СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ АНТИТЕЛ, СПЕЦИФИЧНЫХ К АНТИГЕНУ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ЭНДОМЕТРИАЛЬНОЙ ТКАНИ ЧЕЛОВЕКА, В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ ЧЕЛОВЕКА, СОДЕРЖАЩИХ СПЕЦИФИЧНЫЕ АНТИТЕЛА Российский патент 2007 года по МПК G01N33/68 C07K16/18 

Изобретение относится к области клинической лабораторной диагностики и может найти применение в гинекологии и акушерстве для постановки диагноза аутоиммунного синдрома, сопутствующего клинической картине эндометриоза и других заболеваний женской репродуктивной системы.

Известен лабораторный метод определения аутоантител к антигену эндометрия, описанный в статье "The prevalence of endometrial immunoglobulin G antibodies in patients with endometriosis". O.A.Odukoya, N.Wheatcroft, A.P.Weetman, I.D.Cooke //Human Reproduction, Oxford University press, Oxford, England, 1995, vol.10, №5, pp.1214-1219 ("Преобладание эндометриальных антител типа иммуноглобулинов G у пациенток с эндометриозом". О.А.Одукойя, Н.Уиткрофт, А.П.Уитмен, И.Д.Кук //Репродукция человека, изд-во Оксфордского ун-та, Оксфорд, Англия, 1995, том 10, №5, стр.1214-1219 - см. Приложение 1). Известный метод является иммуноферментным твердофазным (ELISA). В данной работе в качестве антигена использовали гомогенат образцов эндометриальных тканей, содержащий как стромальные, так и эпителиальные клетки. Согласно описанию при осуществлении данного метода образцы гомогенизировали при +4°С в присутствии ингибиторов протеиназ. Тяжелые фракции осаждали путем центрифугирования, удаляли IgG путем инкубации с протеин-А Сефарозой и полученную взвесь клеточных компонентов использовали в качестве антигена.

Полученный описанным способом антиген включает в себя компоненты эпителиальных и стромальных клеток и не дает возможности определять антитела, специфичные к антигенам клеток каждого типа.

В качестве ближайшего аналога рассмотрен лабораторный метод более точного определения антител к антигену эндометрия (целевому антигену) путем проведения твердофазного иммуноферментного анализа (ТИФА), описанный в статье "Antiendometrial antibodies in women measured by an enzyme-linked immunosorbent assay". S.Femandez-Shaw, S.H.Kennedy, B.R.Hicks, K.Edmonds, P.M.Starkey, B.H.Barlow //Human reproduction, Oxford University press, Oxford, England, 1996, vol.11, №.6, pp.1180-1184. ("Анти-эндометриальные антитела у женщин, измеренные путем иммуноферментного анализа (ELISA)". К.Фернандес-Шоу, С.Х.Кеннеди, Б.Р.Хикс, К.Эдмондс, П.М.Старки, Б.Х.Барлоу //Репродукция человека, изд-во Оксфордского ун-та, Оксфорд, Англия, 1996, том 11, №6, стр.1180-1184 - см. Приложение 2). Авторы предложили три варианта приготовления антигена: первый - непосредственно из образцов тканей эндометрия пациентов, второй - с применением выделения клеток эпителия эндометрия пациентов и третий - с использованием в качестве источника антигена лабораторной культуры клеток эпителия эндометрия. Выделение клеток эпителия эндометрия проводили путем иммуномагнитной сепарации, клеточные компоненты разделяли многократным центрифугированием и полученные различные взвеси клеточных компонентов использовали в качестве целевого антигена при проведении иммуноферментного анализа антител.

Полученный описанным способом антиген включает в себя компоненты эпителиальных клеток и не дает возможности определять антитела, специфичные к антигенам стромальных клеток.

