СПОСОБ ОЦЕНКИ АЛЛОГЕННОГО ИММУННОГО ОТВЕТА В КРАТКОВРЕМЕННОЙ СМЕШАННОЙ КУЛЬТУРЕ МОНОНУКЛЕАРОВ НЕРОДСТВЕННЫХ ДОНОРОВ Российский патент 2016 года по МПК G01N33/49 

Область применения

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике. Основано на современных культуральных и иммунологических методах определения экспрессии молекул аллогенной совместимости и межклеточных контактов на мононуклеарах неродственных доноров, взаимодействующих в их смешанной культуре.

Метод смешанной культуры лимфоцитов является классическим примером изучения эффективности иммунного распознавания по аллогенным антигенам главного комплекса тканевой совместимости (для человека - HLA) [1, 2]. Доказано, что основными молекулами, стимулирующими иммунные реакции при смешивании аллогенных лимфоцитов, являются HLA II класса (HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DP). Именно поэтому данный метод нашел широкое применение при типировании локуса HLA-D [3]. Это исследование необходимо проводить для подбора донорского костного мозга при его трансплантации [4, 5]. Показана значимость смешанной культуры лимфоцитов при изучении иммунных причин репродуктивных потерь [6]. Известно, что формирование и вынашивание беременности является иммунным процессом, рестриктированным по HLA [7]. Письмом Минздрава РФ «Профилактика, диагностика, лечение невынашивания беременности» от 11.04.2003 №2510/3796-03-32 при невынашивании рекомендовано использовать методы определения факторов, блокирующих аллоиммунный ответ на HLA плода. Таким методом может быть только смешанная культура лимфоцитов. В классическом варианте смешанная культура лимфоцитов выполняется строго в стерильных условиях, с временем инкубации 120 часов и с применением радиоизотопных маркеров. Метод отражает способность лимфоцитов трансформироваться в бластные клетки под воздействием аллоНLА [8]. Эти условия не приемлемы для современной диагностической лаборатории, если это касается диагностики иммунных причин репродуктивных потерь. В данном случае необходимо в кратчайший срок определить характер иммунного ответа на аллоНLА для различных субпопуляций мононуклеаров. А в развитии этого подхода как метода определения в крови у женщин блокирующих отторжение факторов знание их клеток-мишеней особенно необходимо. Тем самым актуальность разработки современных методов оценки аллоиммунных взаимодействий по HLA между неродственными донорами с применением проточной цитофлуориметрии является актуальной задачей. Такого рода исследований ранее не проводилось.

Аналоги изобретения

В настоящее время предложено большое количество способов оценки с помощью проточной цитофлуориметрии антиген-индуцированной активации лимфоцитов. В работе Корольковой О.Ю., Сенюкова В.В., Кожевникова B.C., показано, что стимуляция мононуклеаров анти-CD3 антителами приводит к повышению экспрессии на них молекул CD25 и HLA-DR в интервале 1-7 сутки [9].

Другим аналогом является способ оценки пролиферативной активности лимфоцитов с помощью цитофлуориметрии. Метод основан на выявлении фракции мононуклеаров, экспрессирующих с-концевой фрагмент белка b23/нуклеофозмина [10].

Схожим является способ определения пролиферативной активности лимфоцитов по экспрессии другого маркера - ядрышкового белка а3 [11].

Основными недостатками вышепредставленных методов является сложность, трудоемкость и дорогостоимость их адаптации для оценки аллоиммунных взаимодействий по HLA.

Прототипом предложенного изобретения является способ оценки взаимодействия аллогенных лимфоцитов по экспрессии на их поверхности маркера активации CD2 [12]. Данная работа указывает на возможность краткосрочной инкубации смешанной культуры лимфоцитов и оценки их активации по изменению экспрессии молекул межклеточных контактов.

Основным недостатком данного метода является отсутствие новых технологий оценки экспрессии активационных молекул. В то же время по технической сущности и достигаемому результату данный способ оценки взаимодействия лимфоцитов in vitro является наиболее близким к заявленному способу.

Сущность изобретения

Цель изобретения заключается в улучшении эффективности диагностики аллогенного иммунного распознавания для двух неродственных доноров за счет сопоставления субпопуляционного состава мононуклеаров каждого из доноров в их смешанной культуре с таковым в отдельных культурах каждого из доноров. Известно, что экспрессия HLA-DR - динамический процесс, который связан с активацией иммунокомпетентных клеток, в том числе и при аллоиммунных взаимодействиях [13]. Доказано, что уровень экспрессии HLA-DR на поверхности иммунокомпетентных клеток не связан с его синтезом и его плотность может меняться за 24 часа [14]. Эти два посыла легли в основу нового метода оценки аллоиммунных взаимодействий в смешанной культуре мононуклеаров, где активация различных субпопуляций лимфоцитов оценивалась по уровню изменения экспрессии HLA-DR, детектированному с помощью проточной цитофлуориметрии.

