СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ СЫВОРОТКИ ЖЕНЩИНЫ К МУЖСКИМ МОНОКЛЕАРНЫМ КЛЕТКАМ Российский патент 2015 года по МПК G01N33/48 G01N33/68 

Нарастание числа бесплодных браков, регистрируемое в России и других странах, диктует необходимость поиска современных методов диагностики и лечения бесплодия, особенно в тех случаях, когда причина его не установлена. Одной из причин бесплодия может быть высокая степень тканевой совместимости супругов и, как следствие, слабый иммунный ответ и низкая продукция защитных факторов. В результате иммунного ответа на антигены продуцируются специфические цитотоксические антитела против антигенов отца. Это блокирующие антитела представленные IgG. Они связываются с Fc рецепторами на лимфоцитах (NK-клетках) и, таким образом, препятствуют накоплению активированных NK-клеток с высокой цитотоксической активностью.

Показано, что данный механизм наиболее эффективно работает при максимальных различиях супругов по антигенам главного комплекса гистосовместимости (HLA-антигенам). Слабый иммунный ответ и недостаточная продукция защитных факторов приводит к развитию ранних гестационных осложнений - спонтанных выкидышей или замершей беременности.

В результате иммунного ответа на HLA антигены продуцируются специфические протективные факторы: цитотоксические антитела против антигенов отца (АРСА - antipaternal cytotoxic antibodies); Ab2 анти-анти HLA антитела (Ab2-anti-anti HLA antibodies); антитела, блокирующие смешанную культуру лимфоцитов (MLR-Bf - mixed lymphocyte reaction blocking factor) [1, 2].

Лабораторные тесты, предложенные для подтверждения диагноза аллоиммунного характера невынашивания, включают в себя HLA-типирование, определение материнских лимфоцитотоксических антител против антигенов отца, блокирующих антител к смешанной культуре лейкоцитов (СКЛ) и др.

О том, что эти лабораторные исследования могут быть также полезны при диагностике бесплодия, свидетельствует то, что 85% беременностей прерываются до факта их установления. Предполагается, что привычное невынашивание и бесплодие являются проявлениями существующих иммунных расстройств [3-6].

Изобретение относится к области медицины, в частности к способам определения состояния иммунной системы, и касается способа определения цитотоксичности сыворотки женщины к мужским лимфоцитам.

Аналогом заявленного способа является «Способ количественного определения концентрации антител, специфичных к антигену стромальных клеток эндометриальной ткани человека, в биологических жидкостях человека, содержащих специфичные антитела» [10].

Способ заключается в применении традиционного твердофазного иммуноферментного анализа (ТИФА) и включает химическое связывание антигена с поверхностью микропланшета с последующим помещением биологической жидкости, содержащей антитела, на микропланшет, инкубирование, проведение цветной реакции и спектрофотометрическую оценку показателей цветной реакции. При этом получают целевой антиген, подвергая ферментативному гидролизу образцы нормальных тканей человека, содержащих стромальные клетки эндометрия. Реакцию ферментативного гидролиза останавливают добавлением хелатирующего агента. Полученную смешанную суспензию клеток подвергают центрифугированию в непрерывном градиенте плотности, в результате чего изолируют стромальные клетки. Микросомальную фракцию стромальных клеток используют в качестве целевого антигена, который в выбранных разведениях ковалентно связывают с поверхностью лунок микропланшета, затем в серию лунок вносят в заданных разведениях калибровочный материал, приготовленный на основе стандартного препарата специфичных к целевому антигену антител, в другую серию лунок - исследуемые пробы биологической жидкости и после проведения традиционного ТИФА по спектрофотометрическим показателям строят калибровочную кривую и по ней определяют концентрацию специфичных антител.

Недостаток аналога заключается в сложности техники получения клеток нормальной ткани человека для выявления необходимого антигена, правильной калибровки, получения необходимых комплектующих и техники постановки реакции.

В качестве прототипа авторы предлагают «Способ определения блокирующего эффекта аутологичной сыворотки» [11].

Способ заключается в том, что лимфоциты инкубируют в среде с добавлением фитогемагглютинина, в среде с добавлением фитогемагглютинина и аутологичной сыворотки, в среде с добавлением фитогемагглютинина и пулированной АВ-сыворотки и в среде без добавок, с последующим добавлением меченых FITC антител к CD69. Далее оценивают флуоресценцию в каждой из проб и определяют блокирующий эффект по предложенной формуле.

