НЕНАСЫЩЕННЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ ПОЛИСАХАРИДОВ, СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2020 года по МПК C08B37/00 A61K31/726 A61K31/728 A61K31/731 A61K31/737 A61P35/00 A61P39/06 

Область техники изобретения

Настоящее изобретение относится к полисахаридным производным, содержащим, в своей структуре, гетероцикл, имеющий двойную связь в положениях 4 и 5 в соответствии со структурной формулой X,

где R представляет собой-NH-CO-CH₃ или -ОН.

Кроме того, настоящее изобретение относится к получению производных формулы X из исходного полисахарида, содержащего структурный фрагмент Y, где сама модификация может быть упрощена в виде следующей схемы:

где R представляет собой -NH-CO-СН₃ или -ОН, и R¹ представляет собой -SO₂-ONa, -SO₂-ОН или Н, тогда как абсолютная конфигурация углерода 4 может быть R или S.

Кроме того, настоящее изобретение относится к применению данных ненасыщенных производных, которые, в отличие от нативных полисахаридов, проявляют повышенные антиоксидантные свойства, и некоторые из них селективно ингибируют пролиферацию раковых клеток.

Уровень техники изобретения

Полисахариды общей формулы Y

Полисахариды несут различные функции в живых организмах, участвуя в построении структур, хранении питательных веществ и в регуляции. Полисахариды общей формулы Y также относятся к полимерам, встречающимся естественным образом в организмах.

где R представляет собой СН₃-CO-NH- или -ОН и R¹ представляет собой -SO₂-ONa, -SO₂-ОН или Н. К ним относятся, например, хондроитинсульфат, дерматансульфат, каррагинан, кератансульфат или гиалуроновая кислота.

Хондроитинсульфат представляет собой линейный, сульфатированный и отрицательно заряженный гликозаминогликан, состоящий из повторяющихся мономерных звеньев N-ацетил-D-галактозамина и D-глюкуроновой кислоты, соединенных друг с другом β(1→3) и β(1→4) О-гликозидными связями (структурная формула хондроитинсульфата приведена ниже),

где

R¹ представляет собой -Н или -Na,

R² представляет собой -Н, -SO₂-ONa или -SO₂-OH.

Хондроитинсульфат получают из животной соединительной ткани, где он связан с белками и, таким образом, образует часть протеогликанов. Сульфатирование хондроитина в различных позициях обеспечивается различными типами сульфотрансфераз. Уникальный паттерн сульфатирования в конкретных позицииях полимерной цепи кодирует специфическую биологическую активность хондроитинсульфата. Хондроитинсульфат является важным структурным блоком хряща в суставах, обеспечивая их прочность при сжатии и обновление баланса химического состава суставной смазочной жидкости (Baeurle SA et al. Polymer 50, 1805, 2009).

Дерматансульфат представляет собой линейный, сульфатированный и отрицательно заряженный гликозаминогликан, состоящий из повторяющихся мономерных звеньев N-ацетил-D-галактозамина и L-идуроновой кислоты, соединенных друг с другом (1→3) и β(1→4) О-гликозидными связями (структурная формула дерматансульфата приведена ниже),

где

R¹ представляет собой -Н или -Na,

R² представляет собой -Н, -SO₂-OH или -SO₂-ONa.

Дерматансульфат отличается от хондроитинсульфата присутствием L-идуроновой кислоты, которая представляет собой С-5 эпимер D-глюкуроновой кислоты. Зеркальная конфигурация идуроновой кислоты придает больше гибкости дерматансульфатным цепям и обеспечивает их специфическое гликозаминогликан-белковое взаимодействие с непосредственным окружением. Данные взаимодействия вносят вклад в регуляцию нескольких клеточных процессов, таких как миграция, пролиферация, дифференцировка или ангиогенез. Превращение хондроитинсульфата в дерматансульфат обеспечивается с помощью трех ферментов, а именно, дерматансульфатэпимеразы 1 (DS-epil), дерматансульфатэпимеразы 2 (DS-epi2) и дерматансульфат-4-О-сульфотрансферазы (D4ST1) (Thelin М., et al., FEBS Journal 280, 2431, 2013).

Кератансульфат принадлежит к группе линейных сульфатированных полисахаридов, содержащих D-галактозу, N-ацетилглюкозамин и галактоза-6-сульфат, соединенные друг с другом β(1→3) и β(1→4) связями, имеющими структуру и связи, аналогичные хондроитинсульфату. Кератансульфат можно найти в роговице, хрящах, костях и соединительной ткани (структурная формула кератансульфата приведена ниже),

R² представляет собой -Н, -SO₂-OH или -SO₂-ONa.

Каррагинаны принадлежат к группе линейных сульфатированных полисахаридов, получаемых в результате экстракции красных морских водорослей. Галактоза и ее 3,6-ангидропроизводное являются их основными структурными единицами, соединенными друг с другом β(1→3) и β(1→4) О-гликозидными связями. Существуют три основные группы каррагинанов, которые различаются степенью сульфатирования и растворимостью в воде. Каппа-каррагинан имеет одну сульфатную группу в димере и образует жесткие гели в водной среде. Йота-каррагинан содержит два сульфата и образует мягкие гели, в то время как лямбда-каррагинан, имеющий три сульфата, не обнаруживает каких-либо желирующих свойств.

Гиалуроновая кислота представляет собой несульфатированный гликозаминогликан, состоящий из двух повторяющихся блоков D-глюкуроновой кислоты и N-ацетил-D-глюкозамина.

где

R¹ представляет собой Н или Na.

