ВАКЦИНЫ И КОМПОЗИЦИИ ПРОТИВ STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE Российский патент 2017 года по МПК A61K39/09 C07K14/315 A61P31/04 

Родственная заявка

Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании даты подачи предварительной заявки на патент США №61/434818, поданной 20 января 2011 года. Полное содержание упомянутой заявки прямо включено в данный документ посредством ссылки.

Государственная поддержка

Настоящая работа была выполнена при государственной поддержке гранта AI066013, выданного Национальным Институтом Здоровья. Таким образом, правительство США обладает определенными правами на настоящее изобретение.

I. Предпосылки изобретения

Пневмококковая инфекция продолжает быть ведущей причиной заболеваемости и смертности в Соединенных Штатах и по всему миру. Ежегодно миллионы случаев пневмонии, менингита, бактериемии и среднего отита объясняются инфицированием патогенным Streptococcus pneumoniae. S.pneumoniae представляет собой грам-положительный инкапсулированный кокк, который колонизирует носоглотку у приблизительно 5-10% здоровых взрослых и 20-40% здоровых детей. Нормальная колонизация становится инфекционной, когда S.pneumoniae переносится в евстахиевы трубы, носовые синусы, легкие, кровоток, оболочки головного мозга, суставные щели, кости и брюшную полость. S.pneumoniae имеет несколько факторов вирулентности, которые позволяют этому организму обойти иммунную систему. Примеры включают полисахаридную капсулу, которая предотвращает фагоцитоз иммунными клетками хозяина, протеазы, которые подавляют комплемент-опосредованную опсонизацию, и белки, вызывающие лизис клеток хозяина. Наличие сложных полисахаридов в полисахаридной капсуле является основой для подразделения пневмококков на различные серотипы. На настоящий момент было идентифицировано 93 серотипа S.pneumoniae.

Различные фармацевтические композиции были использованы для приспособления иммунного ответа против инфицирования S.pneumoniae. Поливалентная пневмококковая вакцина PPV-23 была разработана для профилактики пневмонии и других инфекционных заболеваний, связанных с S.pneumoniae, у взрослой и пожилой групп населения. Вакцина содержит капсульные полисахариды (CP) от 23 серотипов S.pneumoniae. Будучи антигенами, независимыми от T-клеток, эти CP вызывают только кратковременное образование антител, что делает необходимым повторные дозы, которые увеличивают риск иммунологической толерантности. Антитела, индуцируемые против S.pneumoniae, названные антителами к капсуле, распознаются как защитные у взрослых и иммунокомпетентных индивидуумов. Однако у детей до 2 лет и индивидуумов с ослабленным иммунитетом, в том числе пожилых, реакция на антигены, независимые от T-клеток, не развивается, и, следовательно, PPV-23 не обеспечивает их оптимальную защиту. Другая вакцина против S.pneumoniae, Prevnar, включает бактериальные полисахариды от 7 штаммов S.pneumoniae, конъюгированные с белком дифтерийного анатоксина. Эта вакцина вызывает как B-, так и T-клеточные ответы. Однако, поскольку она защищает только от 7 серотипов пневмококков, замещение серотипа может сделать Prevnar неэффективной. Замещение серотипов уже было показано в нескольких клинических испытаниях и эпидемиологических исследованиях, что приводит к необходимости разработки отличающихся составов этих вакцин. Примером является представленный недавно Prevnar 13, направленный на 13 серотипов пневмококка. При этом, эти два состава Prevnar требуют больших затрат при производстве, что существенно ограничивает их доступность для развивающихся стран. PPV-23, которая состоит из 23 очищенных, но неконъюгированных полисахаридов, имеет более широкий охват, но не обеспечивает защиту детям до 2 лет, группе населения с наибольшим риском пневмококковой инфекции.

Таким образом, остается потребность в разработке более эффективных фармацевтических композиций, чем предлагают существующие стратегии. В частности, в такие композиции необходимо включать новые или специфичные антигены, которые вызывают иммунный ответ против S.pneumoniae.

