ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ И ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ СПОСОБЫ Российский патент 2015 года по МПК A61K38/16 A61K39/09 A61P9/00 G01N33/569 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к области идентификации пациентов с ревматическим пороком сердца (RHD), связанным с инфекцией Streptococcus pyogenes (Streptococcus группы A; GAS) и идентификации пациентов с риском развития RHD, связанного с инфекцией GAS. Изобретение также относится к способам и композициям для профилактики и лечения RHD, связанного с инфекцией GAS.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Патоген человека Streptococcus группы A (Streptococcus pyogenes, GAS) широко известен как основная причина общего фарингита. Кроме того, инфекции этой бактерией могут приводить к тяжелым инвазивным заболеваниям, а также к негнойным аутоиммунным осложнениям. Острая ревматическая лихорадка (ARF) представляет собой многоочаговое аутоиммунное заболевание, возникающее у 0,1-3% индивидуумов после нелеченой инфекции GAS.

ARF диагностируют по обновленным критериям Джонса, которые впервые опубликованы в 1944 годы. По обновленным критериям Джонса диагноз ARF можно поставить при наличии двух больших критериев (мигрирующий полиартрит; кардит; подкожные узелки; ревматоидная эритема; хорея Сиденгама), или одного большого критерия и большого критерия и двух малых критериев (лихорадка; артралгия; повышенные скорость осаждения эритроцитов или C-реактивный белок; лейкоцитоз; ECG, демонстрирующая признаки блокады сердца), наряду с признаками инфекции GAS.

Основным клинически значимым осложнением ARF является ревматический порок сердца (RHD). RHD может приводить к опасному поражению сердца с миокардитом или вальвулитом, приводящим к гибели или протезированию клапанов. Во всех развивающихся странах, RHD остается основной причиной приобретенных заболеваний сердца у индивидуумов в возрасте <50 лет. В развитых странах, ARF и RHD являются менее частыми вследствие доступности антибиотиков для лечения инфекций GAS. Однако в середине 1980-х годов сообщалось о возврате ARF и RHD в некоторых областях Соединенных Штатов Америки, и что они продолжали существовать в межгорной области, окружающей Salt Lake City, UT.

В настоящее время для подтверждения наличия у пациента развитого RHD после диагноза ARF применяют тесты, такие как ЭКГ и эхокардиограмма. В настоящее время, не существует доступных анализов для идентификации индивидуумов с наличием или с риском развития RHD в результате инфекции GAS.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к способам идентификации индивидуумов с наличием или с риском развития RHD в результате инфекции GAS. Изобретение также относится к белковым чипам, которые можно использовать в таких способах. Изобретение также относится к способам и композициям для профилактики и лечения RHD, связанного с инфекцией GAS.

Способы диагностики

Изобретение относится к способу диагностики у пациента ревматического порока сердца (RHD), связанного с инфекцией GAS, или идентификации пациента с риском развития RHD, связанного с инфекцией GAS, где указанный способ включает стадии:

a) приведения биологического образца, взятого у пациента, в контакт по меньшей мере с одним антигеном GAS в условиях, подходящих для связывания любых антител, присутствующих в биологическом образце, по меньшей мере с одним антигеном GAS, и

b) сравнения реакционноспособности антител в биологическом образце, взятом у пациента, по меньшей мере в отношении одного антигена GAS с реакционноспособностью антител в контрольном биологическом образце, взятом у здорового индивидуума, по меньшей мере в отношении одного антигена GAS,

где меньшая реакционноспособность в биологическом образце, взятом у пациента, по сравнению с контрольным биологическим образцом, взятым у здорового индивидуума, указывает на то, что пациент страдает ревматическим пороком сердца (RHD), связанным с инфекцией GAS, или что у пациента существует риск развития RHD, связанного с инфекцией GAS.

В одном из аспектов изобретение относится к способу диагностики у пациента ревматического порока сердца (RHD), связанного с инфекцией GAS, или идентификации пациента с риском развития RHD, связанного с инфекцией GAS, где указанный способ включает стадии:

a) приведения биологического образца, взятого у пациента, в контакт по меньшей мере с одним антигеном GAS, выбранным из группы, включающей аминокислотные последовательности

SEQ ID NO:1 (GAS5),

SEQ ID NO:2 (GAS5F),

SEQ ID NO:3 (GAS25),

SEQ ID NO:4 (GAS40),

SEQ ID NO:5 (GAS57),

SEQ ID NO:6 (GAS97),

SEQ ID NO:7 (GAS380) и

SEQ ID NO:8 (SpeA),

или их функциональные эквиваленты, в условиях, подходящих для связывания любых антител, присутствующих в биологическом образце, по меньшей мере с одним антигеном GAS или с их функциональными эквивалентами;

b) оценки реакционноспособности любых антител в биологическом образце, взятом у пациента, связывающихся по меньшей мере с одним антигеном GAS или с их функциональными эквивалентами, и

c) сравнения реакционноспособности на стадии b) с реакционноспособностью антител в контрольном биологическом образце, взятом у здорового индивидуума, связывающихся по меньшей мере с одним антигеном GAS или с их функциональными эквивалентами,

где меньшая реакционноспособность в биологическом образце, взятом у пациента, по сравнению с реакционноспособностью в контрольном биологическом образце, взятом у здорового индивидуума, указывает на то, что пациент страдает ревматическим пороком сердца (RHD), связанным с инфекцией GAS, или что у пациента существует риск развития RHD, связанного с инфекцией GAS.

Термин "ревматический порок сердца (RHD)" включает состояния, поражающие сердце после острой ревматической лихорадки, включая повреждение митрального клапана и/или аортального клапана, миокардит и перикардит.

Анализ образцов сыворотки пациентов, пораженных RHD, и здоровых индивидуумов привел к неожиданному открытию того, что сыворотки пациентов, пораженных RHD, демонстрируют значительно меньшую реакционноспособность в отношении определенных антигенов GAS по сравнению с реакционноспособностью сывороток здоровых пациентов. Эти открытия предоставили первое обоснование того, что реакционноспособность в отношении антигенов GAS можно использовать для различения сывороток, получаемых у здоровых индивидуумов, и сывороток, получаемых от пациентов, страдающих RHD. В частности выявлено, что сыворотки, получаемые от пациентов с RHD, демонстрируют меньшую реакционноспособность с восемью антигенами GAS, указанными в таблице 1 ниже:

Таблица 1
Антигены GAS, применяемые в способах диагностики по изобретению SEQ ID NO Внутреннее обозначение GAS Номер Spy Номер gi 1 GAS5 spy0019 gi-15674263 2 GAS5F spy0019 (фрагмент из аминокислот 224-398) gi-15674263 3 GAS25 spy0167 gi-15674372 4 GAS40 spy0269 gi-15674449 5 GAS57 spy0416 gi-15674549 6 GAS97 spy1801 gi-15675636 7 GAS380 spy1813 gi-15675644 8 SpeA spyM3_1301 gi-21910837

Таким образом, детекцию низкой реакционноспособности в отношении этих восьми антигенов GAS в образцах, взятых у пациентов, по сравнению с реакционноспособностью в контрольных образцах, взятых у здоровых индивидуумов, можно использовать для диагностики RHD, связанной с инфекцией GAS или для идентификации пациентов с повышенным риском развития RHD, связанного с инфекцией GAS. И наоборот, детекция реакционноспособности антител в отношении этих восьми антигенов GAS в образце, взятом у пациента, являющейся сходной с реакционноспособностью, присутствующей в контрольном образце, взятом у здорового индивидуума, указывает на то, что пациент не страдает RHD и у него снижен риск развития RHD, связанного с инфекцией GAS.

Способы по изобретению могут включать приведение биологического образца, взятого у пациента, в контакт с 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или всеми 8 антигенами GAS, перечисленными выше, или с их функциональными эквивалентами.

Когда биологический образец, взятый у пациента, приводят в контакт с 2 из антигенов GAS, способы могут включать приведение образца в контакт с: SEQ ID NO:1 и 2; SEQ ID NO:1 и 3; SEQ ID NO:1 и 4; SEQ ID NO:1 и 5; SEQ ID NO:2 и 3; SEQ ID NO:2 и 4; SEQ ID NO:2 и 5; SEQ ID NO:3 и 4; SEQ ID NO:3 и 5; SEQ ID NO:4 и 5 или их функциональными эквивалентами. Способы также могут включать приведение образца в контакт с SEQ ID NO:1 и 6; SEQ ID NO:1 и 7; SEQ ID NO:1 и 8; SEQ ID NO:2 и 6; SEQ ID NO:2 и 7; SEQ ID NO:2 и 8; SEQ ID NO:3 и 6; SEQ ID NO:3 и 7; SEQ ID NO:3 и 8; SEQ ID NO:4 и 6; SEQ ID NO:4 и 7; SEQ ID NO:4 и 8; SEQ ID NO:5 и 6; SEQ ID NO:5 и 7; SEQ ID NO:5 и 8; SEQ ID NO:6 и 7; SEQ ID NO:6 и 8, или SEQ ID NO:7 и 8 или с их функциональными эквивалентами.

Когда биологический образец, взятый у пациента, приводят в контакт с 3 из антигенов GAS, способы могут включать приведение образца в контакт с любой комбинацией из 3 антигенов GAS из SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8. Например, способы могут включать приведение образца в контакт с SEQ ID NO:1, 2 и 3; SEQ ID NO:1, 3 и 4; SEQ ID NO:1, 4 и 5; SEQ ID NO:2, 3 и 4; SEQ ID NO:2, 4 и 5; SEQ ID NO:3, 4 и 5 или с их функциональными эквивалентами.

Когда биологический образец, взятый у пациента, приводят в контакт с 4 из антигенов GAS, способы могут включать приведение образца в контакт с любой комбинацией из 4 антигенов GAS из SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8. Например, способы могут включать приведение образца в контакт с: SEQ ID NO:1, 2, 3 и 4; SEQ ID NO:2, 3, 4 и 5; SEQ ID NO:1, 3, 4 и 5 или с их функциональными эквивалентами.

Когда биологический образец, взятый у пациента, приводят в контакт с 5 из антигенов GAS, способы могут включать приведение образца в контакт с любой комбинацией из 5 антигенов GAS из SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8. Например, способы могут включать приведение образца в контакт с SEQ ID NO:1, 2, 3, 4 и 5 или с их функциональными эквивалентами.

Когда биологический образец, взятый у пациента, приводят в контакт с 6 из антигенов GAS, способы могут включать приведение образца в контакт с любой комбинацией из 6 антигенов GAS из SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8.

Когда биологический образец, взятый у пациента, приводят в контакт с 7 из антигенов GAS, способы могут включать приведение образца в контакт с: SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, и 7; SEQ ID NO:1, 3, 4, 5, 6, 7 и 8; SEQ ID NO:1, 2, 4, 5, 6, 7 и 8; SEQ ID NO:1, 2, 3, 5, 6, 7 и 8; SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 6, 7 и 8; SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 7 и 8; SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6 и 8 или с их функциональными эквивалентами.

Альтернативно, биологический образец, взятый у пациента, можно приводить в контакт со всеми 8 антигенами GAS, т.е. с SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8 или с их функциональными эквивалентами.

Реакционноспособность антител, связывающихся с 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или всеми 8 этими антигенами GAS или их функциональными эквивалентами в биологическом образце, взятом у пациента, сравнивают с реакционноспособностью антител, связывающихся с этими антигены GAS в контрольном биологическом образце, взятом у здорового индивидуума. Контрольный биологический образец, взятый у здорового индивидуума, приводят в контакт с той же комбинацией антигенов GAS что и биологический образец, взятый у пациента. Как правило, средняя реакционноспособность антител, связывающихся с комбинациями этих антигенов GAS, в контрольных биологических образцах, взятых у здоровых индивидуумов, уже определена. Подходящие способы оценки реакционноспособности антител известны в данной области и более подробно описаны ниже.

Детекция антител:

Все способы по изобретению, описанные выше, включают оценку реакционноспособности антител, т.е. детекцию антител, связывающихся с антигенами GAS, и титров этих антител. Способы детекции антител, связывающихся с антигенами и определения титров антител хорошо известны специалистам в данной области и можно использовать любой из таких способов.

Например, антиген или антигены GAS (или функциональные эквиваленты) можно иммобилизовать в известных положениях на поверхности, такой как поверхность чипа, как описано ниже. Иммобилизованные антигены можно инкубировать с иммобилизованными антигенами в условиях, позволяющих связывание с антигенами любых антител, присутствующих в образце. Подходящий период инкубации может составлять приблизительно 1 час. После отмывки с удалением любых несвязавшихся антител, можно проводить детекцию антител, связывающихся с антигенами, с использованием молекулы, связывающейся и распознающей связанные антитела.

Например, стадия оценки реакционноспособности любых антител, связывающихся с антигенами GAS, в любом из способов, описанных выше, может включать приведение биологического образца и антигенов GAS в контакт с меченным вторичным антителом, таким как меченое антитело против IgG, в условиях, подходящих для связывания вторичного антитела с любыми антителами в биологическом образце, связанными с иммобилизованными антигенами GAS.

