СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОКИСЛЕННОГО ПРОИЗВОДНОГО ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ И СПОСОБ ЕГО МОДИФИКАЦИИ Российский патент 2015 года по МПК C08B37/08 A61K31/728 A61K47/48 C08G81/00 

Область техники

Данное изобретение относится к новому способу получения производного гиалуроновой кислоты, содержащего альдегидную группу -СН=О вместо первичной гидроксигруппы -СН₂-ОН. Окисление может быть выполнено в протонных растворителях с использованием системы 4-замещенный TEMPO (2,2,6,6-тетраметилпиперидинилоксил)/ соокислитель:

где R - водород или любой заместитель, а в качестве соокислителя используется гипохлорит натрия (NaClO) или трихлоризоциануровая кислота (ТСС).

Уровень техники

Гиалуроновая кислота представляет собой важный полисахарид, состоящий из двух повторяющихся звеньев - β-(1,3)-D-глюкуроновой кислоты и β-(1,4)-N-ацетил-D-глюкозамина. Его молярная масса находится в интервале 5·10⁴-5·10⁶ г-моль^-1 в зависимости от исходного материала и от способа выделения продукта. Гиалуроновая кислота или ее натриевая соль - гиалуронан - важный компонент соединительной ткани и синовиальной жидкости суставов; она играет важную роль в таких биологических процессах, как гидратация, организация протеогликанов, а также клеточная дифференциация, пролиферация и ангиогенез. Гиалуроновая кислота - достаточно гидрофильный полисахарид, растворимый в воде в виде солей во всем интервале рН.

Схема 1. Гиалуроновая кислота

Окисление гиалуроновой кислоты

Окисление полисахаридов - процесс, сопровождающийся изменением степени окисления функциональных групп полисахарида. Как правило, образуются карбоновые кислоты или альдегиды, что может привести к резкому изменению свойств полисахарида. В большинстве случаев в реакции используют реагенты, содержащие атомы в высших степенях окисления.

Окисление проводили согласно способу селективного окисления сахаридов по первичной гидроксильной группе, описанному в работе Angelino, European Journal of Organic Chemistry, 2006, 19, 4323-4326, с помощью системы 2,2,6,6-тетраметил-1-пиперидиноксильного радикала TEMPO и ТСС в ДМФА при температуре 0°С, при этом в качестве основного продукта был получен соответствующий альдегид.

TEMPO - относительно стабильный радикал, который в условиях реакции может существовать в трех окислительно-восстановительных формах. Для окисления спиртов и геминальных диолов эффективна только окисленная форма TEMPO.

TEMPO вводится в реакционную смесь в каталитических количествах, поэтому необходимо использовать соокислитель, который снова переводит TEMPO в его окисленную форму.

Окисление первичной гидроксигруппы гиалуронана до карбоновой кислоты под воздействием 2,2,6,6-тетраметил-1-пиперидиноксильного радикала (TEMPO) и NaOCl проводили при рН 10,2 и при температуре 0°С (схема 2) (Carbohydr Res 2000, 327 (4), 455-61).

Схема 2. Окисление до карбоновой кислоты

Аналогично другим полисахаридам наблюдались высокая региоселективность и незначительное разложение полимера. При повышении концентрации соли (NaBr, NaCl, Na₂SO₄) в растворе скорость окисления несколько снижалась.

Окисление гиалуронана под воздействием системы TEMPO/NaClO было описано в патентной заявке WO 02/18448 А2. Авторы также исследовали взаимодействие полностью карбоксилированных полисахаридов при образовании биологических комплексов.

Скорость окисления ГК и других полисахаридов под воздействием периодата натрия исследована в работе Scott et al. (схема 3) (Histochemie 1969, 19 (2), 155-61).

Схема 3. Окисление до диальдегида

Изучалось количественное влияние таких факторов, как длина цепи, природа заместителей, конфигурация полимера и температура. Применение NaIO₄ для окисления гиалуронана раскрыто также в патентах № US 6683064 и US 6953784.

Изучены модельные реакции низкомолекулярных аналогов ГК в физиологическом буфере (Carbohydr Res 1999, 321, (3-4), 228-34). Продукты окисления глюкуронового и глюкозаминного фрагментов анализировали методом хромато-масс-спектрометрии. Результаты также позволяют предположить, что окисление идет в основном по глюкуроновому фрагменту, причем в качестве основного продукта образуется мезовинная кислота, которая может служить биомаркером окисления гиалуронана.