II. Краткое описание

Streptococcus pneumoniae представляет собой основную проблему здравоохранения, особенно в отношении очень молодых, пожилых или пациентов с ослабленным иммунитетом. Хотя информация о ДНК и белковых последовательностях S.pneumoniae была известна уже некоторое время, и исследователи длительное время пытались получить вакцины против S.pneumoniae, главную проблему составляла идентификация защитных полипептидов среди приблизительно 2100 генов в геноме S.pneumoniae. Настоящая заявка представляет результаты полногеномного скрининга, разработанного для выявления наиболее иммуногенных белков в геноме S.pneumoniae. Было показано на мышиной модели, что некоторые «хиты» на основании скрининга защищают от колонизации S.pneumoniae и, в некоторых случаях, как от колонизации, так и от сепсиса, вызванного S.pneumoniae. Таким образом, настоящее раскрытие предусматривает, inter alia, определенные высокоэффективные вакцины против Streptococcus pneumoniae. Данные вакцины можно использовать терапевтически или профилактически. Настоящее раскрытие также предусматривает специфичные антигены и способы применения антигенов, чтобы вызвать иммунный ответ против S.pneumoniae.

В определенных аспектах настоящее раскрытие предусматривает вакцинный состав, содержащий фармацевтически приемлемый носитель и полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, содержащую (или состоящую из) SEQ ID NO: 265 или 268 или ее иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления полипептид содержит экзогенную сигнальную последовательность. Например, полипептид может иметь аминокислотную последовательность, содержащую SEQ ID NO: 266 или ее иммуногенный фрагмент. Полипептид может иметь аминокислотную последовательность, состоящую из SEQ ID NO: 265, 266 или 268.

В некоторых вариантах осуществления вакцинный состав дополнительно содержит первый полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, содержащую (или состоящую из) одну из SEQ ID NO: 1-23, 267 и 269-270 или ее иммуногенный фрагмент. В определенных вариантах осуществления вакцинный состав дополнительно содержит второй полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, содержащую любую из SEQ ID NO: 1-23, 267 и 269-270 или ее иммуногенный фрагмент.

В определенных вариантах осуществления первый и второй полипептиды принадлежат к различным группам (i)-(vi): (i) SEQ ID NO: 1 или ее иммуногенный фрагмент, (ii) одна из SEQ ID NO: 2-5 и 14-17 или ее иммуногенный фрагмент, (iii) одна из SEQ ID NO: 6-7 и 18-19 или ее иммуногенный фрагмент, (iv) SEQ ID NO: 8 или ее иммуногенный фрагмент, (v) одна из SEQ ID NO: 9-10 и 20-21 или ее иммуногенный фрагмент, и (vi) одна из SEQ ID NO: 11-13, 267 и 269-270 или ее иммуногенный фрагмент.

В некоторых таких вариантах осуществления вакцинный состав содержит полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, содержащую SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10. В некоторых вариантах осуществления вакцинный состав содержит полипептид, состоящий из SEQ ID NO: 6 или 7, и полипептид, состоящий из SEQ ID NO: 9 или 10.

В любом из аспектов или вариантов осуществления в данном документе вакцинный состав может содержать полипептид с SEQ ID NQ: 265, 266 или 268, который представляет собой усеченный фрагмент с удалением 1-20 аминокислотных остатков с N-конца, C-конца или обоих. В некоторых вариантах осуществления вакцинный состав практически не содержит других полипептидов S.pneumoniae, кроме полипептидов, имеющих аминокислотную последовательность, содержащую любую из SEQ ID NO: 1-21 и 265-270.

В определенных вариантах осуществления вакцинный состав содержит один или несколько полипептидов, имеющих аминокислотную последовательность, содержащую SEQ ID NO: 22 или 23 или ее иммуногенный фрагмент.