Молекулярная масса нативной гиалуроновой кислоты находится в диапазоне от 5×10⁴ до 5×10⁶ г⋅моль^-1. Данный очень гидрофильный полисахарид является частью соединительных тканей, кожи, суставной синовиальной жидкости; он играет важную роль во многих биологических процессах, таких как организация протеогликанов, гидратация и дифференцировка клеток. Поскольку данный полимер возникает естественным путем в организме и, следовательно, является биодеградируемым, он полезен в качестве субстрата в исследованиях по тканевой инженерии или в качестве носителя биологически активных веществ.

Полисахариды, содержащие кратные связи

Полисахариды, имеющие кратную -С=С- связь, которая образует часть сахаридного цикла и не находится в конце цепи, очень редки. В качестве примера общих полисахаридов, описаны 5,6-ненасыщенные производные целлюлозы, известные как cellulosenes (Vigo Т.L. et al. Polymers for Advanced Technologies, 10, 6, 311-320, 1999) или их 2,3-ненасыщенные аналоги. Способ получения 5,6-ненасыщенных производных основан на реакции элиминации уходящей группы в положении 6 и атома водорода в положении 5 в основных условиях с получением енольного эфира (кратная связь -С=С- сопряжена с гетероциклическим атомом кислорода). Для получения 2,3-ненасыщенных производных целлюлозы, амилозы или ксилана (D. Horton et al. Carbohydrate Research, 40, 2, 345-352, 1975) требуется, в дополнение к наличию уходящих групп, восстанавливающий агент, как правило, цинк, для получения стандартного алкена (без сопряжения кратной связи и атома кислорода).

Использование полисахаридов, содержащих кратные связи

Приложения нацелены, главным образом, на модификацию кратной связи -С=С-, которая не является непосредственной частью сахаридного цикла. Данные способы основаны на присоединении к полимерному остову нового вещества, при котором структура значительно изменяется, то есть нативный характер полисахарида теряется. В таких случаях, кратная связь обычно используется в реакциях полимеризации (Bellini D. WO 96/37519), добавления (Khetan S. et al., Soft Matter, 5, 1601-1606, 2009) или циклоприсоединения (Nimmo Ch. M. et al., Biomacromolecules, 12, 824-830, 2011; Bobula, T. et al., Carbohydrate. Polymers, 125, 153-160, 2015). Данные способы могут приводить как к эффективному сшиванию полисахаридов (Collins М.N. et al., Carbohydrate Polymers, 92, 1262-1279, 2013; Hacker M.C. et al., Inter. J. Mol. Sc., 16, 27677-706, 2015), так и к селективному связыванию активных веществ с полимером (Mero A. et al., Polymers, 6, 346-369, 2014). Кратная связь метакрилатной группы также очень часто используется для проведения реакции полимеризации (Granstrom М. et al., ЕР 2899214).

Имеется только несколько способов введения кратной связи -С=С- непосредственно в сахаридное кольцо в полимерной цепи. Одним из них является ферментативное расщепление полимеров лиазами, когда двойная связь образуется в невосстанавливающем конце полимера (Kelly S.J. et al., Glycobiology, 11, 4, 294-304, 2001), которым является, в данном случае, гиалуроновая кислота (см. схему ниже).

Это означает, что возникновение такой модификации сильно зависит от молекулярной массы; например, при молекулярной массе, равной 4×10⁴ г⋅моль^-1, модифицируется только один из ста дисахаридов, если молекулярная масса составляет 4×10⁵ г⋅моль^-1, модифицируется один из тысячи дисахаридов. Таким образом, очевидно, что, за исключением случая полисахаридных олигомеров, данный тип модификации является незначительным и на самом деле не существует разницы между исходным и полученным высокомолекулярным полимером.

Второй способ позволяет осуществить встраивание двойной связи в полисахаридную структуру в положениях 4 и 5 по всей длине цепи, так что полимеры, имеющие более высокую молекулярную массу, могут быть эффективно модифицированы (Buffa R. et al. WO 2014/023272, Bobula Т. et al. Carbohydrate Polymers, 136, 1002-1009, 2016). Однако, в данном способе образуется кратная связь -С=С-, и данная связь непосредственно сопряжена с сильным электронным акцептором - альдегидной группой. Данная модификация существенно изменяет химические свойства полисахарида, поскольку она позволяет ковалентное связывание широкого спектра нуклеофилов, обычно аминов. Вышеупомянутый факт также подразумевает, что модифицированный таким образом полимер имеет значительно более высокую электрофильность и, следовательно, химически отличается от нативного полимера. Его можно также считать менее активным антиоксидантом по сравнению с немодифицированным полимером.

Решение, описанное в данном изобретении, может устранить подобные недостатки; в модифицированном полимере нет реактивной электрофильной группы, если сравнивать с немодифицированным полимером. Напротив, двойную связь, сопряженную с гетероциклическим атомом кислорода, можно рассматривать как группу, имеющую нуклеофильные (антиоксидантные) свойства.

Сущность изобретения

Предметом настоящего изобретения являются полисахаридные производные, содержащие в своей структуре гетероцикл, имеющий двойную связь в положениях 4 и 5 в соответствии со структурной формулой X,

где R представляет собой -NH-CO-СН₃ или -ОН.

Молекулярная масса производных находится в пределах от 5×10³ до 5×10⁵ г⋅моль^-1, и исходные полисахариды для получения производных по изобретению предпочтительно выбраны из группы, включающей хондроитинсульфат, каррагинан, дерматансульфат, гиалуроновую кислоту или кератансульфат.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения, основанному на трех стадиях (см. схему ниже):

где R представляет собой -NH-CO-СН₃ или -ОН и R¹ представляет собой -SO₂-ONa, -SO₂-ОН или -Н

1. Окисление - введение альдегидной группы в положении 6 сахаридного цикла.