Основными этапами представленного метода оценки аллогенных взаимодействий мононуклеаров неродственных доноров являются:

1) выделение мононуклеаров двух неродственных доноров при использовании фиколл-верографина с градиентом плотности 1,077 кг/м³ [8];

2) двухкратная отмывка мононуклеаров однократным натрий-фосфатным буфером (Phosphate buffered saline, PBS) в течение 7 минут при температуре 10°С и скорости центрифугирования 1500g;

3) первичное окрашивание всех мононуклеаров конъюгатом моноклональных антител к CD45 (маркер лейкоцитов) с перидинин-хлорофиллом (РС-5) для первого донора и с алофикоцианином (АРС) - для второго донора;

4) инкубация смешанной культуры мононуклеаров в течение 24 часов при температуре 37°С и 5% СО₂, в полной среде (RPMI-1640 с 15% эмбриональной телячьей сывороткой) в концентрации для каждого донора 200000 клеток на 1 мкл (в полном объеме 400 мкл), одновременная инкубация в тех же условиях и концентрациях отдельных культур каждого из доноров;

5) дополнительное окрашивание всех мононуклеаров (смешанной культуры и отдельных культур) с помощью конъюгатов флуоресцентных красителей (флуоресцеин изотиоцианата - FITC и фикоэритрина - РЕ) с моноклональными антителами к CD3 и HLA-DR соответственно;

6) учет экспрессии HLA-DR на различных субпопуляциях мононуклеаров с помощью проточной цитофлуориметрии;

7) одновременная оценка степени прироста экспрессии HLA-DR каждого из доноров на субпопуляциях мононуклеаров смешанной культуры по отношению к таковым в соответствующих контрольных культурах.

Способ осуществляют следующим образом:

1. Забор венозной крови для каждого неродственного донора проводят в боксированном процедурном кабинете в вакутейнеры с этилендиаминуксусной кислотой (ЭДТА) в объеме 3 мл с последующим смешиванием для стабилизации свертывающей системы крови. Для уточнения количества лейкоцитов и лимфоцитов из пробирки забирают 40 мкл крови и проводят общий анализ крови на автоматическом анализаторе. При их значениях в нормоцентильных пределах дальнейшего подсчета мононуклеаров на этапах проведения метода не требуется.

Далее все действия проводятся в боксированном помещении для культуральных работ, в ламинарном шкафу, предназначенном для работ с микроорганизмами 3-4 группой патогенности.

2. Венозную кровь каждого донора разводят в 2 раза однократным натрий-фосфатным буфером, добавляя 3 мл 1×PBS к 3 мл крови.

3. В пластиковую центрифужную пробирку общим объемом 10 мл вносят стерильный раствор фиколл-верографина с градиентом плотности 1,077 кг/м³ в объеме 3 мл и наслаивают на этот раствор ранее разведенную венозную кровь каждого донора (пункт 2) в объеме 6 мл.

4. Далее проводят центрифугирование обеих пробирок, содержащих фиколл-верографин и разведенную венозную кровь на 500 g, 30 минут при температуре 10°С.

5. После окончания центрифугирования из каждой пробирки отбирают интерфазное кольцо, содержащее мононуклеары, и переносят их в новую центрифужную пластиковую пробирку. Для отмывки от примесей раствора фиколл-верографина в пробирки с мононуклеарами добавляют 7 мл 1×PBS. Далее осторожным пипетированием проводят перемешивание мононуклеаров с PBS.

6. Центрифугируют обе пробирки, содержащие мононуклеары доноров и 1×PBS на 500 g, 7 минут при температуре 10°С.

7. После центрифугирования надосадочную жидкость удаляют, а процедуры 5 и 6 повторяют.

8. После центрифугирования надосадочную жидкость удаляют. Остаточный объем жидкости в пробирках не должен превышать 50 мкл.

9. В первую пробирку (донор №1) добавляют 5 мкл моноклональных антител к CD45, конъюгированных с флуоресцентным красителем перидинин-хлорофиллом (РС-5), во вторую пробирку (донор №2) - 5 мкл моноклональных антител к CD45, конъюгированных с алофикоцианином. Рекомендуется использовать моноклональные антитела фирм Beckman coulter (USA), Biolegend (USA).