По мнению авторов, стромальные клетки эндометрия по их иммунохимическим свойствам обладают высокой степенью специфичности и антигенной активности. Это подтверждено статистически достоверными результатами как клинической, так и лабораторной диагностики при эндометриозе. Отсюда следует, что применение именно стромальных клеток в качестве источника антигена предоставляет возможность для более точной диагностики по сравнению с использованием клеток эпителия. Микросомальную фракцию клеток различных тканей традиционно используют в качестве антигенов в иммунохимической диагностике при выполнении иммуноферментного анализа. Фракция по своему составу представляет собой скопление внутренних мембран клеток, с которыми связаны комплексы ферментов. Практически всегда микросомальная фракция обладает высоким аффинитетом (степенью связывания) к циркулирующим в крови больных аутоантителам. Соответственно, данную клеточную фракцию можно рассматривать в качестве наиболее специфичного и активного антигена для проведения иммуноферментного анализа.

Изобретение направлено на получение диагностических показателей, позволяющих с высокой степенью достоверности свидетельствовать о заболевании (патологии) аутоиммунного характера. Предложенный метод позволяет выявить и диагностировать аутоиммунные патологии при нарушениях функционирования репродуктивного аппарата у женщин, а также при системных заболеваниях у женщин. При применении данного антигена удалось минимизировать явление "иммунологического перекреста", при котором имеет место сопутствующая реакция с антигенами других тканей. Соответственно, снижается опасность постановки ошибочного диагноза аутоиммунного синдрома вследствие одновременного выявления аутоантител к тканям других органов.

Решение поставленной задачи базируется на проведении традиционного ТИФА и реализуется за счет принципиально нового подхода к способу получения антигена, основанному на выделении из образцов нормальных тканей эндометрия человека изолированных стромальных клеток и последующего получения из них микросомальной фракции. Такой подход позволяет определить количество антител, специфичных исключительно к антигену стромальных клеток эндометрия, что дает возможность клинической лабораторной диагностики аутоиммунного синдрома.

Выделенный описанным выше образом целевой антиген представляет собой микросомальную фракцию стромальных клеток, к которой специфична подавляющая часть аутоантител. Взаимодействие аутоантител данной специфичности с антигеном микросомальной фракции стромальных клеток представляет собой одну из причин аутоиммуного синдрома при эндометриозе. Наличие этих аутоантител является важным диагностическим признаком. Использование полученного описанным способом антигена позволяет снизить уровень неспецифических реакций.

Традиционный твердофазный иммуноферментный анализ (ТИФА) включает химическое связывание антигена с поверхностью микропланшета с последующим помещением биологической жидкости, содержащей антитела, на микропланшет, инкубирование, проведение цветной реакции и спектрофотометрическую оценку показателей цветной реакции. При этом получают целевой антиген, подвергая ферментативному гидролизу образцы нормальных тканей человека, содержащих стромальные клетки эндометрия. Реакцию ферментативного гидролиза останавливают добавлением хелатирующего агента. Полученную смешанную суспензию клеток подвергают центрифугированию в непрерывном градиенте плотности, в результате чего изолируют стромальные клетки. Микросомальную фракцию стромальных клеток используют в качестве целевого антигена, который в выбранных разведениях ковалентно связывают с поверхностью лунок микропланшета, затем в серию лунок вносят в заданных разведениях калибровочный материал, приготовленный на основе стандартного препарата специфичных к целевому антигену антител, в другую серию лунок - исследуемые пробы биологической жидкости и после проведения традиционного ТИФА по спектрофотометрическим показателям строят калибровочную кривую и по ней определяют концентрацию специфичных антител.

Данный способ позволяет установить "базовый" (нормальный) уровень аутоантител, специфичных к антигенам стромальных клеток эндометрия, а также произвести количественную оценку в условных единицах (Е/мл) уровня концентраций естественных (природных) аутоантител к антигену эндометрия у женщин. Уровень таких антител выше "базового" свидетельствует о заболевании (патологии) аутоиммунного характера. Установление высокого уровня специфичных аутоантител (концентрация аутоантител выше 200-250 Е/мл) служит основанием для постановки диагноза аутоиммунного заболевания, как правило, сопровождающего эндометриоз.