Окисление первичной гидроксильной группы в положении 6 до альдегида. Реакцию можно проводить, например, с помощью окислительной системы 2,2,6,6-тетраметил-1-пиперидинилоксил радикал TEMPO/NaClO в воде. Данная стадия предпочтительно проводится в воде при температуре от 0 до 10°С, с NaClO в молярном количестве, находящемся в пределах диапазона от 0,03 до 0,8 экв., и молярном количестве TEMPO в диапазоне от 0,005 до 0,2 экв. в пересчете на повторяющуюся единицу полисахарида. Исходный полисахарид может иметь молекулярную массу в диапазоне от 5×10³ до 5×10⁵ г⋅моль^-1, и предпочтительно используется от 0,1 до 8 мас. %. водный раствор полисахарида. В завершение, к реакционной смеси может быть добавлен этанол, тиосульфат натрий и т.д., чтобы закончить реакцию и устранить остатки непрореагировавшего вещества (гипохлорит). Альтернативно, окисление может быть осуществлено с помощью системы 1,1,1-триацетокси-1,1-дигидро-1,2-бензидоксол-3(1Н)-она (DMP) при температуре от 10 до 50°С в DMSO, причем количество DMP составляет от 0,05 до 2 экв. в расчете на повторяющуюся единицу полисахарида.

2. Элиминирование

2а. если R¹ = -Н, проводят элиминирование воды (обезвоживание).

Его можно предпочтительно проводить в водно-органических средах, причем органический растворитель является смешивающимся с водой, а объемное соотношение растворителя/воды находится в диапазоне от 3/1 до 1/2. Предпочтительно, на данной стадии можно использовать основание, такое как пиридин, триэтиламин или N,N-диизопропилэтиламин, или неорганическое основание, например Са(ОН)₂. Количество основания в реакционной смеси составляет от 0,01 до 20 экв., предпочтительно от 5 до 10 экв., в расчете на повторяющуюся единицу полисахарида. В качестве органических растворителей могут быть использованы смешивающиеся с водой апротонные полярные растворители, предпочтительно DMSO или сульфолан. Окисление проводят в течение от 0,1 до 12 часов, предпочтительно от 1 до 4 часов; вторую стадию реакции проводят в течение от 12 до 150 часов, предпочтительно от 20 до 40 часов, при температуре от 30 до 80°С, предпочтительно от 50 до 60°С.

2b. если R¹ = -SO₂-ONa или SO₂-OH, выполняется элиминирование группы NaO-SO₂-ONa или HO-SO₂-ONa, соответственно. Если группа -OR¹ в положении 4 в кольце находится в антиперипланарном положении по отношению к водороду в положении 5, элиминирование протекает самопроизвольно без необходимости добавления оснований и без необходимости увеличения температуры реакции. Продолжительность реакции стадий 1+2b составляет от 0,1 до 12 часов, предпочтительно от 1 до 4 часов. Если группа -OR¹ в положении 4 в кольце не находится в антиперипланарном положении по отношению к водороду в положении 5, способ, описанный в части 2а, может быть также использован для эффективного элиминирования.

3. Восстановление - альдегидную группу селективно восстанавливают с борогидридами, предпочтительно с NaBH₄, с образованием первичного спирта -СН₂-ОН, при сохранении кратной связи в положении 4 и 5 сахаридного цикла. Несмотря на то, что специалист в данной области техники мог бы ожидать восстановления двойной связи -С=С- в дополнение к восстановлению альдегидной группы -СНО (или геминального диола -СН(ОН)₂), на удивление, восстановление двойной связи -С=С- не происходит в способе в соответствии с настоящим изобретением. Количество восстановителя может находиться в диапазоне от 0,1 до 10 эквивалентов, в расчете на повторяющуюся единицу полисахарида, предпочтительно от 0,3 до 2 эквивалентов. Реакция может быть выполнена в воде при температуре от 50 до 40°С, рН от 5 до 10, предпочтительно при температуре от 15 до 25°С и рН от 6 до 8 в течение от 1 до 24 часов. Концентрация исходного раствора альдегида предпочтительно составляет от 0,1 до 8% мас.

Приведенные выше факты позволяют предполагать, что способ получения полисахаридных производных в соответствии с настоящим изобретением требует, чтобы исходный полисахарида включал структуру Y

которая включает (1→3) связанный сахаридный цикл, первичную группу -CH₂-ОН в положении 6 и группу -ОН, -SO₂-OH или -SO₂-ONa в положении 4. Группа в положении 2 не является решающей для успешного выполнения данной модификации; для большинства полисахаридов R представляет собой -ОН или -NH-CO-СН₃.

Кроме того, настоящее изобретение относится к применению производных полисахаридов общей формулы X. Как уже было отмечено выше, решение, описанное в данном изобретении, предлагает новые типы производных полисахаридов, имеющих улучшенную нуклеофильность (антиоксидантные свойства) и, в то же время, лишь незначительное изменение первичной структуры полисахарида, вызванное элиминированием атома водорода из положения 5 и группы -ОН, -SO₂-OH или -SO₂-ONa из положения 4. Антиоксидантные свойства данных новых производных были доказаны с помощью стандартного определения с радикалом 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила, когда наблюдались значительные различия между ненасыщенными полисахаридными производными по настоящему изобретению и насыщенными (немодифицированными) аналогами. Именно поэтому производные по настоящему изобретению могут быть использованы, например, для получения материалов с антиоксидантным действием.

Кроме того, было обнаружено, что, если полисахаридом является гиалуроновая кислота, то ненасыщенное производное может быть использовано для получения материала с противораковым действием. Биологические свойства полученных производных тестировали на нескольких линиях клеток карциномы, и во всех случаях наблюдалось снижение выживаемости, тогда как рост стандартных фибробластов не был подавлен с во всем диапазоне протестированных концентраций.

Термин «полисахарид» относится к полисахариду, содержащему структурную единицу Y, такую как, например, гиалуроновая кислота, каррагинан, дерматансульфат, кератансульфат или хондроитинсульфат, или его фармацевтически приемлемой соли.

