействие анатоксинов с Alhydrogel^® (адъювантом в виде гидроксида алюминия) не является исключительно электростатическим, как часто наблюдается при взаимодействиях белка/гидроксида алюминия (Фиг. 8b; Gupta et al., Pharmaceutical Biotechnology 6:229-248, 1995; Seeber et al., Vaccine 9(3):201-203, 1991; White et al., Developments in Biologicals (Basel, Switzerland) 103 (Physico-Chemical Procedures for the Characterization of Vaccines):217-228, 2000).

После связывания с Alhydrogel^® (адъювантом в виде гидроксида алюминия), анатоксин А не проявляет выявляемого изменения его термической устойчивости, тогда как связанный с адъювантом анатоксин В демонстрирует снижение Tm (температуры плавления) ~1,4°C. Фракция Alhydrogel^® (адъюванта в виде гидроксида алюминия), связанная с анатоксином, несколько снижается в присутствии большинства эксципиентов (таблицы 6 и 7). Это свидетельствует о том, что эксципиенты частично вмешиваются в связывания анатоксинов с Alhydrogel^® (адъювантом в виде гидроксида алюминия), вероятно, прямым взаимодействием или с белком, и/или с адъювантом. Термическая устойчивость белков, связанных с Alhydrogel^® (адъювантом в виде гидроксида алюминия), в присутствии и отсутствие эксципиентов суммирована в таблице 6 для анатоксина А и таблице 7 для анатоксина В. Присутствие эксципиентов нарушало термическую устойчивость связанных с адъювантом анатоксинов или уменьшением, или увеличением температуры перехода. Снижение термической устойчивости наблюдалось у обоих анатоксинов в присутствии 10% сорбита, тогда как присутствие 10% сорбита и 10% декстрозы снижает термическую устойчивость одного анатоксина В. Кроме того, Tween 80 оказывал стабилизирующий эффект только в случае связанного с адъювантом анатоксина В. С другой стороны, декстроза (10%) оказывала стабилизирующий эффект на термическую устойчивость обоих анатоксинов. Интересно, что комбинация трех эксципиентов (10% сорбита, 10% декстрозы с 0,05% или 0,1% Tween 80) имеет тенденцию подъема термического перехода обоих связанных с адъювантом анатоксинов на 3-4°C.

Выводы

Систематический скрининг стабилизаторов привел к идентификации эксципиентов, которые улучшали термическую устойчивость А и В анатоксинов Clostridium difficile. Исследование анатоксинов, связанных с Alhydrogel^® (адъювантом в виде гидроксида алюминия), в присутствии выбранных эксципиентов, выявило условия, которые обеспечивали улучшенную физическую устойчивость связанных с адъювантом белков. Это исследование также обеспечило информацию, касающуюся физического поведения анатоксинов в диапазоне условий (температуры, растворенных веществ), которые могут использоваться для составления препаративных форм с повышенной устойчивостью при хранении.

Пример II

Дополнительные изменения в составление вакцины анатоксина C. difficile toxoid исследовали с попыткой улучшения профилей устойчивости и иммуногенности вакцины. Преклинические и клинические данные, полученные к настоящему времени с использованием вакцины, указывают на то, что профили увеличенной устойчивости и иммуногенности были бы важны для поддержки будущих клинических исследований.

pH

Определение pH, который дает максимальную устойчивость, было частью усилий по улучшению составления композиции вакцины. Исследования выполняли на жидких образцах, хранившихся при -65°C, 5°C, 25°C и 37°C в течение периода времени до 28 дней при рН в диапазоне от 5,5 до 7,5. Следующие способы использовали для установления профиля устойчивости:

1. Спектроскопия кругового дихроизма (CD) (изменения вторичной структуры),

2. Спектроскопия кругового дихроизма (CD) (изменения температуры плавления, T_m), и

3. Спектрофотометрия (OD_{350 нм}) и SEC-HPLC (хроматография с исключением по размеру - высокоэффективная жидкостная хроматография) (образование агрегатов).

Не было изменения вторичной структуры, наблюдавшейся в спектре CD, для анатоксина А при рН выше 6,0, и для анатоксина В по всему испытанному диапазону рН (Фиг. 9 и фиг. 10; Salnikova et al., J. Pharm. Sci. 97(9):3735-3752, 2008). Данные по точке плавления, полученные по измерениям CD, выявили, что максимальная устойчивость обоих анатоксинов достигается при рН более чем 7,0 (Фиг. 11 и фиг. 12).

