Способ получения наночастиц селена Российский патент 2025 года по МПК C01B19/02 A61K33/04 B82Y40/00 

Предлагаемое изобретение относится к биотехнологии, медицине и пищевой промышленности, касается способа получения наночастиц селена, который может быть использована при производстве биологически активных добавок с антигипоксическими свойствами для человека, а также в области ветеринарии и сельского хозяйства, в частности животноводстве и птицеводстве, может найти применение в качестве биологически активной добавки, обладающей высокой усвояемостью, в рационе кормов.

Гипоксия - это состояние, при котором к тканям и органам не поступает количество кислорода, достаточное для того, чтобы они могли поддерживать нормальную жизнедеятельность. Если насыщение кислородом сильно нарушено, в тканях начинаются необратимые разрушительные процессы, а органы постепенно утрачивают свои функции. Причины гипоксии могут быть чрезвычайно разнообразными: пребывание в душном непроветриваемом помещении; нахождение на высоте без использования кислородного оборудования; удушение, утопление; отек слизистой оболочки бронхов; бронхоспазм; отек легких; разрушение эритроцитов и анемия; инфаркт миокарда; пороки сердца; воспаление легких (в том числе, осложнение коронавирусной инфекции); отравление монооксидом углерода, ядами, солями тяжелых металлов и т.п.; интенсивные нагрузки на мышцы, когда потребность в кислороде превышает его реальный приток к тканям; васкулиты; сосудистые патологии при сахарном диабете. Селен является эссенциальным микроэлементам и базовым компонентом антиоксидантной системы организма - селен-содержащий фермент глутатионпероксидаза предотвращает накопление в клетках перекисных продуктов обмена веществ. Селен оказывает противовоспалительное, антимутагенное, противораковое, противовирусное, антибактериальное, противогрибковое, иммуномодулирующее действие, стимулирует процессы обмена веществ. Кроме этого, он необходим для синтеза и действия гормонов щитовидной железы, которые являются важными регуляторами роста и развития организма. Этот микроэлемент важен для неспецифического иммунного ответа, а его низкий уровень связан с ослаблением иммунитета. Введение в рацион селена снижает воспалительную активность в организме. Недостаток селена является фактором риска развития различных патологий - заболевания щитовидной железы, йододефицит, репродуктивная недостаточность, повышение склонности к воспалительным заболеваниям, болезни кожи, волос и ногтей, кардиопатия, замедление роста, атеросклероз, заболевания печени, анемия.

По сравнению с органическими и неорганическими формами селена (оксианионов селената или селенита (селенометионин, селеноцистеин, метилселеносцистеин и селенит натрия), наночастицы селена демонстрируют более низкую токсичность. Также крайне важно разработать инновационные системы для транспорта селена, которые бы повышали биодоступность этого элемента и способствовали его контролируемому высвобождению в организме, например использовать биосовместимый, биодоступный полисахарид хитозан в качестве. Основное преимущество наноселена, по сравнению с другими формами: гораздо более низкая токсичность. Из-за такого комплекса положительных свойств наночастицы селена, стабилизированные хитозаном, выступают перспективной биологической антигипоксической добавкой.

Известно антиоксидантное средство с гепатопротекторным эффектом на основе наноструктурированного селена и способы его получения и применения (RU 2557992 C1), которое представляет собой водорастворимые порошки красно-оранжевого цвета, содержащие селен нулевой валентности в количестве от 0.5 до 60% в виде нанокомпозита с размерами частиц селена в диапазоне 1-100 нм. Нанокомпозит получают из различного селенсодержащего сырья непосредственно в водном растворе природного галактозосодержащего гепатотропного полисахарида (арабиногалактана, галактоманнана, каррагинана и др.) восстановителями - боргадридом натрия, гидразингидратом или пероксидом водорода, затем очищают его высаживанием в 96%-ный этиловый спирт или другой спирт, или ацетон и сушат. Для получения готового антиоксидантного средства сухой полисахаридный нанокомпозит селена растворяют в дистиллированной воде, при следующем соотношении компонентов, масс. %:

селенсодержащий нанокомпозит 0,0001-1,0 вода дистиллированная остальное

Соотношение нанокомпозита и воды задают таким образом, чтобы в приготовленном антиоксидантном средстве концентрация селена была близка к эффективной дозе селена в селените натрия, используемого для профилактики и лечения вызываемой дефицитом селена в организме беломышечной болезни.

Недостатком данного изобретения является использование в качестве одного из вариантов восстановителей - боргидрида натрия, т.к. соединения бора токсичны для организма, и могут не очиститься при переосаждении композита, так как будут адсорбированны полисахаридом.

Известен способ получения Pleurotus tuber-regium полисахаридного функционализированного наноселенового гидрозоля с противоопухолевой активностью и способ его получения (US 9072669 B2) где Pleurotus tuber-regium - королевский клубневой гриб. Получение указанного гидрозоля включает следующие этапы: 1) добавление раствора витамина С к водному раствору полисахаридов Pleurotus tuber-regium и равномерное их перемешивание при нормальной температуре и при нормальном давлении; 2) добавление по каплям раствора диоксида селена или раствора селенита в раствор, описанный выше (1) при равномерном перемешивании; и 3) добавление воды в этот раствор до заданного объема для получения и гидрозоля наноселена, стабилизированного полисахаридами, до прекращения углубления красного окрашивания гидрозоля.

