Способ получения гамма-глобулиновой фракции человека для прегравидарной профилактики врожденных пороков сердца в последующем поколении Российский патент 2024 года по МПК G01N33/48 A61K39/395 B01D15/12 B01D15/16 B01D15/38 

Изобретение относится к медицине, а именно к аллергологии и иммунологии, предназначено для получения и оценки прототипа иммуноглобулина человека способного профилактировать иммунное воспаление в системе «мать-эмбрион/плод» и блокировать отдельные звенья патогенеза врожденных пороков сердца в последующем поколении.

Иммунные механизмы, лежащие в основе врожденных пороков, аномалий развития плода и репродуктивных потерь, продолжают активно изучаться [Есина Е.В., Логина Н.Ю., Аляутдина О.С. (2013). Роль иммунных взаимодействий в развитии бесплодия: обзор литературы. РМЖ. Мать и дитя, 21(1), 44-48.]. С позиции репродуктивной морфологии и физиологии в первые 8 недель беременности происходит иммунная адаптация материнского микроокружения к аллогенным антигенам эмбриона, совместно с активным органогенезом в последнем [King A., Allan D.S., Bowen М. et al. HLA-E expressed on trophoblast and interacts with CD94/NKG2 receptors on decidual NK cells // Eur. J. Immunol. 2000. V. 30. P. 1623-1631.; Kovats S., Main E., Librach C. HLA-G expressed in human trophoblast // Science. 1990. V. 248. P. 220-223.; Тарбаева Д.А., Кузник Б.И., Загородняя Э.Д., Иозефсон С.А. Функция HLA в репродуктивной системе // Забайкальский медицинский вестник. - 2009. - №1. - с. 6-19.]. Это процесс регулируется огромным количеством внутриклеточных и межклеточных мессенджеров. Формируются регуляторные сети, которые, с одной стороны, обеспечивают эффективный органогенез, но, с другой стороны, они подвержены влиянию внешнего микроокружения, в том числе иммунным взаимодействиям в системе «мать-эмбрион/плод». Последние определяют провоспалительный потенциал, распространяющийся на весь эмбриобласт. Неоднократно формулировалась гипотеза о триггерах, запускающих патологическую регуляцию эмбриогенеза сердечно-сосудистой системы, и являющихся продуктами патологических иммунных взаимодействий в системе «мать-эмбрион/плод» [Shabaldin А. V., Shmulevich S. A., Chistyakova G. N., Remizova I. I., Lukoyanycheva E. В., Gorshkov, S. V., Shabaldina E. V. (2019). Peculiarities of allogenic interactions in the short-term culture of lymphocytes of spouses who have children with congenital heart diseases or early reproductive losses. Medical Immunology (Russia), 21(2), 279-292.].

Именно на это общее звено патогенеза врожденных пороков и аномалий развития плода (в том числе врожденных пороков сердца - ВПС) и репродуктивных потерь, может быть направлена прегравидарная иммунная терапия.

Одним из ведущих препаратов для лечения иммунных причин репродуктивных потерь является иммуноглобулин для внутривенного введения, который входит в стандарты лечения аллогенной формы привычного невынашивания беременности [Сотникова Н.Ю., Малышкина А.И., Соловьева А.Е., Можаева Т.А. (2009). Иммуномодулирующая терапия невынашивания беременности. Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии, 8(6), 11-16.; Ушкалова Е.А., Шифман Е.М. (2011). Проблема нерегламентированного применения иммуноглобулина для внутривенного введения в акушерстве. Акушерство и гинекология, (3), 74-80.; Сельков С.А., Соколов Д.И., Чепанов С.В. (2013). Иммунорегуляторные эффекты иммуноглобулинов для внутривенного введения. Медицинская иммунология, 15(1), 5-12.]. Данный препарат может содержать антитела, блокирующих или модулирующих экспрессию аутогенных (материнские) и аллогенных (отцовские на эмбрионе и трофобласте) молекул антигенной презентации (HLA-DR) и эмбриональных молекул тканевой совместимости (HLA-G). Именно через эти механизмы, может быть ограничено воспаление в системе «мать-эмбрион» и, ассоциированный с ним, тератогенез в сердечнососудистой системе. Иммуноглобулины для внутривенного введения применяются в лечебных целях как до беременности, так и во время нее [Ушкалова Е.А., Шифман Е.М. (2011). Проблема нерегламентированного применения иммуноглобулина для внутривенного введения в акушерстве. Акушерство и гинекология, (3), 74-80.; Nyborg KM, Kolte AM, Larsen ЕС, Christiansen OB. Immunomodulatory treatment with intravenous immunoglobulin and prednisone in patients with recurrent miscarriage and implantation failure after in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection. Fertil Steril. 2014; 102 (6): 1650-1655. doi: 10.1016/j.fertnstert.2014.08.029.; Романенко H.A., Бессмельцев С.С, Чечеткин А.В. Коррекция иммунного статуса пациентов иммуноглобулином человека для внутривенного введения. Казанский медицинский журнал. 2017. №5. С 775-783.].

Группой для применения данного препарата могут быть семьи с репродуктивными потерями в анамнезе и имеющих детей с ВПС.Лечебный эффект будет заключаться в блокировании свободных для распознавания HLA молекул эмбриобласта.

Наибольшее количество антител к антигенам HLA различных классов, выявляется у женщин репродуктивного периода, и имеющих несколько детей, что доказывает их физиологическую роль [Дубоссарская З.М., Дубоссарская Ю.А. Основные вопросы иммунологии репродукции. Медицинские аспекты здоровья женщины. 2010. №31 (4). С 15-21.]. Соответственно, иммуноглобулин, полученный из крови многорожавших женщин, будет иметь больший протективный эффект в отношении блокирования иммунного воспаления в системе «мать-эмбрион/плод», и лежащего в основе патогенеза как репродуктивных потерь, так и ВПС. Получение очищенной фракции гаммаглобулина из крови многорожавших женщин и оценка ее функциональной активности в отношении молекул HLA-DR и HLA-G может быть первым этапом (прототипом) создания иммунобиологического препарата для прегравидарной профилактики врожденных пороков сердца.