Состояния агрегации анатоксинов А и В по диапазону рН от 6 до 7,5 мало варьировалось в диапазоне ≤60°C при анализе образования агрегатов (% мономера) с использованием SEC-HPLC и % площади извлечения. Однако различия состояния агрегации стали более очевидными по диапазону рН, когда температуры поднимались (в частности, выше 5°C), причем самые низкие величины рН имели тенденцию к большим сдвигам уровней агрегации. Это сопровождается увеличением оптической плотности при 350 нм при более низких величинах рН, как описано в публикации Salnikova et al., J. Pharm. Sci. 97(9):3735-3752, 2008.

Когда агрегацию оценивали при различных величинах рН в течение времени при фиксированной температуре хранения (≤60°C) (фиг. 13), результаты снова указали на то, что состояния агрегации были очень стабильными при сверх низких температурах с предположением, что агрегации содействовали более низкие уровни рН (<рН 7,0). С учетом этих данных, номинальный рН для хранения основного количества вакцины был установлен на 7,5.

Ионная сила

Определение ионной силы, которая дает максимальную устойчивость, было также частью усилий по улучшению составления композиции. Исследования выполняли на жидких образцах, удерживаемых при -65°C, 5°C, 25°C и 37°C в течение периода времени до 28 дней в буфере 20 мМ цитрата натрия при рН 7,25 с вариабельными концентрациями (0-300 мМ) хлорида натрия. Способы, используемые для установления профиля устойчивости, представляли собой SEC-HPLC, SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) и визуальный внешний вид.

Использование SDS-PAGE или визуального внешнего вида не могло выявить отчетливое различие. SEC-HPLC ясно показала агрегацию анатоксина В при более высоких концентрациях соли. Представлялось, что агрегация в анатоксине А зависит от времени и температуры, причем единственный заметный эффект наблюдается при 50 мМ NaCl. Эти данные указывают на то, что для достижения максимальной устойчивости анатоксинов следует добавлять 0-50 мМ хлорида натрия или 5% сахарозу (фиг. 14 и фиг. 15).

Замена буфера и добавление эксципиентов

Предварительное исследование выполняли для оценки воздействия буфера и эксципиента на устойчивость анатоксинов. Данные, полученные при использовании HPLC-SEC, продемонстрировали, что буфер цитрата натрия с сорбитом в качестве эксципиента обеспечивал наибольшую устойчивость, по данным определения процентного извлечения анатоксинов с течением времени, как показано в таблице 8 и таблице 9.

Оценка лиофилизированных препаратов

Для выбора лиофилизированной препаративной формы, которая была бы устойчивой, для фазы II клинических испытаний, заявители использовали анализ иммуногенности у хомяков, потому что именно в преклиническом анализе демонстрируется самая высокая чувствительность к изменениям продукта, которые связаны с клинической иммуногенностью. Данные предварительных исследований привели к скрининговому исследованию эксципиентов на основе цитрата натрия в качестве сорбита и сорбита в качестве стабилизирующего эксципиента. Сахарозу вводили в качестве стабилизирующего эксципиента как замещение сорбита в лиофилизированной препаративной форме ввиду низкой Tg' (температуры стеклования) и длительных периодов времени лиофилизации, наблюдавшихся в препаративных формах сорбита. Второе скрининговое исследование лиофилизации/эксципиента также выполняли с использованием буфера фосфата калия и трегалозы на основании данных параллельного исследования. В результате этих исследований и данных предыдущих экспериментов, возникли три ведущие препаративные формы.