Применение окисленной ГК в реакциях сшивки

Применение окисленной ГК для получения сетчатых гидрогелей описано в работе Weng et al. (схема 4), J Biomed Mater Res A 2008, 85 (2), 352-65. В этом случае использовали два прекурсора: частично окисленный гиалуронан и желатин:

Схема 4. Сшивка окисленного гиалуронана и желатина

Физико-химические свойства полученных гидрогелей исследовали инструментальными методами - Фурье-ИК-спектроскопии, сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) и реометрии. При повышении степени замещения в гиалуронане наблюдалось соответствующее увеличение совместимости гидрогелей и снижение водопоглощающей способности. Исследование взаимодействия гидрогеля с клетками проводили с использованием дермальных фибробласт. По данным анализа долгосрочной жизнеспособности клеток, как гидрогели, так и продукты их деградации были биосовместимы. При культивировании с клетками гидрогель разлагался в течение 4 недель с очевидной потерей целостности. Хорошая биосовместимость и биоразлагаемость были далее подтверждены в опытах на мышах при подкожной имплантации. Наконец, депонирование внеклеточного матрикса в гидрогелях in vitro и in vivo было показано методом СЭМ.

Способ получения сшитой ГК из окисленного гиалуронана и желатина методом обратной эмульсии, при котором трехмерный гидрогель получался в отсутствие добавок сшивающего агента, был описан в работе Weng et al., Biomaterials 2008, 29, (31), 4149-56. В указанной публикации методом ВЭЖХ изучали включение модельных лекарственных препаратов в структуру гидрогеля (инкапсулирование) и их высвобождение под воздействием макрофагов.

Получение эластичных гидрогелей сочетанием ГК, окисленной до ГК-альдегида под воздействием периодата натрия, и ГК, модифицированной дигидразидом адипиновой кислоты, было описано в работе Sabiner et al., (схема 5), J. Biomater. Sci. Polym. Ed 2008, 19 (2), 223-43.

Схема 5. Получение сетчатого гиалуронана

По данным МТТ-теста, полученные производные не оказывали видимого воздействия на пролиферацию культивированных фибробластов.

Раскрытие изобретения

Настоящее изобретение относится к усовершенствованию способа селективного окисления первичной гидроксигруппы гиалуроновой кислоты в положении 6 глюкозаминного фрагмента полисахарида до альдегидной группы. Эта новая реакция проводится с использованием системы 2,2,6,6-тктраметил-1-пиперидинилоксильный радикал TEMPO / соокислитель. В ранее опубликованных методах вводилась либо альдегидная группа в положения 2 и 3 глюкуронового фрагмента гиалуронана с раскрытием сахаридного цикла (схема 6, структура 2), либо карбоксильная группа в положение 6 глюкозаминного фрагмента гиалуронана (схема 6, структура 1).

Схема 6. Окисление гиалуронана, продукты реакции

Преимущество способа согласно настоящему изобретению состоит в том, что в соответствующем продукте окисления (структура 3, схема 6) сохраняется строение сопряженных циклов сахаридов. Раскрытие цикла в продукте окисления до диальдегида (структура 2, схема 6) приводит к нарушению линейности цепи и, следовательно, к существенному изменению трехмерной структуры полисахарида по сравнению с немодифицированным гиалуронаном. Несмотря на то, что в продукте окисления до карбоновой кислоты (структура 1, схема 6) разрыва линейности цепи не происходит, карбоксильная группа не обеспечивает столь разнообразных возможностей дальнейшей модификации (связывания), как альдегидная группа. Так как карбоксильная группа уже имеется в составе немодифицированного полисахарида, окисление до структуры 1 (схема 6) приводит только к повышению полярности полисахарида, а не придает ему новое свойство, применимое для связывания новых заместителей.

Известно, что альдегидная группа, связанная с алкильной группой, находится в воде в форме так называемого геминального диола ГК-СН(ОН)₂, который взаимодействует с нуклеофилами аналогично альдегидам. По данным ЯМР спектроскопии более 95% гиалуронана, окисленного по положению 6 глюкозаминного фрагмента (продукт 3, схема 6), в водных растворах представляет собой геминальный диол.

Согласно способу настоящего изобретения гиалуроновую кислоту растворяют в воде, затем прибавляют окислитель и перемешивают реакционную смесь при температуре от -10 до 20°С, предпочтительно при 0°С, в течение от 1 до 150 часов, предпочтительно в течение 24 часов.

Полученный окисленный гиалуронан может вступать в реакции связывания с другими веществами, например, содержащими аминогруппу. Связывание может приводить к образованию либо иминной формы, либо - после восстановления - аминной формы (восстановительное аминирование) (схема 7):

Схема 7. Связывание аминов с окисленным гиалуронаном

Обе части указанной модификации проводят в водном растворе, восстановление идет под воздействием NaBH₃CN. Обе реакции, приведенные на схеме 7, можно провести в одну стадию.

