АНТИОКСИДАНТНОЕ СРЕДСТВО С ГЕПАТОПРОТЕКТОРНЫМ ЭФФЕКТОМ НА ОСНОВЕ НАНОСТРУКТУРИРОВАННОГО СЕЛЕНА И СПОСОБЫ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2015 года по МПК A61K33/04 A61K47/36 A61P1/16 A61P39/06 B82B1/00 B82Y30/00 

Изобретение относится к фармации, в частности, может применяться для профилактики и лечения редокс-зависимых заболеваний, а также для восполнения селена в организме животных и человека, что обеспечивает целевую гепатотропную антиоксидантную защиту и восполнение в организме эссенциального микроэлемента селена, а также снижение его токсичности при терапевтическом применении.

Известен комплексный поливитаминный препарат, регулирующий метаболические процессы и снижающий частоту проявления селенового дефицита в организме животных, в том числе птиц, содержащий селен и масляный растворитель, при этом он содержит в своем составе селен в виде натрия селенита, ретинола ацетат в качестве витамина A, а масляным растворителем является масло кукурузных зародышей.

[Патент. RU №2250099, кл. A61K 9/08, A61K 33/04, A61K 31/07, A61K 35/78, опубл. 20.04.2005 г.].

Известен препарат, содержащий селенит натрия и витамин E, который с успехом используется для профилактики послеродовых заболеваний у крупного рогатого скота. Так, комплексное применение селенита натрия и витамина E способствовало снижению мастита в стадах на 30% и более [Smith A.M. and Picciano М.Ф. Evidence for increased selenium requirement for the rat during pregnancy and lactation. - J. of Nutrition, 1986, v.H6, N6, p.1068-1079.; Smith I., Hogan J. Vitamin E and selenium can help lover incident of mastitis. - Zarge anim. Veter., 1988, 43, 6, 20-24].

Недостатками данных препаратов являются их неудовлетворительная усвояемость и достаточно высокая токсичность.

Известно средство на основе наномолекулярного селенопротеина, обладающее выраженным иммунотропным и метаболическим действием. Способ его получения включает экстракцию протеина из белок-содержащего растительного сырья органическими растворителями с последующим добавлением селена, обработкой смеси в электромагнитном синусоидальном высокочастотном поле, затем трипсином, добавлением к образовавшимся наночастицам молекулы селенопротеина ионов селена и повторного выдерживания в высокочастотном электромагнитном поле 20-30 ГГц. Полученное средство представляет собой наномолекулярную селенопротеиновую матрицу, содержащую селен, полученный путем термолиза селеномочевины, при этом молярное соотношение протеина и селена составляет 1:8.

[Патент. RU №2242234, кл. A61K 33/04, A61K 35/78, A61P 37/02, опубл. 20.12.2004 г.].

Данное средство обладает только иммунотропным и метаболическим действием, причем наноразмерной является макромолекула селенопротеина, а размерность частиц селена не определена.

Известна также иммуномодулирующая композиция для животных, которая содержит в качестве активно действующего вещества белок сыворотки молока - лактоферрин, в качестве растворителя - дистиллированную воду. Активно действующее вещество включает в дополнение к лактоферрину белки сыворотки молока лактоальбумин и лактоглобуллин, при этом активно действующее вещество представляет собой водный раствор смеси белков сыворотки молока с концентрацией общего белка 10 г/л, содержащий 10-20% лактоферрина, 20-30% лактоальбумина, 60-70% лактоглобуллина, кроме того, указанное активно действующее вещество дополнительно содержит наночастицы селена, которые непосредственно образуются в процессе формирования композиции при добавлении в водный раствор смеси трех белков 1 М раствора солянокислого гидразина и 1 М раствора селенита натрия Na₂SeO₃. Затем объем полученной смеси доводят дистиллированной водой до 100 мас.%. Останавливают реакцию доведением pH раствора до 7,2 1 М раствором гидроксида натрия и освобождают от низкомолекулярных соединений диализом против дистиллированной воды. Наночастицы селена, включенные в состав активно действующего вещества, придают композиции дополнительный антиоксидантный эффект.

[Патент RU №2485964, кл. A61K 35/20; A61K 33/04; A61P 37/02; B82B 1/00;, опубл. 27.06.2013 г.].

Недостатком данной композиции является то, что в качестве активного действующего вещества используют белки животного происхождения (из цельного коровьего молока), что обуславливает их потенциальную аллергогенность, а также в значительной мере сказывается на увеличении стоимости препарата. Кроме того, для остановки реакции образования наночастиц селена необходим контроль pH среды, а также дополнительная стадия диализа для освобождения от низкомолекулярных соединений.

Запатентован также препарат для инъекций, повышающий иммунную резистентность организма животных, который может быть использован для регулирования метаболических процессов и снижения частоты селенового дефицита в организме животных, в котором селен содержится в наноразмерном состоянии. Препарат получают восстановлением неорганического производного селена в высокой степени окисления (H₂SeO₃) с образованием атомов селена в нулевой степени окисления или нульвалентных, которые затем конденсируют с образованием наночастиц селена размером до 100 нм и стабилизируют полиэлектролитом (высокомолекулярным природным или синтетическим азотсодержащим полимером, способным стабилизировать наночастицы селена). Препарат включает в себя воду для инъекций, высокомолекулярный азотсодержащий полимер в качестве стабилизатора, селен в наноразмерном состоянии и нулевой валентности (Se⁰).