Выделенный и иммобилизованный описанным выше образом целевой антиген представляет собой адсорбированную в лунках микропланшета микросомальную фракцию стромальных клеток эндометрия (МФСК), которые способны в опыте связывать специфичные антитела, при этом антиген постоянного химического состава и молекулярного строения может быть получен многократно. Кроме того, появляется возможность единовременного обследования большого количества проб (до 40 анализов), а также получение относительно больших (до 600 мг) количеств готового антигена и его длительное хранение в замороженном состоянии.

На фиг.1 представлена схема нанесения калибровочного материала в лунки микропланшета. На фиг.2 представлен пример построения калибровочной кривой.

Способ осуществляется следующим образом.

Образцы нормальных (без видимой анатомической и гистологической патологии) тканей эндометрия человека, полученные в ходе диагностических обследований, и замороженные подвергают размораживанию и затем ферментативному гидролизу. Гидролиз проводят следующим образом: образцы тканей инкубируют с коллагеназой (очищенная бактериальная коллагеназа - коммерческий препарат "коллализин", пр-во НИИ вакцин и сывороток, Санкт-Петербург, Россия). Инкубацию проводят в термостате при 37°С в течение 60-80 минут до появления визуальных признаков мацерации образцов. После появления признаков мацерации ферментативный гидролиз продолжают еще в течение 10 минут, после чего останавливают реакцию добавлением этилендиаминтетраацетата - динатриевой соли (ЭДТА-2Nа) до конечной концентрации 1%. Мацерат с раствором ЭДТА-2 Na выдерживают 20 минут при комнатной температуре и постоянном помешивании, после чего мацерат промывают стандартным забуференным физиологическим раствором (ЗФР). Смешанную клеточную суспензию продавливают сквозь нейлоновый фильтр диаметром 220 мкм и концентрируют путем центрифугирования в течение не менее 10 минут при 100 g. Для разделения эпителиальных и стромальных клеток тканей эндометрия приготовляют непрерывный градиент плотности на основе маточных растворов фиколла: А и В с концентрацией соответственно 10 и 15% фиколла на стандартном ЗФР. В каждый из маточных растворов добавляют баранью сыворотку до конечной концентрации 5%. С помощью миксера "GM" создают раствор фиколла с непрерывным распределением градиента плотности. Градиент стабилизируют путем центрифугирования в течение одного часа при 5000 g. Смешанную клеточную суспензию наносят на поверхность раствора фиколла и проводят разделение клеток центрифугированием в течение 2,5 часов при 10000 g. При центрифугировании эпителиальные клетки вследствие меньшей плотности концентрируются преимущественно в верхнем слое градиента, а стромальные (более плотные) - в нижнем. После центрифугирования из нижней части "столба" градиента плотности отбирают приблизительно 1/5 объема, отобранный материал промывают три раза раствором ЗФР с добавлением пятипроцентной бараньей сыворотки. Полученную суспензию стромальных клеток затем подвергают деструкции путем повторения процедуры "замораживание-оттаивание", которую осуществляют попеременным погружением капсулы с суспензией клеток в жидкий азот и воду комнатной температуры не менее десяти раз. Полученную после деструкции взвесь клеточных компонентов дополнительно центрифугируют. При этом отделяют остающуюся в надосадочной жидкости микросомальную фракцию стромальных клеток эндометриальной ткани, которую используют в качестве целевого антигена при определении аутоантител, специфичных к ткани эндометрия.

Раствор целевого антигена фиксируют добавлением формальдегида до конечной концентрации 2,5% и в дальнейшем, при необходимости, хранят в 50% растворе глицерина на ЗФР при температуре 20°С.