Вторичное антитело, такое как антитело против IgG, можно метить такой флуоресцентной или ферментной меткой, что посредством детекции метки осуществляют детекцию связывания вторичного антитела и, таким образом, присутствия антител против антигенов GAS в биологическом образце. Когда метка представляет собой флуоресцентную метку, сравнение интенсивности флуоресценции можно использовать для оценки относительной реакционноспособности антител и, таким образом, определения того, демонстрирует ли конкретный образец, взятый у пациента, сниженную реакционноспособность антител по сравнению с контрольным биологическим образцом. Можно ожидать, что фоновая интенсивность флуоресценции составляет приблизительно 5000. Учитывая стандартное отклонение, на присутствие в образце антитела, связывающегося с антигеном GAS, может указывать интенсивность флуоресценции по меньшей мере 15000. Интенсивность флуоресценции по меньшей мере 30000 можно рассматривать как свидетельство высокой реакционноспособности, указывающий на высокий титр антител, связывающихся с антигеном GAS, в образце. Таким образом, в определенных аспектах изобретения интенсивность флуоресценции 15000-30000 может указывать на низкую реакционноспособность, вероятно связанную с RHD.

Описанные выше способы можно проводить на белковом чипе, таком как чипы, более подробно описанные ниже или с использованием стандартных способов ELISA или дот-блоттинга.

Биологические образцы:

Биологические образцы, которые можно тестировать в способах по изобретению, могут представлять собой любой образец, для которого известно, что он содержит антитела против антигенов GAS. Примеры подходящих образцов представляют собой образцы слюны, образцы крови или образцы сыворотки. В частности, образец может представлять собой образец сыворотки.

Биологический образец, взятый у пациента, получают у пациента-человека. Пациент-человек, может представлять собой взрослого, подроста в возрасте приблизительно от 12 до приблизительно 18 лет или ребенка до 12 лет. У пациента могут выявлять клинические симптомы острого ревматизма, включая мигрирующий полиартрит; кардит; подкожные узелки; ревматоидную эритему; хорею Сиденгама, лихорадку; артралгию; повышенные скорость оседания эритроцитов или C-реактивный белок; лейкоцитоз или ЭКГ, демонстрирующую признаки блокады сердца. У пациента могут выявлять признаки текущей инфекции GAS. В некоторых случаях у пациента могут отсутствовать симптомы текущей инфекции GAS и острого ревматизма.

Контрольный биологический образец можно получать у здорового индивидуума из того же географического положения, что и биологический образец, взятый у пациента.

Способы по изобретению можно проводить in vitro. Способы по изобретению могут дополнительно включать стадию получения биологического образца у пациента.

Белковые чипы:

Для облегчения скрининга биологических образцов на несколько антигенов GAS одновременно, антигены GAS, используемые в способах по изобретению, можно представлять на одном или нескольких белковых чипах. Например, каждый из антигенов GAS можно представлять на отдельном чипе или на одном чипе можно представлять несколько антигенов GAS одновременно. По дополнительному аспекту изобретения предоставлены белковые чипы. Эти чипы пригодны для использования в любом из описанных выше способов.

Изобретение относится к белковому чипу, содержащему по меньшей мере два антигена GAS с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 или SEQ ID NO:8 или их функциональных эквивалентов.

Белковый чип может содержать 2, 3, 4, 5, 6, 7 или все 8 из этих антигенов GAS или их функциональных эквивалентов.

Когда чип содержит 2 антигена GAS, он может содержать антигены, содержащие аминокислотные последовательности: SEQ ID NO:1 и 2; SEQ ID NO:1 и 3; SEQ ID NO:1 и 4; SEQ ID NO:1 и 5; SEQ ID NO:2 и 3; SEQ ID NO:2 и 4; SEQ ID NO:2 и 5; SEQ ID NO:3 и 4; SEQ ID NO:3 и 5; SEQ ID NO:4 и 5, или их функциональные эквиваленты. Альтернативно, чип может содержать антигены, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1 и 6; SEQ ID NO:1 и 7; SEQ ID NO:1 и 8; SEQ ID NO:2 и 6; SEQ ID NO:2 и 7; SEQ ID NO:2 и 8; SEQ ID NO:3 и 6; SEQ ID NO:3 и 7; SEQ ID NO:3 и 8; SEQ ID NO:4 и 6; SEQ ID NO:4 и 7; SEQ ID NO:4 и 8; SEQ ID NO:5 и 6; SEQ ID NO:5 и 7; SEQ ID NO:5 и 8; SEQ ID NO:6 и 7; SEQ ID NO:6 и 8 или SEQ ID NO:7 и 8 или их функциональные эквиваленты

Когда чип содержит 3 антигена GAS, он может содержать любую комбинацию из 3 антигенов GAS SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8. Например, чип может содержать антигены GAS: SEQ ID NO:1, 2 и 3; SEQ ID NO:1, 3 и 4; SEQ ID NO:1, 4 и 5; SEQ ID NO:2, 3 и 4; SEQ ID NO:2, 4 и 5; SEQ ID NO:3, 4 и 5 или их функциональные эквиваленты.

Когда чип содержит 4 антигена GAS, он может содержать любую комбинацию из 4 антигенов GAS из SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8. Например, чип может содержать антигены GAS: SEQ ID NO:1, 2, 3 и 4; SEQ ID NO:2, 3, 4 и 5; SEQ ID NO:1, 3, 4 и 5 или их функциональные эквиваленты.

Когда чип содержит 5 антигенов GAS, он может содержать любую комбинацию из 5 антигенов GAS из SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8. Например, чип может содержать антигены GAS: SEQ ID NO:1, 2, 3, 4 и 5 или их функциональные эквиваленты.

Когда чип содержит 6 антигенов GAS, он может содержать любую комбинацию из 6 антигенов GAS из SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8.

Когда чип содержит 7 антигенов GAS, он может содержать антигены GAS: SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7; SEQ ID NO:1, 3, 4, 5, 6, 7 и 8; SEQ ID NO:1, 2, 4, 5, 6, 7 и 8; SEQ ID NO:1, 2, 3, 5, 6, 7 и 8; SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 6, 7 и 8; SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 7 и 8; SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6 и 8 или их функциональные эквиваленты.

Альтернативно, чип может содержать все 8 антигенов GAS, т.е. SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8 или их функциональные эквиваленты.

Белковый чип может содержать дополнительные антигены GAS.

В способе по изобретению можно использовать любой тип белкового чипа, известный в данной области. Получение белковых чипов описано в Cretich, M., Damin F., et al., (Biomolecular Engineering 23, 77-88 (2006)) и Zhu, H & Snyder, M. (Current Opinion in Chemical Biology, 7:55-63 (2003)).

Например, белковый чип может представлять собой предметное стекло, на котором закреплены антиген или антигены. В его простейшей форме чип может представлять собой предметное стекло, на котором представлен простой антиген, получаемое просто посредством покрытия предметных стекол микроскопа аминосиланом (Ansorge, Faulstich), добавления к стеклам содержащего антиген раствора и высушивания. Стекла, покрытые аминосиланом, для покрытия антигеном можно получать из Telechem и Pierce.

Альтернативно, на чипе могут быть представлены несколько антигенов. Например, на покрытые нитроцеллюлозой стекла можно точечно наносить нанолитры нескольких антигенов GAS. На таких чипах могут быть представлены повторы каждого антигена GAS. Точки антигенов в таких чипах могут составлять приблизительно 150 мкм в диаметре и содержать ~0,35 нг белка.

Другие типы белковых чипов включают 3D слой геля и чипы с микролунками. Как очевидно читателю-специалисту, по настоящему изобретению вполне могут оказаться пригодными для использования типы белковых чипов, которые еще сконструированы, но которые будут разработаны в будущем.

Изобретение дополнительно относится к набору, содержащему белковый чип по изобретению и инструкции для использования чипа для диагностики пациентов с наличием или с риском развития ревматического порока сердца, связанного с инфекцией GAS.

Способы и композиции для лечения и профилактики RHD

В настоящее время, для всех пациентов с диагнозом ARF рекомендована профилактика антибиотиком (как правило, пенициллином) в течение периода по меньшей мере 5 лет после диагноза для снижения риска последующей инфекции GAS и развития RHD. Идентификация, пациентов у которых существует риск RHD и не существует риска RHD, позволяет подбирать медицинское лечение для пациентов, у которых диагностирована ARF.

Изобретение дает возможность, что когда способом по изобретению пациента идентифицируют как страдающего RHD, связанным с инфекцией GAS, с риском развития RHD, связанного с инфекцией GAS, пациента можно лечить антибиотиками. И наоборот, когда пациента способом по изобретению идентифицируют как пациента с низким риском развития RHD, связанного с инфекцией GAS, лечение антибиотиками может быть необязательным.

Понимание авторами изобретения того, что сыворотки здоровых индивидуумов демонстрируют высокую реакционноспособность в отношении антигенов GAS, описываемую выше, позволяет предположить, что антитела против этих антигенов GAS могут играть защитную роль в профилактики развития RHD. Таким образом, изобретение относится к композиции, содержащей по меньшей мере один антиген GAS, выбранный из группы, включающей аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 или их функциональные эквиваленты. Изобретение также относится к композиции, содержащей по меньшей мере одно антитело, специфически связывающееся по меньшей мере с одним антигеном GAS, выбранным из группы, включающей аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 или их функциональные эквиваленты. Эти композиции могут представлять собой иммуногенные композиции, например, вакцинные композиции.

По дополнительному аспекту изобретение относится к способу лечения или профилактики RHD, связанного с инфекцией GAS, включающему введение нуждающемуся в этом пациенту по меньшей мере одного антигена GAS, выбранного из группы, включающей аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 или их функциональные эквиваленты. Изобретение дополнительно относится по меньшей мере к одному антигену GAS, выбранному из группы, включающей аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 или их функциональные эквиваленты, для применения для лечения или профилактики RHD, связанного с инфекцией GAS. Изобретение также относится к использованию по меньшей мере одного антигена GAS, выбранного из группы, включающей аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 или их функциональные эквиваленты, в производстве лекарственного средства для лечения или профилактики RHD, связанного с инфекцией GAS. Альтернативно, можно использовать молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие эти антигены GAS.

Изобретение также относится к способу лечения или профилактики RHD, связанного с инфекцией GAS, включающему введение нуждающемуся в этом пациенту по меньшей мере одного антитела, специфически связывающегося по меньшей мере с одним антигеном GAS, выбранным из группы, включающей аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 или их функциональные эквиваленты. Изобретение дополнительно относится по меньшей мере к одному антителу, специфически связывающемуся по меньшей мере с одним антигеном GAS, выбранным из группы, включающей аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 или их функциональные эквиваленты, для применения для лечения или профилактики RHD, связанного с инфекцией GAS. Изобретение также относится к использованию по меньшей мере одного антитела, специфически связывающегося по меньшей мере с одним антигеном GAS, выбранным из группы, включающей аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 или их функциональные эквиваленты, в производстве лекарственного средства для лечения или профилактики RHD, связанного с инфекцией GAS.

Как правило, антитела по изобретению специфически связываются с антигеном GAS с аффинностью 1 мкМ, 100 нМ, 10 нМ, 1 нМ, 100 пМ или выше. Термин "антитело" включает интактные молекулы иммуноглобулинов, а также их фрагменты, которые способны к связыванию полипептида. Они включают гибридные (химерные) молекулы антител [1, 2]; фрагменты F(ab')₂ и F(ab) и молекулы Fv; нековалентные гетеродимеры [3, 4]; молекулы одноцепочечных Fv (sFv) [5]; конструкции димерных и тримерных фрагментов антител; минитела [6, 7]; молекулы гуманизированных антител [8-10] и любые функциональные фрагменты, получаемые из таких молекул, а также антитела, получаемые нетрадиционными способами, такими как фаговый дисплей. В некоторых вариантах осуществления антитела представляют собой моноклональные антитела. Способы получения моноклональных антител хорошо известны в данной области. В некоторых вариантах осуществления антитела представляют собой гуманизированные антитела или антитела человека полностью.

В композициях и способах лечения по изобретению можно использовать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или все 8 антигенов GAS, описанных выше, или антитела, которые специфически связываются с 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или всеми 8 из этих антигенов GAS. Можно использовать комбинации антигенов GAS и антител, специфично связывающихся c этими антигенами.