Известно несколько способов получения иммуноглобулинов для внутривенного введения и блокирования их комплементарной активности [Волков А. В., Алешкин В. А. (1998). Способ получения иммуноглобулинового препарата.; Зорик А. В., Алешкин В. А., Лютов А. Г., Борисова И. В. (2002). Способ получения иммуноглобулинового препарата.; Мелихова А. В., Давыдкин В. Ю., Алешкин В. А., Давыдкин И. Ю. (2009).

Способ получения иммуноглобулинового препарата.], в основе которых лежит метод спиртового фракционирования сыворотки/плазмы крови по Кону [Заплатников А. Л. (2007). Специфические иммуноглобулины для внутривенного введения в педиатрической практике. Педиатрическая фармакология, 4(1), 48-50.]. Этот общепринятый способ фракционирования белков плазмы крови человека и животных, предусматривает использование этанола при низкой температуре от -3 до -5°С. В этих условиях белки сохраняют свои нативные свойства. Для дальнейшего выделения и очистки индивидуальных компонентов из полученных фракций наибольшее распространение в последнее время получил метод хроматографии.

Известен, способ хроматографического выделения иммуноглобулина, включающий растворение в буферном растворе белковой фракции плазмы крови, в качестве которой используют осадок А спиртового фракционирования плазмы крови по Кону [Карасев В.С, Бочкова О.П., Староверов С.М., Красильников И.В., Николаева А.М., Петровских В.П., Перевозчиков А.Б. (2012). Способ хроматографического выделения иммуноглобулина.]. Производят предварительную очистку полученного раствора в двух последовательно соединенных колонках, заполненных гидрофобным сорбентом и анионитом, соответственно, с последующим пропусканием через упомянутые две колонки буферного раствора. После сбора предварительно очищенной жидкой фракции, содержащей иммуноглобулин, ее направляют на вирусную сольвент-детергентную инактивацию, а затем на хроматографическую очистку, осуществляемую в системе из трех последовательно соединенных колонок, заполненных анионитом, гидрофобным сорбентом и катионитом, соответственно. Проводят элюирование иммуноглобулина с колонки, заполненной катионитом, а колонки с анионитом и гидрофобным сорбентом направляют на регенерацию. Изобретение обеспечивает возможность выделения иммуноглобулина из необогащенного сырья - осадка А, полученного спиртовым фракционированием плазмы крови по Кону, с высоким выходом и чистотой целевого продукта [Карасев В.С, Бочкова О.П., Староверов С.М, Красильников И. В., Николаева А. М., Петровских В. П., Перевозчиков А. Б. (2012). Способ хроматографического выделения иммуноглобулина.].

Известен способ очистки иммуноглобулина, содержащегося в белковой фракции плазмы крови, включающий ее растворение в буферном растворе, вирусную сольвент-детергентную инактивацию при комнатной температуре и хроматографическую очистку, при которой надосадочная жидкость, содержащая IgG, подвергается, по меньшей мере, одной операции обработки, например, в два этапа, но при необходимости и нескольким этапам анионообменной и катионообменной хроматографии для удаления значительной доли оставшихся загрязняющих примесей. В предпочтительном варианте осуществления изобретения осветленная и, при необходимости, профильтрованная надосадочная жидкость, содержащая IgG, наносится на анионообменную смолу и затем на катионообменную смолу, которыми заполнены две последовательно установленные колонки, уравновешенные одним и тем же буферным раствором. После промывки колонку с анионитом отключают, а колонку с катионитом, на которой сорбирован иммуноглобулин, элюируют буферным раствором с рН и концентрацией, достаточными для эффективного выделения целевого продукта в градиенте хлорида натрия. Элюированную фракцию с IgG концентрируют и обессоливают с помощью ультрафильтрации и обрабатывают Tween-80 и трибутилфосфатом для разрушения вирусов. Полученный раствор снова пропускают через две последовательно соединенные колонки с анионитом и катеонитом аналогично описанному выше. Колонку с анионитом отсоединяют и элюируют фракцию с IgG в градиенте хлорида натрия. Элюированную фракцию с IgG собирают в мальтозе и подвергают концентрированию [Лаурсен И., Тейснер Б. (2003). Способ получения иммуноглобулинов для внутривенного введения и другие иммуноглобулиновые продукты.].

Недостатками этих способов являются их сложность, многостадийность и низкий выход целевого продукта (менее 73%). Кроме того, эти способы разработаны для производства препаратов иммуноглобулинов из крови человека, что не является основой данного изобретения.

Существуют лабораторные методы для получения прототипов препаратов иммуноглобулинов. К ним относятся следующие методы и способы.

Метод получения фракции иммуноглобулинов G, М, А путем непрерывного электрофореза с предварительным спиртовым фракционированием плазмы крови. Он является трудоемким, его проведение возможно только при наличии специального оборудования, а полученный препарат является частично комбинированным [Патент US 4.246.085.].

Способ получения комплексного иммуноглобулинового препарата с использованием фосфата кальция и каприловой кислоты с дальнейшей обработкой на DEAE-Sephadex А-50 и бета-пропиолактоном. Такой способ получения является сложным, многостадийным, требующим специализированного оборудования, а его использование возможно в условиях высокоспециализированных лабораторий [Патент US 5.075.425.].