10. Пробирки с мононуклеарами доноров и соответствующими конъюгатами моноклональных антител с флуоресцентными красителями инкубируют в течение 15 минут при комнатной температуре в полной темноте (в закрытом шкафу).

11. Отмывают от несвязавшихся моноклональных антител и центрифугируют, как описано в пунктах 5 и 6 однократно.

12. После отмывки в каждую пробирку вносят по 1000 мкл полной среды и перемешивают мононуклеары осторожным пипетированием. Основой полной среды для инкубации является питательная среда RPMI-1640, содержащая в своем составе 15% эмбриональную телячью сыворотку (ЭТС), 2 ммоль L-глютамина, 10 ммоль Hepes-буфера, 5×10^-5 моль 2-меркаптоэтанола и гентамицин-сульфат в концентрации 50 мкг/мл.

13. В шесть пластиковых пробирок для проточной цитофлуориметрии (Beckman coulter, USA или Becton dickinson, USA) вносят по 200 мкл приготовленных на полной среде мононуклеаров. Все постановки дублируются, поэтому для каждого этапа используют две пробирки. Первые две пробирки (№1 и №2) предназначены для смешанной культуры лимфоцитов, поэтому в каждую пробирку (№1 и №2) вносят мононуклеары первого и второго доноров в общем объеме 200 мкл и далее смешивают осторожным пипетированием в течение 15 секунд. В пробирки №3 и №4 вносят 200 мкл мононуклеаров первого донора (монокультура мононуклеаров первого донора). В пробирки №5 и №6 вносят 200 мкл мононуклеаров второго донора (монокультура мононуклеаров второго донора).

14. Далее все пробирки помещают в СО₂ - инкубатор на 24 часа. Условия инкубации: температура 37°С, полная влажность, 5% CO₂. Сверху пробирки накрывают крышкой от 96-луночного планшета.

15. После окончания инкубации проводят однократную отмывку мононуклеаров каждой пробирки. Для этого в каждую пробирку добавляют 2 мл 1×PBS, мононуклеары перемешивают пипетированием и центрифугируют в течение 5 минут при 500g и температуре 10°С. Надосадочную жидкость удаляют. Остаточный объем жидкости не должен превышать 50 мкл.

16. Окрашивание всех мононуклеаров (смешанной культуры и отдельных монокультур) проводят с помощью конъюгатов флуоресцентных красителей (FITC и РЕ) с моноклональными антителами к CD3 (добавляют отдельным наконечником в каждую пробирку по 5 мкл) и HLA-DR (добавляют отдельным наконечником в каждую пробирку по 5 мкл) соответственно. Рекомендуется использовать коммерческие системы, содержащие по одной пробе aнти-CD3-FITC и анти-HLA-DR-PE, фирмы Beckman coulter, USA.

17. Пробирки с мононуклеарами доноров и соответствующими конъюгатами моноклональных антител с флуоресцентными красителями инкубируют в течение 15 минут при комнатной температуре в полной темноте (в закрытом шкафу).

18. После окончания инкубации проводят двукратную отмывку в соответствии с пунктом №15.

19. В каждую пробирку добавляют 200 мкл 1х фиксатора для связи моноклональных антител с соответствующими рецепторами на мононуклеарах. Рекомендуется использовать OptiLyse (Beckman coulter, USA).

20. Подготовка для проведения проточной цитофлуориметрии.

Протокол для проточной цитофлуориметрии показан на рисунках 1 и 2.

Подготавливают шесть окон (соответствуют 1aR2, 1б, 1в, 2aR3, 2б, 2в). К гейту R2 (рисунок 1а) привязывают окна, соответствующие рисункам 1б и 1в; а к гейту R3 (рисунок 2а) - окна, соответствующие рисункам 2б и 2в.

21. Снятие результатов. Поочередно проводят проточную цитофлуориметрию мононуклеаров смешанной культуры пробирки №1 и №2 для дублирования результата. При данном анализе одновременно задействованы все шесть окон. В гейтах R2 (рисунок 1а) и R3 (рисунок 2а) накапливаются мононуклеары с маркером CD45 и далее для каждого донора видно распределение трех субпопуляций: CD3^-HLA-DR⁺; CD3⁺HLA-DR⁺; CD45⁺HLA-DR⁺. На следующем этапе проводят проточную цитофлуориметрию монокультур первого донора (пробирки №3 и №4 - для дублирования результата) и второго донора (пробирки №5 и №6 - для дублирования результата). Здесь накапливаются клетки только в трех соответствующих окнах: для первого донора - 1а, 1б, 1в (пробирки №3 и №4); для второго - 2а, 2б, 2в (пробирки №5 и №6).

