СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОГЕННЫХ НАНОЧАСТИЦ СЕЛЕНА И ТЕЛЛУРА Российский патент 2025 года по МПК C01F17/00 C12P3/00 C12N1/20 B82B3/00 

Изобретение относится к нанобиотехнологии и может быть использовано в химической промышленности для микробного восстановления селенита и теллурита до элементарных селена и теллура в виде наночастиц.

Микробное восстановление селена Se(IV) и теллура Te(IV) до наноструктур Se⁰ и Te⁰ является экологически чистым и экономически эффективным процессом с потенциальным применением для биоремедиации и адсорбционном удалении органических красителей и тяжёлых металлов. Биогенные наноструктуры Te⁰ и Se⁰ могут быть использованы в качестве безопасных антимикробных и противообрастающих агентов, так как проявляют низкую цитотоксичность по сравнению с соединениями селена и теллура. Наночастицы селена и теллура приобретают все большее значение в электронике и оптике благодаря своим полупроводниковым, фотопроводящим, фотоэлектрическим и каталитическим свойствам. Также такие структуры рассматриваются при разработке инновационных материалов, таких как квантовые точки на основе этих металлоидов с полупроводниковыми и оптическими свойствами, которые могут быть широко использованы, например, для биологического обнаружения и визуализации клеток.

Механизмы токсического действия металлоидов селена и теллура на бактерии до сих пор мало изучены. Одна из гипотез предполагает, что токсичность элементов может быть связана с растворимой формой ионов SeO₃^2- и TeO₃^2-, окисляющих тиолы и образующих активные формы кислорода. По-видимому, существует несколько механизмов устойчивости к указанным металлоидам. Одним из них является ферментативное или неферментативное восстановление селенита и теллурита до элементарного селена и теллура, в результате которого образуются наночастицы. За последние десятилетия способность восстанавливать селенит и теллурит с образованием наночастиц была продемонстрирована для ряда микроорганизмов, как анаэробных, так и аэробных. Однако, синтез наноструктур желаемой формы и размера представляет собой серьезную проблему. В настоящее время хорошо известно, что тип микроорганизма, среда роста и условия синтеза оказывают большое влияние на размер, форму и монодисперсность получаемых наночастиц. Многочисленные исследования подтверждают, что морфология, размер и физико-химические свойства полученных наночастиц видоспецифичны. Скорость восстановления оксианионов селена и теллура, природа биоредуцированных форм Se⁰ и Te⁰ и их расположение зависят от типа микроорганизма и механизма биоредукции. Так, биогенез наночастиц селена и теллура может происходить с образованием внеклеточных или внутриклеточных гранул элементарного селена и теллура, состоящих из стабильных однородных наносфер диаметром до 300 нм, либо наностержней шириной 10 нм, которые группируются вместе, образуя более крупные розетки до 1000 нм, либо наносфер неправильной формы с диаметром <50 нм, которые сливаются в большие сложные агрегаты. Наночастицы, продуцируемые разными организмами, демонстрируют большие различия в УФ-видимых и рамановских спектральных характеристиках, что свидетельствует о том, что различные виды Se- и Te-редуцирующих бактерий производят биоминералы Se⁰ and Te⁰ с различной атомной структурой. Эти структурные вариации объясняются разнообразием ферментов, катализирующих восстановление оксианионов селена и теллура. Более того, на морфологию и размер полученных наночастиц сильно влияют физико-химические условия культивирования. Варьирование концентрации прекурсора (селенита или теллурита), pH, температуры и времени культивирования позволяет получать наночастицы разных размеров и морфологии. Например, сферические и палочковидные морфологии наночастиц селена могут образоваться в присутствии 3 мМ Na₂SeO₃, тогда как при 1,5 мМ того же прекурсора наблюдаются только сферы. Кроме того, повышение температуры может привести к агрегации наночастиц селена в наностержни. Прекурсоры Se (Na₂SeO₄, Na₂SeO₃, SeO₂) и Te (Na₂TeO₃, K₂TeO₃), а также pH и время реакции регулируют для получения металлоидных наноструктур различных форм (Se-наносферы, Te-наностержни, Te-нанопроволоки и Te-нанотрубки). Эти особенности отражают разнообразие ферментов, участвующих в диссимиляционной редукции, которые различаются у разных микроорганизмов. Условия биосинтеза наночастиц не могут быть воспроизведены современными методами химического синтеза.