В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает вакцинные составы, содержащие известный антиген S.pneumoniae, такой как пневмолизоид, холин-связывающий белок A (CbpA) или пневмококковый поверхностный белок A (PspA), или их производные, а также один, два или три полипептида из таблицы 1 или таблицы 2. Иллюстративный вакцинный состав содержит: (i) полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, содержащую (или состоящую из) одну или несколько из SEQ ID NO: 1-23 и 265-270 или ее иммуногенный фрагмент, (ii) пневмолизоид и (iii) фармацевтически приемлемый носитель. Дополнительный иллюстративный вакцинный состав содержит: (i) полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, содержащую (или состоящую из) одну или несколько из SEQ ID NO: 1-23 и 265-270 или ее иммуногенный фрагмент, (ii) CbpA или его производное и (iii) фармацевтически приемлемый носитель. Дополнительный иллюстративный вакцинный состав содержит: (i) полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, содержащую (или состоящую из) одну или несколько из SEQ ID NO: 1-23 и 265-270 или ее иммуногенный фрагмент, (ii) PspA или его производное и (iii) фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых таких вариантах осуществления полипептид (i) содержит любую из SEQ ID NO: 2-5, 6, 7, 9-13 и 265-267. В некоторых вариантах осуществления вакцинный состав дополнительно содержит второй полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, содержащую одну из SEQ ID NO: 1-23 и 265-270. В некоторых вариантах осуществления пневмолизоид представляет собой PdT, Pd-A, Pd-B, rPd2, rPd3, Ply8, Δ6PLY, L460D (см., например, патентный документ US 2009/0285846 и L. Mitchell, Protective Immune Responses to Streptococcus pneumoniae Pneumolysoids, ASM2011 conference abstract, 2011) или их вариант. В некоторых вариантах осуществления производное PspA содержит весь или фрагмент пролин-богатого участка PspA.

В определенных вариантах осуществления полипептид конъюгирован с иммуногенным носителем. В некоторых вариантах осуществления вакцинный состав содержит по меньшей мере один липидированный полипептид.

В некоторых вариантах осуществления вакцинный состав дополнительно содержит конъюгированные полисахариды S.pneumoniae. Конъюгированные полисахариды могут представлять собой, например, описываемые в патенте США №5623057, патенте США №5371197 или в патентном документе PCT/US 2011/023526.

В некоторых вариантах осуществления вакцинный состав дополнительно содержит адъювант. Адъювант может представлять собой, например, агонист толл-подобных рецепторов (TLR). Адъювант может представлять собой, например, квасцы. В некоторых вариантах осуществления вакцинный состав содержит 1-1000 мкг каждого полипептида и 1-250 мкг адъюванта.

В определенных вариантах осуществления вакцинный состав вызывает Т_Н17-клеточный ответ по меньшей мере в 1,5 раза больший, чем вызванный контрольным неродственным антигеном после контакта с Т_Н17-клетками. В некоторых вариантах осуществления вакцинный состав подавляет инфицирование S.pneumoniae у неинфицированного субъекта. В определенных вариантах осуществления вакцинный состав подавляет колонизацию S.pneumoniae у индивидуума. В некоторых вариантах осуществления вакцинный состав подавляет симптомы или осложнения, вызванные S.pneumoniae. Например, вакцинный состав подавляет сепсис, вызванный S.pneumoniae.

В определенных аспектах настоящее раскрытие предусматривает способ лечения субъекта, страдающего от инфекции S.pneumoniae или восприимчивого к ней, включающий введение эффективного количества любого из вакцинных составов, описанных в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления при помощи способа препятствуют инфицированию S.pneumoniae неинфицированного субъекта. В некоторых вариантах осуществления при помощи способа подавляют колонизацию S.pneumoniae у субъекта. В некоторых вариантах осуществления при помощи способа подавляют симптомы или осложнения, вызванные S.pneumoniae. Иллюстративным осложнением является сепсис.

В определенных вариантах осуществления способа субъекта лечат одной дозой. В других вариантах осуществления способа субъекта лечат двумя или тремя дозами. В некоторых вариантах осуществления способа субъекта лечат тремя дозами.

В определенных вариантах осуществления субъект является человеком.

Настоящее раскрытие предусматривает, например, вакцинный состав, содержащий фармацевтически приемлемый носитель и один или несколько полипептидов, имеющих аминокислотную последовательность, содержащую любую из SEQ ID NO: 1-13, 265, 266 и 267 или ее иммуногенный фрагмент.

Настоящее раскрытие также предусматривает вакцинный состав, содержащий фармацевтически приемлемый носитель и по меньшей мере один полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, содержащую SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 265 или ее иммуногенный фрагмент. Настоящее раскрытие дополнительно предусматривает вакцинный состав, содержащий фармацевтически приемлемый носитель и по меньшей мере один полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, состоящую из SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 265 или ее иммуногенный фрагмент.