Модификация производного гиалуроновой кислоты осуществляется при реакции окисленного производного с амином общей формулы H₂N-R либо с гиалуронаном, замещенным группой -R-NH₂, в которой R-алкил с линейной или разветвленной цепью С₁-С₃₀, не обязательно содержащий ароматические или гетероароматические группы. Данный амин может представлять собой алкиламин, например бутиламин или гександиамин, аминокислоту, пептид или полисахарид, содержащий свободную аминогруппу. В случае применения диамина или соединений, содержащих три или более аминогруппы, возможно получение сетчатых производных гиалуронана. Сетчатые производные образуются также при взаимодействии альдегида с гиалуронаном, замещенным аминоалкильной группой ГК-алкил-NН₂.

Подробное описание изобретения

В данном описании DS=степень замещения=100% × число молей введенного заместителя / число молей димеров полисахарида.

Термин «эквивалент (экв.)» в настоящем документе относится к димеру гиалуроновой кислоты, если не указано иное. Процентные доли в настоящем документе соответствуют массовым процентам, если не указано иное.

Молекулярную массу исходного гиалуронана (источник: CPN spol. s r.о., Dolni Dobrouč, CZ) определяли методом SEC-MALLS.

Пример 1. Окисление гиалуроновой кислоты под воздействием системы TEMPO/NaClO

Водный раствор NaClO (0.5 экв.) постепенно добавили к водному раствору гиалуронана (1%) (0.1 г, 20 кДа) (содержащему 10 масс.% NaCl), TEMPO (0.01 экв.) и NаНСО₃ (30 экв.). Смесь перемешивали в течение 24 часов при температуре -5°С. Далее раствор разбавляли до концентрации 0.2% дистиллированной водой и диализовали против смеси (0,1% NaCl, 0,1% NaНСО₃), 3×5 литров (один раз в сутки), и против дистиллированной воды, 7×5 литров (дважды в сутки). Полученный раствор упаривали и анализировали.

DS 10% (по данным спектроскопии ЯМР).

ЯМР ¹Н (D₂O) δ 5,26 (с, 1Н, полимер-СH(ОН)₂)

HSQC (D₂O) кросс-пик 5,26 млн. ед. (1Н) - 90 млн. ед. (¹³С) полимер-СH(ОН)₂)

Фурье-ИК-спектр (КВr) 1740 см^-1 -СН=O

Пример 2. Окисление гиалуроновой кислоты под воздействием системы TEMPO/NaClO

Водный раствор NaClO (0.5 экв.) постепенно добавили к водному раствору гиалуронана (0.5%) (0.1 г, 2000 кДа) (содержащему 10 масс.% NaCl), TEMPO (0.01 экв.) и NaHCO₃ (30 экв.). Смесь перемешивали в течение 24 часов при температуре -5°С. Далее раствор разбавляли до концентрации 0.2% дистиллированной водой и диализовали против смеси (0,1% NaCl, 0,1% NaНСО₃), 3×5 литров (один раз в сутки), и против дистиллированной воды, 7×5 литров (дважды в сутки). Полученный раствор упаривали и анализировали. DS 10% (по данным спектроскопии ЯМР, более подробно см. в Примере 1).

Пример 3. Окисление гиалуроновой кислоты под воздействием системы TEMPO/NaClO

Водный раствор NaClO (0.5 экв.) постепенно добавили к водному раствору гиалуронана (1%) (0.1 г, 20 кДа) (содержащему 10 масс.% NaCl), 4-ацетамидо-ТЕМРО (0.01 экв.) и NaHCO₃ (30 экв.). Смесь перемешивали в течение 24 часов при температуре -5°С.Далее раствор разбавляли до концентрации 0.2% дистиллированной водой и диализовали против смеси (0,1% NaCl, 0,1% NaHCO₃), 3×5 литров (один раз в сутки), и против дистиллированной воды, 7×5 литров (дважды в сутки). Полученный раствор упаривали и анализировали. DS 10% (по данным спектроскопии ЯМР, более подробно см. в Примере 1).

Пример 4. Окисление гиалуроновой кислоты под воздействием системы TEMPO/NaClO

Водный раствор NaClO (0.5 экв.) постепенно добавили к водному раствору гиалуронана (1%) (0.1 г, 20 кДа) (содержащему 10 масс.% NaCl), 4-ацетамидо-ТЕМРО (0.05 экв.) и NaHCO₃ (30 экв.). Смесь перемешивали в течение 10 часов при температуре -10°С. Далее раствор разбавляли до концентрации 0.2% дистиллированной водой и диализовали против смеси (0,1% NaCl, 0,1% NaHCO₃), 3×5 литров (один раз в сутки), и против дистиллированной воды, 7×5 литров (дважды в сутки). Полученный раствор упаривали и анализировали.

DS 10% (по данным спектроскопии ЯМР более подробно см. в Примере 1).