Недостатком известного способа является использование полисахаридов Pleurotus tuber-regium, поскольку источником полисахаридов являются грибы, произрастающие в тропиках, что обуславливает высокую цену и малую распространенность данного реактива.

Известен способ, описанный в патенте US 9624237 B2, выбранный нами в качестве прототипа. В данном способе наночастицы селена синтезируют, следуя следующим этапам:

а) готовят раствора селенсодержащего соединения (селенит, соль селенита, селенитовая кислота, тиосульфат селена, диоксид селена или их комбинация), раствор оридонина, раствор восстановителя (аскорбиновая кислота, галловая кислота, аспарагин, сульфит натрия или их комбинация) и раствор стабилизатора (хитозан, гиалуроновая кислота, гиалуронат натрия или производное целлюлозы или их комбинация). Целью изобретения является использование полученного состава в противораковых и противовоспалительных процедурах. Функционализированная оридонином наночастица селена по прототипу представляет собой двухслойную структуру, образованную окислительно-восстановительной реакцией селена и оридонина в присутствии стабилизатора. Селен образует наночастицы сферической формы, а стабилизатор и оридонин координируются и адсорбируются на поверхности наночастиц селена. В одном варианте осуществления хитозан используется в качестве стабилизатора в данном изобретении. Затем восстановление селенита происходит в присутствии восстановителя (например, аскорбиновой кислоты) и приводит к образованию наночастиц селена. Стабилизатор абсорбируется на поверхности наночастицы селена, что приводит к появлению на поверхности наночастиц NH₃⁺ групп. И одновременно оридонин инкорпорируют на поверхность наночастицы селена по данному изобретению с образованием функционализированной оридонином наночастицы селена. Наночастицы селена, функционализированные оридонином, решают проблему нерастворимости оридонина в воде.

Средний размер наночастиц селена, функциолизированных оридонином, в прототипе составляет 35-160 нм. Однако, основная масса частиц, исходя из приложенных фиг.4 (распределение по размерам наночастци) и фиг.6 (ПЭМ функционализированных оридонином наночастиц селена) характеризуются размерами от 50-60 нм. Известно, что чем больше размер наночастиц, тем меньше их эффективность из-за уменьшения их «размерного» эффекта. Препарат по данному изобретению характеризуется узконаправленным специфическим действием.

Из патента CN 114288412 A (кл. A61K33/04; A61K47/36; A61K9/08; A61P25/24; A61P3/02; A61P35/00; A61P37/04; A61P39/06; B82Y40/00; B82Y5/00, опубл. 08.04.2022 г. ) известен способ получения и применения гидрозоля частиц хитозан-наноселена. Способ включает смешивание пищевого раствора хитозана с селенистой кислотой H₂SeO₃ и витамином С. Предложен способ получения гидрозоля частиц хитозан-наноселена, который включает следующие стадии: смешивание пищевого раствора хитозана с H₂SeO₃, смешивание раствора с раствором хитозана в течение 30 мин, добавление раствора аскорбиновой кислоты в качестве стабилизатора, перемешивание в течение 30 мин при комнатной температуре до получения оранжево-красного раствора со стабильным цветом, и, наконец, фильтрация и удаление примесей из оранжево-красного раствора с помощью фильтрующей мембраны водной системы для получения гидрозоля частиц хитозана-наноселена. Отличительным является использование для растворения хитозана только уксусной кислоты, причем в подпункте 4 формулы указано содержание кислоты - только 1%. Применение патента узконаправленное: снижение окислительного стресса для противодействия нейротоксичности фтора. В предлагаемом изобретении растворение хитозана происходит в водных растворах уксусной, янтарной и молочной кислот в диапазонах концентраций - 0,5-6 масс. % (при необходимости интервалы изменяемы от 1,2 масс. %). В приведенном в настоящем изоюретении методе не требуется удаление примесей из раствора с помощью фильтрующей мембраны. Кроме того, основное количество наночастиц селена в способе настоящего изобретения (более 50%) приходится на размеры менее 10 нм, следовательно, они более биологически активны (исходя из природы наночастиц).

Из патента CN111434339A (кл. A23K20/163; A23K20/20; A23K50/80; A61K31/722; A61K33/04; A61K47/36; A61K9/06; A61P37/04, опубл. 21.07.2020 г. ) известен «Гидрозоль хитозана наноселена с эффектом повышения иммунитета и его получение, консервация и применение». Изобретение относится к технической области гидрозоля наноселена, в частности к гидрозолю хитозана наноселена с эффектом повышения иммунитета и его получению, консервации и применению, причем гидрозоль хитозана наноселена с эффектом усиления иммунитета содержит следующие компоненты: 0,5 ммоль/л-5,0 ммоль/л наноселена и 100,0 мг/л-1000,0 мг/л функционализированного хитозана. Хитозан функционализируют органической кислотой. Указанное в патенте количество хитозана соответствует 0,01 масс. % - 0,1 масс. % (в подпунктах появляется концентрация до 0,12 масс. %). В патенте указано, что раствор органической кислоты может представлять собой любой раствор лимонной кислоты и раствор уксусной кислоты. В предлагаемом изобретении концентрация хитозана находится в пределах: 0,5-5 масс. %, что выше, чем в аналоговом патенте, в качестве растворителя используем растворы уксусной кислоты или молочной кислоты или янтарной кислоты или их смеси.