Наиболее близким по технической сущности получения донорского иммуноглобулина является способ хроматографического выделения иммуноглобулина, включающий растворение в буферном растворе белковой фракции плазмы крови, в качестве которой используют осадок А спиртового фракционирования плазмы крови по Кону. Однако этот способ может быть принят для дальнейшего производства иммуноглобулина человека.

Важным разделом изобретения является оценка полученной фракции гаммаглобулинов на наличие способности блокировать аллогенные HLA-G и HLA-DR.

Существует несколько способов оценки антител к HLA и блокирования этих молекул.

Известен способ определения антител к аллогенным HLA-G, в котором используется тест перекрестной совместимости (cross match) мононуклеаров донора с сывороткой реципиента. Проводят анализ субпопуляций мононуклеаров с помощью проточной цитофлуорометрии на связывание моноклональных антител HLA-G и оценивают степень экспрессии HLA-G на опытных и контрольных мононуклеарах донора. При этом значимыми являются субпопуляции CD3^-HLA-G⁺ и CD3⁺HLA-G⁺, по которым рассчитывают коэффициент подавления (КП) в опытной постановке по отношению к контрольной [Способ определения антител к аллогенным HLA-G. Шабалдин А.В., Мозес В.Г., Беленкова О.В., Шабалдина Е.В. Патент на изобретение RU 2585091 С1, 27.05.2016.

Заявка №2015101526/15 от 19.01.2015.].

Недостатком данного способа является отсутствие данных о применении его для очищенных фракций гаммаглобулинов.

Известен способ иммунологического исследования сыворотки крови реципиента для выявления антител к антигенам HLA системы с помощью методики Luminex, при котором в качестве носителя (твердой фазы) используют полистироловые микросферы с интегрированными в их состав двумя флуорофорами и покрытые очищенными рекомбинантными HLA-антигенами [Руководство по диагностическому лабораторному обеспечению трансплантации солидных органов, оригинал документа доступен на сайте: www.beaumont.ie.]. При наличии в сыворотке антител на поверхности микросферы образуется комплекс АГ-АТ. После добавления к сыворотке коньюгата проводят ее исследование в потоке направляющей жидкости, при этом каждая микросфера подвергается облучению двумя лазерами с разной длиной волны и сигнал, испускаемый флуорофорами, регистрируется датчиками прибора. Таким образом, анализируется одновременно тип микросферы и наличие (концентрация) искомого аналита на соответствующем типе частиц.

Недостатком известного способа является то, что он позволяет проводить идентификацию антител к классическим HLA-антигенам I (А, В и С) и II (DR, DQ) классов и не определяет низко полиморфные молекулы главного комплекса гистосовместимости - HLA-G и HLA-E.

Известен способ оценки перекрестной совместимости (cross-match) донора и реципиента с использованием проточной цитофлуорометрии [The National Histocompatibility And Immunogenetics Service For Solid Organ Transplantation-NHISSOT - 8 издание, Beaumont Hospital, Дублин, Ирландия, 2011.]. Перекрестную пробу на совместимость проводят путем инкубации лимфоцитов донора, полученных из периферической крови с сывороткой реципиента, после чего выполняют окрашивание клеток флуоресцентными красителями или флюоресцирующими моноклональными антителами. Далее с помощью проточной цитофлуорометрии проводят анализ на наличие антител к HLA-антигенам донора.

Недостатком способа является отсутствие стандартизации при интерпритации полученных данных между разными лабораториями, а также отсутствие рекомендаций по определению антител к аллогенным HLA-G.

Наиболее близким по технической сущности оценки способности блокировать экспрессию аллогенных HLA-G и HLA-DR является способ определения антител к аллогенным HLA-G, в котором используется тест перекрестной совместимости (cross match) мононуклеаров донора с сывороткой реципиента. Данный способ может быть принят в качестве прототипа.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа хроматографического выделения фракции гаммаглобулинов из крови многорожавших женщин, и оценка ее способности блокировать экспрессию HLA-G и HLA-DR на донорских лимфоцитах.

Сущность изобретения.

Технический результат изобретения заключается в принципиально новом способе забора биологического материала (донорская кровь женщин, имеющих более двух условно-здоровых детей и отсутствие в канамнезе репродуктивных потерь, а также рождение детей с врожденными пороками и аномалиями развития), новых современных методах получения и оценки чистоты выделения иммуноглобулина человека, а также принципиально новых методах оценки противовоспалительного потенциала, полученного иммунобиологического препарата. Технический результат достигается за счет выделения с помощью аффинной хроматографии из сыворотки крови многорожавших женщин гаммаглобулиновой фракции (ФГГ) ее оценки с помощью иммуноэлектрофореза, дальнейшее ее концентрирование более чем в 7 раз через лиофилизацию, последующее сравнение в ПААГ-ДСН с коммерческим лечебным иммуноглобулином человека для внутривенного введения (ИГЧ) и конечной сравнительной оценкой влияния ФГГ на мембранную экспрессию HLA-G и HLA-DR на аллогенных лимфоцитах детей с врожденными пороками сердца и без них (условно-здоровые дети) по отношению к аллогенной материнской сыворотки.

Получение фракции гаммаглобулина из плазмы многорожавших женщин.

Выделение ФГГ (с высокой концентрацией иммуноглобулина G, IgG) осуществляется при помощи системы DEAE Affi-Gel Blue (BioRad, USA).

Получение и десорбцию ФГГ осуществляется с применением подвижной фазы буферов (20 мм K₂HPO₄/ KH2PO4, рН 8,0, 0,02%). Значение рН регулируется с помощью добавления 0,1М КОН. Работу необходимо осуществлять на хроматографе низкого давления BioLogic (BioRad, USA). Подготовка сорбента включает рекомендованные производителем этапы, в том числе предварительную отмывку сорбента от остаточного красителя на стеклянном фильтре с последующем перенесением сорбента в фосфатный буфер и упаковку сорбента.