Получали лиофилизированные препаративные формы и их устойчивость оценивали в условиях реального времени и ускоренного метода. Анатоксины А и В хранили отдельно для более тщательного исследования их индивидуальных профилей устойчивости. Ниже представлены данные внешнего вида и данные иммуногенности у хомяков по одной препаративной форме (лиофилизированной, 20 мМ цитрата, 5% сахарозы, 0,016% формальдегида, рН 7,5) после хранения при -65,5 или 42°C в течение трех месяцев. В начале исследования и после хранения при -65,5 или 42°C в течение 3 месяцев наблюдались незначительные или отсутствующие различия внешнего вида между препаративными формами (таблица 10 и таблица 11). Кроме того, иммунный ответ хомяков значимо не различается между препаративными формами, хранившимися при 5° и 42°C в течение 7 месяцев, или между одинаковыми препаративными формами с формальдегидом или без него. Хранение при 42°C представляет собой очень напряженное условие и, ввиду того, что во время хранения не наблюдается изменение, результаты свидетельствуют о том, что препаративная форма вероятнее всего будет устойчива в течение значительно более длительного периода при более низкой температуре. Однако статистически достоверный анализ данных, предназначенный для оценки устойчивости при хранении, требует, чтобы наблюдалось некоторое количественно определяемое изменение с тем, чтобы можно было рассчитать его скорость. Поскольку к настоящему времени не наблюдается изменение, нельзя рассчитать его действительную скорость. В свете этих данных, заявители планируют использование составления лиофилизированного лекарственного продукта, состоящего из анатоксинов А и В C. difficile в 20 мМ цитрата, 5% сахарозы, 0,016% формальдегида, pH 7,5, хранящегося при 2-8°C.

Препаративные формы, использованные в исследованиях устойчивости, детально описанные в настоящем сообщении, были получены с использованием цикла лиофилизиации, суммированного в таблице 12. Этот цикл обеспечивал получение твердых, белых, аккуратных лепешек, но находился на самом краю завершения первичной сушки, по данным определения вакуумным считыванием Пирани, уменьшающимся до равного манометрическому вакуумному считыванию (фиг. 16). Следующие критические изменения были внесены в цикл лиофилизации для обращения к этой озабоченности и создания более масштабируемого способа:

1. Температуру хранения снижали до -35°C для обеспечения того, что лекарственная субстанция оставалась замороженной во время первичной сушки в большем масштабе,

2. Первичную сушку удлиняли до 4000 минут для обеспечения завершения первичной сушки в большем масштабе, и

3. Вакуум увеличивали до 100 мТ для осуществления сушки и обеспечения возможности более масштабного способа.

Цикл лиофилизации, перенесенный в Althea Technologies, Inc., для переработки клинических лотов в соответствии с GMP (должной медицинской практикой) описан в таблице 13.

Резюме физико-химических и биологических свойств

Ниже суммированы экспериментально определенные ключевые физико-химические и биологические свойства вакцины.

Химически, вакцина состоит из инактивированных форм (анатоксинов) токсинов А и В C. Difficile, присутствующих соответственно в соотношении 3:2. Токсины А и В C. difficile представляют собой крупные белки, соответственно 308 кДа и 270 кДа, которые похожи, но при этом различны по структуре.

Физически, вакцина представлена в виде раствора с чистотой ≥90% без данных о наличии измеряемой агрегации.

Биохимически, анатоксины А и В вакцины иммунологически реактивны с их соответствующими антителами, специфичными к анатоксину А или В, при анализе вестерн-блоттинга.

Биологически, вакцина является иммуногенной у хомяков, вызывая последовательные и зависимые от дозы реакции сывороточных антител. Анатоксины А и В вакцины лишены цитотоксической активности. Компонент анатоксина А вакцины сохраняет некоторую активность связывания с рецепторами, подобную той, которая наблюдается для нативного токсина А.

Вакцина представлена в лиофилизированной форме в буфере, составленном из 20 мМ цитрата натрия, рН 7,5, 5,5% сахарозы, 0,016% формальдегида. Продукт хранится при 2-8°C.

Скрининговые исследования лиофилизации

Для скрининга лиофилизированных препаративных форм для оценки использовали иммуногенность хомяков. Лиофилизация происходила в FTS LyoStar II. Замораживание осуществлялось снижением температуры хранения до уровня, достаточно низкого для принуждения к снижению температуры продукта ниже Tg'. Первичная сушка начиналась созданием вакуума и его удерживанием до тех пор пока не будет сублимирована свободная вода. Затем температуру хранения увеличивали для начала вторичной сушки и удерживали для дальнейшей сушки продукта отводом адсорбированной воды. Устойчивость препаративных форм определяли при хранении в условиях температуры 5, 25 и 42°C.