Из патента CZ 26981 U1 (кл. A01N25/00; A01N43/00; A01N43/72; A01N45/00; A01N59/02; A61K31/43; A61K31/65; A61K31/7048; A61K33/04; A61K9/70; A61L15/44; A61L2/16; B82B1/00; B82Y5/00; C08L5/08; C08L89/00, опубл. 26.05.2014 г. ) известен «Комплекс биополимерной субстанции с наночастицами селена и антибиотическими препаратами, проявляющими антибактериальную активность». Комплекс наночастиц селена по техническому раствору содержит биополимерное вещество в количестве от 0,01% до 5%, наночастицы селена в концентрации от 10 до 1000 мкМ и, по меньшей мере, один антибиотик лекарственного средства в концентрации от 10 мкМ до 10 мМ, или другие вещества. В качестве восстановителя ионов селена до наночастиц используют аминокислоту - меркаптопропионовую кислоту. Ее стоимость гораздо выше стоимости аскорбиновой кислоты, приведенной настоящем изобретении способа получения наночастиц селена, стабилизированных хитозаном. Верхняя граница по концентрации селена - 1000 мкМ, в пересчете на массовую долю она составляет 0,00779 масс. %. Это верхний предел, указанный в прототипе. В настоящем изобретении пределы по селену при пересчете из соли: 0,000385 масс. %-0,46 масс. %.

Известен патент KR 101120635 B1 (кл. A01G1/00; C05D11/00, опубл. 16.03.2012 г. ) «Метод выращивания высококачественных и функциональных овощных фруктов». При выращивании фруктовых овощей с использованием способа культивирования согласно настоящему изобретению функциональные минералы (Ca, Fe, Se), которые находятся в дефиците в организме человека, а также такие качества, как сахаристость, твердость, разница в цвете, текстура. Производство наночастиц селена: (SeO₂) (оксид селена IV, 99,5%) добавляли и растворяли. Затем в колбу добавляли 500 г аскорбиновой кислоты, со скоростью 20 г/мин. Продукт в круглой колбе центрифугировали в течение 30 минут с помощью высокоскоростной центрифуги (5000 об/мин), центрифугировали и трижды промывали 1000 г дистиллированной воды для получения осадка оксида селена, а затем сушили в вакууме при 25°С в течение 24 часов до получения 15 г селена наночастицах до получения. Наночастицы селена были проанализированы на размер частиц с помощью лазерной дифракции (Nano-ZS, MALVERN). В результате было подтверждено, что средний размер частиц селена наночастиц w равен 12 нм. По данной методике наночастицы селена не стабилизированы никаким полимером, следовательно, в дальнейшем они будут агрегировать до более крупных частиц. Кроме того, хитозан, как известно, увеличивает биодоступность связанных с ним компонентов, поскольку выступает "транспортом" для них в организме. В прототипе никаких полимеров в качестве стабилизатора и транспорта наночастиц не используется.

Известен патент CN 112010271 A (кл. B82Y30/00; B82Y40/00; C01B19/02; C05G3/50; C05G5/12, опубл. 01.12.2020 г. ). Согласно изобретению, применяется твердофазный метод с низким нагревом, используются различные источники Se и различные восстановители, сначала быстро синтезируются наночастицы Se, наночастицы Se, модифицированные различными поверхностными модифицирующими агентами, синтезируются позже под действием ультразвука и поверхностных модифицирующих агентов, и для разделения продуктов применяется метод центробежного разделения, так что в итоге получаются сферические наночастицы Se с разными размерами. Ультразвуковая волна используется для ускорения скорости зародышеобразования экспериментального продукта, увеличения числа зародышеобразования и уменьшения размера частиц. Метод, описанный в прототипе, использует энергозатратные, многоступенчатые промышленно невыгодные процессы получения наночастиц селена - ультразвуковую обработку, лиофилизацию и центрифугирование. Кроме того, на первой стадии смешением соли селена и восстановителя получают наночастицы, которые уже после стабилизируют, добавляя модификатор поверхности. Такой процесс не обеспечит равномерного распределения наночастиц в объеме модификатора. Помимо этого, обработка смеси ультразвуком приведет к частичной деструкции хитозана до низкомолекулярных значений, что может повлиять на свойства продукта. Не указано, в каком виде вводится хитозан, поскольку, если используется высокомолекулярный полимер, он может быть только кислоторастворимым, но в примерах не используют никакие кислоты, в которых был бы растворим хитозан.