Фракции (рисунок 1) собирается с помощью коллектора фракций BioFrac. Регенерацию сорбента после анализа необходимо осуществлять на 0,5М растворе натрия хлора (NaCI).

За один сеанс возможно получение 80 мл ФГГ с концентрацией белка 5,0 г/л и остаточным альбумином менее 0,2 г/л. Концентрация белка в ФГГ соответствует нижней границе концентрации иммуноглобулина G в сыворотке крови человека. Данная фракция обозначается как ФГГ1.

Для оценки частоты гаммаглобулиной фракции осуществляется электрофорез белков сыворотки крови на коммерческих наборах для электрофоретического разделения белковой фракции сыворотки крови на мембранах ацетилцеллюлоза (КлиниТест-ЭФ, Россия). Снятие результатов электрофореза может проводиться на отечественном аппарате для электрофореза белков сыворотки крови УЭФ-01-«Астра» (Россия). Данные представлены на рисунке 2.

Как видно из рисунка (дорожка №6, ФГГ1) в анализируемом образце выявлялась, преимущественно, фракция гаммаглобулинов в невысокой концентрации. Эти данные наглядно показывают, что с помощью аффинной хроматографии была выделена именно фракция гаммаглобулинов.

Для детализации иммуноглобулинов в ФГГ необходимо дополнительно проводить иммуноэлектрофорез белков полученной фракции в 1,5% агарозном геле на 0,05М веронал-мединаловом буфере (ph=8,6) в три этапа. Первый этап был связан с проведением электрофореза белков хроматографического смыва в агарозном геле. На втором этапе в агарозный гель добавляется млоноспецифическая сыворотка против иммуноглобулина G человека (Моно-РИД-G, МикроГен, Россия), антитела которой при диффузии в геле преципитируют со специфическими молекулами. Третий этап связан с высушиванием и окрашиванием пластины с гелем для верификации линий преципитации.

Иммуноэлектрофорез анализируемого образца показал, что в хроматографическом смыве имеется фракция иммуноглобулина G человека (рисунок 3).

Необходимо отметить, что концентрация гаммаглобулинов в лечебных препаратах иммуноглобулинов для внутривенного введения равна 50 г/л. То для оценки эффектов коммерческих иммуноглобулинов для внутривенного введения (ИГЧ) и полученной ФГГ1, необходимо последнюю сконцентрировать как минимум в 5 раз.

Для концентрации ФГГ1 используется установка FreeZone 2.5 Plus (Labconco, США). Замороженные образцы в объеме по 40 мл лиофилизируются с использованием установки FreeZone 2.5 Plus (Labconco, США) в течение суток при вакууме 0,04 мБар и температуре от -50 С. В зависимости от объема полученных ФГГ1 выполняется несколько сеансов лиофилизации. Для уравновешивания концентраций ФГГ и ИГЧ, рекомендовано лиофилизировать 5 проб по 40 мл. с Каждый из полученных лиофилизатов необходимо разводить в 2 мл 0,5М раствором NaCI. Объединенный общий объем будет равен 10 мл. Тем самым, проведено концентрирование по объему в 20 раз. Повторное исследование общего белка и альбумина на анализаторе Architect С8000 (Abbott, USA) показывает, что концентрация белка стала равна 50,6 г/л, а остаточный альбумин - 0,2 г/л. Тем самым, реальное концентрирование полученной фракции происходит в 10 раз. Эту фракция обозначается как ФГГ2 и она выступает прототипом иммуноглобулина человека для внутривенного введения, полученного от многорожавших женщин.

Для верификации белков входящих в ФГГ2 и сравнения ее со стандартным иммуноглобулином человека для внутривенного введения проводится электрофорез в 4,12% полиакриламидном геле в присутствии додецил-сульфата натрия (ДСН-ПААГ). Для ДСН-ПААГ используется фракции ФГГ1, ФГТ2 и иммуноглобулины человека для внутривенного введения (ИГЧ1 - иммуновенин 5%, НПО Микроген, Россия; ИГЧ2 - иммуноглобулин человека нормальный для внутривенного введения 5%, НПО Микроген, Россия). Белки разделяются путем электрофореза в 4,12% полиакриламидном геле в присутствии додецил-сульфата натрия (SDS) при напряжении 150 В в течение 2 часов с использованием буфера для разделения белков NuPAGE MES SDS (NP0002, Thermo Fisher Scientific), антиоксиданта NuPAGE (NP0005, Thermo Fisher Scientific) и камеры для вертикального электрофореза XCell SureLock Mini-Cell (EI0001, Thermo Fisher Scientific). В качестве маркера молекулярных масс используется смесь белковых стандартов Novex Sharp Pre-Stained (LC5800, Thermo Fisher Scientific). Гель окрашивается красителем Кумасси (Coomassie Brilliant Blue G-250). Рисунок 4.

Примечание к рисунку 4 - ДСН-ПААГ электрофорез. М.М. - молекулярная масса. kDa - кило Дальтоны. Сокращения (ФГГ1, ФГГ2, ИГЧ1, ИГЧ2) расшифрованы в тексте. Окраска Кумасси.

Как видно из рисунка 4, основные бенды анализируемых ФГГ1, ФГТ2, ИГЧ1 и ИГЧ2 полностью совпадали между собой. Концентрация белков от ФГГ1 к ФГТ2 значительно увеличилась и была сопоставимой со стандартными лечебными иммуноглобулинами для внутривенного введения (ИГЧ1 и ИГЧ2). Молекулярная масса основных белков в ФГТ2, ИГЧ1 и ИГЧ2 была в пределах 110-150 г/л, что соответствует молекулярной массе гаммаглобулинов.