Полученный описанным выше способом целевой антиген ковалентно связывают с поверхностью лунок микропланшета согласно общепринятым методам [Нго Т.Т., Ленхофф Г. (ред.) Иммуноферментный анализ. Пер. англ., М., Мир, 1998, стр.172-192. [1]]. Для иммобилизации полученного антигена на твердой фазе используемую в качестве антигена микросомальную фракцию стромальных клеток (МФСК) разводят ЗФР до конечной концентрации 1 мкг/мл общего белка и вносят в лунки микропланшета для ТИФА по 100 мкл МФСК. Раствор оставляют в течение двух часов в холодильнике при температуре +4°С, затем в лунки добавляют глутаровый альдегид до конечной концентрации 5%. После этого микропланшет с иммобилизованным антигеном оставляют при температуре +4°С на ночь (10-12 часов) для полного связывания. Процедуру твердофазного иммуноферментного анализа проводят в традиционном варианте [[1], стр.193-209]. В качестве исследуемой биологической жидкости, кроме сыворотки крови, могут быть использованы амниотическая жидкость, спинномозговая жидкость и т.п.

Реагенты и расходные материалы, используемые при проведении ТИФА:

1. Микропланшет для проведения иммуноферментной реакции с нанесенньм антигеном, приготовление которого описано выше.

2. Стандартный раствор для промывки микропланшета (ПР), который готовят следующим образом: к ЗФР добавляют неионный детергент твин-20 до конечной концентрации 0,05%.

3. Стандартный препарат антител готовят из предварительно отобранных сывороток крови пациентов, у которых выявлены антитела, специфичные к целевому антигену, демонстрирующие в ТИФА оптическую плотность не менее "0,9". Отобранные образцы сывороток крови человека сливают вместе (делают "пул") и выделяют иммуноглобулиновую фракцию путем ионообменной хроматографии согласно общепринятой методике [X.Фримель (ред.) "Иммунологические методы". Пер. нем., М., Медицина, 1987]. Затем методом последовательных разведении [[1], стр.222-224] определяют минимальное количество специфичных антител, которое дают реакцию в ТИФА с 10 нг связанного с поверхностью микропланшета целевого антигена. Определенное таким образом количество антител обозначают как единицу "Е" стандартного препарата антител. Иммуноглобулиновую фракцию доводят до концентрации 25000 Е/мл и используют в качестве стандартного препарата антител, специфичных к целевому антигену.

4. Иммуноферментный конъюгат (ИФК) - в качестве иммуноферментного конъюгата используют моноклональные антитела, меченные пероксидазой хрена, со специфичностью к иммуноглобулинам соответствующего класса (IgG, IgM, IgA) или всех классов (специфичность к каппа- и лямбда-цепям иммуноглобулинов). В анализе используют моноклональные антитела производства лаборатории биотехнологии моноклональных антител Центрального рентгенорадиологического института (ЦНИРРИ, Санкт-Петербург).

5. Дилюент - растворитель (ДЛ) для разведения калибровочного материала, приготовленного на основе стандартного препарата антител, проб исследуемых биологических жидкостей и иммуноферментного конъюгата. ДЛ готовят путем добавления к ПР стерильной лошадиной сыворотки до конечной концентрации 1%.

6. Субстратная смесь - любой химический субстрат для проявления ферментативной пероксидазной реакции, например коммерческий препарат тетра-метил-бензидин (ТМБ) в растворе.

Подготовка реагентов и исследуемых проб к работе:

1. Приготовление калибровочного материала: стандартный препарат антител со специфичностью к МФСК разводят в 25 раз (например, при использовании одного микропланшета к 250 мл ДЛ добавляют 10 мкл стандартного препарата антител) и далее путем последовательных разведений в два раза получают соответственно образцы для калибровки в 1000; 500; 250; 125; 62,5; 31,5 и 15,6 Е/мл.

2. Исследуемые пробы разводят в зависимости от концентрации антител в конкретных биологических жидкостях в 25-100 раз, например, образцы сывороток крови разводят в 50 раз, то есть 5 мкл сыворотки разводят в 250 мкл ДЛ.

3. Приготовление рабочего раствора ИФК: исходный коммерческий раствор ИФК разводят ДЛ согласно рекомендациям изготовителя. Например, используемые ИФК производства ЦНИРРИ разводят в 150 раз, при использовании в опыте одного микропланшета к 70 мкл коммерческого раствора добавляют 10500 мкл ДЛ.