К недостаткам прототипа относятся трудоемкость выполнения, дорогостоящие материалы и оборудование, недостаток специально обученного этой методике персонала.

Задачей, на решение которой направлено заявленное изобретение, является упрощение методики определения антител (блокирующих факторов) сыворотки женщины к мужским лимфоцитам, снижение время проведения метода и оценка возможности рисков невынашивания беременности.

Данная задача решается за счет того, что заявленный способ определения цитотоксичности сыворотки женщины к мужским лимфоцитам может быть выполнен предложенным авторами следующим способом.

Забор крови у женщины проводится на 10-20 день цикла. Кровь в количестве 5 мл берется у женщины в одну пробирку вакутейнер с красной крышкой на сыворотку. В мужчины берут кровь в 2 пробирки по 5 мл: в одну с красной крышкой на сыворотку, в другую с зеленой пробкой с гепарином для выделения лимфоцитов.

Пробирки с кровью с красной крышкой маркируем ставим в отдельный штатив на 10 мин в термостат 37°C (можно при комнатной температуре 20 мин), потом на 20 мин в холодильник. Затем центрифугируем 3 тыс. об/мин в течение 10 мин. Сыворотку собираем в стерильную пробирку.

Для получения мужских лимфоцитов кровь наслаивается на фикол-верографин (плотность 1.077) (ООО Компания «ПанЭко» г. Москва) и центрифугируем 20 мин при 3 тыс.об/мин. Полученную интерфазу лимфоцитов отмываем трехкратно сначала в забуференном физ.растворе (0,01 М, pH=7,4), затем в питательной среде RPMI 1640. Определяем количество полученных клеток в 1 мл посредством подсчета в камере Горяева и рассчитываем концентрацию так, чтобы в 1 мл находилось 2 млн. лимфоцитов.

В 96-луночный стерильный планшет вносим в 1-ю и 2-ю лунку по 100 мкл суспензии клеток, 20 мкл среды RPMI 1640, в 1-ю лунку вносим 30 мкл сыворотки женщины (опыт), во 2-ю - 30 мкл сыворотки мужчины (контроль), ресуспендируем и ставим на 24 часа при температуре 37°C в СО₂ инкубатор.

Через сутки считаем количество лимфоцитов в присутствии женской сываротки (опыт) и мужской (контроль).

Цитотоксический индекс выражаем числом, полученным в результате частного от деления количества клеток в опыте на количество лимфоцитов в контроле. В норме цитотоксический индекс равен примерно 0,7 и ниже.

Это значит, что в женской сыворотке присутствуют факторы, подавляющие пролиферацию мужских лимфоцитов и при беременности не будет атаки клеток киллеров на антигены плода.

Техническим результатом, обеспечиваемым приведенной совокупностью признаков является достоверность, экономичность, быстрота выполнения и эффективность определения уровня антител (блокирующих факторов) сыворотки женщины к мужским лимфоцитам, ускорение диагностики.

Предложенный способ позволит быстро, через сутки с начала исследования, экономично и эффективно провести исследование реакции гуморальных факторов иммунной системы женского организма на мужские антигены и оценить степень риска невынашивания беременности, ранних выкидышей, неразвивающейся беременности и т.п.

Способ иллюстрируется следующим примером.

Обследовано 36 женщин, у которых беременность и роды протекали без физиологических отклонений, 32 женщины с привычным невынашиванием беременности неясного генеза.

Цитотоксический индекс у 87% женщин первой группы оказался 0,7±0,2, у 13% - 0,5±0,26.

Цитотоксический индекс у 79% женщин второй группы с привычным невынашиванием беременности неясного генеза был 2,5±0,7, у 21% - 1,0±0,6.

Способ определения цитотоксичности сыворотки женщины к мужским лимфоцитам позволит оценить реакцию иммунной системы женщины на мужские антигены и прогнозировать возможные риски невынашивания беременности. Это исследование дает возможность принимать своевременные меры коррекции путем назначения терапевтических мероприятий. К ним в настоящее время относят проведение аллоиммунизации (Разрешение на применение метода ФС №2009/179 от 2.07.2009 г. ) и применение препарата нормального иммуноглобулина для внутривенного введения [7-9].

Таким образом, предложенный способ даст возможность ускоренной диагностике иммунных нарушений у женщин, и в результате повысит рождаемость.