Пример 5. Окисление гиалуроновой кислоты под воздействием системы TEMPO/NaClO

Водный раствор NaClO (0.3 экв.) постепенно добавили к водному раствору гиалуронана (1%) (0.1 г, 20 кДа), 4-ацетамидо-ТЕМРО (0.1 экв.) и NaHCO₃ (30 экв.). Смесь перемешивали в течение 1 часа при температуре 20°С. Далее раствор разбавляли до концентрации 0.2% дистиллированной водой и диализовали против смеси (0,1% NaCl, 0,1% NaHCO₃), 3×5 литров (один раз в сутки), и против дистиллированной воды, 7×5 литров (дважды в сутки). Полученный раствор упаривали и анализировали. DS 5% (по данным спектроскопии ЯМР, более подробно см. в Примере 1).

Пример 6. Окисление гиалуроновой кислоты под воздействием системы ТЕМРО/ТСС

4-Ацетамидо-ТЕМРО (0.01 экв.) и ТСС (0.2 экв.) добавили к раствору гиалуроновой кислоты (1%) (0.1 г, 20 кДа) в смеси N,N-диметилформамид/вода 70/30.

Смесь перемешивали в течение 24 часов при температуре -5°С. Далее раствор разбавляли до концентрации 0,1% и диализовали против смеси (0,1% NaCl, 0,1% NaHCO₃), 3×5 литров (один раз в сутки) и против дистиллированной воды 7×5 литров (дважды в сутки). Полученный раствор упаривали и анализировали. DS 5% (по данным спектроскопии ЯМР, более подробно см. в Примере 1).

Пример 7. Окисление гиалуроновой кислоты под воздействием системы ТЕМРО/ТСС

4-Ацетамидо-ТЕМРО (0.01 экв.) и ТСС (0.2 экв.) добавили к раствору гиалуроновой кислоты (1%) (0.1 г, 20 кДа) в смеси N,N-диметилформамид/вода 90/10. Смесь перемешивали в течение 24 часов при температуре 20°С. Затем раствор разбавляли до концентрации 0,1% и диализовали против смеси (0,1% NaCl, 0,1% NaHCO₃), 3×5 литров (один раз в сутки) и против дистиллированной воды 7×5 литров (дважды в сутки). Полученный раствор упаривали и анализировали. DS 10% (по данным спектроскопии ЯМР, более подробно см. в Примере 1).

Пример 8. Окисление гиалуроновой кислоты под воздействием системы ТЕМРО/ТСС

4-Ацетамидо-ТЕМРО (0.01 экв.) и ТСС (1 экв.) добавили к раствору гиалуроновой кислоты (1%) (0.1 г, 20 кДа) в смеси N,N-диметилформамид/вода 40/60. Смесь перемешивали в течение 24 часов при температуре -5°С. Затем раствор разбавляли до концентрации 0,1% и диализовали против смеси (0,1% NaCl, 0,1% NaHCO₃), 3×5 литров (один раз в сутки) и против дистиллированной воды 7×5 литров (дважды в сутки). Полученный раствор упаривали и анализировали. DS 15% (по данным спектроскопии ЯМР, более подробно см. в Примере 1).

Пример 9. Окисление гиалуроновой кислоты под воздействием системы ТЕМРО/ТСС

4-Ацетамидо-ТЕМРО (0.01 экв.) и ТСС (1 экв.) добавили к раствору гиалуроновой кислоты (0.5%) (0.1 г, 2000 кДа) в смеси N,N-диметилформамид/вода 40/60. Смесь перемешивали в течение 24 часов при температуре -5°С. Далее раствор разбавляли до концентрации 0,1% и диализовали против смеси (0,1% NaCl, 0,1% NaHCO₃), 3×5 литров (один раз в сутки) и против дистиллированной воды 7×5 литров (дважды в сутки). Полученный раствор упаривали и анализировали. DS 15% (по данным спектроскопии ЯМР, более подробно см. в Примере 1).

Пример 10. Окисление гиалуроновой кислоты под воздействием системы ТЕМРО/ТСС

TEMPO (0.01 экв.) и ТСС (0.2 экв.) добавили к раствору гиалуроновой кислоты (1%) (0.1 г, 20 кДа) в смеси N,N-диметилформамид/вода 70/30. Смесь перемешивали в течение 1 часа при температуре 20°С. Далее раствор разбавляли до концентрации 0,1% и диализовали против смеси (0,1% NaCl, 0,1% NaHCO₃), 3×5 литров (один раз в сутки), и против дистиллированной воды, 7×5 литров (дважды в сутки). Полученный раствор упаривали и анализировали.

DS 5% (по данным спектроскопии ЯМР, более подробно см. в Примере 1).