22. Расчет полученных результатов. Для каждой субпопуляции рассчитывают коэффициент прироста (КП) удельного веса субпопуляции в смешанной культуре по отношению к ее удельному весу в соответствующей монокультуре:

KП_CD3+HLA-DR+=((CD3⁺HLA-DR⁺ _скл-CD3⁺HLA-DR⁺ _кон)×100)/CD3⁺HLA-DR⁺ _кон., где:

CD³+HLA-DR⁺ _скл - относительное число клеток субпопуляции CD3⁺HLA-DR⁺ в смешанной культуре лимфоцитов (СКЛ), %;

CD³+HLA-DR⁺ _кон - относительное число клеток субпопуляции CD3⁺HLA-DR⁺ в монокультуре анализируемого донора, %, кон. - контроль;

KП_CD3-HLA-DR+=((CD3^-HLA-DR⁺ _скл-CD3^-HLA-DR⁺ _кон)×100)/CD3^-HLA-DR⁺ _кон., где:

CD3^-HLA-DR⁺ _скл - относительное число клеток субпопуляции CD3^-HLA-DR⁺ в смешанной культуре лимфоцитов, %;

CD3^-HLA-DR⁺ _кон - относительное число клеток субпопуляции CD3^-HLA-DR⁺ в монокультуре анализируемого донора, %;

KП_CD45+HLA-DR+=((CD45⁺HLA-DR⁺ _скл-CD45⁺HLA-DR⁺ _кон)×100)/CD45⁺HLA-DR⁺ _кон., где:

CD45⁺HLA-DR⁺ _скл - относительное число клеток субпопуляции CD45⁺HLA-DR⁺ в смешанной культуре лимфоцитов, %;

CD45⁺HLA-DR⁺ _кон - относительное число клеток субпопуляции CD45⁺HLA-DR⁺ в монокультуре анализируемого донора, %.

Наиболее значимыми для оценки эффективности аллоиммунного распознавания по HLA являются субпопуляции CD3^-HLA-DR⁺ и CD45⁺HLA-DR⁺. Наличие аллоиммунного ответа документируется при положительном КП для этих субпопуляций.

По вышеуказанному протоколу было выполнено исследование смешанной культуры мононуклеаров от 23 пар различных неродственных доноров. Для изучения воспроизводимости метода было выполнено по четыре дублирующих постановки от шести пар неродственных доноров. Показано, что после проведения инкубации в смешанной культуре мононуклеаров изменяется соотношение их субпопуляций к таковым в соответствующей отдельной культуре. Данные представлены таблице 1.

После инкубации количество клеток субпопуляции CD3⁺HLA-DR⁺ в смешанной культуре мононуклеаров составило 2,33±0,13% против 1,09±0,11% в отдельных культурах, р>0,05. Статистически значимых различий (при использовании критерия Манна-Уитни) для данных показателей не выявлено. Для каждого случая по данной субпопуляции рассчитали коэффициент прироста: КП=((CD3⁺HLA-DR⁺ _скл-CD3⁺HLA-DR⁺ _кон.)×100)/CD3⁺HLA-DR⁺ _кон.

Разброс коэффициентов прироста для данной субпопуляции мононуклеаров находился в пределах от -34,7% до +115,3%, что указывает на изменение экспрессии маркера, характеризующую данную субпопуляцию при аллогенных иммунных взаимодействиях по HLA от угнетения до выраженной активации. Процент пар неродственных доноров имеющих отрицательные показатели коэффициента прироста, составил 21,73% (5 пар). В целом, средний коэффициент прироста для данной популяции был равен 43,81±6,31%.

Относительное количество клеток субпопуляции CD3^-HLA-DR⁺ после инкубации в смешанной культуре мононуклеаров составляло 21,87±2,16%, а в монокультурах - 15,63±1,08%, р<0,05. Для этой субпопуляции рассчитывали аналогичный коэффициент прироста. Не было выявлено ни одного отрицательного коэффициента, и значения КП находились в пределах от 26,71% до 64,21%, составив в среднем 44,13±2,23%. Эти данные указывают на то, что вышеназванная субпопуляция мононуклеаров отражает степень выраженности иммунного ответа на аллоНLА для неродственных доноров.