Термин «фармацевтически приемлемая соль» относится к солям, которые являются безопасными и эффективными для использования in vivo и имеют требуемую биологическую активность. Фармацевтически приемлемые соли предпочтительно включают ионы щелочных металлов или ионов щелочноземельных металлов, более предпочтительно Na⁺, K⁺, Mg⁺ или Li⁺.

Реализация решения, описанного в данном изобретении, не является технологически сложной и не требует использования дорогостоящих химических веществ, растворителей или процедур выделения.

Подробное описание чертежей

Фиг. 1 - Влияние ДНА, полученной в соответствии с примером 25, на жизнеспособность клеток

Схема показывает развитие ингибирования роста раковых клеток MDA-MB-231 -аденокарцинома груди, А-549 - аденокарцинома легкого, HEP-G2 - гепатоцеллюлярная карцинома, по сравнению с ингибированием NHDF (primary human dermal fibroblasts) -первичные человеческие кожные фибробласты.

Процедура описана в примере 27.

Фиг. 2 - Антиоксидантные свойства материалов ΔНА и ΔCS по сравнению с немодифицированными полисахаридами НА, CS и со стандартом - Trolox - 6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоновой кислотой

НА - гиалуроновая кислота

ΔНА - гиалуроновая кислота, дегидратированная в положениях 4 и 5 (пример 22)

CS - хондроитинсульфат

ΔCS - хондроитинсульфат, дегидратированный в положениях 4 и 5 (пример 2) протестировано с помощью 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DTTH)) в соответствии с процедурой, описанной в примере 23

Статистическая значимость t-теста - * р <0,05; ** р <0,01; *** р <0,001

Предпочтительные варианты осуществления изобретения

DS = степень замещения = 100% * (молярное количество модифицированной единицы сахарида) /(молярное количество повторяющейся единицы полисахарида)

Используемый в настоящем изобретении термин эквивалент (экв.) относится к повторяющейся единице конкретного полисахарида, если не указано иное. Процентное значение указано в массовых процентах, если не указано иное.

Молекулярная масса исходных полисахаридов представляет собой среднемасссовую молекулярную массу, определенную способом SECMALLS.

Пример 1

Окисление и элиминирование хондроитинсульфата (CS) = Получение α,β-ненасыщенного CS альдегида

Раствор гипохлорита натрия (0,8 экв., 11% активного хлора) постепенно добавляли в 2%-ный водный раствор CS (200 мг, Mw = 4×10⁴ г⋅моль^-1), охлажденного до 5°С и содержащего додекагидрат гидрофосфата динатрия (2,2 экв.), бромид натрия (0,8 экв.) и 4-AcNH-TEMPO (0,01 экв.). Смесь перемешивали в течение 2 часов при температуре 5°С. Затем к реакционной смеси добавляли этанол (10 экв.) и реакционную смесь перемешивали еще один час при комнатной температуре. Продукт выделяли осаждением с помощью IPA и анализировали с помощью ЯМР.

DS = 23% (установлено с помощью ЯМР)

Пример 2.

Восстановление α,β-ненасыщенного CS альдегида = Получение ΔCS

Готовили 2%-ный раствор мас./об. α,β-ненасыщенного CS-альдегида (200 мг, 0,5 ммоль) в дистиллированной воде, раствор охлаждали до 5°С и затем добавляли 2 эквивалента боргидрида натрия. Реакционную смесь перемешивали в течение 4 часов при 5°С. Продукт выделяли осаждением изопропанолом и анализировали с помощью ЯМР.

DS = 25% (определено с помощью ЯМР), Mw = 2×10⁴ г⋅моль^-1 (определено с помощью SECMALLS)

Спектральный анализ ACS: ЯМР ¹H (500 МГц, D₂O, δ м.д.): 02 и 2,04 (3Н, Ac-NH-; bs); 4,03 (2Н, Н6; bs); 4,22 (1Н, Н2, bs); 4,26 (1Н, Н3; bs); 5,06 (1Н, H1; bs); 5,18 (1Н, Н4, bs); ЯМР ¹Н-¹Н COZY (D₂O); кросс-пики; δ м.д.: 4,22-5,06; 4,26-5,18; ЯМР ¹Н-¹³С HSQC (D₂O); кросс-пики; δ м.д.: 4,03-61,0; 4,22-50,5; 4,26-73,4; 5,06-98,3; 5,18-98,9; ЯМР DOSY (D₂O); log D ((2,02 и 2,04; Ac-NH-); (4,03; Н6); (4,22; Н2); (4,26; Н3); (5,06; Н4); (5,18; H1)) ~ -10,4 m²s^-1; log D (4,72; H₂O) ~ -8;6 m²s^-1; ИК (KBr; см^-1): 1660 (v -С=С- st);

Пример 3

Окисление и элиминирование дерматансульфата (DeS) = Получение α,β-ненасыщенного DeS-альдегида

Водный раствор гипохлорита натрия (0,8 экв., 11% активного хлора) постепенно добавляли в 2%-ный водный раствор DeS (200 мг, 0,42 ммоль), охлажденного до 5°С и содержащего додекагидрат гидрофосфата динатрия (2,2 экв.), бромид натрия (0,8 экв.) и 4-AcNH-TEMPO (0,01 экв.), смесь перемешивали в течение 2 часов при 5°С. Затем к реакционной смеси добавляли этанол (10 экв.) и реакционную смесь перемешивали еще один час при комнатной температуре. Продукт выделяли осаждением с помощью IPA и анализировали с помощью ЯМР.

DS = 20% (определено с помощью ЯМР)

Пример 4

Восстановление α,β-ненасыщенного альдегида дерматансульфата = Получение ΔDeS

Готовили 2%-ный раствор мас./об. α,β-ненасыщенного DeS-альдегида (200 мг, 0,5 ммоль) в дистиллированной воде. Раствор охлаждали до 5°С и затем добавляли боргидрид натрия (2 эквивалента на дисахарид DeS). Реакционную смесь перемешивали в течение 4 часов при 5°С. Продукт выделяли осаждением изопропанолом и анализировали с помощью ЯМР.

