СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЛАВОНОИДОВ В ЖЕЛЧЕГОННОМ СБОРЕ № 3 Российский патент 2015 года по МПК G01N33/15 G01N21/00 

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и может быть использовано в центрах контроля качества лекарственных средств и контрольно-аналитических лабораториях при проведении анализа флавоноидов в «Желчегонном сборе №3» («Фитогепатол №3»).

Действующая система контроля качества требует постоянного усовершенствования подходов к стандартизации биологически активных соединений с использованием современных методов анализа и актуальных данных об их свойствах, позволяющих дифференцированно определять конкретные группы биологически активных соединений.

«Желчегонный сбор №3» широко применяется в современной медицине в комплексной терапии заболеваний печени и желчевыводящих путей (2, 5, 6). Фармакологическое действие данного лекарственного сбора обусловлено различными группами биологически активных соединений. Состав сбора представлен цветками ромашки, листьями мяты перечной, цветками ноготков, травой тысячелистника, цветками пижмы. Обозначение в ромашке аптечной, мяте перечной, тысячелистнике обыкновенном и пижме обыкновенной двух важнейших групп действующих веществ - эфирного масла и флавоноидов позволяет говорить о прогнозировании (8). Известно, что спазмолитическое и противовоспалительное действие препарата проявляется за счет наличия эфирного масла, при этом желчегонный эффект обусловлен второй группой биологически активных соединений флавоноидами. Наличие в сборе цветков календулы усиливает противовоспалительное действие лекарственного сбора (5, 6, 8). Согласно нормативной документации на «Желчегонный сбор №3» определение качества ведется по содержанию эфирного масла (1). Принимая во внимание тот факт, что компоненты эфирного масла практически нерастворимы в воде при получении настоя, уровень содержания эфирного масла в «Желчегонном сборе №3» не позволяет оценивать степень эффективности данного препарата. На наш взгляд, в указанном сборе целесообразно определять содержание водорастворимых действующих веществ - флавоноидов, поскольку именно они определяют основное фармакологическое действие, а именно желчегонный эффект сбора (9, 10).

Таким образом, целью изобретения является разработка метода анализа флавоноидов в «Желчегонном сборе №3».

Техническим результатом предлагаемого способа является улучшение метода количественного анализа «Желчегонного сбора №3», путем определения флавоноидов как биологически активных соединений, определяющих основные фармакологические свойства сбора.

Технический результат достигается тем, что проводят количественное определение суммы флавоноидов методом дифференциальной спектрофотометрии, в пересчете на цинарозид, при длине волны 400 нм, водно-спиртового извлечения и использования в качестве экстрагента 70% этилового спирта, при этом содержание суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид и абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле:

$$X=\frac{D\ast m_0\ast 30\ast 10\ast 25\ast 100\ast 100}{D_0\ast m\ast 25\ast 1\ast 25\ast (100-W)}$$ ,

где D - оптическая плотность испытуемого раствора;

D₀ - оптическая плотность раствора государственного стандартного образца цинарозида;

m - масса сырья, г;

m₀ - масса государственного стандартного образца цинарозида, г;

W - потеря в массе при высушивании в процентах;

в случае отсутствия стандартного образца цинарозида используют теоретическое значение удельного показателя поглощения его спиртового раствора - 350, и абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле:

$$X=\frac{D\ast 30\ast 25\ast 100}{m\ast 350\ast (100-W)}$$

где D - оптическая плотность испытуемого раствора;

m - масса сырья, г;

350 - удельный показатель поглощения $$\left(E_{1см}^{\%}\right)$$ спиртового раствора государственного стандартного образца цинарозида при 400 нм;

W - потеря в массе сырья при высушивании, в процентах.