Кроме того, настоящая заявка предусматривает вакцинный состав, содержащий фармацевтически приемлемый носитель и один или несколько полипептидов, имеющих аминокислотную последовательность, содержащую любую из SEQ ID NO: 14-23, 268, 269 и 270 или ее иммуногенный фрагмент.

Настоящее раскрытие дополнительно предусматривает иммуногенную композицию, содержащую фармацевтически приемлемый носитель и два или более полипептида, имеющих аминокислотные последовательности, содержащие любую из SEQ ID NO: 1-13, 265, 266 и 267 или ее иммуногенный фрагмент.

Настоящее раскрытие также предусматривает вакцинный состав, содержащий фармацевтически приемлемый носитель и два или более полипептида, имеющих аминокислотные последовательности, содержащие SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 265 или ее иммуногенный фрагмент. Настоящее раскрытие дополнительно предусматривает вакцинный состав, содержащий фармацевтически приемлемый носитель и два или более полипептида, имеющих аминокислотные последовательности, состоящие из SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 265 или их иммуногенного фрагмента. Настоящее раскрытие также предусматривает вакцинный состав, содержащий фармацевтически приемлемый носитель и два или более полипептида, имеющих аминокислотные последовательности, содержащие SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 265 или ее иммуногенный фрагмент. Кроме того, настоящее раскрытие предусматривает вакцинный состав, содержащий фармацевтически приемлемый носитель и два или более полипептида, имеющих аминокислотные последовательности, содержащие SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 265 или ее иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность, содержащая SEQ ID NO: 265, содержит экзогенную сигнальную последовательность.

Настоящее раскрытие также предусматривает вакцинный состав, содержащий фармацевтически приемлемый носитель и три или более полипептида, имеющих аминокислотные последовательности, содержащие SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 265, соответственно, или ее иммуногенный фрагмент. Настоящее раскрытие дополнительно предусматривает вакцинный состав, содержащий фармацевтически приемлемый носитель и три или более полипептида, имеющих аминокислотные последовательности, состоящие из SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 265, соответственно, или их иммуногенного фрагмента.

III. Краткое описание графических материалов

На ФИГ.1 показана концентрация IL-17 на основании образцов крови от мышей, которых иммунизировали указанным белком(ами) и адъювантом, холерным энтеротоксином, которые затем стимулировали убитыми неинкапсулированными цельноклеточными S.pneumoniae, как описано в примере 5. На левой панели показаны данные в формате диаграммы рассеивания, а на правой панели показано среднее арифметическое и стандартное отклонение для каждого образца. Группа иммунизации "All 3" представляет животных, иммунизированных комбинацией SP2108, SP0148 и SP1634.

На ФИГ.2 показана концентрация IL-17 на основании образцов крови от мышей, которых иммунизировали указанным белком(ами) и адъювантом, холерным энтеротоксином, которые затем стимулировали комбинацией трех белков (SP2108, SP0148 и SP1634), как описано в примере 5.

На ФИГ.3 показано число колоний S.pneumoniae, полученных из носового смыва у мышей, которых иммунизировали указанным белком(ами) и адъювантом, холерным энтеротоксином, затем проводили их контрольное заражение путем интраназального введения S.pneumoniae, как описано в примере 5. 003 представляет собой контрольный неродственный антиген.

На ФИГ.4 показана концентрация IL-17 на основании образцов крови от мышей, которых иммунизировали указанным белком(ами) и адъювантом, холерным энтеротоксином, которые затем стимулировали убитыми неинкапсулированными цельноклеточными S.pneumoniae, как описано в примере 6.

На ФИГ.5 показана концентрация IL-17 на основании образцов крови от мышей, которых иммунизировали указанным белком(ами) и адъювантом, холерным энтеротоксином, которые затем стимулировали указанным белком(ами), как описано в примере 6.

На ФИГ.6 показано количество колоний S.pneumoniae, полученных из носового смыва у мышей, которых иммунизировали указанным белком(ами) и адъювантом, холерным энтеротоксином, затем проводили их контрольное заражение посредством интраназального введения S.pneumoniae, как описано в примере 6. Белок ICP47 от HSV-2 с названием гена US 12 (NP_044543.1, NC_001798.1; показан на фигуре как 003) и овальбумин (OVA) представляют собой контрольные антигены.