Тем самым, из крови многорожавших женщин получается очищенная и сконцентрированная фракции гаммаглобулина (ФГГ1/ФГГ2), что документируется в иммуноэлектрофорезе, в электрофорезе белков сыворотки крови и в ДНС-ПААГ электрофорезе. ФГГ2 является прототипом иммунобиологического препарата для прегравидарной профилактики риска формирования врожденных пороков сердца.

Влияние ФГГ на экспрессию молекул HLA-G и HLA-DR лимфоцитов матерей и детей с септальными врожденными пороками сердца и контрольных групп.

Протокол проточной цитофлуориметрии.

Для определения специфичности сконцентрированной ФГГ2 по отношению к молекулам HLA-G, HLA-DR, а также для сравнения его эффекта с аутогенными и аллогенными сыворотками и стандартным лечебным 5% иммуноглобулином для внутривенного введения (ИГЧ1) разработан протокол иммунологического тестирования с помощью проточной цитофлуориметрии. Протокол основана на методическом подходе - «cross-match».

Для тестирования ФГГ2 выделяются донорские лимфоциты из 4 мл периферической крови на градиенте плотности фиколл-верографина 1,077 г/см³ (Фиколл-1077, Диа-М, Москва, Россия) по стандартной методике. Полученные взвеси лимфоцитов двукратно отмываются раствором Хэнкса (Диа-М, Москва, Россия). Для этого по 1000 мкл раствора Хэнкса добавляются в пробирки с лимфоцитами, и центрифугируются 10 минут при 1500 g. После центрифугирования надосадочная жидкость убирается. Далее во все монокультуры с минимальным количеством раствора Хенкса (среднее содержание лимфоцитов было 3 млн клеток в 25 мкл раствора Хенкса) для первичного окрашивания лимфоцитов добавляются 5 мкл раствора моноклональных антител к молекуле CD45, конъюгированными с флуоресцентным красителем перидинин-хлорофиллом 7 (РС-7, Biolegent, США). Инкубация проводится в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте, после которой выполняется однократная отмывка лимфоцитов раствором Хенкса от несвязанных антител. После отмывки в пробирки с лимфоцитарными монокультурами добавляется 800 мкл полной среды (RPMI-1640 (Sigma-Aldrich, USA), с 2 ммолями L-глютамином (Рапгеас, Испания), с 10 ммолями Hepes-буфера (Sigma-Aldrich, США), с 5*10^-5 молями 2-меркаптоэтанола (Biochem, Франция) и с 50 мкг/мл раствором гентамицина-сульфата (Ветинтерфарм, Россия)).

Для каждой лимфоцитарной монокультуры необходимо приготовить по восемь пробирок для проточного цитофлуориметра Beckman Coulter (USA), в четырех из которых будет оцениваться экспрессия HLA-G, а в следующих четырех - экспрессия HLA-DR. В каждую пробирку вносится по 100 мкл клеточной взвеси (350 тысяч клеток в полной среде). Далее, в первую и пятую пробирки добавляется по 100 мкл полной среды (контрольные пробы), во вторую и шестую пробирки вносились по 100 мкл аллогенной сыворотки крови, в третью и восьмую пробирки добавлялись 30 мкл ФГТ2 и 70 мкл полной среды, тем самым концентрация гаммаглобулина уравнивается с сывороткой периферической крови. Соответственно для уравнивания концентраций гаммаглобулинов с периферической кровью в четвертую и девятую пробирки вносится по 30 мкл ИГЧ1 и по 70 мкл полной среды. Все пробирки инкубируются в термостате при 37 градусов Цельсия в течение 30 минут.

После окончания инкубации проводится однократная отмывка лимфоцитов каждой пробирки раствором Хенкса, по вышеописанной методике. После однократной отмывки выполняется окрашивание лимфоцитов в каждой монокультуре как в полной среде, так и в среде с добавлением аллогенных сывороток, с ФГГ2 и ИГЧ1 с помощью коньюгированных моноклональных антител (МКАТ). В пробирки, где оценивается экспрессия HLA-G, добавляется 3 мкл с МКАТ к молекуле CD3 коньюгированные с флуорисцеин изотиоцианат (FITC) и 3 мкл с МКАТ к молекуле HLA-G коньюгированные с алофикоцианин (АРС) (Biolegend, США). Соответственно в пробирки, где оценивается экспрессия HLA-DR, добавляется МКАТ в тех же соотношения, но вместо МКАТ к HLA-G добавляется МКАТ к HLA-DR, также коньюгированный с АРС (Biolegend, США). Объем антител к количеству лимфоцитов, время и температура инкубаций соответствуют прилагаемым инструкциям к каждому конъюгированному МКАТ. Инкубирование проводится в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте.

С учетом перекрестного реагирования с молекулами HLA-G и HLA-DR антител, содержащих в аллогенных сыворотках, а также в ФГГ2 и ИГЧ1 для вышеописанного протокола оценили концентрацию гаммаглобулинов в растворах моноклональных антител и в добавляемых иммунобиологических материалах. Так из раствора специфических МКАТ добавлялось на 300 тысяч клеток 1,5 мкг антител; а из сыворотки крови и из препаратов иммуноглобулина на это же количество клеток добавлялось около 1000 мкг гаммаглобулина, что могло быть достаточным для частичного закрытия антигенных детерминант анализируемых молекул на лимфоцитах.

После окончания инкубации с МКАТ проводится отмывка лимфоцитов раствором Хенкса по описанной выше методике. Однократный раствор OptiLyse (Beckman coulter, США) добавляется по 200 мкл в каждую пробирку для фиксации антител на лимфоцитах в монокультурах.

Особенности экспрессии HLA-G и HLA-DR на различных субпопуляциях лимфоцитов женщин и детей, а также влияние на этот процесс аллогенных сывороток и гаммаглобулиновых препаратов крови оцениваются с помощью протокола проточной цитофлуориметрии для CytoFlex (Beckman Coulter, США).