Примеры комбинаций антигенов GAS, которые можно использовать в композициях и способах лечения по этому аспекту изобретения включают SEQ ID NO:1 и 2; SEQ ID NO:1 и 3; SEQ ID NO:1 и 4; SEQ ID NO:1 и 5; SEQ ID NO:2 и 3; SEQ ID NO:2 и 4; SEQ ID NO:2 и 5; SEQ ID NO:3 и 4; SEQ ID NO:3 и 5; SEQ ID NO:4 и 5; SEQ ID NO:1 и 6; SEQ ID NO:1 и 7; SEQ ID NO:1 и 8; SEQ ID NO:2 и 6; SEQ ID NO:2 и 7; SEQ ID NO:2 и 8; SEQ ID NO:3 и 6; SEQ ID NO:3 и 7; SEQ ID NO:3 и 8; SEQ ID NO:4 и 6; SEQ ID NO:4 и 7; SEQ ID NO:4 и 8; SEQ ID NO:5 и 6; SEQ ID NO:5 и 7; SEQ ID NO:5 и 8; SEQ ID NO:6 и 7; SEQ ID NO:6 и 8, или SEQ ID NO:7 и 8; SEQ ID NO:1, 2 и 3; SEQ ID NO:1, 3 и 4; SEQ ID NO:1, 4 и 5; SEQ ID NO:, 2, 3 и 4; SEQ ID NO:2, 4 и 5; SEQ ID NO:3, 4 и 5; SEQ ID NO:1, 2, 3 и 4; SEQ ID NO:2, 3, 4 и 5; SEQ ID NO:1, 3, 4 и 5; SEQ ID NO:1, 2, 3, 4 и 5; SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7; SEQ ID NO:1, 3, 4, 5, 6, 7 и 8; SEQ ID NO:1, 2, 4, 5, 6, 7 и 8; SEQ ID NO:1, 2, 3, 5, 6, 7 и 8; SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 6, 7 и 8; SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 7 и 8; SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6 и 8 или их функциональные эквиваленты. Также можно использовать антитела, связывающиеся с этими комбинациями антигенов GAS.

Композиции и способы, описанные выше, в основном могут быть подходящими при лечении и профилактики инфекции GAS, а также при лечении и профилактики RHD, связанного с инфекцией GAS.

Состав композиций для лечения и профилактики RHD

Как подробно описано выше, композиции по изобретению могут быть подходящими в качестве вакцин. Вакцины по изобретению могут быть профилактическими (т.е. для профилактики инфекции) или терапевтическими (т.е. для лечения инфекции), но, как правило, являются профилактическими.

Таким образом, композиции могут быть фармацевтически приемлемыми. Как правило, кроме антигенов они включают дополнительные компоненты, например, как правило, они включают один или несколько фармацевтических носителей и/или эксципиентов.

Как правило, композиции вводят человеку в водной форме. Однако перед введением композиция может находиться в неводной форме. Например, хотя некоторые вакцины производят в водной форме, а затем их заполняют и распределяют и вводят также в водной форме, другие вакцины при производстве лиофилизируют и восстанавливают в водную форму во время использования. Таким образом, композиция по изобретению может быть высушенной, такой как лиофилизированный состав.

Композиция может содержать консерванты, такие как тиомерсал или 2-феноксиэтанол. Однако, предпочтительно, чтобы вакцина по существу не содержала (т.е. содержала менее 5 мкг/мл) веществ с ртутью, например, не содержала тиомерсала. Более типичными являются вакцины не содержащие ртути. Особенно предпочтительными являются вакцины, не содержащие консервантов.

Для улучшения термостабильности композиция может содержать термозащитное средство. Дополнительные подробности о таких средствах предоставлены далее.

Для контроля тоничности, как правило, она содержит физиологическую соль, такую как натриевая соль. Как правило, используют хлорид натрия (NaCl), который может присутствовать в количестве 1-20 мг/мл, например, приблизительно 10±2 мг/мл NaCl. Другие соли, которые могут присутствовать, включают хлорид калия, дигидрофосфат калия, дегидрат двузамещенного фосфата натрия, хлорид магния, хлорид кальция и т.д.

Как правило, осмоляльность композиции составляет от 200 мосмоль/кг до 400 мосмоль/кг, более часто 240-360 мосмоль/кг, а более типично находится в диапазоне 290-310 мосмоль/кг.

Композиции могут содержать один или несколько буферов. Характерные буферы включают: фосфатный буфер; буфер Tris; боратный буфер; сукцинатный буфер; гистидиновый буфер (в частности, с адъювантом гидроксидом алюминия) или цитратный буфер. Как правило, буферы добавляют в диапазоне 5-20 мМ.

Как правило, pH композиции составляет 5,0-8,1, а более характерно 6,0-8,0 например, 6,5 и 7,5, или 7,0-7,8.

Как правило, композиция является стерильной. Как правило, композиция также является апирогенной, например, содержащей <1 ЕЭ (единиц эндотоксинов, стандартный показатель) на дозу, например, <0,1 ЕЭ на дозу. Часто композиция не содержит глютена.

Композиция может содержать вещество для одной иммунизации, или может содержать вещество для нескольких иммунизаций (т.е. набор из "нескольких доз"). Для средств из нескольких доз типичным является введение консерванта. В качестве альтернативы (или дополнительно к) введению консерванта в композиции из нескольких доз, композиции могут содержаться в контейнере с асептическим адаптером для извлечения вещества.

Как правило, вакцины для человека вводят в объеме дозирования приблизительно 0,5 мл, хотя детям можно вводить половину дозы (т.е. приблизительно 0,25 мл).

Композиции по изобретению также могут содержать одно или несколько иммунорегулирующих средств. Часто одно или несколько иммунорегулирующих средств содержат один или несколько адъювантов. Адъюванты могут включать адъювант TH1 и/или адъювант TH2, дополнительно описываемые далее.

Адъюванты, которые можно использовать в композициях по изобретению, в качестве неограничивающих примеров включают:

A. Композиции, содержащие неорганические вещества

Композиции, содержащие неорганические вещества, подходящие для использования в качестве адъювантов по изобретению, включают соли неорганических кислот, такие как соли алюминия и кальциевые соли (или их смеси). Кальциевые соли включают фосфат кальция (например, частицы "CAP", описываемые в ссылке 11). Соли алюминия включают гидроксиды, фосфаты, сульфаты и т.д., где соли находятся в любой подходящей форме (например, геля, кристаллической, аморфной и т.д.). Часто используют адсорбцию к этим солям. Композиции, содержащие неорганические вещества, также можно формулировать в виде частиц соли металла [12].

Можно использовать адъюванты, известные как гидроксид алюминия и фосфат алюминия. Эти названия являются общепринятыми, но их используют только для удобства, так как ни одно не является точным описанием действительно присутствующего химического соединения (например, см. главу 9 ссылки 13)). В изобретении можно использовать любые "гидроксидные" или "фосфатные" адъюванты, которые, как правило, используют в качестве адъювантов. Адъюванты, известные как "гидроксид алюминия", как правило, представляют собой соли гидроксида алюминия, которые, как правило, по меньшей мере частично являются кристаллическими. Адъюванты, известные как "фосфат алюминия", как правило, представляют собой гидроксифосфаты алюминия, часто также содержащие небольшое количество сульфата (т.е. сульфат гидроксифосфата алюминия). Их можно получать посредством осаждения, а условия реакции и концентрации при осаждении влияют на степень замещения фосфата на гидроксил в соли.

Для адъювантов гидроксида алюминия типична волокнистая морфология (например, как видно на микрофотографии с трансмиссионного электронного микроскопа). pI адъювантов гидроксида алюминия, как правило, составляет приблизительно 11 т.е. сам адъювант обладает положительным поверхностным зарядом при физиологическом pH. Опубликованная адсорбционная емкость для адъювантов гидроксида алюминия составляет 1,8-2,6 мг белка на мг Al⁺⁺⁺ при pH 7,4.

Как правило, молярное отношение PO₄/Al адъювантов фосфата алюминия составляет 0,3-1,2, например, 0,8-1,2, как правило, 0,95±0,1. Как правило, фосфат алюминия является аморфным, особенно в форме гидроксифосфатных солей. Типичный адъювант представляет собой аморфный гидроксифосфат алюминий с молярным отношением PO₄/Al 0,84-0,92, содержащий 0,6 мг Al³⁺/мл. Как правило, фосфат алюминия является частицей (например, пластиновидная морфология как видно на микрофотографиях с трансмиссионного электронного микроскопа). Типичные диаметры частиц после адсорбции любого антигена находятся в диапазоне 0,5-20 мкм (например, приблизительно 5-10 мкм). Опубликованная адсорбционная емкость для адъювантов фосфата алюминия составляет 0,7-1,5 мг белок на мг Al⁺⁺⁺ при pH 7,4.

Точка нулевого заряда (PZC) фосфата алюминия обратно пропорционально связана со степенью замещения фосфата гидроксилом, и эта степень замещения может варьировать в зависимости от условий реакции и концентрации реагентов, используемых для получения соли посредством осаждения. PZC также изменяется при изменении концентрации свободных ионов фосфата в растворе (больше фосфата = более кислая PZC) или при добавлении буфера, такого как гистидиновый буфер (делает PZC более основной). Как правило, PZC фосфатов алюминия, используемых по изобретению, составляет 4,0-7,0, например, 5,0-6,5 например, приблизительно 5,7.

Суспензии солей алюминия, используемые для получения композиций по изобретению, могут содержать буфер (например, фосфатный или гистидиновый или буфер Tris), но это не всегда необходимо. Суспензии часто являются стерильными и апирогеными. Суспензия может содержать свободные водные фосфатные ионы, например, присутствующие в концентрации 1,0-20 мМ, например, 5-15 мМ, например, приблизительно 10 мМ. Суспензии также может содержать хлорид натрия.

По изобретению можно использовать смесь гидроксида алюминия и фосфата алюминия. В этом случае может присутствовать больше фосфата алюминия, чем гидроксида, например, при массовом отношении по меньшей мере 2:1, например, ≥5:1, ≥6:1, ≥7:1, ≥8:1, ≥9:1 и т.д.

Концентрация Al⁺⁺⁺ в композиции для введения млекопитающему, как правило, составляет менее 10 мг/мл, например, ≤5 мг/мл, ≤4 мг/мл, ≤3 мг/мл, ≤2 мг/мл, ≤1 мг/мл и т.д. Предпочтительно, диапазон составляет 0,3-1 мг/мл. Предпочтительно, 0,85 мг/дозу.

Особенно предпочтительны фосфаты алюминия, особенно в композициях, содержащих антиген сахарид H. influenzae, и типичный адъювант представляет собой аморфный гидроксифосфат алюминия с молярным отношением PO₄/Al 0,84-0,92, добавляемый при 0,6 мг Al³⁺/мл. Можно использовать адсорбцию с низкой дозой фосфата алюминия, например, 50-100 мкг Al³⁺ на конъюгат на дозу. Когда в композиции присутствует более одного конъюгата, не всем конъюгатам необходимо быть адсорбированными.

B. Масляные эмульсии

Композиции масляных эмульсий, подходящие для использования в качестве адъювантов по изобретению, включают эмульсии сквален-вода, такие как MF59 [глава 10 ссылки 13; также см. ссылку 14] (5% сквалена, 0,5% Tween 80, и 0,5% Span 85, формулируемых в субмикронные частицы с использованием микрофлюидизатора). Также можно использовать полный адъювант Фрейнда (CFA) и неполный адъювант Фрейнда (IFA).

Известны различные эмульсионные адъюванты "масло-в-воде", и, как правило, они содержат по меньшей мере одно масло и по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество, где масло(а) и поверхностно-активное вещество(а) являются биологически разлагаемыми (метаболизируемыми) и биологически совместимыми. Как правило, для получения стабильных эмульсий капли масла в эмульсии в диаметре составляют менее 5 мкм, и в идеале имеют субмикронный диаметр, где этих малых размеров достигают с использованием микрофлюидайзера. Предпочтительными являются капли с размером менее 220 нм, так как их можно подвергать стерилизации фильтрованием.

Эмульсия может содержать масла, такие как масла животного происхождения (такие как из рыб) или из овощных источников. Источники для растительных масел включают орехи, семена и зерна. Примерами ореховых масел являются арахисовое масло, соевое масло, кокосовое масло и оливковое масло, доступные чаще всего. Например, можно использовать масло жожоба, получаемое из бобов жожоба. Масла семян включают сафлоровое масло, хлопковое масло, масло семян подсолнечника, масло семян кунжута и т.п. В группе зерновых наиболее легкодоступным является кукурузное масло, но также можно использовать масло других зерен злаков, таких как пшеница, овес, рожь, рис, тэфф, тритикале и т.п. Сложные эфиры глицерина и 1,2-пропандиола с 6-10 углеродными жирными кислотами, хотя они не встречаются в маслах семян в природе, можно получать посредством гидролиза, разделения и этерификации подходящих веществ, начиная от масла орехов и семян. Жиры и масла из молока млекопитающих являются метаболизируемыми и, таким образом, их можно использовать в практическом осуществлении настоящего изобретения. Способы разделения, очистка, омыления и другие способы, необходимые для получения чистых масел из животных источников, хорошо известны в данной области. Большинство рыб содержат метаболизируемые масла, которые можно легко выделять. Например, масло печени трески, масла печени акул и китовый жир, такой как спермацет, являются примерами некоторых масел рыб, которые можно использовать в настоящем документе. Ряд масел с разветвленной цепью синтезируют биохимически из 5-углеродных изопреновых единиц и, как правило, обозначают как терпеноиды. Масло печени акулы содержит разветвленные, ненасыщенные терпеноиды, известные как сквален, 2,6,10,15,19,23-гексаметил-2,6,10,14,18,22-тетракозагексан, который особенно предпочтителен в настоящем документе. Также предпочтительным маслом является сквалан, насыщенный аналог сквалена. Масла рыб, включая сквален и сквалан, являются легкодоступными в коммерческих источниках, или их можно получать известными в данной области способами. Другими предпочтительными маслами являются токоферолы (см. ниже). Можно использовать смеси масел.