На ФИГ.7 показано число колоний S.pneumoniae, полученных из носового смыва у мышей, которых иммунизировали указанным белком(ами) и адъювантом, холерным энтеротоксином, затем проводили их контрольное заражение путем интраназального введения S.pneumoniae, как описано в примере 7.

На ФИГ.8 показано число колоний S.pneumoniae, полученных из носового смыва у мышей BALB/c, которых иммунизировали указанным белком(ами) и адъювантом, холерным энтеротоксином, затем проводили их контрольное заражение путем интраназального введения S.pneumoniae, как описано в примере 8.

На ФИГ.9 показана концентрация IL-17A на основании образцов крови от мышей, которых иммунизировали указанными белками и адъювантом, холерным энтеротоксином, которые затем стимулировали белком иммунизации (левая панель) или убитыми неинкапсулированными цельноклеточными S.pneumoniae (правая панель), как описано в примере 9.

На ФИГ 10. показано число колоний S.pneumoniae, полученных из носового смыва у мышей, которых иммунизировали указанными белками и адъювантом, холерным энтеротоксином, затем проводили их контрольное заражение путем интраназального введения S.pneumoniae, как описано в примере 10.

На ФИГ.11 показана выживаемость мышей, которых иммунизировали указанными белками и адъювантом, квасцами, затем подвергли аспирационному контрольному заражению S.pneumoniae, как описано в примере 11.

На ФИГ.12 показана выживаемость мышей, которых иммунизировали указанными белками и адъювантом, квасцами, затем подвергли аспирационному контрольному заражению S.pneumoniae, как описано в примере 12.

На ФИГ.13 показано число колоний S.pneumoniae, полученных из носового смыва у мышей, которых иммунизировали указанными белками и адъювантом, холерным энтеротоксином, затем проводили их контрольное заражение путем интраназального введения S.pneumoniae, как описано в примере 13.

На ФИГ.14 показана концентрация IL-17A на основании образцов крови от мышей, которых иммунизировали указанными белками и квасцами, которые затем стимулировали белками, указанными вверху слева, как описано в примере 14.

На ФИГ.15 показано число колоний S.pneumoniae, полученных из носового смыва у мышей, которых иммунизировали указанными белками и квасцами или убитыми неинкапсулированными цельноклеточными S.pneumoniae плюс квасцы (WCV), затем проводили контрольное заражение путем интраназального введения S.pneumoniae, как описано в примере 15.

На ФИГ.16 показано число колоний S.pneumoniae, полученных из носового смыва у мышей, которых иммунизировали указанными белками и квасцами или убитыми неинкапсулированными цельноклеточными S.pneumoniae плюс квасцы (WCV), затем проводили их контрольное заражение путем интраназального введения S.pneumoniae в двух объединенных исследованиях, как описано в примере 16.

На ФИГ.17 показано число колоний S.pneumoniae, полученных из носового смыва у мышей, которых иммунизировали указанными белками и квасцами или убитыми неинкапсулированными цельноклеточными S.pneumoniae плюс квасцы (WCB), затем проводили их контрольное заражение путем интраназального введения S.pneumoniae, как описано в примере 17.

На ФИГ.18 показана выживаемость мышей, которым инъецировали антитела или сыворотки, специфичные к указанным белкам, затем их подвергали аспирационному контрольному заражению S.pneumoniae, как описано в примере 18.

На ФИГ.19 показан процент животных, защищенных от сепсиса в шести отдельных исследованиях аспирационного контрольного заражения, два из которых описаны более подробно в примерах 12 и 18.

IV. Подробное описание

A. Специфичные полипептиды и нуклеиновые кислоты для применения в вакцинах и иммуногенных композициях против S.pneumoniae

Настоящая заявка описывает вакцины против S.pneumoniae, которые включают один или несколько полипептидов или генов, перечисленных в таблице 1, или их варианты или фрагменты, как описано ниже. Вакцина может включать полипептид, который содержит последовательность из таблицы 1 или ее вариант или иммуногенный фрагмент, или полипептид, который состоит из последовательности из таблицы 1 или ее варианта или иммуногенного фрагмента. Последовательность ДНК и белка для каждого гена и полипептида можно найти с помощью поиска по Обозначению локуса в находящейся в свободном доступе базе данных Entrez Gene (на веб-сайте NCBI NIH во Всемирной паутине, www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=gene), в геноме Streptococcus pneumoniae TIGR4, и указанные последовательности также включены в настоящую заявку.