Протокол включает несколько последовательных этапов для каждой монокультуры, инкубированных в полной среде и в среде с добавлением аллогенных сывороток крови, а также с ФГГ2 и ИГЧ1.

Первый этап связан с выделением в первой гистограмме популяции лимфоцитов по их размерным характеристикам (прямое (малоугловое) светорассеяние - forward scatter - FSL) и по внутриклеточной плотности (боковое светорассеяние - side scatter - SSL).

В следующей гистограмме пул лимфоцитов дополнительно кластеризован по общему лейкоцитарному маркеру CD45 (CD45-PC7) и внутриклеточной плотности (SSL).

Третья гистограмма является для этого исследования основной. Именно в ней анализируются выделенные лимфоциты по фенотипам: CD3⁺/HLA-G⁺, CD3⁺/HLA-G⁺ и CD3⁺/HLA-DR+, CD3^-/HLA-DR⁺, а также CD45⁺/HLA-G⁺, CD45⁺/HLA-DR⁺. Анализ этих субпопуляций лимфоцитов проводится во всех монокультурах как в полной среде, так и с добавлением аллогенных сывороток крови и с ФГГ2, ИГЧ1 (рисунок 1, рисунок 2).

По различию экспрессии HLA-G и HLA-DR на различных субпопуляциях женских и детских лимфоцитов в полной среде и в среде с добавлением аллогенных сывороток крови, с ФГГ2 и с ИГЧ1, соответственно, определяется их эффект. Если в среде с той или иной сывороткой крови или с ФГГ2 и ИГЧ1 экспрессия HLA-G и HLA-DR на соответствующей субпопуляции лимфоцитов ниже, чем в полной среде, то эффект данного иммунобиологического материала считается блокирующим. В том случае, если в среде с сывороткой крови или с ФГГ2 и ИГЧ1 экспрессия молекул HLA-G и HLA-DR на соответствующей субпопуляции лимфоцитов выше, чем в полной среде, то эффект данной сыворотки считается активирующим. Для количественной оценки эффектов сывороток крови и ФГГ2, ИГЧ1 используется формула:

Изменение экспрессии HLA-G или HLA-DR в % = ((количество клеток с молекулами HLA-G или HLA-DR в среде с сывороткой крови или с ФГГ2, ИГЧ1 - количество клеток с молекулами HLA-G или HLA-DR в полной среде)/количество клеток с молекулами HLA-G или HLA-DR в полной среде)* 100% (рисунки 5, 6)

Примечание к рисунку 5 - протокол проточной цитофлуометрии для анализа экспрессии молекул HLA-G и HLA-DR на лимфоцитах в полной среде (сбор клеток прекращался при достижении 10000 лимфоцитов по гейту SSC-A/CD45 РС-7А).

Примечание к рисунку 6 - протокол проточной цитофлуометрии для анализа экспрессии молекул HLA-G и HLA-DR на лимфоцитах в среде с ФГГ2 (сбор клеток прекращался при достижении 10000 лимфоцитов по гейту SSC-A/CD45 РС-7А).

Оценка эффекта выделенной фракции гаммаглобулина.

Материалы и методы.

Для оценки функциональной активности ФГГ2 в отношении молекул HLA-DR и HLA-G было сформировано несколько групп. Основная группа включала 38 женщин и их детей со спорадическими септальными ВПС (дефект межжелудочковой перегородки - ДМЖП и дефект межпредсердной перегородки - ДМПП). Группы была сформирована на базе отделения кардиохирургии №2 Научно-исследовательского института Комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний (НИИ КПССЗ). Группа сравнения была представлена 21 женщиной и их условно-здоровыми детьми без ВПС, а также с отсутствием в семье родов или преанатального обнаружения ВПС. Группа была сформирована на поликлинических базах ФГБОУ ВО Кемеровского государственного медицинского университета. У всех матерей было получено информированное согласие на их участие, а также их детей, в иммунологическом исследовании. Группа сравнения была сопоставима по возрасту с основной группой. На выделенных лимфоцитах (далее обозначались как донорские) оценивалась функциональная активность очищенной и сконцентрированной ФГГ. Выбор основной группы и группы сравнения был обусловлен тем, что функциональная оценка ФГГ2 и ИГЧ1 проводилась по отношению к эффекту аллогенной материнской сыворотки на лимфоциты детей с ВПС, так и на лимфоциты условно-здоровых детей.

Математическую обработку полученного материала проводили с помощью методов описательной статистики с использованием пакета прикладных программ STATISTICA 8.0 (StatSofflnc, USA). Нормальность распределения выборок оценивали с помощью W-теста Шапиро-Уилка. Проверка на нормальность распределения показала, что данные в исследовании не имеют нормального распределения. Поэтому в дальнейшем расчеты производились методами непараметрической статистики. Номинальные данные описывались с указанием абсолютных значений, процентных долей (%). Количественные данные представляли в виде медианы (Me), 25-го и 75-го процентилей (Р25 и Р75). Сравнение значений уровней метрических показателей в несвязанных выборках проводили с помощью непараметрического Манна-Уитни, а в связанных - Вилкоксона Вероятность ошибки первого рода была принята за 5%, соответственно уровень статистической значимости выявлялся при р<0,05, что соответствует стандартным требованиям.

Результаты.