Пример 11. Окисление гиалуроновой кислоты под воздействием системы ТЕМРО/ТСС

TEMPO (0.01 экв.) и ТСС (0.2 экв.) добавили к раствору гиалуроновой кислоты (1%) (0.1 г, 20 кДа) в смеси ДМФА/вода 70/30. Смесь перемешивали в течение 100 часов при температуре -5°С. Затем раствор разбавляли до концентрации 0,1% и диализовали против смеси (0,1% NaCl, 0,1% NНСО₃), 3×5 литров (один раз в сутки) и против дистиллированной воды 7×5 литров (дважды в сутки). Полученный раствор упаривали и анализировали. DS 5% (по данным спектроскопии ЯМР, более подробно см. в Примере 1).

Пример 12. Окисление гиалуроновой кислоты под воздействием системы TEMPO/NaBrO

Водный раствор NaClO (0.5 экв.) постепенно добавили к водному раствору гиалуронана (1%) (0.1 г, 20 кДа) (содержащему 5 масс.% NaBr), 4-ацетамидо-ТЕМРО (0.5 экв.) и NaHCO₃ (30 экв.). Смесь перемешивали в течение 24 часов при температуре 0°С. Далее раствор разбавляли до концентрации 0.2% дистиллированной водой и диализовали против смеси (0,1% NaCl, 0,1% NaНСО₃), 3×5 литров (один раз в сутки), и против дистиллированной воды, 7×5 литров (дважды в сутки). Полученный раствор упаривали и анализировали. DS 14% (по данным спектроскопии ЯМР, более подробно см. в Примере 1).

Пример 13. Окисление гиалуроновой кислоты под воздействием системы TEMPO/NaClO

Водный раствор NaClO (0.5 экв.) постепенно добавили к водному раствору гиалуронана (1%) (0.1 г, 200 кДа) (содержащему 10 масс.% NaBr), TEMPO (0.5 экв.) и NaHCO₃ (5 экв.). Смесь перемешивали в течение 24 часов при температуре 0°С. Далее раствор разбавляли до концентрации 0.2% дистиллированной водой и диализовали против смеси (0,1% NaCl, 0,1% NaHCO₃), 3×5 литров (один раз в сутки), и против дистиллированной воды, 7×5 литров (дважды в сутки). Полученный раствор упаривали и анализировали. DS 18% (по данным спектроскопии ЯМР, более подробно см. в Примере 1).

Пример 14. Реакция окисленного гиалуронана с амином

К водному раствору окисленной гиалуроновой кислоты (1%) (0,1 г, степень замещения: DS=18%, Пример 13) добавили бутиламин (0,4 экв.). Смесь перемешивали в течение 24 часов при температуре 20°С. Осаждали двукратным количеством ацетона и 0,1 мл насыщенного водного раствора NaCl, отфильтровывали и сушили в вакууме. Полученное желтое вещество анализировали. ЭСП 328 нм, переход n→π^∗-CH=N-

Пример 15. Реакция окисленного гиалуронана с бутиламином и последующее восстановление

К водному раствору окисленной гиалуроновой кислоты (1%) (0,1 г, степень замещения: DS=18%, Пример 13) добавили бутиламин (0,4 экв.). Смесь перемешивали в течение 24 часов при температуре 20°С. Далее раствор смешивали с NaBH₃CN (3 экв.) в 0,5 мл воды. Смесь перемешивали в течение 24 часов при температуре 20°С. Затем раствор разбавляли до концентрации 0,1% и диализовали против смеси (0,1% NaCl, 0,1% NaHCO₃), 3×5 литров (один раз в сутки) и против дистиллированной воды 7×5 литров (дважды в сутки). Полученный раствор упаривали и анализировали. DS 15% (по данным спектроскопии ЯМР).

Спектр ¹Н ЯМР (D₂O) δ 3,05 (м, 2Н, полимер-СН₂-NH-СH₂-CH₂-),   1,60 (м, 2Н, полимер-CH₂-NH-CH₂-CH₂-),   1,35 (м, 2Н, полимер-СН₂-NH-СН₂-СН₂-СH₂-),   0,85 (м, 3Н, -СН₂-СH₃) DOSY ЯМР (D₂O) lgD (0,85 м.д., -СН₂-СН₃) ~ -10,3 м²/с   lgD (1,35 м.д., полимер-СН₂-NН-СН₂-СН₂-СH₂-) ~ - 10,3 м²/с   lgD (1,60 м.д., полимер-СН₂-NH-СН₂-СН₂-) ~ - 10,3 м²/с   lgD (3,05 м.д., полимер-СН₂-NH-СH₂-) ~ - 0,3 м²/с   lgD (2,03 м.д., СH₃-СО-NH-полимер) ~ - 10,3 м²/с   lgD (H₂O) ~ -8,6 м²/с