Поверхностно-активные вещества можно классифицировать по их "HLB" (гидрофильно/липофильному балансу). HLB предпочтительных поверхностно-активных веществ по изобретению составляет по меньшей мере 10, например, по меньшей мере 15, например, по меньшей мере 16. Изобретение можно использовать с поверхностно-активными веществами, включающими в качестве неограничивающих примеров: поверхностно-активные вещества сложных эфиров полиоксиэтиленсорбитана (как правило, обозначаемые как Tween), особенно полисорбат 20 и полисорбат 80; сополимеры этиленоксида (EO), пропиленоксида (PO) и/или бутиленоксида (BO), продаваемые под торговой маркой DOWFAX™, такие как линейные блок-сополимеры EO/PO; октоксинолы, которые могут варьировать по числу повторяющихся этокси (окси-1,2-этандиильных) групп, где особый интерес представляет октоксинол-9 (Triton X-100, или трет-октилфеноксиполиэтоксиэтанол); (октилфенокси)полиэтоксиэтанол (IGEPAL CA-630/NP-40); фосфолипиды, такие как фосфатидилхолин (лецитин); нонилфенолэтоксилаты, такие как тергитол (Tergitol™) серии NP; простые жирные эфиры полиоксиэтилена, получаемые из лаурилового, цетилового, стеарилового и олеилового спиртов (известные как поверхностно-активные вещества Brij), такие как простой монолауриловый эфир триэтиленгликоля (Brij 30); и сложные сорбитановые эфиры (общеизвестные как SPAN), такие как триолеат сорбитана (Span 85) и сорбитанмонолаурат. Предпочтительными являются неионные поверхностно-активные вещества. Предпочтительными поверхностно-активными веществами для включения в эмульсию являются Tween 80 (полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат), Span 85 (триолеат сорбитана), лецитин и Triton X-100.

Можно использовать смеси поверхностно-активных веществ, например, смеси Tween 80/Span 85. Также подходит комбинация сложного эфира полиоксиэтиленсорбитана, такого как полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат (Tween 80), и октоксинола, такого как трет-октилфеноксиполиэтоксиэтанол (Triton X-100). Другая подходящая комбинация включает лаурет 9 и сложный эфир полиоксиэтиленсорбитана и/или октоксинол.

Предпочтительные количества поверхностно-активных веществ (% по массе) представляют собой: сложные эфиры полиоксиэтиленсорбитана (такие как Tween 80) - от 0,01 до 1%, в частности приблизительно 0,1%; октил- или нонилфеноксиполиоксиэтанолы (такие как Triton X-100 или другие детергенты в ряду Triton) - от 0,001 до 0,1%, в частности, 0,005-0,02%; простые эфиры полиоксиэтилена (такие как лаурет 9) 0,1-20%, например, 0,1-10% и, в частности, 0,1-1% или приблизительно 0,5%.

Средний размер капли предпочтительных эмульсионных адъювантов составляют <1 мкм, например, ≤750 нм, ≤500 нм, ≤400 нм, ≤300 нм, ≤250 нм, ≤220 нм, ≤200 нм или менее. Эти размеры капель можно подходящим способом получать такими способами, как микрофлюидизация.

Конкретные эмульсионные адъюванты "масло-в-воде", подходящие по изобретению, в качестве неограничивающих примеров включают:

- Субмикронную эмульсию сквалена, Tween 80 и Span 85. Композиция эмульсии по объему может составлять приблизительно 5% сквалена, приблизительно 0,5% полисорбата 80 и приблизительно 0,5% Span 85. В единицах массы, эти соотношения принимают вид 4,3% сквалена, 0,5% полисорбата 80 и 0,48% Span 85. Этот адъювант известен как "MF59" [15-17], как более подробно описано в главе 10 ссылки 18 и главе 12 ссылки 19. Эмульсия MF59, предпочтительно, содержит цитратные ионы например, 10 мМ буфер цитрата натрия.

- Эмульсию сквалена, токоферола и полисорбата 80 (Tween 80). Эмульсия может содержать фосфатно-солевой буфер. Она также может содержать Span 85 (например, в количестве 1%) и/или лецитин. Эти эмульсии могут содержать 2-10% сквалена, 2-10% токоферола и 0,3-3% Tween 80, и массовое отношение сквалена:токоферола, как правило, составляет ≤1, так как это обеспечивает более стабильную эмульсию. Сквален и Tween 80 могут находиться в объемном отношении приблизительно 5:2 или в массовом отношении приблизительно 11:5. Одну из таких эмульсий можно получать, растворяя Tween 80 в PBS с получением 2% раствора, затем смешивая 90 мл этого раствора со смесью (5 г DL-α-токоферола и 5 мл сквалена), затем подвергая смесь микрофлюидизации. Получаемая эмульсия может содержать субмикронные капли масла, например, со средним диаметром 100-250 нм, часто приблизительно 180 нм. Эмульсия также может содержать 3-де-O-ацилированный монофосфориллипид A (3d-MPL). Другая подходящая эмульсия этого типа в расчете на дозу для человека может содержать 0,5-10 мг сквалена, 0,5-11 мг токоферола и 0,1-4 мг полисорбата 80 [20].

- Эмульсию сквалена, токоферола и детергента Triton (например, Triton X-100). Эмульсия также может содержать 3d-MPL (см. ниже). Эмульсия может содержать фосфатный буфер.

- Эмульсию, содержащую полисорбат (например, полисорбат 80), детергент Triton (например, Triton X-100) и токоферол (например, α-токоферолсукцинат). Эмульсия может содержать эти три компонента в массовом отношении приблизительно 75:11:10 (например, 750 мкг/мл полисорбата 80, 110 мкг/мл Triton X-100 и 100 мкг/мл α-токоферолсукцината), и эти концентрации должны включать любой вклад в эти компоненты от антигенов. Эмульсия также может содержать сквален. Эмульсия также может содержать 3d-MPL (см. ниже). Водная фаза может содержать фосфатный буфер.

- Эмульсию сквалана, полисорбата 80 и полоксамера 401 ("Плюроник™ L121"). Эмульсию можно формулировать в фосфатно-солевом буфере, pH 7,4. Эта эмульсия является пригодным носителем для доставки мурамилдипептидов, и ее используют с треонил-MDP в адъюванте "SAF-1" [21] (0,05-1% Thr-MDP, 5% сквалана, 2,5% плюроника L121 и 0,2% полисорбата 80). Ее также можно использовать без Thr-MDP, как в адъюванте "AF" [22] (5% сквалана, 1,25% плюроника L121 и 0,2% полисорбата 80). Предпочтительной являеся микрофлюидизация.

- Эмульсию, содержащую сквален, водный растворитель, гидрофильное неионное поверхностно-активное вещество простого эфира алкилполиоксиэтилена (например, простой полиоксиэтилен(12)цетостеариловый эфир) и гидрофобное неионное поверхностно-активное вещество (например, сложный сорбитановый эфир или сложный эфир маннида, такой как сорбитанмоноолеат или "Span 80"). Как правило, эмульсия является термообратимой и/или содержит по меньшей мере 90% масляных капель (по объему) с размером менее 200 нм [23]. Эмульсия также может содержать одно или несколько из: альдита; криопротектора (например, сахара, такого как додецилмальтозид и/или сахароза) и/или алкилполигликозид. Эмульсия может содержать агонист TLR4 [24]. Такие эмульсии могут являться лиофилизированными.

- Эмульсию сквалена, полоксамера 105 и Abil-Care [25]. Конечная концентрация (масса) этих компонентов в вакцины с адъювантом составляет 5% сквалена, 4% полоксамера 105 (полиол-плюроник) и 2% Abil-Care 85 (диметикон Bis-PEG/PPG-16/16 PEG/PPG-16/16; каприловый/каприновый триглицерид).

- Эмульсию, содержащую 0,5-50% масла, 0,1-10% фосфолипида и 0,05-5% неионного поверхностно-активного вещества. Как описано в ссылке 26, предпочтительные фосфолипидные компоненты представляют собой фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол, фосфатидилглицерин, фосфатидная кислота, сфингомиелин и кардиолипин. Подходящими являются субмикронные размеры капель.

- Субмикронную эмульсию "масло-в-воде" неметабозируемого масла (такого как легкое минеральное масло) и по меньшей мере одного поверхностно-активного вещества (такого как лецитин, Tween 80 или Span 80). Можно включать добавки, такие как сапонин QuilA, холестерин, конъюгат сапонин-липофил (такой как GPI-0100, описанный в ссылке 27, получаемый добавлением алифатического амина в дезацилсапонин посредством карбоксильной группы глюкуроновой кислоты), бромид диметилдиоктадециламмония и/или N,N-диоктадецил-N,N-бис-(2-гидроксиэтил)пропандиамин.

- Эмульсию, в которой сапонин (например, QuilA или QS21) и стерол (например, холестерин) связаны в виде спиральных мицелл [28].

- Эмульсию, содержащую минеральное масло, неионный липофильный этоксилированный жирный спирт и неионное гидрофильное поверхностно-активное вещество (например, этоксилированный жирный спирт и/или блок-сополимер полиоксиэтилена-полиоксипропилена) [29].

- Эмульсию, содержащую минеральное масло, неионный гидрофильный этоксилированный жирный спирт и неионное липофильное поверхностно-активное вещество (например, этоксилированный жирный спирт и/или блок-сополимер полиоксиэтилена-полиоксипропилена) [29].

В некоторых вариантах осуществления эмульсию можно смешивать с антигеном без подготовки, в момент доставки, и, таким образом, адъювант и антиген можно хранить раздельно в упакованной или распространяемой вакцине, готовой для конечного составления в момент использования. В других вариантах осуществления эмульсию смешивают с антигеном при производстве, и, таким образом, композицию упаковывают в жидкой форме с адъювантом. Как правило, антиген находится в водной форме, такой как вакцина, и его окончательно получают, смешивая две жидкости. Соотношение объемов двух жидкостей для смешивания может варьировать (например, от 5:1 до 1:5), но, как правило, приблизительно составляет 1:1. Когда в приведенных выше описаниях конкретных эмульсий указаны концентрации компонентов, как правило, эти концентрации указаны для неразбавленной композиции, и, таким образом, концентрация после смешивания с раствором антигена будет уменьшаться.

Когда композиция содержит токоферол, можно использовать любые токоферолы из α, β, γ, δ, ε или ξ, но предпочтительны α-токоферолы. Токоферол может принимать несколько форм, например, различных солей и/или изомеров. Соли включают органические соли, такие как сукцинат, ацетат, никотинат и т.д. Можно использовать D-α-токоферол и DL-α-токоферол. Токоферолы преимущественно включают в вакцины для применения у пожилых людей (например, в возрасте 60 лет или старше), так как опубликовано, что витамин E обладает положительным действием на иммунный ответ в этой группе пациентов [30]. Он также обладает свойствами антиоксиданта, что может помочь стабилизировать эмульсии [31]. Предпочтительный α-токоферол представляет собой DL-α-токоферол, а предпочтительная соль этого токоферола представляет собой сукцинат. Выявлено, что соль янтарной кислоты in vivo взаимодействует со связанными с TNF лигандами.

C. Составы с сапонином [глава 22 ссылки 13]

Также в качестве адъювантов по изобретению можно использовать составы с сапонином. Сапонины представляют собой гетерогенную группу стероловых гликозидов и тритерпеноидных гликозидов, которые выявлены в коре, листьях, стеблях, корнях и даже цветах широкого диапазона видов растений. В качестве адъювантов широко исследовали сапонин из коры дерева Quillaia saponaria Molina. Сапонин также можно коммерческим получать из Smilax ornata (сассапариль), Gypsophilla paniculata (перекати поле) и Saponaria officianalis (мыльный корень). Адъюванты из составов с сапонином включают очищенные составы, такие как QS21, а также липидные составы, такие как ISCOM. QS21 продают как стимулон (Stimulon^ТМ).

Композиции сапонина очищали с использованием ВЭЖХ и ВЭЖХ-ОФ. С использованием эти способов идентифицированы конкретные очищенные фракции, включающие QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B и QH-C. В некоторых случаях сапонин представляет собой QS21. Способ получения QS21 описан в ссылке 32. Составы с сапонином также могут содержать стерол, так как холестерин [33],

Можно использовать комбинации сапонинов и холестеринов с формированием уникальных частиц, называемых иммуностимулирующими комплексами (ISCOM) [глава 23 ссылки 13]. Как правило, ISCOM также содержат фосфолипид, такой как фосфатидилэтаноламин или фосфатидилхолин. В ISCOM можно использовать любой известный сапонин. В некоторых вариантах осуществления ISCOM содержит одно или несколько из QuilA, QHA и QHC. ISCOM дополнительно описаны в ссылках 33-35. Необязательно в ISCOMS можно не добавлять дополнительного детергента [36].