Известен патент CN 102283318 A (кл. A23K20/163, опубл. 21.12.2011 г. ) «Способ приготовления и применение улучшителя мяса ультрадисперсных частиц хитозана, содержащего селен». Способ приготовления включает следующие стадии: 1) добавление хитозана в раствор кислоты для получения раствора кислоты хитозана; 2) капание водного раствора полифосфата натрия в раствор хитозановой кислоты с магнитным перемешиванием, перемешиванием и получением молочной суспензии; 3) регулирование значения рН млечной суспензии от 3 до 5 с образованием эмульсии частиц; 4) центробежное разделение эмульсии частиц для получения частиц, добавление частиц в раствор соли селена, регулирование значения рН раствора в диапазоне от 4,0 до 6,0, проведение реакции при комнатной температуре в течение 2-10 часов и получение эмульсии; 5) регулирование значения рН эмульсии в диапазоне от 7,0 до 9,0, промывка, фильтрация или центробежное обезвоживание, сбор твердого продукта; и 6) сушка и дробление твердого продукта и, таким образом, получение улучшителя мяса ультратонких частиц хитозана, несущего селен. Улучшитель мяса с ультрадисперсными частицами хитозана, содержащий селен, используется в качестве кормовой добавки для домашнего скота и птицы или водных животных. Данный метод является многостадийным, трудозатратным, энергетически невыгодным. Наночастицы по данному методу получаются широкодисперсными и крупными (от 5 до 500 нм). Не указана кислота для растворения хитозана.

Наиболее близким техническим решением к заявляемому изобретению является синтез биологически активной композиции хитозан-наночастицы селена (статья "Синтез биологически активной композиции хитозан-наночастицы селена" К. В. Апрятина, Е. И. Мурач, С. В. Амарантов, Е. И. Ерлыкина, В. С. Веселов, Л. А. Смирнова // Прикладная биохимия и микробиология, 2022, том 58, № 2, с. 140-14), принятый за ближайший аналог (прототип). Синтез по прототипу включает получение наночастиц селена в растворе хитозана с молекулярной массой 200 кДа, степенью деацетилирования 85% (производства ООО “Биопрогресс”, Московская обл., Россия) без дополнительной очистки. 3 мас. % хитозан растворяли в 2% янтарной кислоте. Наночастицы селена получали из селенистокислого натрия с концентрацией 2,1 масс. % с добавлением аскорбиновой кислоты в эквимолярной концентрации при необходимом дополнительном воздействии УФ-облучения под УФ-лампой мощностью 1600 мВт/м² на фиксированном расстоянии раствора от лампы в 15 см при температуре 35°С. Основная масса сформированных наночастиц приходилась на размерные характеристики от 20 до 60 нм.

Преимуществами и общими признаками с разработанным способом получения наночастиц селена является:

- использование того же источника селена, стабилизатора, восстановителя, растворителя;

- концентрации компонентов в схожих диапазонах с настоящим изобретением.

Однако, прототип не лишен недостатков:

- во-первых, сложность технологического процесса при использовании стадии с УФ-облучением, для осуществления которого требуется специальная УФ-установка с длинами волн 313, 330, и 366 нм;

- во-вторых, средний размер полученных наночастиц от 20 нм, что снижает их биоусвояемость и эффективность;

- в-третьих, выбор для стабилизации в процессе синтеза наночастиц селена хитозана с определенной молекулярной массой исключает его взаимозаменяемость, что усложняет процесс синтеза.

В задачу изобретения положена разработка нового способа получения биосовместимых наночастиц селена, стабилизированных хитозаном, без использования УФ-облучения, и дополнительно обладающих антигипоксическим действием.

Технический результат от использования изобретения заключается в упрощении процесса синтеза, повышении эффективности, биосовместимости и биоусвояемости полученных наночастиц селена, возможности их применения в качестве биосовместимой биоактивной добавки с антигипоксическими свойствами для человека, а также животных и птиц, как в виде раствора непосредственно после синтеза, так и в высушенном виде - в виде порошка, например, в составе БАДов, или в спрессованном виде в составе таблеток, капсул.

Это достигается тем, что в способе получения наночастиц селена, включающем смешение раствора, содержащего источник селена, в качестве которого используют селенит натрия, или селенит калия в количестве 0,001-1 масс. %, стабилизатор, в качестве которого используют хитозан с молекулярной массой от 25 кДа до 400 кДа в количестве 0,5-5 масс. %, восстановитель, в качестве которого используют аскорбиновую кислоту в количестве 0,0011-1,5 масс. % и растворитель, в качестве которого используют раствор уксусной кислоты, или молочной кислоты, или янтарной кислоты, или их смеси в количестве 0,1-6 масс. % и воду в количестве до 100% при расчете общей массы раствора, полученный раствор подвергают микроволновому излучению при мощности установки 400-1000 Вт в течение 2-10 мин; аскорбиновую кислоту вводят в раствор хитозана при непрерывном перемешивании и выдерживают постоянное перемешивание в течение 1-2,5 часов; время синтеза наночастиц селена контролируют спектрофотометрически по появлению и убыванию до постоянного значения полосы поглощения, соответствующей аскорбиновой кислоте λ ~ 250-280 нм; наночастицы образуются с размерами в диапазоне 1-22 нм, со средними размерами наночастиц 5 нм; полученные наночастицы селена применяют в качестве биологически активной добавки с антигипоксическими свойствами.