Пример 16. Реакция окисленного гиалуронана с диамином и последующее восстановление

К водному раствору окисленной гиалуроновой кислоты (1%) (0,1 г, степень замещения: DS=18%, Пример 13) добавили гександиамин (0,4 экв.). Смесь перемешивали в течение 24 часов при температуре 20°С. Далее раствор смешивали с NaBH₃CN (3 экв.) в 0,5 мл воды. Смесь перемешивали в течение 24 часов при температуре 20°С. Далее раствор разбавляли до концентрации 0,1% и диализовали против смеси (0,1% NaCl, 0,1% NaHCO₃), 3×5 литров (один раз в сутки) и против дистиллированной воды 7×5 литров (дважды в сутки). Полученный раствор упаривали и анализировали.

DS 16% (по данным спектроскопии ЯМР).

Спектр ¹Н ЯМР (D₂O) δ 3,12 (м, 2Н, полимер-СН₂-NH-СH₂-),   3,02 (м, 2Н, -CH₂-NH₂),   1,7 (м, 4Н, -NH-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-),   1,45 (м, 4Н, -NH-CH₂-СН₂-СH₂-СH₂-СН₂-) ЯМР (D₂O) DOSY lgD (1,45 м.д, -NH-СН₂-СН₂-СН₂-СH₂-СН₂-)~ - 10,5 м²/с   lgD (1,7 м.д., -NH-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-) ~ -10,5 м²/с   lgD (3,02 м.д., -CH₂-NH₂) ~ -10,5 m²/s   lgD (2,03 м.д., СH₃-СО-NH-полимер) ~ -10,5 м²/с   lgD (H₂O) ~ -8,7 м²/с

Пример 17. Реакция окисленного гиалуронана с аминогиалуронаном

Водный раствор окисленной гиалуроновой кислоты (1%) (0,1 g, степень замещения: DS=18%, Пример 13) смешивали с 1%-ным водным раствором производного гиалуронана, замещенного гександиамином (1 экв., DS=16%, Пример 16) при температуре 20°С. Нерастворимый плотный смолистый осадок, образовавшийся через несколько минут, механически измельчали, отделяли фильтрованием и сушили при пониженном давлении.

Фурье-ИК-спектр (КВr) 1700 см^-1.

Пример 18 Восстановительное аминирование окисленного гиалуронана под воздействием лизина

К водному раствору окисленной гиалуроновой кислоты (1%) (0,1 г, степень замещения: DS=18%, Пример 13) добавили лизин (0.3 экв.). Смесь перемешивали в течение 24 часов при температуре 20°С. Далее раствор смешивали с NaBH₃CN (3 экв.) в 0,5 мл воды. Смесь перемешивали в течение 24 часов при температуре 20°С.Раствор разбавляли до концентрации 0,1% и диализовали против смеси (0,1% NaCl, 0,1% NaHCO₃), 3×5 литров (один раз в сутки) и против дистиллированной воды 7×5 литров (дважды в сутки). Полученный раствор упаривали и анализировали. DS 14% (по данным спектроскопии ЯМР).

Спектр ¹Н ЯМР (HSQC, DOSY, 2% NaOD/D₂O): δ 1,33 (м, 2Н, -СН-СН₂-СH₂-), 1,48 (м, 2Н, -СН-СН₂-СН₂-СH₂-), 1,55 (м, 1Н, -СН-СHН-), 1,63 (м, 1H, -СН-СНH-), 2,62 (м, 2Н, -СН-СН₂-СН₂-СН₂-СH₂-), 2,65 (м, 1Н, полимер-СHН-NH-), 2,99 (м, 1H, полимер-СНH-NH-), 3,16(м, 1H, -СH-СН₂).

Пример 19. Восстановительное аминирование окисленного гиалуронана под воздействием лизина

К водному раствору окисленной гиалуроновой кислоты (1%) (0,1 г, степень замещения: DS=18%, Пример 13) добавили лизин (20 экв.). The mixture was stirred for 24 hours at the temperature of 20°C. The solution was then mixed with NaBH₃CN (10 eq) in 0.5 ml of water. Смесь перемешивали в течение 24 часов при температуре 20°С.Раствор разбавляли до концентрации 0,1% и диализовали против смеси (0,1% NaCl, 0,1% NaHCO₃), 3×5 литров (один раз в сутки) и против дистиллированной воды 7×5 литров (дважды в сутки). Полученный раствор упаривали и анализировали. DS 17% (по данным спектроскопии ЯМР, Пример 10).