При проведении анализа измеряют оптическую плотность комплекса флавоноидов с алюминием хлоридом анализируемого раствора на фоне исходного раствора. В этом случае наблюдался батохромный сдвиг длинноволновой полосы флавоноидов, который обнаруживается в УФ-спектре в виде максимума поглощения при длине волны 406 нм. Это находит подтверждение в условиях дифференциальной спектрофотометрии: максимум поглощения при 406 нм (рис. 1). Изучение УФ-спектров государственного стандартного образца цинарозида показало (рис. 2), что раствор данного стандарта в присутствии алюминия хлорида имеет близкий максимум поглощения (400 нм). Следовательно, цинарозид может быть использован в методике анализа в качестве стандартного образца.

Нами изучены спектральные характеристики водно-спиртовых извлечений из сырья растений, составляющих «Желчегонный сбор №3» (рис. 3), для определения содержания суммы флавоноидов в каждом из компонентов сбора (рис. 4).

Исходя из спектральных характеристик компонентов сбора и модельной смеси (рис. 1, 3), определив оптимальные условия экстракции «Желчегонного сбора №3» разработали методику определения суммы флавоноидов в «Желчегонном сборе №3» методом дифференциальной спектрофотометрии в пересчете на цинарозид.

Способ реализуется следующим образом.

Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 1 г измельченного сырья (точная навеска) помещают в колбу со шлифом вместимостью 50 мл, прибавляют 30 мл 70% этилового спирта. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на тарирных весах с точностью до ±0,01 г. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 90 мин. Затем колбу закрывают той же пробкой, снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр и охлаждают в течение 30 мин. Испытуемый раствор готовят следующим образом: 1 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу - вместимостью 25 мл, прибавляют 1 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки 95% этиловым спиртом (испытуемый раствор А). В качестве раствора сравнения используют раствор, приготовленный при тех же условиях, но без добавления алюминия хлорида (раствор сравнения А). Измерение оптической плотности проводят на спектрофотометре при длине волны 400 нм. Параллельно измеряют оптическую плотность раствора государственного стандартного образца цинарозида при длине волны 400 нм, приготовленного по аналогии с испытуемым раствором (см. примечание).

Примечание. Приготовление раствора цинарозида-стандартного образца. Около 0,02 (точная навеска) цинарозида помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяют в 15-20 мл 70% этилового спирта при нагревании на водяной бане. После охлаждения содержимого колбы до комнатной температуры доводят объем раствора 70% этиловым спиртом до метки (раствор А). 1 мл раствора A цинарозида помещают в мерную колбу на 25 мл, прибавляют 1 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора 95% этиловым спиртом до метки (испытуемый раствор Б). В качестве раствора сравнения используют раствор, который готовят следующим образом: 10 мл раствора А цинарозида помещают в мерную колбу на 25 мл и доводят объем раствора до метки 95% этиловым спиртом (раствор сравнения Б).

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид и абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле:

$$X=\frac{D\ast m_0\ast 30\ast 10\ast 25\ast 100\ast 100}{D_0\ast m\ast 25\ast 1\ast 25\ast (100-W)}$$ ,

где D - оптическая плотность испытуемого раствора;

D₀ - оптическая плотность раствора государственного стандартного образца цинарозида;

m - масса сырья, г;

m₀ - масса государственного стандартного образца цинарозида, г;

W - потеря в массе при высушивании в процентах;

в случае отсутствия стандартного образца цинарозида используют теоретическое значение удельного показателя поглощения его спиртового раствора - 350, и абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле:

$$X=\frac{D\ast 30\ast 25\ast 100}{m\ast 350\ast (100-W)}$$

где D - оптическая плотность испытуемого раствора;

m - масса сырья, г;

350 - удельный показатель поглощения $$\left(E_{1см}^{\%}\right)$$ спиртового раствора государственного стандартного образца цинарозида при 400 нм;

W - потеря в массе сырья при высушивании, в процентах.

Предлагаемый способ поясняется следующими примерами.

Пример 1.

