ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS THURINGIENSIS SPP THURINGIENSIS ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ЭКЗОТОКСИНСОДЕРЖАЩИХ БИОИНСЕКТИЦИДОВ Российский патент 1996 года по МПК A01N63/00 C12N1/20 C12N1/20 C12R1/07 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и биотехнологии, а именно к производству бактериальных инсектицидов для борьбы с вредителями растений: тлей, паутинным клещем, хлопковыми совками, капустной мухой и личинками колорадского мука, а также против личинок зоофильных и синантропных мух.

Обеспечение продовольствием находится в прямой зависимости от сохранения сельскохозяйственных культур от вредителей, уничтожающих до 30% урожая. Использование химических инсектицидов в ввиду их опасности для окружающей среды нецелесообразно. Экологически чистыми являются биологические инсектициды на основе бактерий Ваci11us thuringiеnsis. Действующим началом инсектицидной активности является белковый кристаллический эндотоксин, обладающий высокой специфичностью действия. Бактерии Вас. thuringiеnsis подвида thuringiеnsis I серотипа кроме эндотоксина продуцируют термостабильный экзотоксин (синонимы бета-экзотоксин, flу-фактор), представляющий собой атипичный нуклеотид, в состав которого входят остатки аденина, рибозы, глюкозы, аллослизевой и ортофосфорной кислот. Экзотоксин сравнительно безопасен для теплокровных и человека, а спектр его действия для насекомых практически неограничен, он может быть использован как кишечный, так и контактный яд. Эндотоксин бактерий Вас. thuringiensis subsр.thuringiеnsis токсичен для представителей отряда чешуекрылых.

В настоящее время на основе бактерий Васillus thuringiеnsis subsp. thuringiеnsis производится два отечественных инсектицидных препарата: Битоксибациллин, содержащий экзо- и эндотоксины и Турингин на основе бета-экзотоксина.

В качестве ближайшего аналога взят штамм продуцент Битоксибациллина - Ваcillus thuringiеnsis subsр. thuringiеnsis 98 [1] выделяющий экзотоксин в сравнительно невысокой концентрации 0,6 0,8 мг/мл. Другим существенным недостатком этого штамма является чувствительность к фагам [2] Высокая спорообразующая способность известного штамма при длительном использовании бактериального средства защиты может привести к накоплению спор в почве и вызвать сдвиг в экологическом равновесии почвенных микроорганизмов.

Технический результат заявленного изобретения состоит в получении штамма бактерий Ваc.thuringiеnsis subsр.thuringiensis, продуцирующего в культуральную жидкость экзотоксин в более высокой концентрации и эндотоксин с активностью не ниже штамма, описанного в ближайшем аналоге. При сохранении уровня спорообразования предполагается снизить термостабильность спор.

Эта цель достигается использованием в качестве продуцента штамма Ваc. thuriпgiensis НI НИИгенетика 16-Т5О (ВКПМ В-6404), обладающего, более высокими технологическими характеристиками: повышенная концентрация экзотоксина, сравнительная термолабильность спор, активный белковый эндотоксин и фагоустойчивость.

Заявляемый штамм выделен путем многоступенчатой селекции из штамма 98 по признакам экзотоксинообразования, термолабильности спор и фагоустойчивости, имеет следующие характеристики.

1. Культурально- морфологические признаки. Грамположительные подвижные палочки, размером 1,2-1,6 х 2,5-3,0 мкм.

На aгаре Хоттингера при 28^oС через 24 ч роста образует колонии круглой формы с неровными краями и мелкозернистой поверхностью диаметром 4-5 мм. При росте в бульоне Хоттингера при 28^oС через 18 24 ч образуется умеренно-мутная суспензия клеток, при стоянии выпадающая в осадок, через 72 ч образуются единичные споры.

В дрожже-полисахаридной среде (ДПС) следующего состава, г/л: дрожжи кормовые -30, мука кукурузная -15, вода водопроводная до 1 л, рН 7,0 7,2, через 48 ч инкубации при 30^oС титр жизнеспособных клеток составляет 3,2 млрд/мл, термостабильные споры 0,05 образуются кристаллические включения ромбовидной формы 2 х 0,6 мк и термостабильный экзотоксин.

2.Биохимические признаки.