Пример 20. Восстановительное аминирование окисленного гиалуронана под воздействием серина

К водному раствору окисленной гиалуроновой кислоты (1%) (0,1 г, степень замещения: DS=18%, Пример 13) добавили серин (0.3 экв.). Смесь перемешивали 1 мин при температуре 20°С. Далее раствор смешивали с NaBH₃CN (3 экв.) в 0,5 мл воды. Смесь перемешивали в течение 24 часов при температуре 20°С. Раствор разбавляли до концентрации 0,1% и диализовали против смеси (0,1% NaCl, 0,1% NaHCO₃), 3×5 литров (один раз в сутки) и против дистиллированной воды 7×5 литров (дважды в сутки). Полученный раствор упаривали и анализировали.

DS 14% (по данным спектроскопии ЯМР).

¹H ЯМР спектр (HSQC, DOSY) (2% NaOD/D₂O), 6: 2,74 (м, 1H, полимер-СHН-NH-), 3,08 (м, 1Н, полимер-CHH-NH-), 3,21 (м, 1Н, -СH-СН₂-ОН), 3,72 (м, 1H, -СН-СHН-ОН), 3,78 (м, 1Н, -СН-СНH-ОН).

Пример 21. Восстановительное аминирование окисленного гиалуронана под воздействием аргинина

К водному раствору окисленной гиалуроновой кислоты (1%) (0,1 г, степень замещения: DS=18%, Пример 13) добавили аргинин (0.3 экв.). Смесь перемешивали в течение 100 часов при температуре 20°С. Далее раствор смешивали с NaBH₃CN (3 экв.) в 0,5 мл воды. Смесь перемешивали в течение 24 часов при температуре 20°С. Раствор разбавляли до концентрации 0,1% и диализовали против смеси (0.1% NaCl, 0,1% NaHCO₃), 3×5 литров (один раз в сутки) и против дистиллированной воды 7×5 литров (дважды в сутки). Полученный раствор упаривали и анализировали. DS 11% (по данным спектроскопии ЯМР).

¹Н ЯМР спектр (HSQC, DOSY) (2% NaOD/D₂O), δ: 1,61 (м, 2Н, -СН-СН₂-СH₂-), 1,63 (м, 1Н, -СН-СНH-), 1,70 (м, 1Н, -СН-СНH-), 2,65 (м, 1Н, полимер-СHН-NH-), 3,01 (м, 1Н, полимер-СНH-NH-), 3,13 (м, 1H, -СH-СН₂-), 3,21 (м, 2Н, -СН-СН₂-СН₂-СH₂-).

Пример 22. Восстановительное аминирование окисленного гиалуронана под воздействием пентапептида PAL-KTTKS (palmytoyl-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser)

Раствор окисленной гиалуроновой кислоты (1%) (0,1 г, степень замещения: DS=18%, Пример 13) в смеси вода/изопропиловый спирт 2:1 смешивали с 1%-ным раствором замещенного пентапептида PAL-KTTKS (0,05 экв.) в изопропиловом спирте. Смесь перемешивали в течение 24 часов при температуре 20°С. Далее раствор смешивали с NaBH₃CN (3 экв.) в 0,5 мл воды. Смесь перемешивали в течение 24 часов при температуре 20°С. Далее полученный раствор разбавляли до концентрации 0.1% и диализовали против смеси (0.1% NaCl, 0.1% NaHCO₃), 3×5 литров (один раз в сутки) и против дистиллированной воды 7×5 литров (дважды в сутки). Полученный раствор упаривали и анализировали.

DS 9% (по данным спектроскопии ЯМР).

1Н ЯМР спектр (HSQC, DOSY) (2% NaOD/D₂O), δ: 1,61 (м, 2Н, -СН-СН₂-СH₂-), 1,63 (м, 1Н, -СН-СНH-), 1,70 (м, 1Н, -СН-СНH-), 2,65 (м, 1Н, полимер-СHН-NH-), 3,01 (м, 1Н, полимер-СНH-NH-), 3,13 (м, 1H, -СH-СН₂-), 3,21 (м, 2Н, -СН-СН₂-СН₂-СH₂-).

Изобретение относится к новому способу получения производного гиалуроновой кислоты, содержащего альдегидную группу в положении (6) гликозаминного полисахаридного фрагмента. В способе получения окисленного производного гиалуроновой кислоты гиалуроновая кислота взаимодействует с 4-R-TEMPO и соокислителем в протонном растворителе, где R - водород или ацетамидо. В качестве соокислителя используется гипохлорит натрия или ТСС (трихлорциануровая кислота), при этом гиалуроновая кислота находится в форме свободной кислоты или соли. Протонный растворитель представляет собой воду или водные растворы солей общей формулы MX, где М - щелочной металл, а X выбирается из группы, включающей HCO₃ ^-, CO₃ ^2-, PO₄ ^3-, HPO₄ ^2-, H₂PO₄ ^- и галогены. Реакцию гиалуроновой кислоты с 4-R-TEMPO и соокислителем проводят при температуре в интервале от -10 до 20°C, предпочтительно при 0°C, в течение от 5 минут до 24 часов, предпочтительно в течение 10 часов. Полученное производное может служить для связывания аминов, диаминов, аминокислот, пептидов и других соединений, содержащих аминогруппу, например, путем восстановительного аминирования под воздействием NaBH₃CN в водном или водно-органическом растворителе. При использовании диаминов или соединений с тремя или более аминогруппами можно получить сшитые производные гиалуронана. Сшитые производные можно получить также по реакции альдегида с гиалуронаном, замещенным аминоалкильной группой ГК-алкил-НH₂. 2 н. и 18 з.п. ф-лы, 22 пр.