Аналитическую пробу сырья (сбор «Фитогепатол №3» («Желчегонный сбор №3»), ОАО «Красногорсклексредства», серия 60912) измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 1 г измельченного сырья (точная навеска) помещают в колбу со шлифом вместимостью 50 мл, прибавляют 30 мл 70% этилового спирта. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на тарирных весах с точностью до ±0,01 г. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 90 мин. Затем колбу закрывают той же пробкой, снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр и охлаждают в течение 30 мин. Испытуемый раствор готовят следующим образом: 1 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 1 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки 95% этиловым спиртом (испытуемый раствор А). В качестве раствора сравнения используют раствор, приготовленный при тех же условиях, но без добавления алюминия хлорида (раствор сравнения А). Измерение оптической плотности проводят на спектрофотометре при длине волны 400 нм. Параллельно измеряют оптическую плотность раствора стандартного образца цинарозида при длине волны 400 нм, приготовленного по аналогии с испытуемым раствором (см. примечание).

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид и абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле:

$$X=\frac{\mathrm{0,413569}\ast \mathrm{0,0014}\ast 30\ast 1\ast 25\ast 100\ast 100}{\mathrm{0,9562}\ast \mathrm{0,9973}\ast 25\ast 1\ast 25\ast (100-10)}$$

Оптическая плотность D=0,413569, масса сырья m=0,9973.

Содержание суммы флавоноидов = 1,05%.

Все результаты были статистически обработаны. Единичная ошибка количественного определения составила ±3,12%.

Пример 2.

Вскрывают 10 фильтр-пакетов (сбор «Фитогепатол №3» («Желчегонный сбор №3»), ОАО «Красногорсклексредства», фильтр-пакеты, серия 30213). Около 1 г измельченного сырья (точная навеска) помещают в колбу со шлифом вместимостью 50 мл. Далее процесс проводят в соответствии с примером 1.

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид и абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле:

$$X=\frac{\mathrm{0,597248}\ast \mathrm{0,0014}\ast 30\ast 1\ast 25\ast 100\ast 100}{\mathrm{0,9562}\ast \mathrm{1,0016}\ast 25\ast 1\ast 25\ast (100-10)}$$

Оптическая плотность D=0,597248, масса сырья m=1,0016.

Содержание суммы флавоноидов = 1,16%.

Все результаты были статистически обработаны. Единичная ошибка количественного определения составила ±3,28%.

Пример 3.

Аналитическую пробу модельной смеси, составом представленным на рис. 5, измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 1 г измельченного сырья (точная навеска) помещают в колбу со шлифом вместимостью 50 мл. Далее процесс проводят в соответствии с примером 1.

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид и абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле:

$$X=\frac{\mathrm{0,526487}\ast \mathrm{0,0014}\ast 30\ast 1\ast 25\ast 100\ast 100}{\mathrm{0,9562}\ast \mathrm{0,9963}\ast 25\ast 1\ast 25\ast (100-10)}$$

Оптическая плотность D=0,526487, масса сырья m=0,9963.

Содержание суммы флавоноидов = 1,03%.

Все результаты были статистически обработаны. Единичная ошибка количественного определения составила ±3,19%.

Таким образом, предлагаемый способ количественного определения суммы флавоноидов в «Желчегонном сборе №3» разработан впервые для анализа данной группы биологически активных соединений сбора и обладает следующими преимуществами перед методикой, представленной в Фармакопейной статье:

1. Определение идет по содержанию водорастворимых веществ - флавоноидов, вместо эфирного масла, компоненты которого практически нерастворимы в воде.

2. Указанный способ позволяет оценить содержание суммы флавоноидов как биологически активных компонентов, оказывающих основное терапевтическое действие - желчегонный эффект.

3. Разработанный метод является специфичным, поскольку позволяет исключить вклад других соединений (учитывается способность флавоноидов образовывать комплексы с алюминием хлоридом).