Таблица 1 Воздействие эксципиентов GRAS на агрегацию анатоксина А. Соединения, которые задерживают/предотвращают агрегацию, имеют положительный % величин ингибирования агрегации; соединения, которые вызывают агрегацию, имеют отрицательный % величин ингибирования агрегации Эксципиент,
концентрация % ингибирования
агрегации Эксципиент,
концентрация % ингибирования
агрегации Альбумин 2,5% 103* Глицерин 10% 88 α Циклодекстрин 2,5% 101* 2-OH пропил γ-CD 10% 81 Tween 80 - 0,1% 100* Tween 20 - 0,05% 73 Диэтаноламин 0,3 М 100 Tween 80 - 0,05% 67 Цитрат натрия 0,1 М 100 Аспарагиновая кислота 0,15 М 65

Сорбит 10% 100 Tween 20 - 0,1% 64 Гистидин 0,3 М 100* Pluronic F - 68 0,05% 50 Сахароза 10% 100 Tween 20 - 0,01% 37 Трегалоза 10% 100 Декстран сульфат 0,04 мг/мл 30 Гуанидин 0,3 М 99 Brij 35 0,05% 26 Сорбит 20% 99 Декстран сульфат 0,004 мг/мл 16 Декстроза 20% 99 2-OH пропил γ-CD 5% 10 Декстроза 10% 99 Альбумин 5% 9 Трегалоза 20% 99 Brij 35 0,01% -2 Цитрат натрия 0,2 М 99 Хлорид кальция 0,015 М -7 Глицерин 20% 98 Pluronic F-68 0,01% -14 Tween 80 - 0,01% 98 Желатин 5% -46 Альбумин 1% 98 Яблочная кислота 0,15 М -52

Лактоза 20% 98 Молочная кислота 0,15 М -72 Манит 10% 97 Желатин 2,5% -74 Сахароза 20% 97 Глутаминовая кислота 0,15 М -77 Pluronic F-68 0,1% 96 Декстран Т40 0,003 мг/мл -87 2-OH пропил β-CD 10% 96 Глицин 0,3 М -88 2-OH пропил β-CD 5% 96 Декстран сульфат 0,1 мг/мл -88 Декстран Т40 0,08 мг/мл 95 Аскорбиновая кислота 0,15 М -99 Brij 35 0,1% 95 Пролин 0,3 М -112 Декстран Т40 0,03 мг/мл 93 Аргинин 0,3 М -265 Лактоза 10% 92 Arg/Glu 50 мМ каждый -426 Лизин 0,3 М 89* Arg/Glu 25 мМ каждый -463 Погрешности находятся в пределах порядка ±1%.
*Высокая начальная OD при 350 нм.

Таблица 2 Воздействие эксципиентов GRAS на агрегацию анатоксина В. Соединения, которые задерживают/предотвращают агрегацию, имеют положительный % величин ингибирования агрегации; соединения, которые вызывают агрегацию, имеют отрицательный
% величин ингибирования агрегации Эксципиент,
концентрация % ингибирования
агрегации Эксципиент,
концентрация % ингибирования
агрегации α Циклодекстрин 2,5% 100 Декстран Т40 0,03 мг/мл 35 Гистидин 0,3 М 100* Декстран Т40 0,08 мг/мл 25 Tween 80 - 0,1% 100 2-OH пропил γ-CD 10% 12 Tween 80 - 0,05% 100 Brij 35 0,05% 10 Альбумин 1% 99 Pluronic F - 68 0,05% 6 Декстроза 20% 99 Глицерин 10% 4 Альбумин 5% 98 Декстран сульфат 0,04 мг/мл 3 Цитрат натрия 0,2 М 98* Декстран сульфат 0,004 мг/мл 2