[Патент. RU №2392944, кл. A61K 31/758, А61Л 33/04, A61P 3/02 опубликовано 27.06.2010 г.].

Недостатками данного препарата являются использование в качестве стабилизатора синтетических или природных азотсодержащих полимеров белковой природы, что предопределяет их потенциальную аллергогенность, кроме того, эти полимеры не обладают направленным гепатотропным действием.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту по отношению к предлагаемому изобретению является селеносодержащий нанопрепарат на основе полисахаридов гриба Pleurotus tuber-regium с противоопухолевой активностью. Синтез нанокомпозита предполагает две стадии: сначала к полисахариду добавляют аскорбиновую кислоту (восстановитель прекурсора селена), а затем по каплям водный раствор диоксида селена или селенита металла. Появление красного цвета реакционной смеси свидетельствует об образовании наночастиц элементного селена. Прикапывание заканчивают в тот момент, когда окраска раствора уже перестает углубляться. Использование конкретных полисахаридов гриба Pleurotus tuber-regium необходимо как для контроля размеров образующихся частиц селена в целевом нанокомпозите, так и для проявления совместного противоопухолевого действия этих полисахаридов и наночастиц селена.

[Patent US 2013029931 "Pleurotus tuber-regium polysaccharide functionalized nano-selenium hydrosol with anti-tumor activity and preparation method thereof.", кл. A61K 31/715; A61P 35/00, опубликовано 31.01.2013 г.].

Недостатками данного препарата являются узкий спектр тестированного биологического действия (только противоопухолевая активность), а также отсутствие сведений о целевом гепатотропном действии получаемого нанокомпозита (и полисахаридов, входящих в состав этого нанокомпозита).

Задачей предлагаемого изобретения является разработка нового высокоэффективного антиоксидантного препарата селена на основе гепатотропных галактозосодержащих полисахаридных матриц, в которых селен содержится в наноразмерном состоянии.

Технический результат, который достигается с помощью предлагаемого изобретения, сводится к направленной доставке препарата к клеткам печени за счет реализации специфического рецепторного связывания гепатоцитов с галактозными фрагментами полисахаридов, а также к повышению усвояемости препарата и снижению токсического действия селена за счет того, что этот элемент используется в наноразмерном состоянии.

Средство на основе данного препарата предлагается для лечения и профилактики редокс-зависимых патологий (в частности, токсического поражения печени), и представляет собой водорастворимые порошки красно-оранжевого цвета, содержащие селен нулевой валентности (Se⁰) в количестве от 0.5 до 60% в виде нанокомпозита с размерами частиц селена в диапазоне 1-100 нм. Нанокомпозит получают из различного селенсодержащего сырья непосредственно в водном растворе природного галактозосодержащего гепатотропного полисахарида (арабиногалактана, галактоманнана, каррагинана и др.), который, к тому же, является стабилизатором наночастиц, затем очищают его высаживанием в 96%-ный этиловый спирт или другой спирт, или ацетон и сушат. Для получения готового антиоксидантного средства сухой полисахаридный нанокомпозит селена растворяют в дистиллированной воде, при следующем соотношении компонентов в масс.%:

селенсодержащий нанокомпозит 0,0001-1,0 вода дистиллированная остальное

Соотношение нанокомпозита и воды задают таким образом, чтобы в приготовленном антиоксидантном средстве концентрация селена была близка к эффективной дозе селена в селените натрия, используемого для профилактики и лечения вызываемой дефицитом селена в организме беломышечной болезни (0.1-0.2 мг Na₂SeO₃ на 1 кг массы животного, или 0.0457-0.0913 мг чистого селена на 1 кг массы животного, или 3.0 мг для однократной суточной дозы человека).

Сродство галактозосодержащей полисахаридной матрицы к асиалогликопротеиновым рецепторам мембраны гепатоцитов позволяет данному терапевтическому средству направленно связывать селен с мембранами гепатоцитов, а также потенциально внедрять его в эти клетки путем рецептор-обусловленного эндоцитоза. Важно подчеркнуть, что при использовании галактозосодержащих полисахаридов в качестве матрицы-носителя происходит более рациональная доставка веществ в органы (депо) и не наблюдается его перераспределения в пользу РЭС [Медведева С.А. Арабиногалактан лиственницы - перспективная биогенная матрица для биогенных металлов / С.А. Медведева и др. // Химия и компьютерное моделирование. Бутлеровские сообщения. - 2002. - №7. - С.45-50., Кривцов Г.Г., Жданов Р.И. // Вопросы медицинской химии. - 2000. - №3. С. - 25-30]. То есть, комбинирование наноселена с полисахаридами, которые обладают сродством к асиалогликопротеиновым рецепторам печени и селезенки, позволяет обеспечить направленную рецепторно-опосредованную доставку селена к клеткам органов депо и конкретно печени (а также возможный последующий эндоцитоз - внутриклеточную доставку Se) в зависимости от потребности в этом элементе, что можно условно обозначить как «интеллектуальный» механизм.