На фиг. 1 представлены полосы поглощения аскорбиновой кислоты в процессе формировании НЧ селена в растворе хитозана: 1 - 0 мин, 2 - 30 мин, 3 - 60 мин, 4 - 90 мин.

На фиг. 2 представлено типичное распределение по размерам наночастиц селена, стабилизированных хитозаном, определенные методом малоуглового рассеяния рентгеновских лучей.

На фиг. 3 представлено характерное проявление биосовместимых свойств на поверхности пленок образцов, после нанесения на поверхность фибробластов клеточной линии hTERT BJ-5ta: λ - композит на основе хитозана, содержащий ионный селен, [Se⁺⁴] = 0.012 моль/л; b - композит на основе хитозана, содержащий НЧ селена, [Se⁰] = 0.012 моль/л.

Предлагаемый способ получения наночастиц селена относится к методам зеленой химии, т.к. в нем не используются токсичные органические растворители, а в качестве восстановителя ионов используется аскорбиновая кислота, взятая в мольном избытке по отношению к селениту (фиг. 1).

Стабилизированные наночастицы селена, полученные по предлагаемому способу, по всем примерам, образуются с размерами в диапазоне 1-22 нм, обладают узким распределением со средними размерами 5 нм, что свидетельствует об их более высокой усвояемости по сравнению с прототипом, высокими биосовместимыми свойствами (фиг. 3) и эффективным антигипоксическим действием (таблица 1).

В качестве стабилизатора наночастиц селена выбран биосовместимый нетоксичный гипоаллергенный полисахарид хитозан, обеспечивающий транспортировку наночастиц в организме. Кроме того, сам хитозан способен увеличивать биодоступность препарата. Использование хитозана с различными молекулярными массами - от 25 кДа до 400 кДа взаимозаменяемо по приведенной формуле.

Аскорбиновая кислота, выступающая в качестве восстановителя ионов селена, участвует в окислительно-восстановительных реакциях в организме, оказывает неспецифическое общестимулирующее влияние, адаптационные способности и сопротивляемость организма к инфекциям, а также способствует процессам регенерации.

Все вещества используют марки х.ч. или осч.

Предлагаемый способ получения наночастиц селена осуществляют следующим образом.

В воднокислотный раствор хитозана вносят водный раствор селената натрия (или селената калия), затем при непрерывном перемешивании необходимую навеску аскорбиновой кислоты, на 10-20 мольных % превышающую содержание селенита. Далее раствор помещают в микроволновую печь, например, в микроволновую печь LG MS2336GIN, тем не менее марка печи не влияет на результат. Для осуществления получения наночастиц селена важна только мощность установки - необходимую мощность печи задают в диапазоне 400-1000 Вт. От величины мощности зависит время воздействия излучения на раствор - от 2 до 10 минут соответственно. Смешивание компонентов осуществляют при комнатной температуре в заявленных интервалах. Размеры наночастиц селена определяют методом малоуглового рассеяния рентгеновских лучей. Ход реакции контролируют спектрофотометрическим методом по возникновению и последующему убыванию до постоянного значения во времени полосы поглощения, характерной для аскорбиновой кислоты в области длин волн 250-280 нм. Постоянное значение полосы поглощения, соответствующей аскорбиновой кислоте, взятой в мольном избытке по отношению к селениту, говорит о полном восстановлении ионов селена до наночастиц. При этом в процессе восстановления ионов селена и образования наночастиц окраска раствора менялась с бледно-желтой на красную, характерную для композиций, содержащих наночастицы селена. Молекулярная масса хитозана может варьироваться от 25 кДа до 400 кДа.

Использование микроволнового излучения для инициации и ускорения процесса синтеза наночастиц селена способствует его упрощению. Упрощению процесса синтеза способствует также использование хитозана с различной молекулярной массой, что обеспечивает его взаимозаменяемость. Получение наночастиц селена со средним размером 5 нм, обладающих антигипоксическим действием, способствует повышению их эффективности, биосовместимости и биоусвояемости.

Ниже представлены примеры осуществления предлагаемой группы изобретений.

Пример 1.

В раствор 2 мас. % хитозана (молекулярная масса 400 кДа) в 2 мас. % уксусной кислоте по каплям добавляли раствор селенита натрия в концентрации 0,001 мас. %. (как прекурсора наночастиц селена) и систему перемешивали в течение 5 минут. Аскорбиновую кислоту (0,0012 мас. %) вводили в раствор хитозана при непрерывном перемешивании и выдерживали постоянное перемешивание в течение 1 часа. Количество воды в растворе составляло 95,9978 мас. %. Полученный раствор подвергали микроволновому излучению при мощности установки LG MS2336GIN - 1000 Вт в течение 2 мин. Время синтеза наночастиц селена контролировали спектрофотометрически по появлению и убыванию до постоянного значения полосы поглощения, соответствующей аскорбиновой кислоте λ ~ 250-280 нм. Постоянное значение полосы поглощения, соответствующей аскорбиновой кислоте, взятой в мольном избытке по отношению к селениту, говорит о полном восстановлении ионов селена до наночастиц. Также об этом свидетельствует прекращение изменение окраски раствора.