Известен способ биосинтеза наночастиц селена с использованием бактерии Bacillus cereus [Saeedeh Pouri, et al. «Biological Synthesis of Selenium Nanoparticles and Evaluation of their Bioavailability» // Brazilian archives of biology and technolog, 2017, V.60: e17160452, DOI:10/1590/1678-4324-2017160452]. Для его осуществления 1 мл свежей бактериальной суспензии инокулировали в 100 мл питательного бульона и инкубировали при 30°С в течение 24 часов. Затем центрифугировали 15 мин при скорости 6000 об/мин, собранный супернатант смешивали в соотношении 1:1 с раствором селената натрия (100 мг/мл) и инкубировали 24 часа при 30°С. После центрифугирования в течение 10 мин при скорости 5000 об/мин осадок промывали 0,9% раствором NaCl и повторно центрифугировали при 5000 об/мин в течение 10 мин. Затем проводили три последовательных замораживания и оттаивания (-70 и 40°C). Конечный осадок растворяли в 5 мл дистиллированной воды и обрабатывали ультразвуком. Далее проводили центрифугирование в течение 5 мин при 5000 об/мин, осадок трижды промывали 1,5 М Трис-HCl (рН=8,3), содержащим 0,5% додецилсульфата натрия, и снова центрифугировали в течение 10 мин при 8000 об/мин. Для удаления оставшегося додецилсульфата натрия осадок, содержащий теперь наночастицы селена, промывали трёхкратным диспергированием в дистиллированной воде и центрифугировали при скорости 8000 об/мин в течение 10 мин. Наконец, осадок ресуспендировали в дистиллированной воде. Для очистки наночастиц селена от клеточного дебриса 4 мл приготовленной суспензии энергично смешивали с 2 мл октанола, центрифугировали (5 мин, 3000 об/мин) и инкубировали (24 ч при 4°С) для диссоциации двух фаз. Таким образом, наночастицы накапливались в органической фазе, а примеси оставались в верхней фазе. Органическую и водную фазы медленно разделяли и отбрасывали, а оставшиеся наночастицы несколько раз последовательно промывали хлороформом, абсолютным этанолом и дистиллированной водой. Конечную суспензию хранили при 4°С. Описанным способом были синтезированы сферические наночастицы селена со средним диаметром 170 нм. МИК (минимальная ингибирующая концентрация) и МБК (минимальная бактерицидная концентрация) селена для полученных с помощью Bacillus cereus наночастиц селена были одинаковыми и равнялись 75 мМ. Поглощение и секреция наноселена были значительно выше, чем у селена не в форме наночастиц (P<0,05).

К недостаткам предложенного способа можно отнести многостадийность и отсутствие сведений о применимости данного микроорганизма для получения наночастиц теллура, а также формирование наночастиц внутри микроорганизма, что требует дополнительных операций для их извлечения.

В [пат. US №8759053, опубл. 24.06.2014] для микробиологического синтеза неоксидных полупроводниковых наночастиц на основе комбинации металлических и неметаллических компонентов использованы анаэробные культуры с активной гидрогеназной системой, обеспечивающей перенос электронов. В примере реализации изобретения получены наночастицы состава CuIn_0,5Ga_0,5Se₂ с использованием Thermoanaerobacter sp. штамм M1 при культивировании в «среде FeS», которая основана на стандартной питательной среде TOR-39, но с 15 мм буфера MOPS при температуре 45-50°С. Донором электронов использована глюкоза в концентрации 10 мМ. Концентрация селенита натрия составляла 5 мМ. Исходный раствор металлов состоял из хлорида меди, хлорида индия и хлорида галлия в молярных соотношениях 2:1:1, так что в исходном растворе 0,2 М содержится 0,2, 0,1 и 0,1 М Cu, In и Ga, соответственно. Металлы добавляли со скоростью 0,25 мм (в пересчёте на медь) в день, чтобы избежать токсичности для бактерий. Осаждённые наночастицы собирали путём повторного центрифугирования с последующей однократной или более промывкой деионизированной водой без лизирования. В общей сложности инкубация составила три недели.