Трегалоза 20% 98 Tween 20 - 0,05% 0 Цитрат натрия 0,1 М 97 2-OH пропил γ-CD 5% -5 Сорбит 20% 97 Tween 20 - 0,01% -5 Сахароза 20% 96 Pluronic
F-68 0,01% -8 Диэтаноламин 0,3 М 96 Tween 20 - 0,1% -13 Декстроза 10% 95 Brij 35 0,01% -25 Сорбит 10% 92 Глицин 0,3 М -26 Альбумин 2,5% 87 Желатин 2,5% -36 2-OH пропил β-CD 5% 79 Декстран сульфат 0,1 мг/мл -38 2-OH пропил β-CD 10% 78 Arg/Glu 50 мМ каждый -39 Маннит 10% 76 Глутаминовая кислота 0,15 М -41 Сахароза 10% 71 Arg/Glu 25 мМ каждый -42 Глицерин 20% 71 Аспарагиновая кислота 0,15 М -50 Трегалоза 10% 69 Желатин 5% -56 Pluronic F - 68 0,01% 68 Пролин 0,3 М -57 Brij 35 0,1% 63 Декстран Т40 0,003 мг/мл -59 Лактоза 20% 52 Молочная кислота 0,15 М -80 Яблочная кислота 0,15 М 44 Гуанидин 0,3 М -96 Tween 80 - 0,01% 40 Хлорид кальция 0,015 М -141 Лактоза 10% 39 Аскорбиновая кислота 0,15 М -223 Лизин 0,3 М 37 Аргинин 0,3 М -280 Погрешности находятся в пределах порядка ±1%.
*Высокая начальная OD при 350 нм

Таблица 3 Воздействие растворенных веществ (детергентов) на термическую устойчивость анатоксина А и В. Мониторинг термической устойчивости ™ проводили DSC. Tm представляет температуру, соответствующую положению максимального пика термического перехода Белок Tm (°С) Анатоксин А 59,8±0,0 Анатоксин А+0,05% tween 80 59,1±0,4 Анатоксин А+0,1% pluronic F68 59,1±0,4 Анатоксин B 55,8±0,0 Анатоксин B + 0,05% tween 80 56,1±0,3 Анатоксин B + 0,1% pluronic F68 58,1±0,3

Таблица 4 Воздействие эксципиентов на среднюю точку температуры термического перехода ™ анатоксина А. Мониторинг термического перехода осуществляли сигналом CD при 208 нм в качестве функции температуры. Каждое измерение проводится в двух повторениях и имеет погрешность ≈0,5°С Анатоксин А в присутствии эесципиента (эксципиентов) Tm Различие Tm Анатоксин А 59,8 0,0 20% трегалоза 59,4 -0,5 20% сахароза 63,1 3,3 20% глицерин 62,4 2,6 0,1% pluronic F68 61,1 1,3 10% сорбит 62,4 2,6 10% декстроза 62,4 2,6 0,05% Tween 80 59,9 0,0 5% сорбит + 0,05% Tween 80 60,4 0,6 10% сорбит + 0,05% Tween 80 62,3 2,5 15% сорбит + 0,05% Tween 80 62,4 2,6 5% декстроза + 0,05% Tween 80 60,2 0,4 10% декстроза + 0,05% Tween 80 62,3 2,5 15% декстроза + 0,05% Tween 80 62,5 2,7 2,5% сорбит + 2,5% декстроза + 0,05% Tween 80 60,2 0,4 5% сорбит + 5% декстроза + 0,05% Tween 80 61,3 1,5 10% сорбит + 10% декстроза + 0,05% Tween 80 63,5 3,7 0,1% Tween 80 59,0 -0,8 10% сорбит + 0,1% Tween 80 60,6 0,7 10% декстроза + 0,1% Tween 80 61,5 1,7 2,5% сорбит + 2,5% декстроза + 0,1% Tween 80 60,0 0,2 5% сорбит + 5% декстроза + 0,1% Tween 80 60,5 0,7 10% сорбит + 10% декстроза + 0,1% Tween 80 62,1 2,3 2,5% сорбит + 2,5% декстроза 60,8 0,9 5% сорбит + 5% декстроза 61,7 1,8 10% сорбит + 10% декстроза 63,9 4,0 15% сорбит + 15% декстроза 64,6 4,8 20% сорбит + 20% декстроза 66,6 6,7 20% сорбит + 10% декстроза 64,9 5,1 10% сорбит + 20% декстроза 50,1 -9,7