Пример 2.

В раствор 0,5 мас. % хитозана (молекулярная масса 100 кДа) в 0,5 мас. % янтарной кислоте по каплям добавляли раствор селенита натрия в концентрации 0,005 мас. %. (как прекурсора наночастиц селена) и систему перемешивали в течение 5 минут. Аскорбиновую кислоту (0,006 мас. %) вводили в раствор хитозана при непрерывном перемешивании и выдерживали постоянное перемешивание в течение 2,5 часов. Количество воды в растворе составляло 98,989 мас. %. Полученный раствор подвергали микроволновому излучению при мощности установки 400 Вт в течение 5 мин. Время синтеза наночастиц селена контролировали спектрофотометрически по появлению и убыванию до постоянного значения полосы поглощения, соответствующей аскорбиновой кислоте λ ~ 250-280 нм. Постоянное значение полосы поглощения, соответствующей аскорбиновой кислоте, взятой в мольном избытке по отношению к селениту, говорит о полном восстановлении ионов селена до наночастиц. Также об этом свидетельствует прекращение изменение окраски раствора.

Пример 3.

В раствор 5 мас. % хитозана (молекулярная масса 25 кДа) в 6 мас. % молочной кислоте по каплям добавляли раствор селенита калия в концентрации 1 мас. %. (как прекурсора наночастиц селена) и систему перемешивали в течение 5 минут. Аскорбиновую кислоту (1,5 мас. %) вводили в раствор хитозана при непрерывном перемешивании и выдерживали постоянное перемешивание в течение 2,5 часов. Количество воды в растворе составляло 86,5 мас. %. Полученный раствор подвергали микроволновому излучению при мощности установки 1000 Вт в течение 10 мин. Время синтеза наночастиц селена контролировали спектрофотометрически по появлению и убыванию до постоянного значения полосы поглощения, соответствующей аскорбиновой кислоте λ ~ 250-280 нм. Постоянное значение полосы поглощения, соответствующей аскорбиновой кислоте, взятой в мольном избытке по отношению к селениту, говорит о полном восстановлении ионов селена до наночастиц. Также об этом свидетельствует прекращение изменение окраски раствора.

Пример 4.

В раствор 3 мас. % хитозана (молекулярная масса 100 кДа) в 1 мас. % уксусной кислоте и 0,5% молочной кислоте по каплям добавляли раствор селенита натрия в концентрации 0,2 мас. %. (как прекурсора наночастиц селена) и систему перемешивали в течение 5 минут. Аскорбиновую кислоту (0,26 мас. %) вводили в раствор хитозана при непрерывном перемешивании и выдерживали постоянное перемешивание в течение 1,5 часов. Количество воды в растворе составляло 95,04 мас. %. Полученный раствор подвергали микроволновому излучению при мощности установки 700 Вт в течение 6 мин. Время синтеза наночастиц селена контролировали спектрофотометрически по появлению и убыванию до постоянного значения полосы поглощения, соответствующей аскорбиновой кислоте λ ~ 250-280 нм. Постоянное значение полосы поглощения, соответствующей аскорбиновой кислоте, взятой в мольном избытке по отношению к селениту, говорит о полном восстановлении ионов селена до наночастиц. Также об этом свидетельствует прекращение изменение окраски раствора.

Пример 5.

В раствор 4 мас. % хитозана (молекулярная масса 230 кДа) в 1 мас. % уксусной кислоте и 1 % янтарной кислоте по каплям добавляли раствор селенита натрия в концентрации 0,01 мас. %. (как прекурсора наночастиц селена) и систему перемешивали в течение 5 минут. Аскорбиновую кислоту (0,015 мас. %) вводили в раствор хитозана при непрерывном перемешивании и выдерживали постоянное перемешивание в течение 1 часа. Количество воды в растворе составляло 93,975 мас. %. Полученный раствор подвергали микроволновому излучению при мощности установки 1000 Вт в течение 5 мин. Время синтеза наночастиц селена контролировали спектрофотометрически по появлению и убыванию до постоянного значения полосы поглощения, соответствующей аскорбиновой кислоте λ ~ 250-280 нм. Постоянное значение полосы поглощения, соответствующей аскорбиновой кислоте, взятой в мольном избытке по отношению к селениту, говорит о полном восстановлении ионов селена до наночастиц. Также об этом свидетельствует прекращение изменение окраски раствора.

Пример 6.

В раствор 3 мас. % хитозана (молекулярная масса 100 кДа) в 1,2 мас. % уксусной кислоте по каплям добавляли раствор селенита натрия в концентрации 0,1 мас. %. (как прекурсора наночастиц селена) и систему перемешивали в течение 5 минут. Аскорбиновую кислоту (0,12 мас. %) вводили в раствор хитозана при непрерывном перемешивании и выдерживали постоянное перемешивание в течение 2 часов. Количество воды в растворе составляло 95,58 мас. %. Полученный раствор подвергали микроволновому излучению при мощности установки 400 Вт в течение 10 мин. Время синтеза наночастиц селена контролировали спектрофотометрически по появлению и убыванию до постоянного значения полосы поглощения, соответствующей аскорбиновой кислоте λ ~ 250-280 нм. Постоянное значение полосы поглощения, соответствующей аскорбиновой кислоте, взятой в мольном избытке по отношению к селениту, говорит о полном восстановлении ионов селена до наночастиц. Также об этом свидетельствует прекращение изменение окраски раствора.