Список используемой литературы:

1. Pandey М.K., Agrawal S. Induction of MRL-Bf and protection of fetal loss: a current double blind randomized trial of paternal lymphocyte immunization for women with raccurent spontaneous abortion. Int Immunopharmacol 2004; 4:289-298.

2. Ito K., Tanaka Т., Tsutsumi N. Possible mechanisms of immunotherapy for maintaining pregnancy in recurrent spontaneous aborters: analysis of antiidiotype antibodies directed against autologous T-cell receptors. Hum Reprod 1999; 14:650-655.

3. Бескоровайная Т.С, Полтавец И.В., Близнец Е.А., Вассерман Н.Н., Тверская СМ., Поляков Л.В. Роль антигенов II класса главного комплекса гистосовместимости в привычном невынашивании беременности. Проблемы репродукции 2006; 12:2.46-54.

4. Хонина Н.А., Тихонова М.А., Дзуцева И.Б., Пасман Н.М., Останин А.А., Черных Е.Р. Иммунные дисфункции у женщин с бесплодием неясного генеза. Мед. иммунология 2010; 12:6:511-520.

5. Yamada Н., Atsumi Т., Kato Е.Н. Prevalence of diverse antiphospholipid antibodies in women with recurrent spontaneous abortion. Fertil Steril 2003; 80:1276-1278.

6. Koyama M., Saji F., Takahashi S., Takemura M. Probabilistic assessment of the HLA-sharing of recurrent spontaneous abortion couples in Japanese population. Tissue antigen 2010; 37:211-217.

7. Чернышов В.Н., Судома И.А., Донской Б.В., Костючик А.А., Маслий Ю.В. Значение повышенной цитотоксичности естественных киллеров при многократных неудачах экстракорпорального оплодотворения. Журн. АМН Украины, 2010, т. 16, №2, с. 288-298.

8. Маркова А.С., Меньшиков И.В., Бедулева Л.В., Бушмелева Н.Н., Казакова И.Г., Веретенникова К.Г. Клинико-диагностическая ценность методовопределения иммунного ответа матери на антигены отца и установления толерантности при беременности. Вестник удмуртского университета. 2011. Вып. 4. Биология, науки о земле, Физиологические исследования, с. 102-106.

9. Khonina N.A., Broitman E.V., Shevela E.Y., Pasman N.M., Chernykh E.R.. Mixed lymptocyte reaction blocking factors (MRL-bf) as potential biomarker for indication and efficacy of paternal lymphocyte immunization in recurrent spontaneous abortion//Arch. Cynecol. Obstet-2013. - Vol. 288. - P. 933-937.

10. Михнина E.A., Комаров E.K., Хохлов П.П. Способ количественного определения концентрации антител, специфичных к антигену стромальных клеток эндометриальной ткани человека, в биологических жидкостях человека, содержащих специфичные антитела. Патент №2303267 от 08.06.2005.

11. Сухих Г.Т., Ванько Л.В., Сидельникова В.М., Николаева М.А., Зиганшина М.М., Кречетова Л.В. Способ определения блокирующего эффекта аутологичной сыворотки. Патент №2396566 от 29.04.2009.

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике бесплодия женщин. Для этого проводят определение цитотоксичности сыворотки женщин к мужским лимфоцитам, включая их совместное культивирование с контрольной мужской и исследуемой женской сывороткой в лунках 96-луночного планшета в присутствии питательной среды RPMI 1640 в СО₂-инкубаторе. Через сутки в камере Горяева подсчитывают количество лимфоцитов в лунке с мужской сывороткой (контроль) и женской (опыт). Далее определяют цитотоксический индекс (ЦИ), который представляет собой частное от деления количества клеток в опыте на количество клеток в контроле. Нормальный показатель ЦИ составляет примерно 0,7 и ниже. Изобретение позволяет проводить исследование реакции гуморальных фактором иммунной системы женского организма на мужские антигены и оценить степень риска невынашивания беременности, ранних выкидышей и неразвивающейся беременности. 1 пр.

Способ определения цитотоксичности сыворотки женщины к мужским лимфоцитам, включающий их совместное культивирование с контрольной мужской и исследуемой женской сывороткой в лунках 96-луночного планшета в присутствии питательной среды RPMI 1640 в СО₂-инкубаторе в течение суток с последующим подсчетом количества лимфоцитов в камере Горяева и определением цитотоксического индекса, выражающегося в частном от деления количества клеток в опыте на количество клеток в контроле при нормальном показателе примерно 0,7 и ниже.