DS = 23% (определено с помощью ЯМР)

Спектральный анализ ΔDeS: ЯМР ¹Н (500 МГц, D₂O, δ м.д.): 2,01 (3Н, Ac-NH-, bs), 5,05 (1H, Hl, bs), 5,17(lH, Hl, bs).

Пример 5

Окисление и элиминирование каррагинана (КА) = Получение α,β-ненасыщенного КА-альдегида

Водный раствор гипохлорита натрия (0,8 экв., 11% активного хлора) постепенно добавляли в 1%-ный водный раствор КА (200 мг, 0,31 ммоль), охлажденного до №% °С, содержащего содержащего додекагидрат гидрофосфата динатрия (2,2 экв.), бромид натрия (0,8 экв.) и 4-AcNH-TEMPO (0,01 экв.). Смесь перемешивали в течение 2 часов при 10°С. Затем к реакции добавляли этанол (10 экв.) и реакционную смесь перемешивали еще один час при комнатной температуре. Продукт выделяли осаждением с помощью IPA и анализировали с помощью ЯМР.

DS = 10% (определено с помощью ЯМР)

Пример 6

Восстановление α,β-ненасыщенного альдегида каррагинана = Получение ΔКА

Готовили 2%-ный раствор мас./об. α,β-ненасыщенного альдегида КА (200 мг, 0,5 ммоль) в дистиллированной воде. Раствор охлаждали до 5 °С и затем добавляли боргидрид натрия (2 эквивалента на дисахарид КАА). Реакционную смесь перемешивали в течение 4 часов при 5°С. Продукт выделяли осаждением изопропанолом и анализировали с помощью ЯМР.

DS = 13% (определено с помощью ЯМР)

ЯМР ¹Н (500 МГц, D₂O, δ м.д.): 5,07 (1Н, H1, bs), 5,18 (1Н, H1, bs),

Пример 7

Окисление кератансульфата (КS) = Получение KS-альдегида

Водный раствор NaClO (0,3 экв.) постепенно добавляли, в атмосфере азота, в 1%-ный водный раствор KS (1 г, 2×10⁴ г⋅моль^-1), содержащий NaCl 1%, KBr 1%, TEMPO (0,01 экв.) и NaHCO₃ (20 экв.). Смесь перемешивали в течение 24 часов при 0°С, затем добавляли 0,1 г тиосульфата натрия и смесь перемешивали дополнительно в течение 10 минут. Полученный раствор разбавляли дистиллированной водой до 0,2% и диализовали против смеси (0,1% NaCl, 0,1% NaHCO₃), 5 литров 3 раза (один раз в день), и против дистиллированной воды, 5 литров 7 раз (2 раза в день). Затем полученный раствор выпаривали и анализировали.

DS 3% (определено с помощью ЯМР)

Пример 8

Элиминирование KS-альдегида = Получение α,β-ненасыщенного альдегида KS

6,7 мл DMSO и DIPEA основания (5 экв.) добавляли в 3% раствор КS-альдегида (0,1 г, степень окисления DS = 3%, пример 7) в воде. Смесь перемешивали в течение 72 часов при температуре 60°С. Затем полученный раствор осаждали смесью изопропанол/гексан и твердую часть сушили в вакууме.

DS 2% (определено с помощью ЯМР),

ЯМР ¹Н (D₂O) δ 9,22 (с, 1Н, -CH=O), 32 (м, 1Н, -СН= С-СН=O)

Пример 9

Восстановление α,β-ненасыщенного альдегида KS = Получение ΔKS

Боргидрид натрия (2 экв.) добавляли в 2%-ный раствор α,β-ненасыщенного KS-альдегида (200 мг, пример 8) в дистиллированной воде. Реакционную смесь перемешивали в течение 3 часов при 5°С, затем осаждали изопропанолом и анализировали с помощью ЯМР.

DS = 2% (определено с помощью ЯМР)

ЯМР ¹H (D₂O) 5,05 (1Н, H1, bs), 5,17 (1Н, Н4, bs)

Пример 10

Окисление гиалуроновой кислоты (НА) = Получение НА-альдегида

Водный раствор NaClO (0,5 экв.) постепенно добавляли, в атмосфере азота, в 1%-ный водный раствор НА (1 г, 2×10⁵ г⋅моль^-1), содержащий NaCl, 1%, KBr l%, TEMPO (0,01 экв.) и NaHCO₃ (20 экв.). Смесь перемешивали в течение 12 часов при 0°С, затем добавляли 0,5 мл этанола и смесь перемешивали еще 1 час. Полученный раствор разбавляли дистиллированной водой до 0,2% и диализовали против смеси (0,1% NaCl, 0,1% NaHCO₃), 5 литров 3 раза (один раз в день), и против дистиллированной воды, 5 литров 7 раз (2 раза в день). Затем полученный раствор выпаривали и анализировали.

DS 10% (определено с помощью ЯМР)

Пример 11

Окисление НА = Получение НА-альдегида

Водный раствор NaClO (0,5 экв.) постепенно добавляли, в атмосфере азота, в 1%-ный водный раствор НА (1 г, 2×10⁵ г⋅моль^-1), содержащий 1% NaCl, КВг 1%, N-ацетиламино -TEMPO (0,01 экв.) и NaHCO₃ (20 экв.). Смесь перемешивали в течение 12 ч при 10°С, затем добавляли 0,1 мл этанола и смесь перемешивали еще в течение 1 часа. Полученный раствор разбавляли дистиллированной водой до 0,2% и диализовали против смеси (0,1% NaCl, 0,1% NaHCO₃), 5 литров 3 раза (один раз в день), и против дистиллированной воды, 5 литров 7 раз (2 раза в день). Затем полученный раствор выпаривали и анализировали.