Уксусная, молочная и янтарная кислоты, а также селенит натрия и селенит калия являются взаимозаменяемыми в соответствующих массовых процентах.

Использование хитозана с различными молекулярными массами - от 25 кДа до 400 кДа взаимозаменяемо по приведенной формуле.

Смещение концентрации компонентов в сторону от указанных пределов затрудняет процесс получения продукта, поскольку ухудшается растворимость хитозана и уменьшается выход целевого продукта. Уменьшение концентрации хитозана ниже указанных пределов приводит к снижению стабильности дисперсии наночастиц селена в полимере. Пределы концентрации кислот оптимально подобраны для лучшего растворения полисахарида.

Пределы мощности микроволнового облучения: 400-1000 Вт выбраны, исходя из того, что при мощности менее 400 Вт длительность синтеза наночастиц возрастает, что не имеет высокой рентабельности, при мощности более 1000 Вт раствор начинает выкипать из-за слишком высокого излучения.

Качественным доказательством формирования наночастиц селена с выходом 100% и полным исчерпанием прекурсора селена является спектрофотометрически зарегистрированное постоянное значение полосы поглощения, соответствующей аскорбиновой кислоте, взятой в мольном избытке по отношению к селениту, растворенному в воднокислотном растворе стабилизатора (фиг. 1).

По данному способу изобретения по всем примерам получаются наночастицы селена, со средним размером 5 нм. Размеры остальных наночастиц находится в пределах 1-22 нм. Подтверждением являются данные малоуглового рассеяния рентгеновских лучей (фиг. 2).

Полученная композиция наночастиц селена, стабилизированных хитозаном, характеризуется высокой биосовместимостью, о которой свидетельствует адгезия и пролиферация клеток фибробластов как предшественников соединительной ткани после 24 ч их инкубации на поверхности пленок композиции. На поверхности композиций наночастиц селена, стабилизированных хитозаном, отмытых от избытка кислоты до нейтральной рН среды, наблюдалось равномерное распределение фибробластов, их рост и деление, что указывало на высокую степень биосовмесимости данного образца. В то же время, на композиции, содержащей ионный селен в той же концентрации клетки после их культивирования погибли и не просматриваются. (фиг. 3)

По данному способу изобретения по всем примерам получаются композиции, обладающие высокой антигипоксической активностью. Антигипоксические свойства композиции хитозан-наночастицы селена доказывали в условиях моделирования гипобарической гипоксии, оцениваемых по активности свободнорадикальных процессов в плазме крови. Эксперимент по исследованию антигипоксического действия композиции хитозан-наночастицы селена проводился in vivo на белых нелинейных крысах. Животных разделили на 4 группы по 5 особей в каждой. К первой группе отнесли интактных животных, вторая группа составила контроль по гипоксии, животным третьей группы вводили раствор сукцината хитозана, четвёртой группе вводили наночастицы селена, стабилизированные хитозаном. Препараты вводили животным перорально 1 раз в сутки в течение четырёх дней в объёме 1 мл на одно животное с помощью металлического зонда. Через 1 сутки после прекращения введения препаратов всех животных, кроме первой группы, помещали в барокамеру и подвергали воздействию гипобарической гипоксии в следующем режиме: условная высота 8000 м над уровнем моря в течение 30 мин. Изменение давления в барокамере осуществляли постепенно, снижение высоты до 3000 м проводили со скоростью не более 1 км/мин. Сразу после прекращения воздействия гипобарической гипоксии животных усыпляли хлороформом и осуществляли взятие крови путём декапитации. Проводили измерение параметров крови.

Результаты по показателям крови при изучении антигипоксических свойств композиций хитозана и хитозана, содержащего наночастицы селена, in vivo в условиях моделирования гипобарической гипоксии, оцениваемые по активности свободнорадикальных процессов в плазме крови экспериментальных животных приведены в таблице 1.

Таблица 1

Показатели крови экспериментальных животных при введении образцов перед воздействием гипобарической гипоксии