Таблица 5 Воздействие эксципиентов на среднюю точку температуры термического перехода ™ анатоксина В. Мониторинг термического перехода осуществляли сигналом CD при 208 нм в качестве функции температуры. Каждое измерение проводится в двух повторениях и имеет погрешность ≈0,5°С Анатоксин В в присутствии эесципиента (эксципиентов) Tm Различие Tm Анатоксин В 55,8 0,0 20% трегалоза 60,3 -4,5 20% сахароза - - 20% глицерин 58,6 2,8 0,1% pluronic F68 56,2 0,4 10% сорбит 56,6 0,8 10% декстроза 57,3 1,6 0,05% Tween 80 55,1 -0,7 5% сорбит + 0,05% Tween 80 56,7 0,9 10% сорбит + 0,05% Tween 80 63,2 7,4 15% сорбит + 0,05% Tween 80 64,0 8,2 5% декстроза + 0,05% Tween 80 59,1 3,3 10% декстроза + 0,05% Tween 80 70,8 15,0 2,5% сорбит + 2,5% декстроза + 0,05% Tween 80 56,7 0,9 5% сорбит + 5% декстроза + 0,05% Tween 80 63,5 7,7 10% сорбит + 10% декстроза + 0,05% Tween 80 69,1 13,3 0,1% Tween 80 53,6 -2,2 10% сорбит + 0,1% Tween 80 58,5 2,7 10% декстроза + 0,1% Tween 80 62,6 6,9 2,5% сорбит + 2,5% декстроза + 0,1% Tween 80 60,0 4,2 5% сорбит + 5% декстроза + 0,1% Tween 80 56,5 0,8 10% сорбит + 10% декстроза + 0,1% Tween 80 60,8 5,1 5% сорбит + 5% декстроза 56,5 0,7 10% сорбит + 10% декстроза 65,3 9,6 15% сорбит + 15% декстроза 60,1 4,4 20% сорбит + 20% декстроза 63,1 7,3 20% сорбит + 10% декстроза 38,0 -17,8 10% сорбит + 20% декстроза 61,2 5,5

Таблица 6 Термическая устойчивость анатоксина А, связанного с Alhydrogel® (адъювантом гидроксида алюминия) в присутствии и в отсутствие эксципиента (эксципиентов) (пока нет других определений). Мониторинг термической устойчивости Tm DSC, причем Tm указывает температуру, соответствующую положению пика термического перехода. Процент анатоксина, связанного с адъювантом, измеряли при каждом состоянии с погрешностью 1%. Каждое состояние изучали в двух повторениях Анатоксин А, связанный с Alhydrogel® (адъювантом гидроксида алюминия) в присутствии растворенных веществ %
связанного белка Tm Различие Tm Не связанный анатоксин А - 58,8±0,4 0,1 Анатоксин А 96 58,7±0,3 - 10% сорбит 81 52,4±1,5 -6,2 10% декстроза 86 60,6±0,5 2,0 0,05% Tween 80 93 58,7±0,1 0,0 10% сорбит + 10% декстроза 77 62,9±0,0 4,2 10% сорбит + 10% декстроза + 0,05% Tween 80 81 63,1±1,2 4,2

10% сорбит + 10% декстроза + 0,1% Tween 80 74 62,0±1,3 3,3 10% сорбит + 0,05% Tween 80 86 59,3±0,8 0,7 10% декстроза + 0,05% Tween 80 85 59,5±1,1 0,8

Таблица 7 Термическая устойчивость анатоксина В, связанного с Alhydrogel® (адъювантом гидроксида алюминия) в присутствии и в отсутствие эксципиента (эксципиентов) (пока нет других определений). Мониторинг термической устойчивости Tm DSC, причем Tm указывает температуру, соответствующую положению пика термического перехода. Процент анатоксина, связанного с адъювантом, измеряли при каждом состоянии с погрешностью 1%. Каждое состояние изучали в двух повторениях Анатоксин В, связанный с Alhydrogel® (адъювантом гидроксида алюминия) в присутствии растворенных веществ %
связанного белка Tm Различие Tm Не связанный анатоксин В - 56,2±0,4 1,4 Анатоксин В 99 54,8±0,5 - 10% сорбит 92 52,5±1,4 -2,2 10% декстроза 96 57,9±0,2 3,1 0,05% Tween 80 96 58,2±0,6 3,4 10% сорбит + 10% декстроза 95 54,2±0,9 -0,5 10% сорбит + 10% декстроза + 0,05% Tween 80 99 58,0±2,8 3,3 10% сорбит + 10% декстроза + 0,1% Tween 80 77 58,7±1,0 3,9 10% сорбит + 0,05% Tween 80 96 58,5±1,0 3,8 10% декстроза + 0,05% Tween 80 92 55,8±2,5 1,1