DS 9% (определено с помощью ЯМР)

Пример 12

Окисление НА = Получение НА-альдегида

Водный раствор NaClO (0,3 экв.) постепенно добавляли, в атмосфере азота, в 1%-ный водный раствор НА (1 г, 2×10⁵ г⋅моль^-1), содержащий NaCl, 1%, 1% KBr, TEMPO (0, 2 экв.) и NaHCO₃ (20 экв.). Смесь перемешивали в течение 48 ч при 5°С, затем добавляли 0,1 мл этанола и смесь перемешивали еще 1 час. Полученный раствор разбавляли дистиллированной водой до 0,2% и диализовали против смеси (0,1% NaCl, 0,1% NaHCO₃), 5 литров 3 раза (один раз в день), и против дистиллированной воды, 5 литров 7 раз (2 раза в день). Затем полученный раствор выпаривали и анализировали.

DS 5% (определено с помощью ЯМР)

Пример 13

Окисление гиалуроновой кислоты (НА) = Получение НА-альдегида

Водный раствор NaClO (0,7 экв.) постепенно добавляли, в атмосфере азота, в 1%-ный водный раствор НА (1 г, 2×10⁵ г⋅моль^-1), содержащий NaCl, 1%, 1% KBr, TEMPO (0,01 экв.) и NaHCO₃ (20 экв.). Смесь перемешивали в течение 0,5 ч при 0°С, затем добавляли 0,1 мл этанола и смесь перемешивали еще 1 час. Полученный раствор разбавляли дистиллированной водой до 0,2% и диализовали против смеси (0,1% NaCl, 0,1% NaHCO₃), 5 литров 3 раза (один раз в день), и против дистиллированной воды, 5 литров 7 раз (2 раза в день). Затем полученный раствор выпаривали и анализировали.

DS 9% (определено с помощью ЯМР)

Пример 14

Окисление гиалуроновой кислоты (НА) = Получение НА-альдегида

Водный раствор NaClO (0,5 экв.) постепенно добавляли, в атмосфере азота, в 1%-ный водный раствор НА (1 г, 2×10⁵ г⋅моль^-1), содержащий NaCl, 1%, 1% KBr, TEMPO (0,01 экв.) и NaHCO₃ (20 экв.). Смесь перемешивали в течение 12 ч при 0°С, затем добавляли 0,1 мл этанола и смесь перемешивали еще 1 час. Полученный раствор разбавляли дистиллированной водой до 0,2% и диализовали против смеси (0,1% NaCl, 0,1% NaHCO₃), 5 литров 3 раза (один раз в день), и против дистиллированной воды, 5 литров 7 раз (2 раза в день). Затем полученный раствор выпаривали и анализировали.

DS 10% (определено с помощью ЯМР)

Пример 15

Окисление гиалуроновой кислоты (НА) = Получение НА-альдегида 1,2 экв. 1,1,1-триацетокси-1,1-дигидро-1,2-бензиодоксол-3(1Н)-она (реагент Десс-Мартина) добавляли в 1%-ный раствор кислой формы гиалуронана (1 г, 1×10⁵ г⋅моль^-1) в неводном DMSO, и смесь перемешивали в течение 5 ч при 20°С. Полученный раствор затем разбавляли дистиллированной водой до 0,2% и диализовали против смеси (0,1% NaCl, 0,1% NaHCO₃), 5 литров 3 раза (один раз в день), и против дистиллированной воды, 5 литров 7 раз (2 раза в день). Затем полученный раствор выпаривали и анализировали.

DS 40% (определено с помощью ЯМР)

Пример 16

Элиминирование НА-альдегида = Получение α,β-ненасыщенного НА-альдегида

6,7 мл DMSO и основания DIPEA (5 экв.) добавляли в 3%-ный раствор НА-альдегида (0,1 г, степень окисления DS = 40%, пример 15) в воде. Смесь перемешивали в течение 72 часов при 60°С. Полученный раствор затем осаждали смесью изопропанол/гексан, и твердое вещество сушили в вакууме.

DS 20% (определено с помощью ЯМР),

ЯМР ¹Н (D₂O) δ 9,24 (с, 1H, -CH=O), 6,32 (м, 1Н, -CH=С-СН=O)

UV-Vis (D₂O) 252 нм, π-π* переход α,β-ненасыщенный альдегид

Пример 17

Элиминирование НА-альдегида = Получение α,β-ненасыщенного НА-альдегида

6,7 мл DMSO и основание триэтиламин (20 экв.) добавляли в 3%-ный раствор НА-альдегида (0,1 г, степень окисления DS = 10%, пример 10) в воде. Смесь перемешивали в течение 150 часов при температуре 3°С. Полученный раствор затем осаждали смесью изопропанол/гексан, и твердое вещество сушили в вакууме.

DS 5% (определено с помощью ЯМР)

Пример 18

Элиминирование НА-альдегида = Получение α,β-ненасыщенного НА-альдегида

6,7 мл DMSO и пиридиновое основание (0,01 экв.) добавляли в 3%-ный раствор НА-альдегида (0,1 г, степень окисления DS = 10%, пример 10) в воде. Смесь перемешивали в течение 12 часов при 8°С. Полученный раствор затем осаждали смесью изопропанол/гексан, и твердое вещество сушили в вакууме.

DS 3% (определено с помощью ЯМР)

Пример 19

Элиминирование НА-альдегида = Получение α,β-ненасыщенного НА-альдегида

1 0,7 мл DMSO и пиридиновое основание (10 экв.) добавляли в 3%-ный раствор НА-альдегида (0,1 г, степень окисления DS = 10%, пример 10) в воде. Смесь перемешивали в течение 48 часов при температуре 6°С. Полученный раствор затем осаждали смесью изопропанол/гексан, и твердое вещество сушили в вакууме.