Нанокомпозит селена с галактозосодержащей полисахаридной матрицей предлагается получать тремя способами из различных селеносодержащих исходных веществ в присутствии различных галактозосодержащих полисахаридов, например, арабиногалактан или галактоманнан, или каррагинан и др.:

1. Восстановлением диоксида селена в воде - селенистой кислоты H₂SeO₃ или ее солей при помощи боргидрида натрия в водном растворе галактозосодержащего полисахарида при комнатной температуре с образованием атомов селена в нулевой степени окисления согласно схеме:

8H₂SeO₃+4NaBH₄=8Se⁰+Na₂B₄O₇+2NaOH+15H₂O

При этом восстановление селена до нуль-валентного состояния и последующее формирование наночастиц селена протекает в матрице галактозосодержащего полисахарида, обуславливающего гепатотропные свойства получаемого нанокомпозита, а также выполняющего функцию стабилизатора наночастиц в момент образования нанокомпозита. Выделение и очистка от примесей готового нанокомпозита производится посредством высаживания в четырехкратный избыток смешивающегося с водой органического растворителя (ацетона, этанола и др.) с последующей фильтрацией и сушкой.

2. Восстановлением товарного элементного селена (в виде пудры, порошка, гранул или блоков) до полиселенид- и селенид-анионов гидразингидратом в щелочной среде. При этом происходит растворение элементного селена и образование высокореакционноспособных селенид-анионов согласно уравнению:

2Se+4NaOH+N₂H₄·H₂O=2Na₂Se+N₂+5H₂O

[Э.Н. Дерягина, Н.В. Руссавская, Л.К. Паперная, Е.П. Леванова, Э.Н. Сухомазова, Н.А. Корчевий. "Синтез халькогенорганических соединений в основно-восстановительных системах" // Известия АН. Серия химическая, 2005, №11. С.2395-2405.]

Генерируемые селенид-анионы характеризуются ограниченной временной стабильностью, что определяет необходимость их получения непосредственно перед синтезом наночастиц селена. Затем к полученному раствору, содержащему селенид-анионы, добавляют водный раствор галактозосодержащего полисахарида и окисляют, продувая кислородом воздуха при комнатной температуре, что обеспечивает образование атомов селена в нулевой степени окисления, а полисахарид выступает в роли стабилизирующего лиганда для формирующихся наночастиц Se⁰. Выделение и очистка от примесей готового нанокомпозита также происходит посредством высаживания в четырехкратный избыток смешивающегося с водой органического растворителя (ацетона, этанола и др.) с последующей фильтрацией и сушкой.

3. Окислением органилдиселенофосфинатов аммония, щелочных и щелочноземельных металлов пероксидом водорода, которое протекает согласно схеме:

M[Se₂PR₂]_n+2H₂O₂=2Se⁰+M[O₂PR₂]_n+2H₂O

M = катионы аммония или щелочных, или щелочноземельных металлов, n=1, 2.

R = алкил-, арил-, гетарил-, арилалкил-, гетарилалкил-

Взаимодействие происходит в водных растворах полисахаридов с последующим формированием наночастиц селена и их одновременной стабилизацией полисахаридной матрицей при температуре 35-40°C. Выделение и очистка от примесей готового нанокомпозита происходит также посредством высаживания в четырехкратный избыток смешивающегося с водой органического растворителя (ацетона, этанола и др.) с последующей фильтрацией и сушкой.

В зависимости от способа получения наноселена, размер образующихся наночастиц составляет 1-100 нм, что определялось просвечивающей электронной микроскопией, а также ренгенофазовым анализом.

Накомпозит селена на основе природного галактозосодержащего гепатотропного полисахарида представляет собой гибридные органо-неорганические материалы, в качестве неорганической фазы которых выступают наноразмерные частицы элементного селена в количестве 0.5-60% и размером 1-100 нм, а в качестве органической фазы - природные галактозосодержащие полисахариды с гепатотропной активностью: арабиногалактан, галактоманнан, каррагинан и другие.

Независимо от способа получения наночастиц селена, выделение Se⁰-содержащего нанокомпозита осуществляют высаживанием реакционной смеси в четырехкратный избыток смешивающегося с водой органического растворителя (ацетона, этанола и др.). При этом происходит формирование осадка селенсодержащего нанокомпозита вследствие нерастворимости в органическом растворителе высокомолекулярного галактозосодержащего полисахарида (арабиногалактан, галактоманнан, каррагинан, и др.), являющегося основной фазой нанокомпозита. Все остальные органические и неорганические прекурсоры, восстановители и продукты их превращений являются низкомолекулярными и поэтому растворяются в водно-органической смеси и легко отделяются от нанокомпозита в процессе дальнейшей фильтрации и промывке на фильтре. Завершается процесс получения нанокомпозитов их простой сушкой на воздухе. Полученные нанокомпозиты представляют собой водорастворимые порошки оранжево-красного цвета, с содержанием селена от 0.5 до 60%.