Содержания всех приведенных выше ссылок включены в настоящее описание путем ссылки. Пока контекст не указывает на обратное, использование в настоящем описании форм единственного числа, таких как «некий (некая(ое))» и «данный (данная(ое))», не исключает указание соответствующей формы множественного числа. Так, например, если в пункте формулы изобретения указано применение токсина, анатоксина или эксципиента, то при отсутствии других указаний это можно также интерпретировать как включающее применение более чем одного токсина, анатоксина или эксципиента. Другие варианты осуществления охватываются следующей формулой изобретения.

Предложены иммуногенная композиция для применения при лечении или профилактике заболеваний, связанных с Clostridium difficile, способ получения такой композиции, путем смешивания входящих в ее состав ингредиентов и способ индуцирования иммунного ответа к C. Difficile, включающий введение такой композиции индивидууму. Представленная композиция включает токсин или анатоксин Clostridium difficile и один или несколько фармацевтически приемлемых эксципиентов, содержащих а) буфер, выбранный из группы цитрата и фосфата, в концентрации от 10-30, 15-25 или 20 мМ и б) сахар или сахарный спирт, выбранный из группы, состоящей из сорбита, трегалозы и сахарозы в концентрации 4-20%. Входящие в состав композиции эксципиенты увеличивают устойчивость и/или уменьшают агрегацию токсинов, что позволяет получать композиции более устойчивые для хранения с сохранением их конформационной целостности. 3 н. и 38 з.п. ф-лы, 16 ил., 13 табл.

1. Иммуногенная композиция для применения при лечении или профилактике заболеваний, связанных с Clostridium difficile, включающая токсин или анатоксин Clostridium difficile и один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов, где один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов увеличивают термическую устойчивость токсина или анатоксина и/или снижают или задерживают агрегацию токсина или анатоксина, по отношению к композиции, не содержащей один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов, и где один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов содержат (а) буфер, выбранный из группы, состоящей из цитрата и фосфата, в концентрации от 10-30, 15-25 или 20 мМ; и (b) сахар или сахарный спирт, выбранный из группы, состоящей из сорбита, трегалозы, декстрозы и сахарозы в концентрации 2-20%.

2. Композиция по п.1, где один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов снижают или задерживают агрегацию токсина или анатоксина на 50% или более, относительно композиции, не содержащей один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов.

3. Композиция по п.1, где один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов увеличивают термическую устойчивость токсина или анатоксина на 0,5°C или более относительно композиции, не содержащей один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов.

4. Композиция по п.1, где композиция содержит анатоксины токсинов А и В из С. Difficile.

5. Композиция по п.4, где анатоксины А и В присутствуют в композиции в соотношении от 5:1 (А:В) до 1:5 (А:В).

6. Композиция по п.5, где анатоксины А и В присутствуют в композиции в соотношении от 3:1 до 3:2 или 1:1 (А:В).

7. Композиция по п.1, где композиция представляет собой фармацевтическую композицию.

8. Композиция по п.1, дополнительно включающая адъювант.

9. Композиция по п.8, где адъювант содержит соединение алюминия.

10. Композиция по п.9, где соединение алюминия, представляет собой соединение гидроксида алюминия.

11. Композиция по п.1, где композиция представлена в жидкой форме.

12. Композиция по п.1, где композиция представлена в сухой порошкообразной форме, лиофилизированной форме, высушенной распылением форме или высушенной вспениванием форме.

13. Композиция по п.1, дополнительно содержащая один или более дополнительных фармацевтически приемлемых эксципиентов, выбранных из агентов тоничности, простых углеводородов, углеводородных полимеров, аминокислот, олигопептидов, полиаминокислот, многоатомных спиртов и их простых эфиров, детергентов, липидов, поверхностно-активных веществ, антиоксидантов, солей, альбумина, желатинов, формальдегида или их комбинаций.

14. Композиция по п.13, где агент тоничности представляет собой маннит в концентрации 10%.

15. Композиция по п.13, где аминокислота, олигопептид или полиаминокислота присутствует в концентрации до 100 мМ.