DS 4% (определено с помощью ЯМР)

Пример 20

Элиминирование НА-альдегида = Получение α,β-ненасыщенного НА-альдегида

10 мл DMSO и основание DIPEA (5 экв.) добавляли в 3%-ный раствор НА-альдегида (0,1 г, степень окисления DS = 10%, пример 10) в воде. Смесь перемешивали в течение 48 часов при температуре 6°С. Полученный раствор затем осаждали смесью изопропанол/гексан, и твердое вещество сушили в вакууме.

DS 5% (определено с помощью ЯМР)

Пример 21

Элиминирование НА-альдегида = Получение α,β-ненасыщенного НА-альдегида

6,7 мл сульфонана и основание DIPEA (5 экв.) добавляли в 3%-ный раствор НА-альдегида (0,1 г, степень окисления DS = 10%, пример 10) в воде. Смесь перемешивали в течение 7 часов при температуре 5°С. Полученный раствор затем осаждали смесью изопропанол/гексан и твердую часть сушили в вакууме.

DS 5% (определено с помощью ЯМР)

Пример 22

Восстановление α,β-ненасыщенного НА-альдегида = получение ΔНА

Боргидрид натрия (10 экв.) добавляли в 2%-ный раствор α,β-ненасыщенного НА-альдегида (200 мг, пример 16) в дистиллированной воде, при температуре 5°С. Реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа при 5 С, затем осаждали изопропанолом и анализировали с помощью ЯМР.

DS 20% (определено с помощью ЯМР)

ЯМР ¹Н (D₂O) 5,06 (1Н, H1, bs), 5,17 (1Н, H1, bs)

Пример 23

Восстановление α,β-ненасыщенного НА-альдегида = получение ΔHA

Боргидрид натрия (0,1 экв.) добавляли в виде 2%-ного раствора α,β-ненасыщенного НА-альдегида (200 мг, пример 17) в дистиллированной воде, при температуре 5°С. Реакционную смесь перемешивали в течение 20 часов при 5°С, затем осаждали изопропанолом и анализировали с помощью ЯМР.

DS = 4% (определено с помощью ЯМР)

Пример 24

Восстановление α,β-ненасыщенного НА-альдегида = получение ΔHA

Боргидрид натрия (1 экв.) добавляли в виде 2%-ного раствора α,β-ненасыщенного НА-альдегида (200 мг, пример 17) в дистиллированной воде при 40°С. Реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа при 40°С, затем осаждали изопропанолом и анализировали с помощью ЯМР.

DS = 5% (определено с помощью ЯМР)

Пример 25

Восстановление α,β-ненасыщенного НА-альдегида = получение ΔНА

Боргидрид натрия (2 экв.) добавляли в виде 2%-ного раствора α,β-ненасыщенного НА-альдегида (200 мг, пример 17) в дистиллированной воде при 20°С. Реакционную смесь перемешивали в течение 4 часов при 20°С, затем осаждали изопропанолом и анализировали с помощью ЯМР.

DS = 5% (определено с помощью ЯМР)

Пример 26

Определение окислительной активности (Фигура 2)

Антиоксидантную активность ДНА полисахаридов, полученных в соответствии с примером 22, и ΔCS, полученного в соответствии с примером 2, определяли с помощью стабильного свободного радикала 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила (ДФПГ, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)). Данное определение было выполнено в соответствии с описанием в (Brand-Williams W. et al., LWT- Science Science and Technology, 28, 1, 25-30, 1995) с незначительной модификацией. Вкратце, 100 мкл 0,01%-ного раствора ДФПГ в метаноле добавляли в 100 мкл тестируемого вещества, растворенного в 50 мМ Tris рН 7,1. Уменьшение оптической плотности измеряли через 15 мин при 515 нм. В качестве положительного контроля использовали Trolox (6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоновую кислоту). Данные измерялись в трех независимых экспериментах. Т-тест был использован для оценки статистической значимости * р<0,05, ** р<0,01, *** р<0,001 (Фигура 2).

Пример 27

Испытание цитотоксичности производных, полученных в соответствии с примером 25 (фиг. 1)

Цитотоксическое действие производного НА сравнивали для нераковых клеток -первичных дермальных фибробластов человека, а также для клеточных линий карциномы молочной железы (MDA-MB-231), клеточных линий карциномы легких (А-549) и клеточных линий гепатоцеллюлярной карциномы (HEP-G2). Для целей экспериментов, клетки культивировали в стандартных условиях (37°С, 5% СО₂) в соответствующей среде (10% FBS (fetal bovine serum) - эмбриональная бычья сыворотка). После достижения 80% конфлюэнтности клетки пассировали, подсчитывали с помощью автоматического счетчика CASY ТТ, Roche, и наносили на 96-луночные планшеты с плотностью 5000 клеток на лунку в 200 мкл среды. Через 24 часа заменяли среду растворами тестируемых веществ с концентрациями 1000; 500; 100; и 10 мкг/мл в 10% среды. Жизнеспособность клеток измеряли через 24, 48 и 72 часа после обработки с помощью теста МТТ - 20 мкл раствора МТТ (5 мг/мл) добавляли в каждую лунку, а затем проводили инкубацию в течение 2,5 часов с последующим лизисом клеток раствором для солюбилизации (IPA:DMSO 1:1 с 10% Triton Х-100 и 9,9% 37% HCl) в течение 30 минут. Затем измеряли поглощение с помощью устройства считывания микропланшетов VERSAmax при 570 нм и 690 нм (коррекция фона). Жизнеспособность обработанных клеток оценивали по корреляции с необработанным контролем, который соответствует нулю на фигуре 1. Значения выше нуля относятся к клеточной активации (отсутствие цитотоксического действия производных соединений), и значения ниже нуля указывают на пониженную клеточную жизнеспособность - т.е. цитотоксическое действие производных соединений. В случае NHDF, очевидно, на фигуре 1, что тестируемое производное соединение не имело цитотоксического действия. В случае с линиями карциномы (MDA-MB-231, А-549, НЕР-G2), наблюдалось цитотоксическое действие производных соединений. На основании результатов представленных испытаний, может быть выведен потенциальный противораковое действие производного соединения (фигура 1).