Определенные полипептиды из таблицы 1 и их варианты описываются подробнее ниже.

1. SP1912 (SEQ ID NO: 265) и ее варианты

SP1912 представляет собой гипотетический белок из 99 аминокислот. Хотя функция белка окончательно не установлена, анализ последовательности позволяет предположить, что это предполагаемый тиоредоксин.

В некоторых вариантах осуществления вакцины или фармацевтические композиции, содержащие полипептид S.pneumoniae, содержат полипептид, содержащий по меньшей мере 20 последовательных аминокислотных остатков, выбранных из SP1912. Полипептид также может представлять собой вариант фрагмента по меньшей мере из 20 остатков. В определенных вариантах осуществления полипептид включает не более 90, 75, 60, 45 или 30 последовательных аминокислот из SP1912.

В некоторых вариантах осуществления композиции и способы в данном документе предусматривают применение варианта SP1912, который содержит экзогенную последовательность для липидизации. В некоторых вариантах осуществления липидизацией управляет сигнальная последовательность. Таким образом, сигнальная последовательность для липидизации может представлять собой, например, сигнальную последовательностью из SP2108 (SEQ ID NO: 275) или SP0148, или сигнальную последовательностью Е.coli. Иллюстративный вариант SP1912L, содержащий сигнальную последовательность гена RlpB Е.coli (SEQ ID NO: 276), представлен полипептидной последовательностью SEQ ID NO: 266. SP1912 (SEQ ID NO: 265) и SP1912L (SEQ ID NO: 266) могут кодироваться, соответственно, нуклеиновыми кислотами согласно SEQ ID NO: 271 и 272, хотя, вследствие вырожденности генетического кода, могут использоваться другие последовательности ДНК (включая кодон-оптимизированные последовательности).

Консенсусные последовательности, иллюстрирующие комбинации последовательностей SP1912 от различных серотипов, представлены как SEQ ID NO: 268. Таким образом, в определенных вариантах осуществления вакцинный состав содержит полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 268 или ее иммуногенного фрагмента (например, вместо полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, содержащую SEQ ID NO: 265).

2. SP0024 (SEQ ID NO: 1) и ее варианты

SP0024 представляет собой гипотетический белок из 165 аминокислот, содержащий консервативный домен карбоангидразы, который тянется от аминокислоты 27 до аминокислоты 163. Исходя из этого консенсусного мотива, SP0024 может представлять собой цинк-связывающий белок.

В некоторых вариантах осуществления вакцины или фармацевтические композиции, содержащие полипептид S.pneumoniae, содержат полипептид, содержащий по меньшей мере 20 последовательных аминокислотных остатков, выбранных из SP0024. Полипептид также может представлять собой вариант фрагмента по меньшей мере из 20 остатков. В определенных вариантах осуществления полипептид включает не более 150, 125 или 100 последовательных аминокислот из SP0024.

3. SP0882 (SEQ ID NO: 2) и ее варианты

SP0882 представляет собой консервативный гипотетический белок из 274 аминокислот. Большая часть белка (аминокислоты 2-270) образует эстеразо- или липазоподобный участок.

В некоторых вариантах осуществления вакцины или фармацевтические композиции, содержащие полипептид S.pneumoniae, содержат полипептид, содержащий по меньшей мере, 20 последовательных аминокислотных остатков, выбранных из SP0882. Полипептид также может представлять собой вариант фрагмента по меньшей мере из 20 остатков. В определенных вариантах осуществления полипептид включает не более 250, 275, 200, 175, 150, 125 или 100 последовательных аминокислот из SP0882.

Один конкретный усеченный вариант, названный SP0882N, состоит из 130 аминокислот N-конца SP0882 и показан как SEQ ID NO: 3. SP0882N включает участок, который чрезвычайно консервативен среди различных серотипов. В определенных вариантах осуществления полипептид, содержащий SP0882 или SP0882N или иммуногенный фрагмент любой из них, также содержит экзогенную сигнальную последовательность. В некоторых вариантах осуществления сигнальная последовательность является сигнальной последовательностью Е.coli или S.pneumoniae. Сигнальная последовательность может представлять собой, например, сигнальную последовательность из SP2108. Двумя примерами таких полипептидов являются SEQ ID NO: 4 и 5.