Антиоксидантное средство на основе наночастиц селена и галактозосодержащего полисахарида готовят растворением полученных селенсодержащих нанокомпозитов в дистиллированной воде. Соотношение компонентов в полученном средстве варьируется в следующих пределах (масс.%)

селенсодержащий нанокомпозит 0,0001-1,0 вода дистиллированная остальное содержание селена 0.0457-0.0913 мг на кг веса животного, или 3.0 мг для однократной суточной дозы человека

Следующие примеры получения препарата для лечения и профилактики редокс-ассоциированных патологий (в частности, токсического поражения печени), а также исследование их антиоксидантной активности, иллюстрируют изобретение.

Пример 1. В реакционную колбу помещают 0.5 г галактозосодержащего полисахарида каррагинана, добавляют 50 г воды и нагревают смесь при постоянном перемешивании на магнитной мешалке до температуры 40°C до полного растворения полисахарида, после чего раствор охлаждают до комнатной температуры и приливают 5 мл водного раствора, содержащего 0.0037 г диоксида селена, или 0.0042 г селенистой кислоты, или 0.0043 г селенита натрия. Перемешивают смесь в течение 5 минут, после чего добавляют 0.0050 г боргидрида натрия. По истечении 15 минут, производят выделение Se⁰-содержащего нанокомпозита осаждением реакционной смеси в четырехкратный избыток ацетона или этанола, с последующей фильтрацией, промывкой на фильтре тем же растворителем, а затем сушкой на воздухе. Полученный нанокомпозит представляет собой водорастворимый порошок оранжево-красного цвета, с массовым содержанием селена 0.5% и полисахарида 99.5%. Выход нанокомпозита составляет 97% (в пересчете на селен из его прекурсора).

Количественное содержание селена в полученном нанокомпозите определялось элементным анализом, а также ренгено-энергодисперсионным микроанализом. Полученные Se⁰-содержащие нанокомпозиты проанализированы посредством просвечивающей электронной микроскопии и рентгенодифракционного анализа. Наличие в составе всех полученных нанокомпозитов наноразмерных частиц элементного селена, идентифицировано методом рентгенодифракционного анализа (Дифрактометр Bruker D8 ADVANCE), по уширенным рефлексам в области 21.6°; 29.7°; и 42° 2θ, которые соответствуют (110), (101) и (200) плоскостям кристаллической решетки наноразмерного элементного селена. Сферическая морфология наноразмерных частиц селена в составе нанокомпозитов на основе арабиногалактана, галактоманнана и каррагинана установлена на основании просвечивающей электронной микроскопии.

Пример 2. Проводят аналогично примеру 1, но берут увеличенное в 120 раз количество диоксида селена, или селенистой кислоты, или селенита натрия, а также боргидрида натрия. Выход нанокомпозита составляет 99% (в пересчете на селен из его прекурсора). Полученные материалы представляют собой водорастворимые порошки оранжево-красного цвета, с содержанием селена 60% и полисахарида 40%. Количественное содержание селена в полученном нанокомпозите, природа и морфология полученных нанокристаллов селена доказывалась как в примере 1.

Пример 3. В реакционную колбу, помещают 0.5 г галактозосодержащего полисахарида галактоманнана, добавляют 50 г воды и нагревают смесь при постоянном перемешивании на магнитной мешалке до температуры 40°C до полного растворения полисахарида, после чего раствор охлаждают до комнатной температуры и вносят 5 мл раствора содержащего 0.022 г диоксида селена, или 0.025 г селенистой кислоты, или 0.026 г селенита натрия. Перемешивают смесь в течение 5 минут, после чего добавляют 0.029 г боргидрида натрия. По истечении 15 минут, производят выделение Se⁰-содержащего нанокомпозита (Se⁰-ГМ) осаждением реакционной смеси в четырехкратный избыток ацетона или этанола, с последующей промывкой на фильтре тем же растворителем, фильтрацией и сушкой на воздухе. Выход нанокомпозита составляет 98% (в пересчете на селен из его прекурсора). Полученные материалы представляют собой водорастворимые порошки оранжево-красного цвета, с содержанием селена 3%, полисахарида 97%. Количественное содержание селена в полученном нанокомпозите, природа и морфология полученных нанокристаллов селена доказывалась как в примере 1.

Пример 4. Проводят аналогично примеру 3, но берут увеличенное в 20 раз количество диоксида селена, или селенистой кислоты, или селенита натрия, а также боргидрида натрия. Выход нанокомпозита составляет 99% (в пересчете на селен из его прекурсора). Полученные материалы представляют собой водорастворимые порошки оранжево-красного цвета, с содержанием селена 60% и полисахарида 40%. Количественное содержание селена в полученном нанокомпозите, природа и морфология полученных нанокристаллов селена доказывалась как в примере 1.