Обзор получения адъювантов на основе сапонина можно найти в ссылках 37 и 38.

D. Виросомы и вирусоподобные частицы

Также в качестве адъювантов по изобретению можно использовать виросомы и вирусоподобные частицы (VLP). Эти структуры, как правило, содержат один или несколько белков вируса, необязательно комбинированных или формулированных с фосфолипидом. Как правило, они являются непатогенными, нереплицирующимися и, как правило, не содержат ничего из природного генома вируса. Вирусные белки можно рекомбинантно получать или выделять из целых вирусов. Эти вирусные белки, пригодные для использования в виросомах или VLP, включают белки, получаемые из вируса гриппа (такие как HA или NA), вируса гепатита B (такие как коровые белки или белки капсида), вируса гепатита E, вируса кори, вируса Синдбис, ротавируса, вируса ящура, ретровируса, норовируса, вируса папилломы человека, ВИЧ, РНК-фагов, фага Qβ (такие как белки оболочки), фага GA, фага fr, фага AP205 и Ty (такие как белок ретротранспозона Ty p1). VLP дополнительно описаны в ссылках 39-44. Виросомы дополнительно описаны, например, в ссылке 45.

E. Производные бактерий или микроорганизмов

Адъюванты, подходящие для использования по изобретению, включают производные бактерий или микроорганизмов, такие как нетоксические производные липополисахарида (LPS) энтеробактерий, производные липида A, иммуностимулирующие олигонуклеотиды и рибозилирующие АДФ токсины и их детоксицированные производные.

Нетоксические производные LPS включают монофосфориллипид A (MPL) и 3-O-деацилированный MPL (3dMPL). 3dMPL представляет собой смесь 3 де-O-ацилированного монофосфориллипида A с 4, 5 или 6 ацилированными цепями. Предпочтительная "малая частица", формируемая 3 де-O-ацилированным монофосфориллипидом A, описана в ссылке 46. Такие "малые частицы" 3dMPL являются достаточно малыми для стерилизации фильтрованием через 0,22 мкм мембрану [46]. Другие нетоксические производные LPS включают миметики монофосфориллипида A, такие как аминоалкилглюкозаминидфосфатные производные, например, RC-529 [47,48].

Производные липида A включают производные липида A Escherichia coli, такие как OM-174. OM-174 описан, например, в ссылках 49 и 50.

Иммуностимулирующие олигонуклеотиды, подходящие для использования в качестве адъювантов по изобретению, включают нуклеотидные последовательности, содержащие мотив CpG (динуклеотидная последовательность, содержащая неметилированный цитозин, фосфатной связью связанный с гуанозином). Также известно, что иммуностимулирующими являются двухцепочечные РНК и олигонуклеотиды, содержащие палиндромные последовательности или последовательности поли(dG).

CpG могут содержать модификации/аналоги нуклеотидов, такие как тиофосфатные модификации, и могут бытья двухцепочечными или одноцепочечными. В ссылках 51, 52 и 53 описаны возможные замены аналогами, например, замена гуанозина 2'-дезокси-7-деазагуанозином. Адъювантное действие олигонуклеотидов CpG дополнительно описано в ссылках 54-59.

Последовательность CpG может быть направлена на TLR9, такой как мотив GTCGTT или TTCGTT [60]. Последовательность CpG может быть специфичной для индукции иммунного ответа Th1, такой как ODN CpG-A, или она может быть более специфичной для индукции B-клеточного ответа, такой как ODN CpG-B. ODN CpG-A и CpG-B описаны в ссылках 61-63. В некоторых вариантах осуществления CpG представляет собой ODN CpG-A.

В других вариантах осуществления олигонуклеотид CpG конструируют так, чтобы 5'-конец был доступным для распознавания рецептором. Необязательно, две олигонуклеотидные последовательности CpG можно соединять по их 3'-концам с формированием "иммуномеров". См., например, ссылки 60 и 64-66.

Подходящим адъювантом CpG является CpG7909, также известный как ProMune^ТМ (Coley Pharmaceutical Group, Inc.). Другим является CpGl826. В качестве альтернативы или в дополнение использованию последовательностей CpG, можно использовать последовательности TpG [67], и в этих олигонуклеотиды может отсутствовать неметилированные мотивы CpG. Иммуностимулирующий олигонуклеотид может быть богатым по пиримидинам. Например, он может содержать более одного последовательного тимидинового нуклеотида (например, TTTT, как описано в ссылке 67), и/или он может содержать композицию нуклеотидов с >25% тимидина (например, >35%, >40%, >50%, >60%, >80% и т.д.). Например, он может содержать более одного последовательного цитозинового нуклеотида (например, CCCC, как описано в ссылке 67), и/или он может содержать состав нуклеотидов с >25% цитозина (например, >35%, >40%, >50%, >60%, >80% и т.д.). Эти олигонуклеотиды могут не содержать неметилированный мотив CpG. Как правило, иммуностимулирующие олигонуклеотиды содержат по меньшей мере 20 нуклеотидов. Они могут содержать менее 100 нуклеотидов.

Особенно подходящий адъювант на основе иммуностимулирующих олигонуклеотидов известен как IC-31^ТМ [68]. Таким образом, адъювант, используемый по изобретению может содержать смесь (i) олигонуклеотида (например, из 15-40 нуклеотидов), содержащего по меньшей мере один (а предпочтительно несколько) мотивов CpI (т.е. цитозина, связанного с инозином с формированием динуклеотида), и (ii) поликатионного полимера, такого как олигопептид (например, из 5-20 аминокислот), содержащего по меньшей мере одну (а предпочтительно несколько) последовательность(и) трипептида Lys-Arg-Lys. Олигонуклеотид может представлять собой дезоксинуклеотид, содержащий 26-членную последовательность 5'-(IC)₁₃-3' (SEQ ID NO:427). Поликатионный полимер может представлять собой пептид, содержащий 11-членную аминокислотную последовательность KLKLLLLLKLK (SEQ ID NO:426). Олигонуклеотид и полимер могут формировать комплексы, например, как описано в ссылках 69 и 70.

В качестве адъювантов по изобретению можно использовать бактериальные рибозилирующие АДФ токсины и их детоксицированные производные. В некоторых вариантах осуществления белок получают из E.coli (термолабильный энтеротоксин E.coli "LT"), холеры ("CT") или коклюша ("PT"). Использование детоксицированных рибозилирующих АДФ токсинов в качестве слизистых адъювантов описано в ссылке 71, а в качестве парентеральных адъювантов - в ссылке 72. Токсин или токсоид, как правило, находится в форме голотоксина, содержащего субъединицы A и B. В некоторых вариантах осуществления субъединица A содержит детоксицирующую мутацию; субъединица B часто не мутирована. В некоторых вариантах осуществления адъювант представляет собой детоксицированный мутант LT, такой как LT-K63, LT-R72 и LT-G192. Использование рибозилирующих АДФ токсинов и их детоксицированных производных, в частности, LT-K63 и LT-R72, в качестве адъювантов можно найти в ссылках 73-80. Подходящий мутант CT представляет собой или CT-E29H [81]. Числовые ссылки на замены аминокислот, как правило, основаны на выравниваниях субъединиц A и B рибозилирующих АДФ токсинов, проводимых в ссылке 82, конкретно, в полном объеме включенной в настоящий документ в качестве ссылки.

F. Иммуномодуляторы человека

Иммуномодуляторы человека, подходящие для использования в качестве адъювантов по изобретению, включают цитокины, такие как интерлейкины (например, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 [83], и т.д.) [84], интерфероны (например, интерферон γ), макрофагальный колониестимулирующий фактор и фактор некроза опухоли. Предпочтительным иммуномодулятором является IL-12.

G. Биоадгезивные и мукоадгезивные средства

Также в качестве адъювантов по изобретению можно использовать биоадгезивные и мукоадгезивные средства. Подходящие биоадгезивные средства включают микросферы этерифицированной гиалуроновой кислоты [85] или мукоадгезивные средства, такие как поперечно-сшитые производные поли(акриловой кислоты), поливинилового спирта, поливинилпирролидона, полисахаридов и карбоксиметилцеллюлозы. Также в качестве адъювантов по изобретению можно использовать хитозан и его производные [86].

H. Микрочастицы

Также в качестве адъювантов по изобретению можно использовать микрочастицы. Предпочтительными являются микрочастицы (т.е. частицы с диаметром от ~100 нм до ~150 мкм, в некоторых вариантах осуществления с диаметром от ~200 нм до ~30 мкм, например, с диаметром от ~500 нм до ~10 мкм), получаемые из веществ, которые являются биологически разлагаемыми и нетоксическими (например, поли(α-гидроксикислота), полигидроксимасляная кислота, сложный полиортоэфир, полиангидрид, поликапролактон и т.д.), с сополимером лактида с гликолидом, необязательно, обрабатываемые так, чтобы иметь отрицательно заряженную поверхность (например, SDS) или положительно заряженную поверхность (например, катионным детергентом, таким как CTAB).

I. Липосомы (главы 13 и 14 ссылки 13)

Примеры липосомных составов, подходящих для использования в качестве адъювантов, описаны в ссылках 87-89.

J. Составы простых эфиров полиоксиэтилена и сложных эфиров полиоксиэтилена

Адъюванты, подходящие для использования по изобретению, включают простые эфиры полиоксиэтилена и сложные эфиры полиоксиэтилена [90]. Такие составы дополнительно включают поверхностно-активные вещества сложного эфира полиоксиэтиленсорбитана в комбинации с октоксинолом [91], а также поверхностно-активные вещества простых эфиров или сложных эфиров полиоксиэтиленалкила в комбинации по меньшей мере с одним дополнительным неионным поверхностно-активным веществом, таким как октоксинол [92]. Предпочтительные простые эфиры полиоксиэтилена выбраны из следующей группы: простой полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир (лаурет 9), простой полиоксиэтилен-9-стеариловый эфир, простой полиоксиэтилен-8-стеариловый эфир, простой полиоксиэтилен-4-лауриловый эфир, простой полиоксиэтилен-35-лауриловый эфир и простой полиоксиэтилен-23-лауриловый эфир.

K. Фосфазены

Можно использовать фосфазен, такой как поли[ди(карбоксилатфенокси)фосфазен] ("PCPP"), как описано, например, в ссылках 93 и 94.

L. Мурамилпептиды

Примеры мурамилпептидов, подходящих для использования в качестве адъювантов по изобретению, включают N-ацетилмурамил-L-треонил-D-изоглутамин (thr-MDP), N-ацетилнормурамил-L-аланил-D-изоглутамин (нор-MDP) и N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланин-2-(1'-2'-дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)этиламин MTP-PE).

M. Имидазохинолоновые соединения.

Примеры имидазохинолоновых соединений, подходящих для использования в качестве адъювантов по изобретению, включают имиквимод (Imiquimod) ("R-837") [95,96], резиквимод (Resiquimod) ("R-848") [97] и их аналоги и их соли (например, гидрохлоридные соли). Дополнительные подробности об иммуностимулирующиъ имидазохинолинах можно найти в ссылках 98-102.

N. Замещенные карбамиды

Замещенные карбамиды, подходящие в качестве адъювантов, включают соединения формул I, II или III или их соли:

как определено в ссылке 103, такие как, например, "ER 803058", "ER 803732", "ER 804053", "ER 804058", "ER 804059", "ER 804442", "ER 804680", "ER 804764", "ER 803022" или "ER 804057":

O. Дополнительные адъюванты

Дополнительные адъюванты, которые можно использовать по изобретению, включают:

- Фосфатное производное аминоалкилглюкозаминида, такое как RC-529 [104,105],

- Тиосемикарбазоновое соединение, такое как тиосемикарбазоновые соединения, описываемые в ссылке 106. Способы формулирования, производства и скрининга активных соединений также описаны в ссылке 106. Тиосемикарбазоны являются особенно эффективными при стимуляции мононуклеарных клеток периферической крови человек для продукции цитокинов, таких как TNF-α.

- Триптантриновое соединение, такое как триптантриновые соединения, описываемые в ссылке 107. Способы формулирования, производства и скрининга активных соединений также описаны в ссылке 107. Тиосемикарбазоны являются особенно эффективными при стимуляции мононуклеарных клеток периферической крови человек для продукции цитокинов, таких как TNF-α.

- Аналог нуклеозида, такой как: (a) изаторабин (ANA-245; 7-тиа-8-оксогуанозин):

и его пролекарственные средства; (b) ANA975; (c) АНК-025-1; (d) ANA380; (e) соединения, описываемые в ссылках 108-110, локсорибин (7-аллил-8-оксогуанозин) [111].