1. Способ получения окисленного производного гиалуроновой кислоты, в котором гиалуроновая кислота взаимодействует с 4-R-TEMPO и соокислителем в протонном растворителе, где R - водород или ацетамидо.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, в качестве соокислителя используется гипохлорит натрия или ТСС (трихлорциануровая кислота).

3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что гиалуроновая кислота находится в форме свободной кислоты или соли.

4. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что молярная масса гиалуроновой кислоты находится в интервале от 1·10⁴ до 5·10⁶ г моль^-1.

5. Способ п. 1, отличающийся тем, что протонный растворитель представляет собой воду или водные растворы солей общей формулы MX, где М - щелочной металл, а X выбирается из группы, включающей HCO₃ ^-, CO₃ ^2-, PO₄ ^3-, HPO₄ ^2-, H₂PO₄ ^- и галогены.

6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что концентрация водных растворов солей находится в диапазоне от 0 до 15 масс. %.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что реакцию гиалуроновой кислоты с 4-R-TEMPO и соокислителем проводят при температуре в интервале от -10 до 20°C, предпочтительно при 0°C, в течение от 5 минут до 24 часов, предпочтительно в течение 10 часов.

8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что 4-R-TEMPO вводят в количестве от 0.005 до 0.5 эквивалента по отношению к димеру гиалуронана.

9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что соокислитель вводят в количестве от 0.05 до 1 эквивалента по отношению к димеру гиалуронана.

10. Способ п. 1, отличающийся тем, что в качестве растворителя используется вода или смесь воды с полярным апротонным растворителем, например ДМФА, причем содержание воды составляет не менее 30% (по объему).

11. Способ модификации производного гиалуроновой кислоты, полученного способом по любому из пп. 1-10, в котором окисленное производное гиалуроновой кислоты взаимодействует с амином общей формулы H₂N-R или с гиалуронаном, замещенным группой -R-NH₂, где R - алкил с линейной или разветвленной цепью C₁-C₃₀, необязательно содержащий ароматические или гетероароматические группы.

12. Способ по п. 11, отличающийся тем, что окисленное производное гиалуроновой кислоты взаимодействует с аминокислотой.

13. Способ по п. 11, отличающийся тем, что окисленное производное гиалуроновой кислоты взаимодействует с пептидом.

14. Способ по п. 11, отличающийся тем, что окисленное производное гиалуроновой кислоты взаимодействует с полисахаридом, содержащим свободную аминогруппу.

15. Способ по любому из пп. 11-14, отличающийся тем, что количество амина, аминокислоты, пептида или полисахарида находится в интервале от 0,05 до 10 эквивалентов по отношению к димеру гиалуронана.

16. Способ по любому из пп. 11-14, отличающийся тем, что реакцию окисленного производного гиалуроновой кислоты с амином, аминокислотой, пептидом или полисахаридом проводят в воде или водно-органическом растворителе при температуре в интервале от 0 до 80°C, предпочтительно при 20°C, в течение от 1 минуты до 24 часов, предпочтительно в течение 1 часа.

17. Способ по п. 16, отличающийся тем, что реакцию окисленного производного гиалуроновой кислоты с амином, аминокислотой, пептидом или полисахаридом проводят в присутствии восстановителя NaBH₃CN, который добавляют к реакционной смеси через 0-100 часов после добавления амина, аминокислоты, пептида или полисахарида.

18. Способ по п. 17, отличающийся тем, что количество восстановителя NaBF₃CN находится в интервале от 0 до 20 молярных эквивалентов по отношению к молярному количеству альдегида или геминального диола.

19. Способ по п. 16, отличающийся тем, что органический растворитель выбирают из группы, включающей смешивающиеся с водой спирты, предпочтительно изопропиловый и этиловый спирт, и смешивающиеся с водой полярные апротонные растворители, предпочтительно диметилсульфоксид.

20. Способ по п. 16, отличающийся тем, что количество воды составляет не менее 50 об. % от объема всего раствора.