Пример 5. В реакционную колбу помещают 1.0 г полисахарида арабиногалактана и 0.08 г органилдиселенофосфината или аммония, или щелочного, или щелочноземельного металла, затем добавляют 50 г воды и перемешивают на магнитной мешалке до полного растворения полисахарида. После чего раствор дополнительно термостатируют 3 ч при 35-40°C и добавляют концентрированную перекись водорода (Пергидроль). Выделение Se⁰-содержащего нанокомпозита и очистку нанокомпозита от образовавшегося дифенилфосфината осуществляют выливанием реакционной смеси в четырехкратный избыток ацетона или этанола, с последующей промывкой на фильтре тем же растворителем, фильтрацией осадка и сушкой на воздухе. Выход нанокомпозита составляет 97% (в пересчете на селен из его прекурсора). Полученные материалы представляют собой водорастворимые порошки оранжево-красного цвета, с содержанием селена 2%, и полисахарида 98%. Количественное содержание селена в полученном нанокомпозите, природа и морфология полученных нанокристаллов селена доказывалась как в примере 1.

Пример 6. В реакционную трехгорлую колбу, оборудованную обратным холодильником, термометром и отверстием для ввода реагентов, помещают 0.224 г гидроксида натрия, добавляют 0.5 г гидразингидрата и нагревают смесь при постоянном перемешивании на магнитной мешалке до температуры 70°C, после чего добавляют 0.176 г или порошкообразного, или гранулообразного, или в виде раздробленных кусочков элементного селена. Смесь перемешивают при указанной температуре в течение 1.5 часов и охлаждают до комнатной температуры, при этом происходит растворение элементного селена и образование высокореакционноспособных селенид-анионов.

Далее аликвоту полученного раствора объемом 0.1 мл, вносят при комнатной температуре и интенсивном перемешивании в 1% водный раствор галактозосодержащего полисахарида каррагинана, постоянно барботируя воздух через смесь для селективного окисления селенид-анионов до атомарного элементного селена, с последующей конденсацией его до наночастиц. При этом галактозосодержащий полисахарид каррагинан выступает в роли стабилизирующего лиганда для формирующихся наночастиц Se⁰. По истечении 15 минут, производят выделение Se⁰-содержащего нанокомпозита (Se⁰-КГ) осаждением реакционной смеси в четырехкратный избыток ацетона или этанола, с последующей промывкой на фильтре тем же растворителем, фильтрацией и сушкой на воздухе. Выход нанокомпозита составляет 98% (в пересчете на селен из его прекурсора). Полученные материалы представляют собой водорастворимые порошки оранжево-красного цвета, с содержанием селена 6%, полисахарида 94%. Количественное содержание селена в полученном нанокомпозите, природа и морфология полученных нанокристаллов селена доказывалась как в примере 1.

Пример 7. Проводят аналогично примеру 6, но в качестве стабилизирующего лиганда используют галактозосодержащий полисахарид галактоманнан. Выход нанокомпозита составляет 97% (в пересчете на селен из его прекурсора). Полученные материалы представляют собой водорастворимые порошки оранжево-красного цвета, с содержанием селена 6%, полисахарида 94%. Количественное содержание селена в полученном нанокомпозите, природа и морфология полученных нанокристаллов селена доказывалась как в примере 1.

Пример 8. Проводят аналогично примеру 6, но в качестве стабилизирующего лиганда используют галактозосодержащий полисахарид арабиногалактан. Выход нанокомпозита составляет 99% (в пересчете на селен из его прекурсора). Полученные материалы представляют собой водорастворимые порошки оранжево-красного цвета, с содержанием селена 6%, полисахарида 94%. Количественное содержание селена в полученном нанокомпозите, природа и морфология полученных нанокристаллов селена доказывалась как в примере 1.

Из всех полученных Se⁰-содержащих нанокомпозитов приготовлены антиоксидантные средства для лечения редокс-зависимых патологий. Это иллюстрируется следующими примерами.

Пример 9.

Антиоксидантное средство с гепатопротекторным эффектом на основе наночастиц селена и галактозосодержащего полисахарида арабиногалактана или галактоманнана или каррагинана и др. полисахаридов готовят растворением полученных селенсодержащих нанокомпозитов в дистиллированной воде при комнатной температуре. Средство представляет собой гомогенный прозрачный раствор светло-оранжевого цвета, агрегативно устойчивый в течение длительного периода времени. Соотношение компонентов в полученном средстве варьируется в следующих пределах (масс.%).

селеносодержащий нанокомпозит 0.0001-1,0 вода дистиллированная остальное

При приготовлении средства первоначально исходят из содержания селена в сухом нанокомпозите, определенное элементным анализом, рентгено-энергодисперсионным микроанализом, а также другими чувствительными для определения селена видами анализа. Затем рассчитывают соотношение нанокомпозита и воды таким образом, чтобы в приготовленном антиоксидантном средстве концентрация селена была близка к эффективной дозе селена в селените натрия, используемого для профилактики и лечения вызываемой дефицитом селена в организме беломышечной болезни (0.1-0.2 мг Na₂SeO₃ на 1 кг массы животного, или 0.0457-0.0913 мг чистого селена на 1 кг массы животного, или 3.0 мг для однократной суточной дозы человека).