Штамм 16-Т50 не сбраживает маннозу, салицин, эскулин, не образует лецитиназу, гидролизует крахмал, сбраживает сахарозу. Штамм усваивает ионы аммония и глутаминовую кислоту. Режим культивирования 28-34^oС, оптимум роста 30^oС. Значения рН питательной среды для оптимального культивирования 6,8-7,0.

3. Антигенные свойства.

Вегетативные клетки штамма НИИгенетика 16-Т50 дают положительную реакцию агглютинации с сывороткой Н1.

4. Антагонистические свойства.

Штамм 16-Т50 подавляет рост ряда бактериальных видов: Sаrcina f1аvа, Ваc.subti1is и Ваc.thuringiеnsis других подвидов.

5. Генетические характеристики.

Штамм устойчив к пенициллину (в мкг/мл ) -100, полимиксину -100, тетрациклину 25. Кристаллы штамма состоят из белка с молекулярной массой -130 кDа.

6. Инсектицидные свойства.

Штамм высоко активен против двукрылых (Мuscа dоmesticа, Аеdеs аеgyрtу), жесткокрылых насекомых (колорадского жука), тлей, капустной мухи за счет экзотоксина; белковый кристалл штамма активен против непарного шелкопряда.

7. Фагочувствительность.

Штамм 16-Т5О устойчив к фагам Тg4,Тg13,Тg81,К,М,Э-5,И-77,2,3, 4,5 и ограничивает развитие фагов группы БТБ на 8 порядков.

8. Хранение.

Штамм рекомендуется хранить в лиофильно высушенном виде в стеклянных запаянных ампулах или в виде спорового препарата в жидкой или агаризованной среде ДПС.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Культивирование штамма 16-Т5О.

Культуру штамма 16-Т50 выращивают 24 ч при температуре 28-30^oС в пробирках на скошенных косяках Хоттингера, переносят в бульон Хоттингера (5 мл) и инкубируют 4 ч, затем 5 мл вносят в колбы емкостью 750 мл с 50 мл среды ДПС и культивируют 48 ч при 30^oС на качалке. Определяют титр жизнеспособных клеток и количество термостабильных спор титрованием культуры до и после нагревания при 70^oС в течение 30 мин. Соотношение вегетативных клеток, спор и кристаллов контролируют в оптическом микроскопе.

Результаты представлены в таблице 1.

За 48 ч инкубации в среде ДПС штаммы 98 и 16-Т5О образуют одинаковое количество жизнеспособных клеток 3,2 млрд/мл, однако содержание термостабильных спор различается 0,5 и 95% соответственно. Световая микроскопия выявляет одинаковое количество спор и кристаллов в препаратах штаммов 98 и 16-Т50. Штамм 16-Т50 образует в основном термолабильные споры и этим отличается от штамма аналога.

Пример 2. Сравнение предлагаемого штамма и штамма-аналога по инсектицидной активности экзотоксина
Для оценки термостабильного экзотоксина автоклавированный (110^o С, 0,5 атм, 5-7 мин) или прогретые (100^oC, 30 мин) образцы культур центрифугируют, надосадочную жидкость испытывают на активность в отношении личинок комнатной мухи III стадии развития и колорадского жука 1-2 возраста.

Разведения надосадочной жидкости вносят в корм (пшеничные отруби, молоко и вода в соотношении 3 1 6) 1 мл на 10 г, помещают 25 личинок комнатной мухи и инкубируют при 25^oС. Подсчет куколок проводят на 4-6, а имаго - на 10 сутки после вылета.

Для оценки действия против колорадского жука листья картофеля обмакивают в разведениях надосадочной жидкости, подсушивают на воздухе и помещают в чашки Петри с 10 личинками жука. Инкубируют при комнатной температуре, через 3 суток проводят подсчет погибших личинок.

LК50 определяют по формуле: lg LК50lg Cmах (Li -0,5) [3]
Результаты представлены в таблице 2.

Пример 3. Определение количественного содержания экзотоксина в культуральной жидкости предлагаемого штамма 16-Т5О и штамма-аналога 98.

Концентрацию экзотоксина определяют в надосадочной жидкости культур: спектрофотометрически путем осаждения экзотоксина солями Са-Ва, после удаления солей ионообменными смолами при длине волны 260 нм [4] методом анионообменной хроматографии [5]
Результаты представлены в табл.2.