Группа изобретений относится к биотехнологии, а именно к получению новых полисахаридных производных, содержащих в своей структуре гетероцикл, имеющий двойную связь в положениях 4 и 5 в соответствии со структурной формулой X

где R представляет собой -NH-CO-СН₃ или –ОН. Способ получения состоит в окислении группы ОН в положении 6 до альдегида, с последующим элиминированием, имеющим целью образование двойной -С=С- связи в положениях 4 и 5, и окончательным восстановлением альдегидной группы в положении 6 до исходного спирта. Полученные производные полисахаридов показывают повышенную антиоксидантную активность, а производные на основе гиалуроновой кислоты также характеризуются избирательным отрицательным действием на жизнеспособность клеток карциномы. 4 н. и 10 з.п. ф-лы, 2 ил., 27 пр.

1. Ненасыщенное производное полисахаридов, содержащее в своей структуре по меньшей мере один гетероцикл, имеющий двойную связь в положениях 4 и 5 в соответствии со структурной формулой X

где R представляет собой -NH-CO-СН₃ или -ОН.

2. Ненасыщенное производное полисахаридов по п. 1, характеризующееся тем, что его молекулярная масса находится в диапазоне от 5×10³ до 5×10⁵ г⋅моль^-1 и что полисахариды выбраны из группы, включающей хондроитинсульфат, каррагинан, дерматансульфат, гиалуроновую кислоту или кератансульфат.

3. Способ получения полисахаридного производного по п. 1 или 2, характеризующийся тем, что исходный полисахарид, включающий фрагмент Y

где R представляет собой -NH-CO-СН₃ или -ОН, и R¹ представляет собой -SO₂-ONa, -SO₂-ОН или -Н, на первой стадии окисляется до альдегида в положении 6, на второй стадии подвергается элиминированию в положениях 4 и 5 цикла с образованием двойной связи, и на третьей стадии альдегидная группа селективно восстанавливается.

4. Способ получения по п. 3, характеризующийся тем, что исходный полисахарид представляет собой хондроитинсульфат, каррагинан, дерматансульфат, гиалуроновую кислоту или кератансульфат.

5. Способ получения по п. 3, характеризующийся тем, что на первой стадии окисление в положении С-6 протекает либо с помощью системы R³-TEMPO/NaClO, где R³ представляет собой водород или N-ацетильную группу, в воде при температуре от 0 до 10°С, причем молярное количество NaClO находится в пределах диапазона от 0,3 до 0,8 экв. и молярное количество R³-TEMPO находится в пределах диапазона от 0,005 до 0,2 экв., в расчете на повторяющуюся единицу полисахарида, либо с помощью 1,1,1-триацетокси-1,1-дигидро-1,2-бензиодоксол-3(1Н)-она (DMP) в DMSO при температуре от 10 до 50°С, причем количество DMP находится в пределах диапазона от 0,05 до 2 экв., в расчете на повторяющуюся единицу полисахарида.

6. Способ получения по п. 3, характеризующийся тем, что исходный полисахарид представляет собой гиалуроновую кислоту или кератансульфат, и что на второй стадии окисленный полисахарид подвергается реакции элиминирования в смеси вода/полярный апротонный растворитель в присутствии основания при температуре от 30 до 80°С, предпочтительно при температуре от 50 до 60°С.

7. Способ получения по п. 6, характеризующийся тем, что количество основания составляет от 0,01 до 20 экв., предпочтительно от 5 до 10 экв., в расчете на повторяющуюся единицу полисахарида, причем основание выбрано из группы, включающей органические основания, например пиридин, триэтиламин или N,N-диизопропилэтиламин, или неорганические основания, например Са(ОН)₂.

8. Способ получения по п. 6, характеризующийся тем, что апротонный растворитель смешивается с водой и включает в себя, например, DMSO или сульфолан, и объемное соотношение растворителя/воды находится в пределах диапазона от 3/1 до 1/2.

9. Способ получения по п. 6, характеризующийся тем, что вторая стадия реакции протекает в течение от 12 до 150 часов.

10. Способ получения по п. 3, характеризующийся тем, что исходный полисахарид представляет собой хондроитинсульфат, каррагинан или дерматансульфат, и что окисленный полисахарид спонтанно элиминируется на второй стадии, непосредственно в реакционной смеси с образованием α,β-ненасыщенного альдегида, и спонтанное элиминирование протекает без необходимости добавления какого-либо основания, органического растворителя и без повышения температуры реакции.

11. Способ получения по п. 3, характеризующийся тем, что молекулярная масса исходного полисахарида находится в диапазоне от 5×10³ до 5×10⁵ г⋅моль^-1.

12. Способ получения по п. 3, характеризующийся тем, что на третьей стадии добавляют боргидрид натрия в количестве от 0,1 до 10 экв., предпочтительно от 0,3 до 2 экв., в расчете на повторяющуюся единицу полисахарида, в воде, при температуре от 5 до 40°С, предпочтительно при температуре от 15 до 25°С, при рН в диапазоне от 5 до 10, предпочтительно от 6 до 8.

13. Применение производного по п. 1 или 2 для получения материала, обладающего повышенным антиоксидантным действием.

14. Применение производного по п. 2, причем полисахарид представляет собой гиалуроновую кислоту, для получения материала, имеющего противораковое действие.