Пример 10.

Определение антиоксидантной активности in vitro.

Для оценки антиоксидантной активности (АОА) нанокомпозита селена с арабиногалактаном использовали спектрофотометрический метод, в котором радикал-катион 2,2′-азинобис(3-этилбентиозолин-6-сульфоновой кислоты) диаммониевой соли (ABTS^+·), имеющий характерное поглощение в области 600-850 нм, генерировали персульфатом калия и измеряли процент ингибирования поглощения добавляемыми антиоксидантами (Re R., Pellegrini N., Proteggente A., Pannala A., Yang M., Rice-Evans C. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization ASSAY // Free Radical Biology & Medicine, Vol.26, Nos. 9/10, pp.1231-1237, 1999)

Методика определения. Антиоксидантную активность определяли по методике, описанной в работе (Ильясов И.Р., Белобородов В.Л., Тюкавкина Н.А., Веровская Е.В. Применение радикал катионов ABTS^·+ в оценке антирадикальной активности флавоноидов. // Фармация, 2008, №6, С.15-18). Для определения АОА использовали раствор чистого арабиногалактана, а также его нанокомпозиты с селеном с концентрациями 1,9% и 3% в дистиллированной воде. Растворы антиоксидантов: аскорбиновой кислоты в воде и кверцетина в этаноле готовили с концентрациями 0,002 моль/л и 0,00057 моль/л, соответственно.

Процент ингибирования рассчитывали по формуле:

% ингиб. = 100·(1-A₂/A₁),

где A₁ - оптическая плотность раствора ABTS^·+ на длине волны 730 нм без добавления исследуемого образца; A₂ - оптическая плотность раствора ABTS^·+ через 4 минуты после добавления исследуемого образца.

На основании полученных результатов строили графики зависимости процента ингибирования от концентрации антиоксиданта и определяли IC50 - концентрацию, при которой нейтрализуется 50% радикал-катионов, также рассчитывали наиболее универсальную относительную характеристику АРА - ТЕАС - эквивалент антиоксидантной активности в пересчете на тролокс, активность которого принимают за 1. Данные по АРА изученных соединений представлены в таблице 1.

Таблица 1. Характеристика антирадикальной активности исследуемых соединений для их молярных концентраций Соединение Ингибирующая концентрация IC50, мкмоль/л TEACм^IC50 Арабиногалактан Не обладает Не обладает Нанокомпозит арабиногалактана и селена 18±2.9 0.91 s=2.5; n=6 Стандарт (аскорбиновая кислота) 16.1±1.1 0.98 s=0.96; n=5

Достоверность полученных величин IC50 оценивали среднеквадратической ошибкой (s) и доверительным интервалом среднего значения (Δx), вычисленным для n измерений при 95% вероятности по формулам (K. Doerffel, Statistics in Analytical Chemistry, Deut. Verlag Grundstoffind., Leipzig (1966).).

Как видно из таблицы, величины АРА стандартного антиоксиданта (аскорбиновая кислота) совпадают с литературными, поэтому используемую методику оценки АРА можно считать адекватной. Табличные данные свидетельствуют, что АРА полученного нанокомпозита селена с арабиногалактаном сравнима с таковой для аскорбиновой кислоты. Поскольку эксперименты показали, что исходный арабиногалактан не способен ингибировать ABTS^·+ при значительно более высоких концентрациях, чем нанокомпозит на его основе, можно полагать, что АРА последнего определяется наличием Se.

Значения антиоксидантной активности Se⁰-содержащих нанокомпозитов на основе галактоманнана и каррагинана in vitro, которые определялись нами аналогичным образом, оказались такими же, как и для Se⁰-содержащего нанокомпозита на основе арабиногалактана.

Пример 11.

Определение антиоксидантной активности in vivo.

Для определения антиоксидантной активности препарата использовали здоровых крыс, массой 180-220 г. исследования проводили согласно «Руководству по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» под общей редакцией члена-корреспондента РАМН, профессора Р.У. Хабриева (Издательство «Медицина», 2005 г.). Изучаемый препарат вводили животным перорально через зонд в дозе 2 мкг/100 г массы животного (исходя из информации о содержании селена и эффективных доз селенита натрия). Результаты исследования о содержании продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) и антиоксидантной активности (АОА) приведены в таблице 2.