Относительное содержание клеток субпопуляции CD45⁺HLA-DR⁺ после инкубации в смешанной культуре мононуклеаров состовляло 24,11±3,05%, а в монокультурах - 16,72±1,79%, р<0,05. Расчет коэффициента прироста для данной субпопуляции показал отсутствие отрицательных результатов, предел его изменений был от 19,33% до 57,17%, составив в среднем 38,19±3,56%. Необходимо учитывать, что данная субпопуляция образуется за счет CD3⁺/HLA-DR⁺ и CD3^-/HLA-DR⁺, а так как доминируют последние, то и оценка активности на аллоНLА по CD45⁺/HLA-DR⁺ фактически совпадает с CD3^-/HLA-DR⁺.

Учитывая тот факт, что в пяти семейных парах коэффициент прироста по субпопуляции CD3⁺/HLADR⁺ был отрицательным, нами проведен расчет процента негативного иммунного ответа для всех субпопуляций и получена величина, равная 7,25%. Тем самым эффективность данного метода оценки аллоиммунных взаимодействий по HLA приняли за 92,75%.

Исследования воспроизводимости метода показали, что для субпопуляции CD3⁺/HLA-DR⁺ среднее отклонение от минимального до максимального коэффициента прироста в дублирующих постановках составляет 10,57±1,22%; для субпопуляции CD3⁺/HLA-DR⁺ - 9,33±0,96%, а для субпопуляции CD45⁺/HLA-DR⁺ - 9,25±0,93%. Среднее отклонение для всех показателей - 9,71±0,59%. На основании этого можно сделать заключение, что воспроизводимость метода выше 90,25%.

В целом, представленные данные указывают на то, что предложенный способ оценки аллоиммунных взаимодействий мононуклеаров неродственных доноров является эффективным (92,75%) и воспроизводимым (90,25%) диагностическим методом.

Для подтверждения эффективности способа провели исследования разработанным методом смешанной культуры мононуклеаров распознавание аллогенности по HLA-DR двух неродственных доноров и пары близнецов.

Пример 1. Донор Н. (№1), женщина, 34 года, проходила прегравидарную подготовку в ЗАО «Современные медицинские технологии» на этапе планирования беременности (амбулаторная карта ЗАО «Современные медицинские технологии» №5-14-983/ж). Клиническое обследование показало, что женщина не имеет хронической соматической и генитальной патологии. При обследовании на заболевания, передающиеся половым путем, наличие урогенитальных инфекций не выявлено.

Донор Е. (№2), мужчина, возраст 35 лет, является мужем донора №1. Вместе с супругой проходил обследование в ЗАО «Современные медицинские технологии» (амбулаторная карта ЗАО «Современные медицинские технологии» №5-14-983/м). Как и супруге, проведено исследования на урогенитальные инфекции, осмотрен терапевтом и урологом. Общий диагноз - здоров.

При проведении смешанной культуры мононуклеаров установлено, что иммунный ответ женских мононуклеаров на мужские (донор №1 против донора №2) характеризовался следующими коэффициентами прироста: KП_CD3 ⁺ _HLA-DR ⁺=(+)23%; KП_CD3 ^- _HLA-DR ⁺=(+)54% и KП_СD45 ⁺ _HLA-DR ⁺=(+)51%.

При оценке иммунного ответа мужских мононуклеаров на женские мононуклеары (донор №2 против донора №1) были получены следующие коэффициенты прироста: KП_CD3 ⁺ _HLA-_DR+=(+)38%; KП_CD3 ^- _HLA-DR ⁺=(+)61% и KП_СD45 ⁺ _HLA-DR ⁺=(+)58%.

Тем самым в смешанной культуре мононуклеаров «донор №1 против донора №2» и «донор №2 против донора №1» отмечен прирост субпопуляций, что указывает на наличие аллогенного иммунного ответа, индуцированного различием доноров по HLA-DRB1*. Последний факт был документирован молекулярно-генетическим типированием на коммерческих наборах НПФ «ДНК-технологии». У женщины обнаружен генотип HLA-DRB1*01,07, у супруга - генотип HLA-DRB1*04,10.

Таким образом, по результатам иммунологического и молекулярно-генетического исследования в семейной паре (донор №1 и донор №2) общих аллелей не обнаружено.

Пример 2. Донор Л. (№1), женщина, возраст 25 лет проходила прегравидарную подготовку в ЗАО «Современные медицинские технологии» на этапе планирования беременности (амбулаторная карта ЗАО «Современные медицинские технологии» №5-14-631/ж). Клинико-диагностическое обследование показало, что женщина не имеет хронической генитальной и экстрагенитальной патологии. Все исследования на урогенитальные инфекции были отрицательные.