Недостатком известного способа является использование анаэробной культуры Thermoanaerobacter sp. Анаэробные условия имеют ограничения, такие как режим культивирования и характеристики изолятов, которые делают оптимизацию и масштабирование процессов биопроизводства утомительными и сложными.

В [Vinod Yadav, et al. «Generation of Selenium Containing Nano-Structures Ву Soil Bacterium, Pseudomonas aeruginosa» // Biotechnology, 2008, V.7, No.2, pp. 299-304] приведён биосинтез наночастиц селена в аэробных условиях бактериями Pseudomonas aeruginosa (SNT1). P. aeruginosa выделена из селенсодержащих почв и имела устойчивость к 100 мг/л селена в виде селената и селенита в питательной среде. Штамм инокулировали в автоклавированный триптонно-соевый бульон (ТСБ) при рН=5,5-6,0 в стерильных условиях. Колбы выдерживали на шейкере при 150 об/мин в течение первых 2 ч, затем при 120 об/мин при 28°С в течение 3 суток. Затем отбирали 0,1 мл инокулята из активно растущей культуры в ТСБ (OD₆₀₀=2) и повторно инокулировали в 100 мл ТСБ в колбах Эрленейера на 250 мл с различной концентрацией 5, 15 и 25 мг/л селенита натрия в ТСБ. Микроорганизмы выращивали в течение 12 часов. Выращенную бактериальную культуру лизировали с помощью додецилсульфата натрия и лизоцима. Затем лизированную биомассу центрифугировали при скорости 10000 об/мин.

Недостатком, прежде всего, является использование условно патогенного микроорганизма, работа с которым требует дополнительных мер безопасности и высокой квалификации персонала. Помимо этого, предложенный биосинтез имеет низкую производительность, так как применяются низкие концентрации селена. Также не описано применение способа для получения с помощью P. aeruginosa наночастиц теллура.

Род аэробных грамотрицательных бактерий Alteromonas принадлежит к классу Gammaproteobacteria и в настоящее время включает 20 официально опубликованных видов. Представители рода Alteromonas широко распространены в морской среде и изолированы от воды, абиссальных отложений, отложений приливной зоны, водных организмов и биоплёнок обрастания. Многие представители рода Alteromonas характеризуются устойчивостью к тяжёлым металлам, так как продуцируют внеклеточные полисахариды, способные связывать многие токсичные металлы в виде экзогенных гранул.

Предложен способ культивирования морской бактерии Alteromonas macleodii в среде, включающей ионы теллура, с получением наночастиц теллура [Beleneva I.A., et al. «The tellurite-reducing bacterium Alteromonas macleodii from a culture of the toxic dinoflagellate Prorocentrum foraminosum» // Heliyon, V.2019, 5e02435, DOI:10.1016/j.heliyon]. Микроорганизм был извлечён из морских образцов. Штаммы выращивали в аэробных условиях на чашках с морским агаром 2216, затем культуру переносили в морской бульон 2216 (Difco) для получения плотной клеточной суспензии. Далее бактериальную взвесь петлёй переносили на морской агар, содержащий 0, 10, 100, 500, 1000, 1500, 2000 и 2500 мкг/мл K₂TeO₃, и чашки инкубировали в течение 5 суток при 30°С. В результате были получены окрашенные наночастицы теллура, локализованные внутри и за пределами клеток. Для выяснения вопроса о потере жизнеспособности клеток после длительного культивирования в течение 7 суток в среде, богатой K₂TeO₃ (2500 мкг/мл), штамм пересевали на морской агар без теллурита калия. Для теста на рост в различных условиях (с 1000 мкг/мл K₂TeO₃ и без него) клетки штамма 2328, выращенные в течение ночи при 23°С, инокулировали (1%, по объёму) в морской бульон 2216 (Difco) и культивировали в колбе-качалке при 130 об/мин. Рост контролировали через определённые промежутки времени, измеряя OD₆₀₀ культур на спектрофотометре. Минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) определяли как наименьшую концентрацию, при которой ингибировался рост штамма.