На этом этапе проведено сравнение эффектов активации и блокирования экспрессии HLA-G и HLA-DR на лимфоцитах детей основной и контрольной групп под воздействием аллогенной сыворотки и ФГГ2, ИГЧ1. Данные представлены в таблице 1. Как видно из таблицы, аллогенная материнская сыворотка обладала блокирующим эффектом на субпопуляции лимфоцитов CD3^-, HLA-G⁺ и CD3⁺, HLA-G⁺ в контрольной группе и, напротив, активирующим эффектом - в основной группе (дети с ВПС). По этим показателям получены значимые различия между группами. Этот феномен неоднократно обсуждался в ранее проведенных исследованиях [Shabaldin А. V., Grivtsova S. V., DeevaN. S., Shmulevich S. A., Tsepokina A. V., Anikeenko A. A., Vavin G. V. (2021). Changes in the expression of HLA-DR on lymphocyte subpopulations of spouses having children with sporadic congenital heart defects without chromosomal diseases, under the influence of female's autoserum. Медицинская иммунология, 23(1), 143-148.; Shabaldin A. V., Deeva N. S., Sukhikh A. S., Vavin G. V., Kryukov P. M. (2021). Altered expression of cell membrane HLA-G molecules in mothers of children with inborn heart defects upon exposure to plasma gamma-globulin from muciparous women. Russian Journal of Immunology, 24(3), 373-376.]. Известно, что ген HLAG имеет низкий полиморфизм, поэтому практически у всех людей экспрессируется почти один и тот же белок [Persson G., Jorgensen N., Nilsson L. L., Andersen L. H. J., Hviid, Т. V. F. (2020). A role for both HLA-F and HLA-G in reproduction and during pregnancy?. Human immunology, 81(4), 127-133]. В тоже время, данная молекула является ключевой для ограничения иммунного воспаления в системе «мать-эмбрион/плод» и вынашивания беременности [Lynge Nilsson, L. Djurisic, S.Hviid, Т. V. F. (2014). Controlling the immunological crosstalk during conception and pregnancy: HLA-G in reproduction. Frontiers in immunology, 5, 198.]. Доказано, что дефицит экспрессии HLA-G на клетках эмбриона и цитотрофобласта, а не генетический полиморфизм, ассоциирован с репродуктивными потерями [Densmore Т. L., Tim Goodnough L., АН S., Dynis M., Chaplin,H. (1999). Prevalence of HLA sensitization in female apheresis donors. Transfusion, 39(1), 103-106.]. Кроме того, показано, что молекула HLA-G экспрессируется не только на клетках вневорсинчатого цитотрофобласта, но и в половых путях, в крови беременных и небеременных женщин, в семенной жидкости, а также в предимплантированных эмбрионах [Densmore Т. L., Tim Goodnough L., АН S., Dynis M., Chaplin,H. (1999). Prevalence of HLA sensitization in female apheresis donors. Transfusion, 39(1), 103-106.]]. Тем самым, особенности экспрессии HLA-G в клетках эмбриона, могут быть значимыми в ограничении иммунного отторжения полуаллогенного эмбриона, и провоспалительной компоненты патогенеза ВПС. Такими дополнительными регуляторными свойствами могут обладать женские аллоиммунные антитела к HLA-G, которые присутствовали в аллогенных материнских сыворотках контрольной группы и отсутствовали в аллогенных материнских сыворотках основной группы (таблица 1).

Соответственно, в коммерческом лечебном иммуноглобулине для внутривенного введения (ИГЧ1) и в полученной концентрированной гаммаглобулиновой фракции (ФГГ2) эти антитела присутствовали. Так из таблицы 1 видно, что ИГЧ1 и ФГГ2 оказывали блокирующий эффект на все субпопуляции детских лимфоцитов, экспрессирующих HLA-G, в основной и контрольной группах. Причем, эффект данных препаратов был сопоставим с эффектом аллогенной материнской сыворотки для детских лимфоцитов CD3^-, HLA-G⁺ в контрольной группе. Это были только условно-здоровые дети (без ВПС). Для данной субпопуляции в основной группе эффект ИГЧ1 и ФГТ2 значимо отличался от влияния на экспрессию HLA-G женской аллогенной сыворотки (таблица 1). Тем самым, если бы этим женщина было проведено внутривенное введение ИГЧ1 до беременности или в первые недели беременности, то вполне вероятно, что патогенез ВПС был бы заблокирован.

Схожим эффектом обладали ИГЧ1 и ФГГ2 на экспрессию HLA-G в субпопуляции CD3⁺, HLA-G⁺ в основной и контрольной группах. Надо отметить, что в контрольной группе блокирующий эффект ИГЧ1 был значимо ниже блокирующего эффекта аллогенной сыворотки. В то время как, блокирующий эффект ФГТ2 в этой группе был сопоставим с аллогенной сывороткой. Это можно расценить с позиции большего количества аллоиммунных регуляторных антител к молекуле HLA-G, экспрессируемой на Т-лимфоцитах, в ФГТ2. Представленное исследование показывает наибольший блокирующий эффект по отношению к экспрессии HLA-G именно от ФГТ2, который сопоставим с аллогенной сывороткой женщин, родивших здоровых детей.

В таблице 2 представлен анализ эффектов аллогенной сыворотки, ФГГ2 и ИГЧ1 в отношении лимфоцитарных молекул HLA-DR в основной и контрольной группах. Как видно из таблицы, аллогенная материнская сыворотка обладала тем же блокирующим эффектом в отношении HLA-DR на анализируемых субпопуляции лимфоцитов CD3^-, HLA-DR⁺ и CD3⁺, HLA-DR⁺ в контрольной группе, как и для HLA-G. По данным показателям, между контрольной и основной группой были получены значимые различия. В основной группе женская аллогенная сыворотка, также проявляла активирующий эффект по отношению к экспрессии молекулы HLA-DR. Этот феномен обсужден ранее, в том числе с позиции аллоиммунных регуляторных антител к HLA-DR, как иммунной основы для вынашивания беременности и протекции ВПС [Shabaldin А. V., Grivtsova S. V., Deeva N. S., Shmulevich S. A., Tsepokina A. V., Anikeenko A. A., Vavin G. V. (2021). Changes in the expression of HLA-DR on lymphocyte subpopulations of spouses having children with sporadic congenital heart defects without chromosomal diseases, under the influence of female's autoserum. Медицинская иммунология, 23(1), 143-148.].