4. Рабочий раствор субстратной смеси для проявления цветной ферментативной реакции приготовляют непосредственно перед употреблением путем смешивания раствора тетра-метил-бензидина (ТМБ) и раствора пероксида водорода (например, при использовании реагентов производства АО "Протеиновый контур" (Санкт-Петербург) смешивают равные объемы растворов "Реагент" и "Субстрат").

5. В качестве реагента, останавливающего цветную реакцию (стоп-раствор), используют 9% раствор соляной кислоты.

Проведение ТИФА:

1. В лунки микропланшета вертикальных рядов 1 и 2 вносят по 100 мкл калибровочного материала в возрастающем порядке концентраций: 0 (холостая проба - чистый ДЛ); 15,6; 31,5; 62,5; 125; 250; 500 и 1000 Е/мл (см. фиг.1). Причем материал каждой концентрации вносят в параллели в две соседние лунки одного вертикального ряда, например калибровочный материал 15,6 Е/мл вносят в лунки "С" и "D" ряда "1". В лунки вертикальных рядов с 3 по 12 вносят также попарно в параллели по 100 мкл разведенных образцов исследуемых биологических жидкостей, например, одну пробу вносят в лунки "А" и "В" вертикального ряда "3".

2. Микропланшет с внесенным калибровочным материалом и исследуемыми пробами накрывают крышкой и инкубируют в термостате при 45°С в течение одного часа.

3. Содержимое лунок микропланшета удаляют резким встряхиванием и промывают лунки шесть раз раствором ПР.

4. Во все лунки микропланшета вносят по 100 мкл свежеприготовленного рабочего раствора ИФК, накрывают микропланшет и инкубируют в термостате при 45°С в течение 40 минут.

5. Лунки микропланшета промывают аналогично п.3.

6. Во все лунки микропланшета вносят по 100 мкл готового рабочего раствора субстратной смеси для проявления цветной реакции.

7. Микропланшет помещают в темное место и инкубируют при комнатной температуре приблизительно 10-15 минут до видимого визуального проявления "ступенчатой" окраски в лунках с калибровочным материалом. В остальных лунках проявляется окраска в зависимости от количества содержащихся в пробах специфичных антител.

8. Цветную реакцию останавливают добавлением в каждую лунку по 50 мкл стоп-раствора.

9. Результаты цветной реакции измеряют количественно с помощью вертикального оптического абсорбциометра (например "Униплан", АО "Пикон", Россия).

Расчет результатов: концентрацию специфичных антител в условных единицах (Е/мл) рассчитывают с помощью пакета программ типа "FIA-CALC" (фирма "Wallac", Финляндия) в режиме построения калибровочной кривой в двойных логарифмических координатах (Log/Log) с выравниванием кривой по методу "сплайн" интерполяции. Результаты можно также рассчитать посредством ручного построения графика калибровочной кривой в двойном логарифмическом масштабе с последующим нахождением искомых результатов на графике (см. фиг.2) [Чард Т. Радиоиммунные методы, М., Мир, 1981].

Лабораторные исследования, проведенные на базе НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О.Отта РАМН (Санкт-Петербург), показали, что "базовый" уровень нормальных аутоантител к целевому антигену у здоровых женщин составляет 200-250 Е/мл, а у мужчин соответственно 100-150 Е/мл.

Пример 1.

Больная Полякова А.Б., 40 лет, история болезни НПО НИИАГ им. Д.О.Отта РАМН 5840/02. Клинический диагноз: вторичное бесплодие, наружно-генитальный эндометриоз 1, миома матки, аутоиммунный тиреоидит (АИТ), недостаточность яичников (НЛФ), аутоиммунный эндометрит. Уровень аутоантител к антигену эндометрия - 450 Е/мл. После проведения комплексной терапии: коагуляция очагов эндометриоза и консервативная миомэктомия. Терапия агонистами гонадолиберина (бусерилин в течение 4-х месяцев), заместительная терапия АИТ и НЛФ, проведение внутриматочной лазерной терапии. Уровень антител к целевому антигену снизился: 255 Е/мл.

Пример 2.