- Соединения, описываемые в ссылке 112, включая: ацилпиперазиновые соединения, индолдионовые соединения, тетрагидраизохинолиновые (THIQ) соединения, бензоциклодионовые соединения, аминоазавиниловые соединения, аминобензимидазолхинолиноновые (ABIQ) соединения [113,114], гидрафталамидные соединения, бензофеноновые соединения, изоксазоловые соединения, стероловые соединения, хиназилиноновые соединения, пирроловые соединения [115], антрахиноновые соединения, хиноксалиновые соединения, триазиновые соединения, пиразалопиримидиновые соединения и бензазоловые соединения [116].

- Соединения, содержащие липиды, связанные с фосфатсодержащим ациклическим каркасом, такие как антагонист TLR4 E5564 [117,118].

- Полиоксидоновый полимер [119,120] или другое N-окисленное полиэтиленпиперазиновое производное.

- Метилинозин-5'-монофосфат ("MIMP") [121].

- Полигидроксилированное пирролизидиновое соединение [122], такое как соединение формулы:

где R выбран из группы, включающей водород, неразветвленные или разветвленные, незамещенные или замещенные, насыщенные или ненасыщенные ацильные, алкильные (например, циклоалкильные), алкенильные, алкинильные и арильные группы или их фармацевтически приемлемые соли или производные. Примеры в качестве неограничивающих примеров включают: казуарин, казуарин-6-α-D-глюкопираноза, 3-эпи-казуарин, 7-эпи-казуарин, 3,7-ди-эпи-казуарин и т.д.

- Лиганд CD1d, такой как α-гликозилцерамид [123-130] (например, α-галактозилцерамид), содержащий фитосфингозин α-гликозилцерамиды, OCH, KRN7000 [(2S,3S,4R)-1-O-(α-D-галактопиранозил)-2-(N-гексакозаноиламино)-1,3,4-октадекантриол], CRONY-101, 3"-O-сульфогалактозилцерамид и т.д.

- Гамма-инулин [131] или его производное, такое как альгаммулин.

Комбинации адъювантов

Изобретение также может содержать комбинации одного или нескольких из адъювантов, указанных выше. Например, по изобретению можно использовать следующие композиции адъювантов: (1) сапонин и эмульсия "масло-в-воде" [132]; (2) сапонин (например, QS21) + нетоксическое производное LPS (например, 3dMPL) [133]; (3) сапонин (например, QS21) + нетоксическое производное LPS (например, 3dMPL) + холестерин; (4) сапонин (например, QS21) + 3dMPL + IL-12 (необязательно + стерол) [134]; (5) комбинации 3dMPL, например, с QS21 и/или эмульсиями "масло-в-воде" [135]; (6) SAF, содержащий 10% сквалана, 0,4% Tween 80™, 5% плюроник-блок-полимер L121 и thr-MDP, микрофлюидизированные в субмикронную эмульсию или перемешанные на центрифуге типа "вортекс" с получением эмульсии с большим размером частиц. (7) адъювантную систему Ribi™ (RAS), (Ribi Immunochem), содержащую 2% сквалена, 0,2% Tween 80 и один или несколько компонентов стенки бактериальной клетки из группы, состоящей из монофосфориллипида A (MPL), димиколата трегалозы (TDM) и каркаса клеточной стенки (CWS), предпочтительно, MPL+CWS (Detox™); и (8) одну или несколько солей неорганических кислот (такие как соль алюминия)+нетоксическое производное LPS (такое как 3dMPL).

Другие вещества, которые действуют в качестве иммуностимулирующих средств, описаны в главе 7 ссылки 13.

Типичным является использование адъюванта с гидроксидом алюминия и/или фосфатом алюминия, и антигенов, которые, как правило, адсорбируются на эти соли. Другим характерным адъювантом является фосфат кальция. Другие комбинации адъювантов включают комбинации адъювантов Th1 и Th2, таких как CpG и алюминий или резиквимод и алюминий. Можно использовать комбинацию фосфата алюминия и 3dMPL.

Композиции по изобретению могут вызывать клеточный иммунный ответ, а также гуморальный иммунный ответ. Этот иммунный ответ может включать долговечные (например, нейтрализующие) антитела и клеточный иммунитет, который может быстро отвечать при воздействии пневмококка.

Полагают, что, в основном, для инициации и/или усиления клеточного и гуморального иммунитета необходимы два типа T-клеток, CD4 и CD8 клетки. CD8 T-клетки могут экспрессировать корецептор CD8, и их, как правило, обозначают как цитотоксические T-лимфоциты (CTL). CD8 T-клетки способны распознавать антигены, представленные на молекулах MHC класса I, и взаимодействовать с ними.

CD4 T-клетки могут экспрессировать корецептор CD4, и их, как правило, обозначают как клетки T-хелперы. CD4 T-клетки способны распознавать антигенные пептиды, связанные с молекулами MHC класса II. После взаимодействия с молекулой MHC класса II, CD4 клетки могут секретировать такие факторы, как цитокины. Эти секретируемые цитокины могут активировать B-клетки, цитотоксические T-клетки, макрофаги и другие клетки, участвующие в иммунном ответе. Клетки T-хелперы или CD4⁺-клетки можно дополнительно подразделять на две функционально различающихся субпопуляции: с фенотипом TH1 и с фенотипом TH2, которые отличаются по их цитокинам и эффекторной функции.

Активированные TH1 клетки усиливают клеточный иммунитет (включая увеличение продукции специфичных для антигена CTL) и, таким образом, имеют особое значение в ответе на внутриклеточные инфекции. Активированные TH1 клетки могут секретировать одно или несколько из IL-2, IFN-γ и TNF-β. Иммунный ответ TH1 может приводить к локальным воспалительным реакциям посредством активированных макрофагов, клеток NK (естественных киллеров) и CD8 цитотоксических T-клеток (CTL). Иммунный ответ TH1 также может воздействовать на усиление иммунного ответа, посредством стимуляции роста B- и T-клеток IL-12. Стимулированные TH1 B-клетки могут секретировать IgG2a.

Активированные TH2 клетки увеличивают продукцию антител и, таким образом, имеют значение в ответе на внеклеточные инфекции. Активированные TH2 клетки могут секретировать одно или несколько из IL-4, IL-5, IL-6 и IL-10. Иммунный ответ TH2 может приводить к продукции IgG1, IgE, IgA и B-клеток памяти для защиты в будущем.

Усиленный иммунный ответ может включать один или несколько из развитых иммунного ответа TH1 и иммунного ответа TH2.

Иммунный ответ TH1 может включать одно или несколько из увеличения количества CTL, увеличения количества одного или нескольких из цитокинов, связанных с иммунным ответом TH1 (таких как IL-2, IFN-γ и TNF-β), увеличение количества активированных макрофагов, увеличения активности NK или увеличения продукции IgG2a. В некоторых вариантах осуществления развитый иммунный ответ TH1 включает увеличение продукции IgG2a.

Иммунный ответ TH1 можно вызывать с использованием адъюванта TH1. Как правило, адъювант TH1 вызывает увеличенные уровни продукции IgG2a относительно иммунизации антигеном без адъюванта. Адъюванты TH1, подходящие для использования по изобретению, могут включать, например, составы сапонина, виросомы и вирусоподобные частицы, нетоксические производные липополисахарида (LPS) энтеробактерий, иммуностимулирующие олигонуклеотиды. Характерными адъювантами TH1 для применения по изобретению являются иммуностимулирующие олигонуклеотиды, такие как олигонуклеотиды, содержащие мотив CpG.

Иммунный ответ TH2 может включать одно или несколько из увеличения количества одного или нескольких из цитокинов, связанных с иммунным ответом TH2 (таких как IL-4, IL-5, IL-6 и IL-10), или увеличения продукции IgG1, IgE, IgA и B-клеток памяти. В некоторых вариантах осуществления усиленный иммунный ответ TH2 включает увеличение продукции IgG1.

Иммунный ответ TH2 можно вызывать с использованием адъюванта TH2. Адъювант TH2, как правило, вызывает увеличенные уровни продукции IgG1 относительно иммунизации антигеном без адъюванта. Адъюванты TH2, подходящие для использования по изобретению, включают, например, содержащие неорганические вещества композиции, масляные эмульсии и рибозилирующие АДФ токсины и их детоксицированные производные. Характерными адъювантами TH2 для применения по изобретению являются содержащие неорганические вещества композиции, такие как соли алюминия.

В некоторых вариантах осуществления изобретение включает композицию, содержащую комбинацию адъюванта TH1 и адъюванта TH2. Часто такая композиция вызывает усиленный ответ TH1 и усиленный ответ TH2, т.е., увеличивает продукцию IgG1 и IgG2a относительно иммунизации без адъюванта. Как правило, композиция, содержащая комбинацию адъювантов TH1 и TH2, вызывает увеличенный иммунный ответ TH1 и/или увеличенный иммунный ответ TH2 относительно иммунизации одним адъювантом (т.е., относительно иммунизации только адъювантом TH1 или иммунизации только адъювантом TH2).

Иммунный ответ может представлять собой один из иммунных ответа TH1 и иммунного ответа TH2 или оба. Иммунный ответ может предусматривать один из усиленного ответа TH1 или усиленного ответа TH2 или оба.

Усиленный иммунный ответ может представлять собой один из системного иммунного ответа и слизистого иммунного ответа или оба. Иммунный ответ может предусматривать один из усиленного системного иммунного ответа и усиленного слизистого иммунного ответа или оба. Как правило, слизистый иммунный ответ представляет собой иммунный ответ TH2. Как правило, слизистый иммунный ответ включает увеличение продукции IgA.

Композиции можно получать в виде инъецируемого препарата, в жидких растворах или суспензиях. Также можно получать твердые формы, подходящие для растворения или суспендирования до инъекции в жидких носителях (например, лиофилизированная композиция или композиция лиофилизированная посредством распыления). Композицию можно получать для местного введения, например, в виде мази, крема или порошка. Композицию можно получать для перорального введения, например, в виде таблетки или капсулы, в виде спрея или в виде сиропа (необязательно ароматизированных). Композицию можно получать для легочного введения, например, в виде ингалятора с использованием тонкодисперсного порошка или спрея. Композицию можно получать в виде суппозитория или пессария. Композицию можно получать для назального, ушного или глазного введения, например, в виде капель. Композиция может находиться в форме набора, разработанного так, чтобы восстанавливать комбинированную композицию непосредственно перед введением млекопитающему. Такие наборы могут содержать один или несколько антигенов в жидкой форме и один или несколько лиофилизированных антигенов.

Когда композиция предназначена для получения непосредственно перед использованием (например, когда компонент представлен в лиофилизированной форме) и присутствует в наборе, набор может содержать два флакона, или он может содержать один готовый заполненный шприц и один флакон, где перед инъекцией содержимое шприца используют для реактивации содержимого флакона.

Композиции, используемые в качестве вакцин, содержат иммунологически эффективное количество антигена(ов), а также любые другие компоненты по мере необходимости. Под "иммунологически эффективным количеством" подразумевают, что введение этого количества индивидууму, в однократной дозе или как часть серии, является эффективным для лечения или профилактики. Это количество варьирует в зависимости от состояния здоровья и физического состояния индивидуума, подлежащего лечению, возраста, таксономической группы индивидуума, подлежащего лечению (например, не являющийся человеком примат, примат и т.д.), способности иммунной системы индивидуума синтезировать антитела, желаемой степени защиты, состава вакцины, оценки медицинского состояния лечащим врачом и других значимых факторов. Полагают, что количество будет попадать в относительно широкий диапазон, который можно определять посредством стандартных исследований. Когда в композицию включены более одного антигена, тогда два антигена могут присутствовать в той же дозе, что и другой, или в различных дозах.

Как указано выше, композиция может содержать термозащитное средство, и этот компонент может быть особенно пригодным в композициях с адъювантами (особенно в тех, которые содержат неорганический адъювант, такой как соль алюминия). Как описано в ссылке 136, жидкое термозащитное средство можно добавлять в водную вакцинную композицию для снижения ее точки замерзания, например, для снижения точки замерзания до температуры ниже 0°C. Таким образом, композицию можно хранить при температуре ниже 0°C, но выше ее точки замерзания, для ингибирования теплового разрушения. Также термозащитное средство обеспечивает замораживание композиций при защите адъювантов с неорганическими солями от агломерации или осаждения после замораживания и оттаивания, а также может защищать композицию от повышенных температур, например, выше 40°C. Исходную водную вакцину и жидкое термозащитное средство можно смешивать так, что жидкое термозащитное средство составляет 1-80% от объема конечной смеси. Подходящие термозащитные средства должны быть безопасны для введения человеку, легко смешиваться/растворяться в воде, и не должны повреждать другие компоненты (например, антиген и адъювант) в композиции. Примеры включают глицерин, пропиленгликоль и/или полиэтиленгликоль (PEG). Средняя молекулярная масса подходящих PEG может находиться в диапазоне 200-20000 Да. В одном из вариантов осуществления средняя молекулярная масса полиэтиленгликоля составляет приблизительно 300 Да ("PEG-300").