Таблица 2. Содержание продуктов ПОЛ и АОА Сроки забора материала Группы экспериментальных животных Исследуемые параметры сыворотки крови     Двойные связи (усл. ед) Диеновые конъюгаты (мкМ/л) Конъюгированные диены _Сопряженные триены (ус. ед.) Малоновый диальдегид (мкМ/л) Антиоксидантная активность (ус. ед.) 7 сутки Nano-Se 1.300±0.092^• 1.950±0.129^♦ 0.786±0.161^♦ 2.290±0.287^* 20.26±1.664 АГ 0.776±0.145 2.300±0.233^♦ 1.043±0.136^♦ 2.960±0.141^se♦ 13.50±1.726 CCl₄ 0.378±0.081 3.424±0.631 2.425±0.350 3.575±0.512 9.020±1.630 интактные 1.613±0.248 1.326±0.155 0.770±0.107 1.763±0.229 19.90±1.784 14 сутки Nano-Se 1.560±0.144 1.753±0.259 0.793±0.159 2.426±0.337 18.43±0.860^•♦ АГ 0.586±0.201^•♦ 2.616±0.280 1.200±0.221 3.156±0.261 11.43±1.368^• CCl₄ 0.374±0.029 3.631±0.385 2.370±0.221 4.092±0.393 7.706±1.746 интактные 1.430±0.081 1.256±0.148 0.466±0.117 1.886±0.217 19.96±3.442 21 сутки Nano-Se 1.093±0.123 1.257±0.062*^•♦ 0.670±0.147 1.938±0.247 20.22±1.616 АГ 0.755±0.129 2.110±0.304^se 1.340±0.237 3.325±0.481 12.18±2.242^♦ CCl₄ 0.473±0.078 2.993±0.313 1.898±0.189 3.204±0.404 8.702±0.853 интактные 1.440±0.206 1.460±0,227 0.553±0.182 2.100±0.254 20.00±1.363 Примечание: ^+• - p<0.05 - в сравнении с интактными животными; * - p<0.05 - в сравнении с группой арабиногалактана; ♦ - p<0.05 - в сравнении с группой CCl_4.

ДК - нетоксичный промежуточный продукт ПОЛ, и при дальнейшем окислении ДК образуют МДА, который оказывает отрицательное воздействие на организм, известное как редокс-ассоциированные поражения. Во все сроки эксперимента, содержание промежуточных продуктов (ДК) в группе Nano-Se ниже, чем в группах сравнения, и приближается к показателю группы интактных животных. Следовательно, и образование МДА из ДК достоверно ниже, чем в остальных группах. Такой показатель как АОА - показатель защиты организма от действия свободных радикалов и активных форм кислорода - всегда оставался на одном уровне в группе Nano-Se и даже превышал таковой у интактных животных, в то время как в группах с АГ и CCl₄ значительно был снижен во все дни эксперимента.

Активность селенсодержащих ферментов восстановленного (GSH) и окисленного (GSSG) глутатиона, а так же супероксиддисмутазы (СОД) приведены в таблице 3.

Таблица 3. Активность селенсодержащих ферментов восстановленного и окисленного глутатиона, а так же супероксиддисмутазы в сыворотке крови Сроки забора материала Группы экспериментальных животных Исследуемые параметры СОД (ус.ед) GSH (мМ/л) GSSG (мМ/л) 7 сутки NanoSe 1.620±0.084* 1.826±0.069^*• 1.380±0.105* АГ 1.343±0.040^se♦ 1.144±0.177^se♦ 1.380±0.032^se♦ CCl₄ 1.078±0.130 1.144±0.086 1.233±0.099 интактные 1.637±0.071 2.013±0.172 1.436±0.059 14 сутки Nano-Se 1.730±0.097 1.940±1.130^• 1.686±0.092 АГ 1.390±0.083 1.276±0.153^•♦ 1.473±0.056 CCl₄ 1.100±0.091 1.093±0.077 1.204±0.069 интактные 1.606±0.118 2.026±0.062 1.660±0.093 21 сутки NanoSe 1.705±0.069^* 1.790±0.641^*•♦ 1.548±0.158^• АГ 1.362±0.166^se♦ 1.235±0.086^se 1.290±0.106 CCl₄ 1.213±0.067 1.160±0.064 1.014±0.083 интактные 1.650±0.102 2.030±0.065 1.700±0.073 Примечание: ^• - p<0.05 - в сравнении с интактными животными; * - p<0.05 - в сравнении с группой арабиногалактана; ♦ - p<0.05 - в сравнении с группой CCl₄

Супероксиддисмутаза (СОД) - фермент - показатель защиты мембран клеток от повреждающего действия свободных радикалов, образующихся при активации ПОЛ - достаточно высок в группе Nano-Se. Также небольшое повышение активности СОД является компенсаторным механизмом защиты клеток от окислительного стресса (Герасименко М.Н. Титова Н.М., Зуков Р.А. и др. Перекисное окисление липидов и состояние антиоксидантной системы в эритроцитах, больных раком почки. / М.Н. Герасименко, Н.М. Титова, Р.А. Зуков, Ю.А. Дыхано, Е.С. Перетока // Бюллет. эксперимент, биол. и мед. - 2012. - №3. - С.693).

Селеносодержащий фермент глутатион восстановленный (GSH) является важнейшим внутриклеточным антиоксидантом (Pompella A., Visvikis A., Paolicchi A., De Tota V., Casini A.F. 2003. The changing faces of glutathione, a cellular protagonist. Biochem. Phermacol. 66: 1499-1503.) и его активность зависит от наличия в организме элементного селена, а также витамин Е. В клетках же глутатион восстанавливает любую дисульфидную связь. При этом GSH превращается в GSSG. Содержание GSH в группе Nano-Se достаточно высокое и приближается к показателям группы интактных животных, что говорит о высоком уровне антиоксидантной защиты клетки во все сроки эксперимента.