Недостатком предложенного способа является то, что исследование преследовало цель установления степени конвертации теллурита из окружающей среды в стабильные наночастицы теллура с использованием морской бактерии Alteromonas macleodii и не включало практическую реализацию способа получения наночастиц. Помимо этого, использованный микроорганизм демонстрировал довольно низкую эффективность для получения наночастиц в больших количествах.

На основании анализа источников информации прототипом для заявляемого изобретения является биосинтез металлоидных наночастиц с помощью аэробных грамотрицательных микроорганизмов, описанный в заявке на изобретение [з. US №20090246519, опубл. 01.10.2009]. Способ позволил получить наночастицы чистого теллура или чистого селена с помощью микроорганизмов, которые выращивают аэробно в питательной среде с добавлением Na₂TeO₃ или Na₂SeO₃, соответственно. Штаммы микроорганизмов были выделены из осадочных отложений природного солончака. Три штамма использованных морских микробов были депонированы в Американскую коллекцию типовых культур (ATCC) под следующими обозначениями ATCC: PTA-8965 Virgibacillus halodenitrificans: 14B, PTA-8966 Bacillus sp.: 6A, PTA-8967 Rhodoturula mucilaginosa: 1A.

Для реализации способа оптимизированная питательная среда (LB-marine) содержала на литр 2 г триптона, 1г дрожжевого экстракта, 12,5 г хлорида натрия и 1 мл раствора микроэлементов. Смесь доводили до рН=8,1, при желании добавляли 1,5% (мас./об.) агара для чашек и автоклавировали в течение 15 минут при 121°C. После охлаждения добавляли 20 мл стерильного 1 М сульфата магния на литр среды перед заливкой чашек Петри или инокулированием жидких культур. Теллурит добавляли в среду из концентрированных стерилизованных фильтром материалов после автоклавирования и использовали при 150 мкг/мл для выделения устойчивых штаммов.

Выделенные культуры инкубировали при комнатной температуре при перемешивании для поддержания аэробных условий. Затем культуры инокулировали 1% (об./об.) плотной чистой культурой каждого штамма и выращивали в течение 48 часов в отсутствие теллурита или селенита. После этого культуры дозировали каждые 24 часа растворами теллурита натрия или селенита натрия. Na₂TeO₃ или Na₂SeO₃ добавляли в среду за несколько раз в небольших дозах. Максимальная концентрация использованного теллурита составила от 0,05 мМ до 68 мМ (11 мг/л-15000 мг/л), что является пределом растворимости для теллурита. Максимальная общая концентрация селенита варьировалась от 0,05 мМ до 100 мМ (9 мг /л-17294 мг/л).

Через 24 ч после последней дозы Te или Se организмы собирали путём центрифугирования. Затем проводили осмотический лизис клеток ресуспендированием в гипотоническом буфере или физическим лизисом путём измельчения, обработки ультразвуком или давлением, и/или химическим лизисом клеток с использованием растворов детергентов (например, додецилсульфата натрия) и/или ферментов, разрушающих клеточную стенку (например, лизоцима).

С использованием штамма Rhodoturula mucilaginosa: 1A переработано в течение пяти недель около 95% теллурита толщиной 0,7 мм, в то время как штаммы Bacillus sp.: 6A перерабатывал около 40% теллурита толщиной 0,7 мм, а штаммы Virgibacillus halodenitrificans: 14B - около 10-15% теллурита толщиной 0,2 мм.

Недостатками известного способа являются множественные дозации селенита или теллурита и длительность биосинтеза до 5 недель, что требует постоянного контроля от персонала. Также к недостатку можно отнести формирование эндогенных наночастиц, накапливающихся в процессе культивирования внутри микроорганизма, которое, с одной стороны, уменьшает эффективность восстановления металлоидов, а с другой, влечёт за собой дополнительные операции для извлечения биогенных наночастиц. Помимо этого, в примерах не раскрыта реализация способа для получения наночастиц селена.

Задачей заявляемого изобретения является получение экзогенных наночастиц селена и теллура с тонкой оболочкой для предотвращения агломерации и растворения частиц путём несложного и недлительного культивирования при комнатных условиях ранее неописанных штаммов рода Pseudoalteromonas.

Техническим результатом заявляемого изобретения является экзогенное получение наночастиц селена и теллура, покрытых органической оболочкой, обеспечивающей длительную стабильность наночастиц, путём аэробного культивирования бактерий Pseudoalteromonas shioyasakiensis в среде морского бульона Zobell 2216.