Филиппова Е.Н., 25 лет, история болезни НПО НИИАГ им. Д.О.Отта РАМН 2510/04. Клинический диагноз: первичное бесплодие, наружно-генитальный эндометриоз 3. Уровень аутоантител к целевому антигену - 915 Е/мл. После проведения комплексной терапии: коагуляция очагов эндометриоза и терапия агонистами гонадолиберина (Золадекс в течение 3-х месяцев), внутриматочная лазерная терапия. Уровень антител к целевому антигену снизился: 195 Е/мл.

Изобретение относится к области клинической лабораторной диагностики и может найти применение в гинекологии и акушерстве для постановки диагноза аутоиммунного синдрома, сопутствующего клинической картине эндометриоза и других заболеваний женской репродуктивной системы. Традиционный твердофазный иммуноферментный анализ (ТИФА) включает химическое связывание антигена с поверхностью микропланшета с последующим помещением биологической жидкости, содержащей антитела, на микропланшет, инкубирование, проведение цветной реакции и спектрофотометрическую оценку показателей цветной реакции. При этом получают целевой антиген, подвергая ферментативному гидролизу образцы нормальных тканей человека, содержащих стромальные клетки эндометрия. Реакцию ферментативного гидролиза останавливают добавлением хелатирующего агента. Полученную смешанную суспензию клеток подвергают центрифугированию в непрерывном градиенте плотности, в результате чего изолируют стромальные клетки. Микросомальную фракцию стромальных клеток используют в качестве целевого антигена, который в выбранных разведениях ковалентно связывают с поверхностью лунок микропланшета, затем в серию лунок вносят в заданных разведениях калибровочный материал, приготовленный на основе стандартного препарата специфичных к целевому антигену антител, в другую серию лунок - исследуемые пробы биологической жидкости и после проведения традиционного ТИФА по спектрофотометрическим показателям строят калибровочную кривую и по ней определяют концентрацию специфичных антител. Технический результат - разработка способа, при помощи которого можно определить количество антител, специфичных исключительно к антигену стромальных клеток эндометрия, что дает возможность клинической лабораторной диагностики аутоиммунного синдрома. 1 з.п.ф-лы, 2 ил.

1. Способ количественного определения концентрации антител, специфичных к антигену стромальных клеток эндометриальной ткани человека, в биологических жидкостях человека, содержащих специфичные антитела, путем проведения твердофазного иммуноферментного анализа, включающего нанесение на микропланшет целевого антигена с последующим помещением исследуемой биологической жидкости на планшет, инкубирование, проведение цветной реакции и спектрофотометрическую оценку показателей цветной реакции, отличающийся тем, что в качестве исходного материала для получения целевого антигена берут образцы нормальных тканей эндометрия человека, которые подвергают ферментативному гидролизу до появления видимых признаков мацерации с последующей обработкой ткани хелатирующим агентом, затем из смешанной суспензии клеток центрифугированием в непрерывном градиенте плотности изолируют стромальные клетки, которые подвергают деструкции путем повторения процедуры "замораживание-оттаивание" не менее 10 раз, из полученной в результате деструкции взвеси клеточных компонентов дополнительным центрифугированием отделяют микросомальную фракцию стромальных клеток эндометриальной ткани, которую используют в качестве целевого антигена, который в выбранных разведениях ковалентно связывают с поверхностью лунок микропланшета, затем в процессе осуществления иммуноферментного анализа в серию лунок вносят в заданных разведениях калибровочный материал, приготовленный на основе стандартного препарата специфичных к целевому антигену антител, в другую серию лунок - исследуемые пробы биологической жидкости, микропланшет с внесенным калибровочным материалом и исследуемыми пробами подвергают инкубированию, с последующим проведением цветной реакции и по спектрофотометрическим показателям строят калибровочную кривую, по которой определяют концентрацию специфичных антител.2. Способ количественного определения концентрации антител по п.1, отличающийся тем, что непрерывный градиент плотности приготовляют на основе двух маточных растворов фиколла-400 с концентрацией соответственно 10% и 15% и стабилизируют градиент центрифугированием в течение одного часа при 5000 g.