Донор М. (№2), мужчина, возраст 32 года, является мужем донора №1. Вместе с супругой проходил обследование в ЗАО «Современные медицинские технологии» (амбулаторная карта ЗАО «Современные медицинские технологии» №5-14-631/м). Донору №2 проведено исследование на урогенитальные инфекции, он осмотрен узкими специалистами и терапевтом. Диагноз после обследования - здоров.

Смешанная культура мононуклеаров показала, что иммунный ответ женских мононуклеаров против мужских (донор №1 против донора №2) характеризовался следующими коэффициентами прироста: KП_CD3 ⁺ _HLA-DR ⁺=(+)19%; KП_CD3 ^- _HLA-DR ⁺=(+)42% и KП_СD45 ⁺ _HLA-DR ⁺=(+)39%.

Иммунный ответ мужских мононуклеаров на женские (донор №2 против донора №1) проявился следующими коэффициентами прироста: KП_CD3 ⁺ _HLA-DR ⁺=(-)11%; KП_CD3 ^- _HLA-DR ⁺=(+)34% и KП_СD45 ⁺ _HLA-DR ⁺=(+)31%.

Как следует из полученных данных KП_СD3-_HLA-_DR+ и KП_СD45+_HLA-_DR+ были всегда положительными как для иммунного ответа «донор №1 против донора №2», так и для обратной ситуации: «донор №2 против донора №1». Эти данные доказывают, что различие доноров по HLA-DRB1* всегда отражено в увеличении численности субпопуляций CD3^-HLA-DR⁺ и CD45⁺HLA-DR⁺. В соответствии с представленными данными, прироста субпопуляции CD3⁺HLA-DR⁺ в смешанной культуре мононуклеаров с направленностью «донор №2 против донора №1» не происходило. Вполне вероятно, что это обусловлено функциональным генотипом донора №1 (HLA-DRB1*11,13). Известно, что аллель HLA-DRB1*13 (антиген HLA-DR6) имеет низкие антигенные свойства, сопоставимые с антигенными свойствами эритроцитарного антигена 0(I) группы крови [15]. Именно это функциональное свойство и определило отсутствие иммунной стимуляции через субпопуляцию CD3⁺HLA-DR⁺. Это дает основание заключить, что коэффициенты KП_СD3-HLA-DR+ и KП_{СD45+HLA-DR+} являются основными для дифференцировки аллогенности доноров по HLA-DRB1*, а коэффициент KП_СD3+HLA-DR+ указывает на функциональные особенности взаимодействующих генотипов HLA-DRB1*.

При проведении молекулярно-генетического типирования гена HLA-DRB1 коммерческими наборами НПФ «ДНК-технология» (г. Москва) у женщины обнаружен генотип HLA-DRB1*11,13. Молекулярно-генетическое типирование локуса HLA-DRB1 выявило у мужчины генотип HLA-DRB1*01,17.

Таким образом, согласно результатам иммунологического и молекулярно-генетического исследования в данной семейной паре общих аллелей не обнаружено.

Пример 3. Донор X. (№1), мужчина, возраст 21 год, проходил лабораторное обследование в ЗАО «Современные медицинские технологии» (амбулаторная карта ЗАО «Современные медицинские технологии» №3-14-711). Донор С.(№2), 21 год (брат близнец донора №1), также проходил лабораторное обследование в ЗАО «Современные медицинские технологии» (амбулаторная карта ЗАО «Современные медицинские технологии» №3-14-712). Обоим донорам было проведено молекулярно-генетическое типирование гена HLA-DRB1 с использованием коммерческих наборов НПФ «ДНК-технология» (г. Москва). Выявлено, что у донора №1 и донора №2 общий генотип HLA-DRB1*14,15.

При проведении смешанной культуры мононуклеаров, используя известные формулы, выявили следующие коэффициенты для пары донор №1 против донора №2:

KП_CD3+HLA-DR+=((CD3⁺HLA-DR⁺ _скл-CD3⁺HLA-DR⁺ _кон.)×100)/CD3⁺HLA-DR⁺ _кон

KП_CD3+HLA-DR+=((6,21%-6,23%)*100%)/6,23%=-0,32%;

KП_CD3-HLA-DR+=((CD3^-HLA-DR⁺ _скл-CD3^-HLA-DR⁺ _кон.)×100)/CD3^-HLA-DR⁺ _кон

КП_CD3-HLA-DR+=((15,33%-16,02%)*100%)/16,02%=-4,31%;

KП_CD45+HLA-DR+=((CD45⁺HLA-DR⁺ _скл-CD45⁺HLA-DR⁺ _кон.)×100)/CD45⁺HLA-DR⁺ _кон

KП_CD45+HLA-DR+=((21,54%-22,25%)*100%)/22,25%=-3,19%.