Технический результат достигают способом получения биогенных наночастиц селена и теллура путём аэробного культивирования грамотрицательных бактерий Pseudoalteromonas shioyasakiensis в среде морского бульона Zobell 2216, включающей ионы селена и теллура, которые вводят однократно в начале биосинтеза. При этом получаемые наночастицы селена и теллура имеют тонкий органический слой на поверхности из внеклеточных полисахаридов микроорганизма, который препятствует агломерации частиц.

Заявляемый способ получения биогенных наночастиц селена и теллура на начальном этапе включает выделение и идентификацию Se(IV)- и Te(IV)-редуцирующих штаммов. Штаммы были выделены из биоплёнок с металлических пластин, погружённых на глубину 2 метра в морской воде в районе Нячанг в Южно-Китайском море. Для этого с поверхности каждой металлической пластины соскабливали биоплёнку площадью 8 см² с помощью трафарета и стерильного инструмента. Микробную массу брали стерильным ватным шариком, который затем вместе с биомассой помещали в пробирку, содержащую 2 мл стерильной морской воды. Полученную суспензию по 0,1 мл на чашку Петри инокулировали на морской агар (Difco). Штамм G2451 был выделен из биоплёнки медьсодержащего стекла, штамм AF2469 - с поверхности противообрастающей краски, а штамм PL2476 - с поверхности оргстекла.

Для получения наночастиц селена и теллура в 100 мл стерильного морского бульона Zobell 2216 (ZMB) с содержанием 400 мкг/мл Te(IV) или 720 мкг/мл Se(IV) вносили 1 мл свежего инокулята. Затем культуру инкубировали аэробно в течение 48 часов при 25°C на шейкере при 100 об/мин. Бактериальные клетки и наночастицы были удалены из культуральной среды через 48 часов путём центрифугирования при 8 000g в течение 10 мин. Гранулы дважды промывали 0,9% раствором NaCl и затем диспергировали ультразвуком при 100 Вт в течение 10 мин. Затем суспензию центрифугировали при 3 500g в течение 10 мин для отделения разрушенных клеток от наночастиц (супернатанта). Для изучения полученные наночастицы были извлечены после центрифугирования при 10 000g в течение 30 мин, дважды промыты и ресуспендированы в деионизированной воде.

Физиологическую характеристику изолятов проводили с помощью стандартных биохимических анализов. Для наблюдения морфологии клеток использовали сканирующую электронную микроскопию. Для идентификации штаммов G2451, AF2469 и PL2476 была проведена экстракция ДНК и амплифицирована почти полная последовательность гена 16S рРНК с использованием консервативных праймеров 11F (GTTTGATCMTGGCTCAG) и 1492R (TACGGYTACCTTGTTTACGACTT).

Характеристику Se- и Te-наноструктур проводили с помощью сканирующей электронной микроскопии, энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии и динамического рассеяния света. Анализ динамического рассеяния света проводили с использованием Zen 3600 Zetasizer Nano ZS, оснащённого источником света гелий-неонового лазера 633 нм (4 мВт), детектирующего информацию о рассеянии под фиксированным углом 173°. Для этого 300 мкл образца переносили в кварцевую кювету (длина пути 10 мм) и среднее распределение по размерам и дзета-потенциал регистрировали при 25°C с помощью программного обеспечения.

Фиг.1 иллюстрирует технический результат получения биогенных наночастиц селена штаммом AF2469 (А) и наночастиц теллура штаммом PL2476 (Б), где 1,2 - микрофотографии наночастиц, 3,4 - спектры энергодисперсионного рентген-анализа, 5,6 - спектры Раман-спектроскопии.

Для определения способности штаммов к восстановлению Te(IV) в аэробных условиях клетки добавляли в 100 мл ZMB с 400 мкг/мл Te(IV) при конечной OD₆₀₀=1,0. В назначенное время отбирали 1,5 мл образца для измерения остаточного содержания Te(IV) с помощью спектрофотометра, основанного на методе восстановления NaBH₄. Подпробу в каждой временной точке центрифугировали для удаления клеток и частиц Te⁰. Остаточную концентрацию TeO₃^2- оксианионов определяли, используя значения поглощения и калибровочную кривую, полученную для известных концентраций (0, 10, 25, 50, 100, 150 и 200 мкг/мл) K₂TeO₃ (R2 = 0,99).