Изменение концентрации жирорастворимых витаминов, являющихся компонентами общей антиоксидантной активности и которые могут играть важнейшую роль в гомеостазе вязкостных свойств мембран, приведены в таблице 4.

Таблица 4. Содержание жирорастворимых витаминов в сыворотке крови Сроки забора материала Группы экспериментальных животных Исследуемые параметры α-токоферол (мкМ/л) ретинол (мкМ/л) 7 сутки Nano-Se 9.000±0.746^* 0.83±0.159 АГ 11.886±1.717^se 1.563±0.225^• CCl₄ 5.208±1.084 0.454±0.127 интактные 7.010±1.020 0.776±0.085 14 сутки Nano-Se 9.456±1.737 0.930±0.152 АГ 14.403±1.241 2.016±0.087^• CCl₄ 5.554±1.128 0.374±0.103 интактные 8.420±1.698 1.040±0.220 21 сутки Nano-Se 7.215±1.082 1.185±0.163^• АГ 14.440±1.916^•♦ 1.362±0.148^• CCl₄ 6.569±0.854 0.600±0.100 интактные 11.230±0.791 1.140±0.355 Примечание: ^• - p<0.05 - в сравнении с интактными животными; * - p<0.05 - в сравнении с группой арабиногалактана; ♦ - p<0.05 - в сравнении с группой CL₄

Таким образом, исследование нового нанокомпозитного препарата селена in vitro и in vivo показало его выраженные антирадикальные свойства, а так же витаминосберегающий эффект, что проявляется в гепатопротекторном эффекте при токсическом поражении печени.

Предлагаемое изобретение по сравнению с другими известными техническими решениями имеет следующие преимущества:

- направленный механизм действия;

- профилактика наступления оксидативного стресса;

- снижение токсического действия на организм селена;

- высокую усвояемость и доступность организмом;

- удобство и атравматичность введения.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно, к нанокомпозитам селена на основе природных гепатотропных галактозосодержащих полисахаридных матриц, представляющим собой водорастворимые порошки оранжево-красного цвета, содержащие наночастицы нуль-валентного селена (Se⁰) с размером частиц 1-100 нм с количественным содержанием 0.5 - 60 масс. %, обладающим антиоксидантной активностью, для лечения и профилактики редокс-зависимых патологий, в частности для лечения токсического поражения печени, к способу их получения и антиоксидантному средству, содержащему указанные нанокомпозиты. Изобретение обеспечивает направленную доставку препарата к клеткам печени, а также повышение усвояемости препарата и снижение токсического действия селена. 3 н. и 4 з.п. ф-лы, 11 пр., 4 табл.

1. Нанокомпозиты селена на основе природных гепатотропных галактозосодержащих полисахаридных матриц, представляющие собой водорастворимые порошки оранжево-красного цвета, содержащие наночастицы нуль-валентного селена (Se⁰) с размером частиц 1-100 нм с количественным содержанием 0.5-60 мас.%, обладающие антиоксидантной активностью, для лечения и профилактики редокс-зависимых патологий.

2. Нанокомпозиты селена на основе природных гепатотропных галактозосодержащих полисахаридных матриц, представляющие собой водорастворимые порошки по п. 1, обладающие антиоксидантной активностью, для лечения токсического поражения печени.

3. Способ получения нанокомпозитов по п. 1, отличающийся тем, что их получают из селенсодержащего сырья непосредственно в водном растворе галактозосодержащих полисахаридов, являющихся одновременно стабилизаторами образующихся наночастиц селена, а выделение порошков нанокомпозитов осуществляют высаживанием в смешивающийся с водой органический растворитель с последующей фильтрацией и сушкой.

4. Способ получения нанокомпозита по п. 3, отличающийся тем, что его получают восстановлением водного раствора диоксида селена, или селенистой кислоты, или ее солей при помощи боргидрида натрия в водном растворе галактозосодержащего полисахарида.

5. Способ получения нанокомпозита по п. 3, отличающийся тем, что сначала получают водные растворы селенид- и полиселенид-анионов восстановлением порошка, гранул или крупных блоков элементного селена гидразингидратом в водно-щелочной среде, а затем образовавшиеся селенид-анионы окисляют в водном растворе галактозосодержащих полисахаридов, продувая воздухом при комнатной температуре.

6. Способ получения нанокомпозита по п. 3, отличающийся тем, что его получают окислением органилдиселенофосфинатов либо аммония, либо щелочных металлов, либо щелочноземельных металлов пероксидом водорода при комнатной температуре или нагревании в водных растворах галактозосодержащих полисахаридов.

7. Антиоксидантное средство для профилактики и лечения редокс-зависимых патологий человека и животных, отличающееся тем, что в качестве действующего фармакологически активного вещества содержит нанокомпозит по п. 1 и воду, очищенную при таком соотношении этих компонентов, чтобы в приготовленном антиоксидантном средстве концентрация селена содержалась в эффективной терапевтической дозе 0.0457-0.0913 мг чистого селена на 1 кг массы животного или 3.0 мг для однократной суточной дозы человека.