При оценке иммунного ответа в направлении донор №2 против донора №1, согласно нижеприведенным формулам, были получены следующие коэффициенты прироста:

KП_CD3+HLA-DR+=((CD3⁺HLA-DR⁺ _скл-CD3⁺HLA-DR⁺ _кон.)×100)/CD3⁺HLA-DR⁺ _кон

KП_CD3+HLA-DR+=((6,11%-6,13%)*100%)/6,13%=-0,33%;

KП_CD3-HLA-DR+=((CD3^-HLA-DR⁺ _скл-CD3^-HLA-DR⁺ _кон.)×100)/CD3^-HLA-DR⁺ _кон

КП_CD3-HLA-DR+=((14,28%-15,01%)*100%)/15,01%=-4,87%;

KП_CD45+HLA-DR+=((CD45⁺HLA-DR⁺ _скл-CD45⁺HLA-DR⁺ _кон.)×100)/CD45⁺HLA-DR⁺ _кон

KП_CD45+HLA-DR+=((20,39%-21,14%)*100%)/21,14%=-3,55%.

Анализируя вышеизложенное, можно заключить, что по всем трем коэффициентам для иммунных ответов «донор №1 против донора №2» и «донор №2 против донора №1» отмечено отсутствие увеличения численности субпопуляций в смешанной культуре мононуклеаров по отношению к контролю. Более того, удельный вес оцениваемых популяций в смешанной культуре мононуклеаров был ниже, чем в монокультурах, поэтому все расчетные коэффициенты были отрицательные. Это указывает на отсутствие аллогенного иммунного ответа по HLA, что справедливо, поскольку доноры были близнецами и имели общий генотип HLA-DRB1*. Последний факт был документирован молекулярно-генетическим типированием на коммерческих наборах НПФ «ДНК-технологии».

Таким образом, преимущества предложенного изобретения заключается в следующем:

1. Способ оценки аллогенного иммунного ответа в кратковременной смешанной культуре мононуклеаров неродственных доноров включает одномоментный анализ субпопуляций мононуклеаров с фенотипом CD3⁺/HLA-DR⁺, CD3^-/HLA-DR⁺, CD45⁺/HLA-DR⁺ каждого донора (разделенных и гейтированных различным флуоресцентным красителем) в их смешанной культуре с помощью проточной цитофлуориметрии, с последующим сопоставлением степени экспрессии HLA-DR на соответствующих мононуклеарах смешанной культуры и контрольных отдельных культур мононуклеаров каждого донора.

2. По уровню экспрессии HLA-DR в смешанной культуре мононуклеаров одновременно происходит оценка иммунного ответа одного донора на аллогенные антигены другого и, наоборот, с ошибкой воспроизводимости менее 10%.

3. Способ не требует проведения дополнительных контрольных серий исследования.

4. Проводится патогенетически обоснованная оценка экспрессии мононуклеарами HLA-DR которые, с одной стороны, являются основными молекулами межклеточных контактов, с другой стороны, - главными аллогенными молекулами тканевой совместимости.

5. Метод исследования является достаточно специфичным для лабораторных исследований иммунных взаимодействий по аллогенным антигенам двух неродственных доноров, что можно использовать в трансплантологии или же при обследовании супругов для диагностики иммунных причин репродуктивных потерь.

Предлагаемый способ является нетрудоемким и может быть использован в клинико-диагностических лабораториях.

Источники информации

1. Bain В, Vas Mr., Lowenstein L. The development of large immature mononuclear cells in mixed leucocyte cultures // Blood. - 1964. - Jan. - V. 23. - P. 108-116.

2. Park В.H. and Good R.A. Third Party Mixed-Leukocyte Culture Test: A Potential New Method of Histocompatibility Testing // Proc Natl Acad Sci USA. - Jun. - 1972. - V. 69(6). - P. 1490-1493.

3. Albrechtsen D., Bratlie Α., Nousiainen H., Solheim B.G., Winther N., Thorsb E. Serological typing of HLA-D: Predictive value in mixed lymphocyte cultures (MLC) // Immunogenetics. - 1978. - V. 6, Issue 1. - P. 91-100.

4. Hajek-Rosenmayr A. Mixed lymphocyte culture as a compatibility test for bone marrow transplantation // Wien Klin Wochenschr. - 1986. - Jan 24. - V. 98(2). - P. 44-49.

5. Приказ Минздрава РСФСР «О внедрении в практику здравоохранения трансплантации костного мозга», №31 от 25.02.1991.