Показатели Интактные Гипоксия Хитозан-
янтарная кислота Хитозан-наночастицы Se ДК,
отн. ед. опт. пл. Фракция Изопропанольная 0,452±
0,036 0,330±
0,046 0,309±
0,026 0,421±
0,038 ТК,
отн. ед. опт. пл. 0,312±
0,017 0,190±
0,020 * 0,161±
0,032 * 0,282±
0,024 ОШ,
отн. ед. опт. пл. 0,076±
0,008 0,028±
0,006 * 0,022±
0,008 * 0,069±
0,007 *^#& ДК,
отн. ед. опт. пл. Гептановая 0,532±
0,084 0,255±
0,620 * 0,355±
0,017 0,406±
0,036 ТК,
отн. ед. опт. пл. 0,421±
0,102 0,097±
0,029 * 0,080±
0,019 * 0,461±
0,023 * ОШ,
отн. ед. опт. пл. 0,262±
0,083 0,073±
0,017 * 0,011±
0,002 * 0,333±
0,098 * Эритроциты,
10¹²/л 10,57±
0,70 7,87±
0,22 * 7,79±
0,10 * 9,62±
0,26 * HGB,
г/л 163,40±
7,65 129,00±
1,64 * 127,00±
1,14 * 128,80±
3,29 * Тромбоциты,
10⁹/л 291,40±
44,12 389,60±
25,32 546,00±
31,85 * 491,60±
48,31 * Лейкоциты,
10⁹/л 7,01±
0,28 6,11±
0,60 9,95±
0,74 *^# 8,20±
0,73 ^& Лимфоциты,
10⁹/л 3,63±
0,30 2,82±
0,51 6,04±
1,15 *^# 4,08±
0,66 ^& Моноциты,
10⁹/л 1,20±
0,16 0,85±
0,15 1,38±
0,29 1,47±
0,40 Нейтрофилы,
10⁹/л 2,18±
0,31 2,44±
0,44 2,53±
0,63 2,79±
0,60

Статистически значимые различия между группами:

* p < 0,05 - по отношению к группе «интактные»; # p < 0,05 - по отношению к группе «гипоксия»; & p < 0,05 - по отношению к группе «хитозан-янтарная кислота»

У животных в условиях гипоксии, усиливающей образование активных форм кислорода, повышается уровень внутриклеточных ферментов антиоксидантной системы, что связано с механизмами поддержания устойчивости организма к окислительному стрессу. Активные формы кислорода помимо того, что способствуют апоптотической гибели клеток и индуцирует воспалительные процессы организма, также способствуют выживанию клеток в гипоксических условиях и индуцируют антиоксидантную защиту. Таким образом, при гипоксии показатели ДК, ТК и ОШ - диеновые конъюгаты, триеновые конъюгаты и основания Шиффа соответственно - снижаются.

Однако, содержание продуктов перекисного окисления у животных, покормленных композицией «хитозан-наночастицы селена», после воздействия гипоксии увеличивалось по сравнению с животными, находящимися в условиях гипоксии, и было близко к показателям интактных животных. Т.е. организм животных в условиях гипоксии при применении композиции испытывал гораздо меньший стресс и практически не отличался от состояния животных, находящихся в условиях нормы.

Количество эритроцитов и содержание гемоглобина при гипоксии достоверно снижались. Не было выявлено достоверных различий по количеству лейкоцитов и лимфоцитов между группами, получавшими препараты селена, по сравнению с интактными животными и группой «гипоксия».

Таким образом, можно сделать вывод, что синтезированная композиция хитозан-наночастицы селена обладает высокими антигипоксическими свойствами и приводит к снижению окислительной деградации липидов, происходящей, в основном, под действием свободных радикалов.

Изобретение может быть использовано при производстве биологически активных добавок с антигипоксическими свойствами. Способ получения наночастиц селена включает смешение раствора, содержащего 0,001-1 масс. % селенита калия или натрия, 0,5-5 масс. % стабилизатора – хитозана, 0,0011-1,5 масс. % восстановителя – аскорбиновой кислоты, 0,1-6 масс. % растворителя – раствора уксусной кислоты, или молочной кислоты, или янтарной кислоты, или их смеси, и воды – остальное до 100%. Полученный раствор подвергают микроволновому излучению при мощности установки 400-1000 Вт в течение 2-10 мин. Изобретение позволяет упростить процесс синтеза наночастиц селена и повысить их эффективность, биосовместимость и биоусвояемость. 4 з.п. ф-лы, 3 ил., 1 табл., 6 пр.

1. Способ получения наночастиц селена, включающий смешение раствора, содержащего источник селена, в качестве которого используют селенит натрия или селенит калия в количестве 0,001-1 масс. %, стабилизатор, в качестве которого используют хитозан с молекулярной массой от 25 до 400 кДа в количестве 0,5-5 масс. %, восстановитель, в качестве которого используют аскорбиновую кислоту в количестве 0,0011-1,5 масс. %, и растворитель, в качестве которого используют раствор уксусной кислоты, или молочной кислоты, или янтарной кислоты, или их смеси в количестве 0,1-6 масс. %, и воду в количестве до 100% при расчете общей массы раствора, при этом полученный раствор подвергают микроволновому излучению при мощности установки 400-1000 Вт в течение 2-10 мин.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что аскорбиновую кислоту вводят в раствор хитозана при непрерывном перемешивании и выдерживают постоянное перемешивание в течение 1-2,5 ч.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что время синтеза наночастиц селена контролируют спектрофотометрически по появлению и убыванию до постоянного значения полосы поглощения, соответствующей аскорбиновой кислоте λ ~ 250-280 нм.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что наночастицы образуются с размерами в диапазоне 1-22 нм со средними размерами наночастиц 5 нм.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что полученные наночастицы селена применяют в качестве биологически активной добавки с антигипоксическими свойствами.