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ:

1. ВФС 42-2558-95. Желчегонный сбор №3 / Фармакопейный государственный комитет. Введ. 09.07.1996. - М., 1996. - 12 с.

2. Государственный реестр лекарственных средств. Официальное издание по состоянию на 1 апреля 2009 года: в 2-х т. Т. 1. - М.: Издательство «Медицинский совет», 2009. - 1359 с.

3. Государственная Фармакопея СССР. - Одиннадцатое издание. - Вып. 1. - М.: Медицина, 1987. - 336 с.

4. Государственная Фармакопея СССР. - Одиннадцатое издание. - Вып. 2. - М.: Медицина, 1990. - 400 с.

5. Куркин В.А. Основы фитотерапии: Учебное пособие для студентов фармацевтических вузов. - Самара: ООО «Офорт», ГОУ ВПО «СамГМУ Росздрава», 2009. - 963 с.

6. Куркин В.А. Фармакогнозия: Учебник для студентов фармацевтических вузов / Изд. 2-е, перераб. и доп. - Самара: ООО «Офорт», ГОУ ВПО «СамГМУ», 2007. - 1239 с.

7. Куркин В.А. Перспективы создания и внедрения импортозамещающих лекарственных растительных средств / В.А. Куркин, Е.В. Авдеева, В.Б. Браславский, О.Е. Правдивцева, А.В. Куркина и др. // XVIII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство»: тезисы докладов. - Москва, 2011. - С. 507.

8. Куркина А.В. Актуальные аспекты стандартизации лекарственных растений, содержащих флавоноиды / А.В. Куркина // Материалы Межрегиональной научной конференции с международным участием, посвященной 70-летию фармацевтического факультета Сибирского государственного медицинского университета. - Томск, 2011. - С. 86-90.

9. Куркина А.В. Новые подходы к стандартизации лекарственного растительного сырья, содержащего флавоноиды. 1. Пижма обыкновенная / А.В. Куркина // 65-ая Межрегиональная конференция по фармации и фармакологии «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции»: сборник научных трудов. - Пятигорск, 2011. - Вып. 66. - С. 134-137.

10. Куркина А.В. Флавоноиды как источник лекарственных препаратов на основе сырья фармакопейных растений / А.В. Куркина // 3-й Международный съезд фитотерапевтов и травников «Современные проблемы фитотерапии и травничества»: материалы научных трудов. - М., 2013. - С. 111-114.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и может быть использовано в контрольно-аналитических лабораториях при проведении анализа флавоноидов в лекарственном растительном сборе «Желчегонный сбор №3». Способ основан на количественном определении суммы флавоноидов методом дифференциальной спектрофотометрии, в пересчете на цинарозид, при длине волны 400 нм, водно-спиртового извлечения и использованием в качестве экстрагента 70% этилового спирта, при этом содержание суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид и абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле. Способ позволяет оценить содержание суммы флавоноидов как биологически активных компонентов, оказывающих основное терапевтическое действие - желчегонный эффект. 3 пр., 14 ил., 2 табл.

Способ количественного определения флавоноидов в «Желчегонном сборе №3» проводят методом дифференциальной спектрофотометрии, в пересчете на цинарозид, при длине волны 400 нм, водно-спиртового извлечения и использованием в качестве экстрагента 70% этилового спирта, при этом содержание суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид и абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле:
,
где D - оптическая плотность испытуемого раствора;
D_o - оптическая плотность раствора государственного стандартного образца цинарозида;
m - масса сырья, г;
m_o - масса государственного стандартного образца цинарозида, г;
W - потеря в массе при высушивании в процентах;
в случае отсутствия стандартного образца цинарозида используют теоретическое значение удельного показателя поглощения его спиртового раствора - 350, и абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле:

где D - оптическая плотность испытуемого раствора;
m - масса сырья, г;
350 - удельный показатель поглощения спиртового раствора государственного стандартного образца цинарозида при 400 нм;
W - потеря в массе сырья при высушивании, в процентах.