Анализ эффективности ИГЧ1 и ФГГ2 по отношению к HLA-DR значимо различался с эффектом аллогенной сыворотки.

Так, ИГЧ1 обладал блокирующим эффектом на экспрессию HLA-DR в контрольной группе для двух анализируемых субпопуляций: CD3^-, HLA-DR⁺ и CD3⁺, HLA-DR⁺. И, напротив, его эффект стремился к нулю в основной группе. Если принять во внимание, что протекция ВПС связана с блокирующим эффектом экспрессии HLA-DR аллогенной сывороткой, то активности ИГЧ1 недостаточно для этой протекции.

В тоже время, ФГГ2 проявлял блокирующий эффект в отношении экспрессии HLA-DR на субпопуляциях лимфоцитов CD3^-, HLA-DR⁺ и CD3⁺, HLA-DR⁺ как в контрольной, так и в основной группах. По этому свойству полученные значимые различия для двух анализируемых субпопуляций лимфоцитов между аллогенной сывороткой в основной группе (таблица 2). Соответственно, протективный эффект в отношении риска формирования ВПС для полученного препарата гаммаглобулиновой фракции значимо выше, чем для коммерческого лечебного иммуноглобулина для внутривенного введения.

Таким образом, донорский иммуноглобулин человека может блокировать экспрессию аллогенных HLA-G и HLA-DR, и, через этот эффект, ограничивать иммунное воспаление в системе «мать-эмбрион/плод». Причем у иммуноглобулина, полученного от многорожавших женщин, этот эффект выражен в большей степени, и тем самым, он может претендовать на иммунобиологический препарат, направленный для прегравидарной иммунной профилактики ВПС.Полученные результаты не противоречат основной концепции иммунологии репродукции и ограничения иммунного воспаления при сердечно-сосудистой патологии [Prieto-Casal F., Cabanas-Gadea С, Figueredo-Lopez S., Villagra-Carron V. (2021). Fetomaternal immunization against HLA antigens in women from a Paraguayan population. Mem. Inst. Investig. Cienc. Salud, 48-57.; A. Mulder, M. J. Kardol, J Kamp, С Uit Het Broek, GMT Schreuder, I I N Doxiadis, F H J Claas, Determination of the frequency of HLA antibody secreting B-lymphocytes in alloantigen sensitized individuals, Clinical and Experimental Immunology, Volume 124, Issue 1, April 2001, Pages].

Тем самым, сущность отличий изобретения заключается в следующем. В заборе биоматериала (крови) от многорожавших женщин, выделения гаммаглобулиновой фракции из донорской крови и характеристика ее в отношении подавления экспрессии HLA-DR, HLA-G на донорских лимфоцитах.

Апробация способа проведена на базе НИИ КПССЗ на 38 парах (матери и их дети) с врожденными пороками сердца. Показано значимое отличие влияния на экспрессию молекул мембранных HLA-G и HLA-DR полученной фракции гаммаглобулина от аллогенной материнской сыворотки женщин основной группы (дети с ВПС) и сопоставимый эффект с аллогенной материнской сыворотки женщин контрольной группы (условно-здоровые дети).

Изобретение относится к медицине. Раскрыт способ получения гамма-глобулиновой фракции (ФГГ) человека для прегравидарной профилактики врожденных пороков сердца в последующем поколении, включающий забор донорской крови женщин, имеющих более двух условно здоровых детей и отсутствие в анамнезе репродуктивных потерь и рождение детей с врожденными пороками и аномалиями развития, метод аффинной хроматографии сыворотки крови с применением подвижной фазы буферов 20 мМ K₂HPO₄/KH₂PO₄, рН 8,0 на хроматографе низкого давления BioLogic, BioRad, USA для получения ФГГ, использование метода электрофореза в 4,12% полиакриламидном геле в присутствии додецил-сульфата натрия (ДСН-ПААГ) для оценки чистоты выделенной ФГГ и метода оценки влияния ФГГ на мембранную экспрессию HLA-G и HLA-DR на аллогенных лимфоцитах детей с врожденными пороками сердца и без них у условно здоровых детей с помощью проточной cross-match цитофлуориметрии, полученная ФГГ способна блокировать мембранную экспрессию HLA-G и HLA-DR на аллогенных лимфоцитах детей с врожденными пороками сердца. Изобретение позволяет получить ФГГ человека, обеспечивающую возможность блокировать отдельные звенья патогенезов врожденных пороков сердца. 6 ил., 2 табл.

Способ получения гамма-глобулиновой фракции (ФГГ) человека для прегравидарной профилактики врожденных пороков сердца в последующем поколении, включающий забор донорской крови женщин, имеющих более двух условно здоровых детей и отсутствие в анамнезе репродуктивных потерь и рождение детей с врожденными пороками и аномалиями развития, метод аффинной хроматографии сыворотки крови с применением подвижной фазы буферов 20 мМ K₂HPO₄/KH₂PO₄, рН 8,0 на хроматографе низкого давления BioLogic, BioRad, USA для получения ФГГ, использование метода электрофореза в 4,12% полиакриламидном геле в присутствии додецил-сульфата натрия (ДСН-ПААГ) для оценки чистоты выделенной ФГГ и метода оценки влияния ФГГ на мембранную экспрессию HLA-G и HLA-DR на аллогенных лимфоцитах детей с врожденными пороками сердца и без них у условно здоровых детей с помощью проточной cross-match цитофлуориметрии, полученная ФГГ способна блокировать мембранную экспрессию HLA-G и HLA-DR на аллогенных лимфоцитах детей с врожденными пороками сердца.