Пример 4. Определение активности белкового эндотоксина у предлагаемого штамма 16-Т50 и штамма-аналога 98.

Инсектицидную активность эндотоксина определяют против гусениц непарного шелкопряда 2 возраста, против которых экзотоксин активностью не обладает. Разведения культуральной жидкости 2 мл вносят в 9 г корма следующего состава, г: фасоль 200, агар-агар 15, сахароза 12, дрожжи пивные медицинские - 15, фолиевая кислота 0,001, аскорбиновая кислота 4, бензойная кислота 2, разведенная в 7 мл этилового спирта, К₂НРО 4; мл, вода 350, масло льняное 2, формалин 5. Распределяют на три чашки Петри, в которые помещают по 10 гусениц. Инкубируют при комнатной температуре, через 6 суток проводят подсчет погибших гусениц. LК50 определяют по формуле (см. выше).

Инсектицидная активность штамма 16-Т50 не отличалась от активности штамма-аналога и составляла 0,035
Пример 5. Сравнение фагоустойчивости штаммов 16-Т50 и 98.

Чувствительность штаммов к фагам определяют титрованием фагов двухслойным методом на агаре Хоттингера. Используют фаги группы БТБ, выделенные при производстве Битоксибациллина, а также фаги, специфичные для бактерий Ваc.thuringiensis других подвидов.

Результаты приведены в табл.3. Штамм НИИгенетика 16-Т5О устойчив ко всем изученным фагам Вас.thuringiensis, в то время как штамма 98 проявляет чувствительность к фагам, выделенным при промышленных ферментациях.

Таким образом, заявляемый штамм обладает следующими отличиями и преимуществами сравнительно со штаммом-аналогом.

1. Более высоким содержанием экзотоксина в культуральной жидкости, что обеспечивает более высокую инсектицидную активность.

2. Фагоустойчивостью к фагам группы БТБ.

3. Термолабильностью спор.

Вышеперечисленные характеристики заявляемого штамма 16-Т5О позволяют рекомендовать его для производства экзотоксинсодержащих биоинсектицидов.

ЛИТЕРАТУРА
1. Авт. свид. 1074138 (1982) Скворцова М.И. Шашкина Н.И. Мурзинцева Н.Б. Повлек Л.Н. Пахтуев А.И. Кандыбин Н,В. Барбашова Н.М. Скворцов Г.Е. Чегодаев Ф. Н. Штамм ВаciIIus thuringiеnsis subрs. thuringiensis 98 - продуцент битоксибациллина.

2. Королева Ю. В. Григорьева Т.М. Азизбекян Р.Р. Выделение и характеристика фагоустойчивых мутантов Ваci11us thuringiensis vаr. thuringiensis. Биотехнология, 1992, 2: 3-5.

3. Ашмарин Н.П. Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Медгиз. М. 1962.

4. Данилова Э. Б. Барбашова Н.М.Спектрофотометрическое определение бета-экзотоксина в культуральной жидкости Ваcillus thuringiensis. Тр. ВНИИ с-х микробиологии, 1985, т.55, с.115-118.

5. Бубенщикова С.Н. Каграманова В.Г. Баратова Л.А. Данилова Э.Б. Кругляк Е. Б. Определение экзотоксина методом высокоэффективной хроматографии. Химия природных соединений, 1982, 3, 389-392. ТТТ1 ТТТ2

Использование: микробиологическая промышленность, производство бактериальных инсектицидов, касается нового штамма бактерий для производства инсектицидов. Сущность изобретения: штамм бактерий Bacillus thuringiensis 16-Т50 выделен из штамма 98 путем многоступенчатой селекции по признакам экзотоксинобразования, термостабильности спор и фагоустойчивости. Штамм депонирован в ВКПМ под N В-6404. При культивировании штамма на дрожже-полисахаридной среде получают культуральную жидкость с титром клеток 3,2 млрд кл/мл, с содержанием термостабильных спор 0,5 %, термолабильных - 95 %, экзотоксина 1,3 мг/мл. 3 табл.

Штамм бактерий Bacillus thuringiensis spp.thuringiensis ВКПМ В-6404 для производства экзотоксинсодержащих биоинсектицидов.