Изобретение относится к композиции, содержащей: (i) один или несколько антигенов и (ii) термозащитное средство. Эту композицию можно составлять, смешивая (i) водную композицию, содержащую один или несколько антигенов, с (ii) термозащитным средством. Затем смесь можно хранить, например, ниже 0°C, при 0-20°C, при 20-35°C, при 35-55°C или более. Ее можно хранить в жидкой или замороженной форме. Смесь может быть лиофилизированной. Альтернативно композицию можно составлять, смешивая (i) высушенную композицию, содержащую один или несколько антигенов, с (ii) жидкой композицией, содержащей термозащитное средство. Таким образом, компонент (ii) можно использовать для восстановления компонента (i).

Функциональные эквиваленты:

SEQ ID NO, используемые для идентификации антигенов GAS, которые можно использовать в способах, белковых чипах и в медицинских применениях по изобретению, описанных выше, представляют собой полноразмерные последовательности этих антигенов GAS.

Способы, белковые чипы и медицинские применения по изобретению не ограничены применением этих полноразмерных антигенов GAS, но также включают любой "функциональный эквивалент" любого из этих антигенов GAS.

Как применяют в настоящем документе термин "функциональный эквивалент" предназначен для включения вариантов антигенов GAS с полноразмерными последовательностями, представленными в списке последовательностей, которые сохраняют способность взаимодействовать с антителами к полноразмерному антигену GAS, присутствующему в биологическом объекте, и которые, таким образом, можно использовать вместо полноразмерных антигенов GAS.

Таким образом, термин "функциональный эквивалент" включает фрагменты полноразмерных антигенов GAS, с последовательностями, приведенными в списке последовательностей. Такие фрагменты могут сохранять способность связываться с антителами, которые связываются с полноразмерными антигенами GAS. Функциональные эквиваленты по изобретению могут связываться с антителами, получаемыми к полноразмерному антигену GAS с аффинностью по меньшей мере 10^-7 M.

Фрагменты включают по меньшей мере n последовательных аминокислот последовательностей полноразмерных антигенов GAS, где n представляет собой 7 или более (например, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или более). Фрагменты могут содержать эпитоп из полноразмерной последовательности антигена GAS. Дополнительно во фрагментах могут отсутствовать одна или несколько аминокислот (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) на C-конце и/или одна или несколько аминокислот (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) на N-конце полноразмерной последовательности. Например, фрагменты, которые можно использовать в способах и чипах по изобретению, включают фрагменты, в которых отсутствуют лидерные последовательности и/или трансмембранные последовательности, представленные в полноразмерных антигенах GAS.

Дополнительные примеры фрагментов, которые можно использовать в способах и чипах по изобретению, включают N-концевые фрагменты. Примеры таких фрагментов включают аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9 (которая представляет собой N-концевой фрагмент последовательности SEQ ID NO:5), и аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:10 (которая представляет собой N-концевой фрагмент SEQ ID NO:4).

Также термин "функциональный эквивалент" включает варианты полноразмерных белков GAS с заменами аминокислот и фрагменты таких вариантов. Варианты могут обладать 50% или большей идентичностью (например, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или более) с последовательностями полноразмерных антигенов GAS, предоставленными в настоящем документе. По сравнению с последовательностью антигена GAS, приведенной в списке последовательностей, варианты могут содержать консервативные аминокислотные замены. Такие характерные замены находятся в числе Ala, Val, Leu и Ile; в числе Ser и Thr; в числе кислых остатков Asp и Glu; в числе Asn и Gln; в числе основных остатков Lys и Arg или в числе ароматических остатков Phe и Tyr.

Термин "функциональный эквивалент" дополнительно включает более протяженные варианты антигенов GAS, включающие слитые белки, содержащие дополнительные молекулы, которые химически или генетически связаны с антигеном GAS. Например, к антигену GAS можно присоединять метку, облегчающую его локализацию на белковом чипе или облегчающую детекцию, когда он связан с антителом. Примеры таких меток включают аналитически детектируемый реагент, такой как радиоактивный изотоп, флуоресцентную молекулу или фермент. Альтернативно, антиген GAS можно сливать с доменом, облегчающим его исходную очистку, таким как гистидиновый домен или домен GST.

Также термин "функциональный эквивалент" включает миметики антигенов GAS, вариантов и фрагментов, описанных выше, которые структурно сходны с антигенами GAS и сохраняют способность связываться с антителами против полноразмерных антигенов GAS.

Общая часть

Термин "содержащий" включает "включающий", а также "состоящий" например, композиция "содержащая" X, может состоять исключительно из X или может включать что-нибудь дополнительно, например, X+Y.

Выражение "по существу" не исключает "полностью", например, композиция, которая "по существу не содержит" Y может совсем не содержать Y. Если необходимо, выражение "по существу" в определении по изобретению может быть пропущено.

Термин "приблизительно" по отношению к числовому значению x означает, например, x±10%.

Если конкретно не указано, способ, включающий стадию смешивания двух или более компонентов, не требует никакого конкретного порядка смешивания. Таким образом, компоненты можно смешивать в любом порядке. Когда присутствуют три компонента, тогда два компоненты можно комбинировать друг с другом, а затем комбинацию можно комбинировать с третьим компонентом и т.д.

Идентичность полипептидных последовательностей предпочтительно, определяют по алгоритму поиска гомологии Смита-Ватермана, как применяют в программе MPSRCH (Oxford Molecular), с использованием поиска аффинных пропусков с параметрами штраф за создание пропуска = 12 и штраф за продление пропуска = 1.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фигура 1. Возрастное распределение пациентов с ревматическим пороком сердца (RHD) и йеменских здоровых доноров крови (YHD), у которых собирали сыворотки. Представлены выбранные для исследования образцы сыворотки совпадающих по возрасту индивидуумов.

Фигура 2. Получение и подтверждение белковых микрочипов. A, анализ SDS-PAGE очищенных рекомбинантных белков GAS, окрашенных Кумасси. На дорожке 1 находятся маркеры молекулярной массы. B, Типичное изображение чипа после инкубации с сывороткой человека и с меченными Cy3 антителами против IgG человека и меченными Cy5 антителами против IgM человека. Выделены повторы тестируемых антигенов и отрицательных и положительных контролей IgG и IgM. C, графическое представление контрольной кривой IgG человека. Ниже графика представлено изображение чипа с различными концентрациями IgG, выявляемое при инкубации с антителами против IgG человека-Cy3. D, Способ нормализации данных на основе сигмовидной кривой. Данные нормализовали с использованием сигмовидной контрольной кривой (черной), выравнивая по эталонной сигмовидной кривой (красная; id, идеальная сигмовидная кривая; P и P', точки пересечения ненормализованных, Val, и нормализованных, N(Val), значений MFI на экспериментальной и эталонной сигмовидных кривых; HL, значения, соответствующие нормализованным значениям MFI 30000; LL представляют собой нормализованные значения MFI 15000.

Фигура 3. Процент йеменских и итальянских здоровых доноров сыворотки с высоким ответом (MFI>30000) на антигены GAS. Антигены представлены в порядке снижения ответа.

Фигура 4. Сравнение иммунореактивности 40 YHD (темно-серый на фигуре 4) и 43 RHD (светло-серый на фигуре 4) сывороток совпадающих по возрасту отобранных людей. Нормализованные значения FI (MFI) подвергали неконтролируемой двумерной иерархической кластеризации с использованием специализированного программного обеспечения (программное обеспечение TIGR Multiexperiment Viewer (MeV) (http://www.tigr.org/software/tm4/mev.html) с определением профилей распознавания антигенов в двух группах сывороток, что привело к идентификации двух основных групп с высоким распознаванием антигенов (1 и 2 на фигуре 4A, также представлено на фигуре 4B). Этот кластерный анализ распределял сыворотки от высокой реакционноспособности (слева) к меньшей реакционноспособности (справа). Можно различить две основные группы сывороток с группой с высокой реакционноспособностью, в основном включающей сыворотки здоровых доноров (A слева на фигуре 4), и второй группой, демонстрирующей меньшую реакционноспособность и в основном включающей сыворотки пациентов с RHD (группа B на фигуре 4).

Фигура 5. Применение кластерного анализа K-средних с классификацией антигенов GAS, присутствующих на чипе в 10 кластеров (от KA1 до KA10), вызывающих сходные профили распознавания. Идентифицировано, что четыре из кластеров антигенов (номера KA1, KA5, KA9, KA10) содержали антигены с большими значениями флуоресценции, чем остальные кластеры. В кластере KA1 наиболее реактивные сыворотки содержали большое количество YHD, что позволяет предполагать наличие на чипе группы антигенов, реакционноспособность которых обеспечивает установление различий между сыворотками, получаемыми у здоровых доноров, и сыворотками, получаемыми у пациентов с RHD.

Фигура 6. Идентификация кластеров антигенов, обеспечивающих установление различий между здоровыми контролями и пациентами с RHD. Сыворотки из кластера KA1 на фигуре 6 дополнительно классифицировали на основе их профилей распознавания с различными группами антигенов с использованием одномерного иерархического кластерного анализа, обеспечивающего определение двух кластеров сывороток HS1 (фиолетовая рамка) и HS2 (синяя рамка). Количества сывороток, полученных у здоровых контролей, и сывороток, полученных у пациентов, присутствующие или отсутствующие в каждом из двух кластеров, указаны на фигуре 6B. Большинство YHD можно найти в кластере с высокой реакционноспособностью, синий, кластер HS2, тогда как большинство сывороток RHD находятся в кластере с низкой реакционноспособностью, фиолетовый, кластер HS1. Возможность установить отличия между двумя группами сывороток с использованием теста этого типа определяли по специфичности и чувствительности (фигура 6C). Для этой конкретной группы антигенов, получали значения специфичности и чувствительности 0,73 и 0,69. На фигуре 6C также представлен идеальный теоретический пример максимума специфичности и чувствительности (значения 1).

Фигура 7. Анализ, описанный на фигуре 6, применяли для других кластеров антигенов: KA5 (B), KA9 (C), KA10 (D), KA5+M9 (E), GAS5+GAS5F+GAS25+GAS40 (F), GAS5+GAS5F+GAS25+GAS40+GAS57 (G), GAS5+GAS25+GAS40+GAS57 (H), GAS5F+GAS25+GAS40+GAS57 (I). Для каждого кластера представлены значения специфичности и чувствительности.

СПОСОБЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Введение

Авторы разработали белковый микрочип, содержащий 130 антигенов рекомбинантных белков GAS. Чип являлся устройством для выбора антигенов, вызывающий высокий ответ антителами у пациентов с фарингитом, а также позволял выявить высокий ответ против антигенов GAS в сыворотках, полученных у пациентов с тиковым заболеванием, убедительно свидетельствуя, что зависимая от антигенов GAS индукция аутоантител у чувствительных индивидуумов может быть вовлечена в возникновение тиковых нарушений (Bombaci M, et al. 2009 PLoS ONE 4, 7: e6332. doi: 10,1371).

В настоящем изобретении авторы использовали белковый микрочип для анализа иммунного ответа на 130 рекомбинантных белков GAS у пациентов с RHD и здоровых доноров с целью идентификации профилей распознавания антигенов, позволяющих авторам различить две группы. Этот подход привел к идентификации кластера антигенов, высокораспознаваемых здоровыми донорами, но не пациентами с RHD, что может определять основу для диагностического теста.

Материалы и способы

Сыворотки человека

Сыворотки у пациентов с ревматическим пороком сердца собирали у 60 пациентов мужского или женского пола из ближневосточного государства (Йемен) в возрасте 11-40 лет с наличием клинических симптомов RHD.

Известно, что титры антител против GAS варьируют в зависимости от ряда факторов, включая возраст и географическое происхождение. Фактически, титры антител к GAS у здоровых людей в раннем детском возрасте являются низкими, достигая пика у детей в возрасте от 5 до 15 лет, снижаясь в позднеподростковом возрасте и раннем периоде взрослого возраста, а затем после этого выходя на плато. По этой причине, сравнение между сыворотками в группах с ревматическим пороком сердца (RHD) и здоровых контрольных йеменских доноров (YHD) проводили с использованием групп одного и того же возрастного диапазона (в возрасте 17-40 лет), таким образом, исключая сыворотки пациентов с RHD в возрасте 11-16 лет, для которых контрольных сывороток в наличии не было. Конечное количество сывороток, используемых для сравнения, составляло 40 YHD и 43 RHD.

На фигуре 1 представлен анализ распределения двух доступных групп и групп, выбранных для исследования.

Кроме того, в качестве дополнительного к здоровым йеменцам сравнения, использовали коллекцию из 20 сывороток, полученных у здоровых доноров итальянцев (IHD), учитывая более частое использование профилактики инфекций GAS антибиотиками в указанной выше западной группе.

Все образцы сыворотки являлись остаточными, полученными при регулярном медицинском контроле при диагностике RHD или при заборе крови, и были предоставлены Department of Child and Adolescent Neuropsychiatry, University La Sapienza, Rome.