16. Композиция по п.13, где многоатомный спирт или его простой эфир выбраны из группы, состоящей из глицерина (в концентрации 10%, 20% или до 20%), полиэтиленгликоля (в концентрации до 20%) и их простых эфиров (в концентрации до 20%) с молекулярной массой 200-10000.

17. Композиция по п.13, где детергенты и липиды выбраны из группы, состоящей из деоксихолата натрия (в концентрации до 0,5%), Tween 20 (в концентрации до 0,05%-0,1%), Tween 80 (в концентрации до 0,05%-0,1%) и плюроникса (в концентрации до 0,5% или 0,1%).

18. Композиция по п.13, где углеводородные полимеры выбраны из декстрана (в концентрации 0,03%-0,08%, 0,04% или 0,004%) и целлюлозы.

19. Композиция по п.13, где соли выбраны из группы, состоящей из хлорида натрия, хлорида калия, хлорида магния и ацетата магния до 150 мМ.

20. Композиция по п.13, где формальдегид присутствует в количестве 0,001-0,02%.

21. Композиция по п.13, где один или более из дополнительных эксципиентов включают один или более эксципиентов, которые перечислены в таблице 1, таблице 2, таблице 8 или таблице 9, в количествах, которые перечислены в указанных таблицах.

22. Композиция по п.1, где композиция включает цитрат натрия или калия.

23. Композиция по п.1, где композиция включает фосфат натрия или калия.

24. Композиция по п.1, где композиция включает сахарозу.

25. Композиция по п.1, где композиция включает цитрат натрия или калия и сахарозу.

26. Композиция по п.1, где композиция включает фосфат натрия или калия и сахарозу.

27. Композиция по любому из пп.22-26, где композиция, кроме того, включает формальдегид.

28. Композиция по п.27, где композиция включает анатоксины А и В Clostridium difficile, 5-100 мМ цитрата натрия или калия, 2-20% сахарозы и ≤0,020% формальдегида, при pH 5,5-8,5.

29. Композиция по п.28, где композиция включает анатоксины А и В Clostridium difficile, 10-30 мМ цитрата натрия или калия, 2-10% сахарозы и ≤0,020% формальдегида, при pH 6,5-8,0.

30. Композиция по п.29, где композиция включает анатоксины А и В Clostridium difficile, 20 мМ цитрата натрия, 5% сахарозы и 0,016% формальдегида, при pH 7,5.

31. Композиция по п.27, где композиция включает анатоксины А и В Clostridium difficile, 5-100 мМ фосфата натрия или калия, 2-20% сахарозы и ≤0,020% формальдегида, при pH 5,5-8,5.

32. Композиция по п.31, где композиция включает анатоксины А и В Clostridium difficile, 10-30 мМ фосфата натрия или калия, 2-10% сахарозы и ≤0,020% формальдегида, при pH 6,5-8,0.

33. Композиция по п.27, где композиция включает анатоксины А и В Clostridium difficile, 20 мМ фосфата калия, 5% сахарозы и 0,016% формальдегида, при pH 7,5.

34. Композиция по п.1, где один или более эксципиентов содержит сорбит.

35. Композиция по п.1, где один или более эксципиентов содержит декстрозу.

36. Композиция по п.1, где один или более эксципиентов содержит Tween 80.

37. Композиция по п.1, где один или более эксципиентов содержит сорбит, декстрозу и Tween 80.

38. Способ получения композиции по п.1, причем способ включает предоставление токсина или анатоксина Clostridium difficile и смешивание токсина или анатоксина Clostridium difficile с одним или более фармацевтически приемлемыми эксципиентами, и где один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов содержат (а) буфер, выбранный из группы, состоящей из цитрата и фосфата, в концентрации от 10-30, 15-25 или 20 мМ; и (b) сахар или сахарный спирт, выбранный из группы, состоящей из сорбита, трегалозы, декстрозы и сахарозы в концентрации 2-20%.

39. Способ индуцирования иммунного ответа к С. difficile у индивидуума, причем способ включает введение индивидууму композиции по любому из пп.1-37.

40. Способ по п.39, где у индивидуума нет болезни, вызванной С. difficile, но есть риск ее развития.

41. Способ по п.39, где у индивидуума имеется заболевание, вызванное С. difficile.