Для определения Se(IV)-редуцирующей способности выделенных штаммов, клетки добавляли в 100 мл ZMB с 720 мкг/мл Se(IV). В указанное время отбирали 1,5 мл образца и центрифугировали для удаления клеток и частиц Se⁰. Супернатант объёмом 600 мл смешивали с 300 мл соляной кислоты (4 моль/л), а затем с 600 мл аскорбиновой кислоты (1 моль/л) при перемешивании. Концентрацию селенита измеряли спектрофотометрически при 500 нм через 10 мин, используя калибровочную кривую, полученную для известных концентраций (0, 30, 55, 110, 225, 450, 600, 750 мкг/мл) Na₂SeO₃.

Динамика процесса восстановления Na₂SeO₃ (A) и K₂TeO₃ (В) штаммами Pseudoalteromonas shioyasakiensis представлена на Фиг.2, где на гистограмме отображена степень извлечения ионов металлоидов (%) через 3, 6, 24, 48 часов культивирования микроорганизмов.

Заявленным в настоящем изобретении способом с использованием штаммов Pseudoalteromonas shioyasakiensis путём биоредукции из прозрачных растворов селенита и теллурита были восстановлены до элементарных селена и теллура в виде красных наночастиц селена и чёрных наночастиц теллура, покрытых органическим слоем. Использованные штаммы микроорганизма имеют высокую скорость процессов биоредукции. Эффективность процесса биоредукции селена составила 71-77,3 мкМ/ч селенита, теллура - 22,9-26,2 мкМ/ч теллурита или 2,61-3,71 мМ и 1,1-1,25 мМ за 48 часов, соответственно.

Характеристика наночастиц селена и теллура, полученных в результате биогенного восстановления, показала, что все они представляют собой сферические агрегаты, но разного размера. Штамм PL2476 образует наночастицы селена и теллура размером менее 100 нм. Более крупные частицы селена получены при использовании штамма G2451 и AF2469, соответственно 146 нм и 170 нм. В случае наночастиц теллура размеры для структур селена и теллура составили: 256 нм при использовании G2451 и 212 нм при использовании AF2469.

Элементный состав сфер Se и Te был подтвержден наличием характерных пиков в EDX-рентгеновском анализе и микрорамановской спектроскопии. Физико-химическая характеристика красных и черных осадков, полученных в результате биоредукции, показала наличие стабильных сферических наночастиц селена и теллура. Энергодисперсионный рентгеновский анализ также показал, что выделенные наночастицы состоят не только из Se⁰ and Te⁰, но также включают C, O and N, что свидетельствует о наличии органических компонентов на поверхности частиц. Элементный состав биогенных наночастиц, продуцируемых исследуемыми бактериями, зависит от штамма, что косвенно указывает на существование разных механизмов биоредукции, используемых изолятами.

Изобретение относится к нанобиотехнологии и может быть использовано в химической промышленности для микробного восстановления селенита и теллурита до элементарных селена и теллура в виде наночастиц. Способ получения биогенных наночастиц селена и теллура включает аэробное культивирование грамотрицательных микроорганизмов в среде морского бульона Zobell 2216, включающей растворы селенита и теллурита, при этом используют штаммы бактерии Pseudoalteromonas shioyasakiensis, а наночастицы селена и теллура получают с органическим слоем на поверхности. Предлагаемый способ получения биогенных наночастиц селена и теллура обеспечивает получение наночастицы селена и теллура с тонким органическим слой на поверхности из внеклеточных полисахаридов микроорганизма, который препятствует агломерации частиц. 2 ил., 1 пр.

Способ получения биогенных наночастиц селена и теллура путём аэробного культивирования грамотрицательных микроорганизмов в среде, включающей ионы селена и теллура, отличающийся тем, что используют штаммы бактерии Pseudoalteromonas shioyasakiensis в среде морского бульона Zobell 2216, растворы селенита и теллурита вводят однократно, а наночастицы селена и теллура получают с органическим слоем на поверхности.