Микрочип белков GAS

Белковый чип получали, нанося на нитроцеллюлозный чип 130 рекомбинантных белков, в основном выбранных из генома GAS SF370 M1 (для подробного описания получения чипа см. фигуру 2).

Чипы инкубировали с различными сыворотками и оценивали реакционноспособность, определяя общий IgG, связывающийся с каждым нанесенным белком с использованием флуоресцентно меченых антител против IgG человека и измеряя значения получаемой интенсивности флуоресценции (FI). Для каждого стекла значения MFI белка нормализовали по сигмовидной скорректированной стандартной кривой IgG, используемой в качестве эталона (фигура 2).

Распознавание антигенов тестируемыми сыворотками считали положительным, когда значения MFI являлись равными или большими 15000, соответствующими значению фона плюс 2 стандартные отклонения. Значения MFI равные или большие 30000 рассматривали как высокий ответ. На чип наносили 120 сывороток, полученных у пациентов (20 сывороток итальянских здоровых доноров (IHD), 40 йеменских здоровых доноров (YHD) и 60 йеменских пациентов с RHD (RHD)).

Результаты

Антигены GAS, распознаваемые сыворотками, полученными у здоровых доноров: ответ антителами выше у йеменцев, чем у итальянцев

Ответ антителами к GAS в группах, принадлежащих различным географическим областям, исследовали с использованием 40 сывороток, полученных у здоровых доноров крови из Йемена и 20 здоровых доноров из Италии. На фигуре 3 представлен процент сывороток, полученных у здоровых доноров, с высоким ответом на антигены GAS. Как показано, фоновый ответ против стрептококков намного выше в образцах, полученных у йеменцев, чем в образцах, полученных у итальянцев, и в отношении количества высокораспознаваемых антигенов, и в отношении количества высокоположительных сывороток.

Дифференциальная иммунореактивность антигенов GAS у здоровых йеменцев и йеменских пациентов с RHD

Авторы сравнивали иммунореактивность 40 YHD (темно-серый на фигуре 4) и 43 RHD (светло-серый на фигуре 4) сывороток выбранных совпадающих по возрасту людей. Для определения профилей распознавания антигенов двух групп сывороток, нормализованные значения FI (MFI) подвергали неконтролируемой двумерной иерархической кластеризации с использованием специализированного программного обеспечения (программное обеспечение TIGR Multiexperiment Viewer (MeV) (http://www.tigr.org/software/tm4/mev.html).

Кластерное представление профилей распознавания антител идентифицировало две основных группы высокораспознаваемых антигенов (1 и 2 на фигуре 4). Группа 1 включала GAS5F (предполагаемый секретируемый белок), GAS25 (предшественник стрептолизина O), GAS40 (предполагаемый поверхностный предотвращающий белок), M1, GAS179 (предполагаемая эстераза), GAS97 (гомолог предшественника иммуногенного секретируемого белка), GAS193 (предшественник неимуногенного секретируемого белка). Группа 2 включала 5 различных M-белков (M12, M23, M2, M3 и M9), GAS57 (предполагаемая протеинкиназа клеточной оболочки), GAS380 (гипотетический белок) и SpeI.

Кроме того, как показано на фигуре 4, этот кластерный анализ распределял сыворотки от высокой реакционноспособности (слева) до меньшей реакционноспособности (справа). Фактически, можно различить две основные группы сывороток, группу с высокой реакционноспособностью, в основном включающую сыворотки, полученные у здоровых доноров (A слева на фигуре 4), и вторую группу, демонстрирующую меньшую реакционноспособность и включающую в основном сыворотки, полученные у пациентов с RHD (группа B на фигуре 4).

Затем авторы применяли кластерный анализ K-средних для классификации антигенов GAS, присутствующих на чипе по 10 кластерам (KA1-KA10 на фигуре 5), вызывающих сходные профили распознавания. Кластеризация k-средних представляет собой статистический способ, предназначенный для разбиения n наблюдений на k кластеров в которых каждое наблюдение принадлежит к кластеру с ближайшим средним. Он сходен с алгоритмом максимизации ожидаемого правдоподобия для смеси гауссиан в том, что они оба пытаются отыскать центры природных кластеров в данных.

Как показано на фигуре 5, четыре из идентифицированных кластеров антигенов (номера KA 1, KA 5, KA 9, KA 10) содержали антигены с более высокими значениями флуоресценции, чем оставшиеся кластеры. Представляет интерес, что даже несмотря на то, что кластеризация была одномерной, т.е. предназначенной для классификации антигенов, а не для классификации сывороток, авторы выявили, что в кластере KA 1 наиболее реакционноспособные сыворотки содержали большое количество YHD. Это наблюдение позволило предположить наличие на чипе группы антигенов, реакционноспособность которых обеспечивает установление различий между сыворотками, получаемыми у здоровых доноров, и сыворотками, получаемыми у пациентов с RHD

Затем авторы попробовали более точно определить группу антигенов, позволяющих им различать здоровых индивидуумов и пациентов с кардиопатией. Для этой цели сыворотки дополнительно классифицировали на основе их профилей распознавания по различным группам антигенов с использованием одномерного иерархического кластерного анализа.

Этот тип анализа впервые применяли к группе антигенов, включенных в кластер KA1 на фигуре 5, что позволило на первом иерархическом уровне определить два кластера сывороток, HS1 и HS2, соответствующих фиолетовой (HS1) и синей (HS2) рамкам на фигуре 6A. Количества сывороток, полученных у здоровых индивидуумов, и сывороток, полученных у пациентов, присутствующие или отсутствующие в каждом из двух кластеров, приведены на фигуре 6B. Как представлено, большинство YHD можно найти в кластере с высокой реакционноспособностью, синий, кластер HS2, тогда как большинство сывороток RHD находятся в кластере с низкой реакционноспособностью, фиолетовый, кластер HS1. Возможность установить отличия между двумя группами сывороток с использованием теста определяли по специфичности и чувствительности. На фигуре 6C представлен идеальный теоретический пример максимума специфичности и чувствительности (значения 1). Как представлено, для данной конкретной группы антигенов авторы получили значения специфичности и чувствительности 0,73 и 0,69.

Тот же тип анализа применяли для антигенов в кластерах KA5, KA9, KA10 и KA5+M9. Тот же тип анализа также применяли для других групп антигенов, включающих GAS5+GAS5F+GAS25+GAS40, GAS5+GAS5F+GAS25+GAS40+GAS57, GAS5+GAS25+GAS40+GAS57, GAS5F+GAS25+GAS40+GAS57. Результаты обобщены на фигуре 7A-I.

Как представлено, кластер, обеспечивающий наибольшие значения специфичности и чувствительности, включал антигены кластера KA1 (GAS5, GAS40, GAS5F, GAS57, GAS97, GAS380 и SpeA) и антигены GAS5, GAS25, GAS40 и GAS57, тогда как наименьшие значения получали для кластера, включающего варианты M GAS.

ОБСУЖДЕНИЕ

Авторы полагают, что этот тип анализа с использованием антигенов GAS5, GAS25, GAS40 и GAS57 может обеспечивать основу для более точной диагностики RHD и позволяет предсказывать вероятность развития RHD у пациента с ARF, таким образом, обеспечивая медицинским специалистам руководство в принятии решения о лучшей профилактической терапии пациентов с ARF.

ССЫЛКИ

Группа изобретений относится к медицине и касается способа лечения или профилактики RHD, связанного с инфекцией GAS, включающего введение пациенту по меньшей мере одного антигена GAS, выбранного из группы, включающей аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 или их функциональные эквиваленты. Группа изобретений также касается способа диагностики RHD, связанного с инфекцией GAS, у пациента; белкового чипа для диагностики RHD, связанного с инфекцией GAS, у пациента; набора, содержащего указанный белковый чип и инструкции для применения в диагностике пациентов с наличием или с риском развития ревматического порока сердца, связанного с инфекцией GAS. Группа изобретений обеспечивает лечение RHD, связанного с инфекцией GAS; точную диагностику RHD. 6 н. и 7 з.п. ф-лы, 7 ил., 1 табл., 1 пр.

1. Способ лечения или профилактики RHD, связанного с инфекцией GAS, включающий введение пациенту по меньшей мере одного антигена GAS, выбранного из группы, включающей аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 или их функциональные эквиваленты.

2. Применение по меньшей мере одного антигена GAS, выбранного из группы, включающей аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8, или его функционального эквивалента для лечения или профилактики RHD, связанного с инфекцией GAS.

3. Способ диагностики ревматического порока сердца (RHD), связанного с инфекцией GAS, у пациента, где указанный способ включает стадии:
а) приведения биологического образца, взятого у пациента, в контакт по меньшей мере с одним антигеном GAS, выбранным из группы, включающей аминокислотные последовательности
SEQ ID NO: 1 (GAS5),
SEQ ID NO: 2 (GAS5F),
SEQ ID NO: 3 (GAS25),
SEQ ID NO: 4 (GAS40),
SEQ ID NO: 5 (GAS57),
SEQ ID NO: 6 (GAS97),
SEQ ID NO: 7 (GAS380) и
SEQ ID NO: 8 (SpeA),
или их функциональными эквивалентами в условиях, подходящих для связывания любых антител, присутствующих в биологическом образце, по меньшей мере с одним антигеном GAS или с его функциональными эквивалентами; и
b) сравнения реакционноспособности антител в биологическом образце, взятом у пациента, по меньшей мере в отношении одного антигена GAS с реакционноспособностью антител в контрольном биологическом образце, взятом у здорового индивидуума, по меньшей мере в отношении одного антигена GAS,
где меньшая реакционноспособность в биологическом образце, взятом у пациента, по сравнению с контрольным биологическим образцом, взятым у здорового индивидуума, указывает на то, что пациент страдает ревматическим пороком сердца (RHD), связанным с инфекцией GAS, или что у пациента существует риск развития RHD, связанного с инфекцией GAS.

4. Способ идентификации пациента с риском развития RHD, связанного с инфекцией GAS, где указанный способ включает стадии:
а) приведения биологического образца, взятого у пациента, в контакт по меньшей мере с одним антигеном GAS, выбранным из группы, включающей аминокислотные последовательности
SEQ ID NO: 1 (GAS5),
SEQ ID NO: 2 (GAS5F),
SEQ ID NO: 3 (GAS25),
SEQ ID NO: 4 (GAS40),
SEQ ID NO: 5 (GAS57),
SEQ ID NO: 6 (GAS97),
SEQ ID NO: 7 (GAS380) и
SEQ ID NO: 8 (SpeA),
или их функциональными эквивалентами в условиях, подходящих для связывания любых антител, присутствующих в биологическом образце, по меньшей мере с одним антигеном GAS или с его функциональными эквивалентами; и
b) сравнения реакционноспособности антител в биологическом образце, взятом у пациента, по меньшей мере в отношении одного антигена GAS с реакционноспособностью антител в контрольном биологическом образце, взятом у здорового индивидуума, по меньшей мере в отношении одного антигена GAS,
где меньшая реакционноспособность в биологическом образце, взятом у пациента, по сравнению с контрольным биологическим образцом, взятым у здорового индивидуума, указывает на то, что пациент страдает ревматическим пороком сердца (RHD), связанным с инфекцией GAS, или что у пациента существует риск развития RHD, связанного с инфекцией GAS.

5. Способ по п. 3 или 4, где стадия а) включает приведение образца в контакт с 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 из антигенов GAS, содержащих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 или их функциональные эквиваленты.

6. Способ по п. 3 или 4, где стадия а) включает приведение образца в контакт с 3 антигенами GAS, содержащими аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1, 2 и 3; SEQ ID NO: 1, 3 и 4; SEQ ID NO: 1, 4 и 5; SEQ ID NO: 2, 3 и 4; SEQ ID NO: 2, 4 и 5 или SEQ ID NO: 3, 4 и 5 или их функциональные эквиваленты.

7. Способ по п. 3 или 4, где стадия а) включает приведение образца в контакт с 4 антигенами GAS, содержащими аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1, 2, 3 и 4; или SEQ ID NO: 2, 3, 4 и 5; SEQ ID NO: 1, 3, 4 и 5 или их функциональные эквиваленты.

8. Способ по п. 3 или 4, где стадия а) включает приведение образца в контакт с 5 антигенами GAS, содержащими аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 и 5.

9. Способ по п. 3 или 4, где биологический образец представляет собой образец сыворотки.

10. Способ по п. 3 или 4, где биологический образец берут у подростка или у ребенка.

11. Способ по п. 3 или 4, где антигены GAS представлены на одном или нескольких белковых чипах.

12. Белковый чип для диагностики ревматического порока сердца (RHD), связанного с инфекцией GAS, у пациента, содержащий по меньшей мере два антигена GAS с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 8, или их функциональные эквиваленты.

13. Набор, содержащий белковый чип по п. 12 и инструкции для применения в диагностике пациентов с наличием или с риском развития ревматического порока сердца, связанного с инфекцией GAS.