6. Pandey M.К., Saxena V. and Agrawal S. Characterization of mixed lymphocyte reaction blocking antibodies (MLR-Bf) in human pregnancy // BMC Pregnancy and Childbirth. - 2003. - V. 3(2). - P. 1471-2393.

7. Говалло, В.И. Иммунология репродукции / M.: Медицина, 1987. - 304 с.

8. Фримель Г. Иммунологические методы / М.: Медицина, 1987. - 476 с.

9. Королькова О.Ю., Сенюков В.В., Кожевников B.C. Экспрессия эрготоп-ассоциированных маркеров активированными Т-лимфоцитами // Медицинская Иммунология. - 2009. - Т. 11. - №2-3. - С. 234-235.

10. Булычева Т.И., Дейнеко Н.Л. Способ иммуноцитохимической оценки пролиферативного состояния лимфоцитов по характеру экспрессии с-концевого фрагмента белка b23/нуклеофозмина в реакции непрямой иммунофлюоресценции, патент на изобретение RU 2438135.

11. Григорьев А.А., Дейнеко Н.Л., Булычева Т.И. Способ иммунохимической оценки пролиферации лимфоцитов человека с помощью нового маркера - ядрышкового белка а3, патент на изобретение RU 2431670.

12. Самбур М.Б. Способ оценки взаимодействия лимфоцитов in vitro, основанный на определении их розеткообразующей способности // Иммунология. - 1991. - №2. - С. 30-33.

13. Ярилин А.А. Иммунология / М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. - 752 с.

14. Леплина О.Ю. Характеристика интерферон-альфа-индуцированных дендритных клеток и их терапевтический потенциал в лечении онкологических и инфекционных заболеваний: автореф. дисс. … канд. мед. наук, Новосибирск. - 2011. - 28 с.

15. Зарецкая Ю.М., Клиническая иммуногенетика / М.: Медицина, 1989. - 234 с.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для оценки аллогенного иммунного ответа в кратковременной смешанной культуре мононуклеаров неродственных доноров. Для этого с помощью проточной цитофлуориметрии проводят одномоментный анализ субпопуляций мононуклеаров с фенотипом CD3⁺HLA-DR⁺, CD3^-HLA-DR⁺, CD45⁺HLA-DR⁺ каждого донора, разделенных и гейтированных различным флуоресцентным красителем в их смешанной культуре. После чего рассчитывают коэффициенты прироста (КП) для каждой субпопуляции. При положительных значениях КП_CD3-HLA-DR+, и КП_CD45+HLA-DR+ делают заключение о наличии иммунного распознавания по аллоHLA, а коэффициент КП_CD3+HLA-DR+ указывает на функциональные особенности взаимодействующих генотипов HLA-DRB1*. Изобретение позволяет оценить иммунные взаимодействия и выявить аллогенную клеточную сенсибилизацию по аллогенным антигенам главного комплекса тканевой совместимости. 1 табл., 2 ил., 3 пр.

Способ оценки аллогенного иммунного ответа в кратковременной смешанной культуре мононуклеаров неродственных доноров на основании иммунологического исследования венозной крови, отличающийся тем, что включает одномоментный анализ субпопуляций мононуклеаров с фенотипом CD3⁺HLA-DR⁺, CD3^-HLA-DR⁺, CD45⁺HLA-DR⁺ каждого донора, разделенных и гейтированных различным флуоресцентным красителем в их смешанной культуре, с помощью проточной цитофлуориметрии, с последующим расчетом коэффициентов прироста для каждой субпопуляции по формулам:

где:
- относительное число клеток субпопуляции CD3⁺HLA-DR⁺ в смешанной культуре лимфоцитов, %;
- относительное число клеток субпопуляции CD3⁺HLA-DR⁺ - в монокультуре анализируемого донора, %;

где:
- относительное число клеток субпопуляции CD3^-HLA-DR⁺ в смешанной культуре лимфоцитов, %;
- относительное число клеток субпопуляции CD3^-HLA-DR⁺в монокультуре анализируемого донора, %;

где:
- относительное число клеток субпопуляции CD45⁺HLA-DR⁺ в смешанной культуре лимфоцитов, %;
- относительное число клеток субпопуляции CD45⁺HLA-DR⁺ в монокультуре анализируемого донора, %;
и при положительных значениях КП_CD3-HLA-DR+ и КП_CD45+HLA-DR+ делают заключение о наличии иммунного распознавания по аллоHLA, а коэффициент КП_CD3+HLA-DR+ указывает на функциональные особенности взаимодействующих генотипов HLA-DRB1*.