Варианты последовательностей ДНК и белка для SP0882 описаны, inter alia, в публикации заявки на патент США №2009/0215149 и в международных заявках WO 2002/077021, WO 98/18931 и WO 2007/106407. Вариант SP0882N раскрывается в международной заявке WO 2008/146164.

Между различными серотипами S.pneumoniae существует изменчивость последовательности на уровне белка, и консенсусные последовательности, иллюстрирующие комбинации последовательностей SP0882 от различных серотипов S.pneumoniae, представлены как SEQ ID NO: 14-17. В соответствии с этим, в определенных вариантах осуществления вакцинный состав содержит полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, содержащую или состоящую из любой из SEQ ID NO: 14-17 или их иммуногенного фрагмента (например, вместо полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, содержащую одну из SEQ ID NO: 2-5).

Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие различные варианты SP0882 (SEQ ID NO: 2-5), представлены как SEQ ID NO: 24-26, хотя из-за вырожденности генетического кода другие последовательности ДНК (включая кодон-оптимизированные последовательности) могут кодировать эти полипептиды.

4. SP0148 (SEQ ID NO: 7) и ее варианты

Белок SP0148 называется "ABC-транспортер, субстрат-связывающий белок". Белки этого класса, как правило, являются внеклеточными белками, которые временно взаимодействуют с трансмембранным белковым комплексом. Такие комплексы используют энергию, вырабатываемую при гидролизе АТФ, для перемещения специфических субстратов через клеточную мембрану. SP0148 представляет собой белок из 276 или 277 (в зависимости от изолята) аминокислот, который содержит консервативный домен PBPb (периплазматический связывающий белок), охватывающий аминокислоты 40-246 и типичный для мембраносвязанных транспортных комплексов. Кроме того, SP0148 содержит домен бактериальных внеклеточных белков, связывающих растворенное вещество, семейства 3, который в значительной степени совпадает с доменом PBPb и продолжается от аминокислоты 40 до 244. В некоторых вариантах осуществления вакцина или другая композиция содержит усеченный мутант SP0148, содержащий или не содержащий один или нескольких из указанных доменов и мотивов.

В некоторых вариантах осуществления вакцины или фармацевтические композиции, содержащие полипептид S.pneumoniae, содержат полипептид, содержащий по меньшей мере 20 последовательных аминокислотных остатков, выбранных из SP0148. Полипептид также может представлять собой вариант фрагмента по меньшей мере из 20 остатков. В определенных вариантах осуществления полипептид включает не более 250, 275, 200, 175, 150, 125 или 100 последовательных аминокислот из SP0148.

Эндогенный SP0148 содержит сигнальную последовательность, которая управляет его секрецией и потенциальной липидизацией. В некоторых вариантах осуществления сигнальная последовательность полипептида SEQ ID NO: 7 частично или полностью подвергается процессингу в экспрессирующем хозяине, например, Е.coli. В некоторых вариантах осуществления используется вариант SP0148, который не имеет сигнальной последовательности (SEQ ID NO: 6). Полипептид SEQ ID NO: 6 кодируется нуклеиновой кислотой SEQ ID NO: 27, хотя могут использоваться другие последовательности нуклеиновых кислот (включая кодон-оптимизированные последовательности). SEQ ID NO: 28 кодирует последовательность SP0148 полной длины, использованную в скринингах в данном документе.

Варианты аминокислотной последовательности и нуклеотидной последовательности SP0148 можно найти в публикации заявки на патент США №2005/0020813, патентах США №№7378514 и 7504110, и в заявках на европейский патент №№ EP 1572868 и EP 1855717.

Консенсусные последовательности, иллюстрирующие комбинации последовательностей SP0148 от различных серотипов S.pneumoniae, представлены как SEQ ID NO: 18 и 19. В соответствии с этим, в определенных вариантах осуществления вакцинный состав содержит полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, содержащую или состоящую либо из SEQ ID NO: 18-19, либо из их иммуногенного фрагмента (например, вместо полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, содержащую одну из SEQ ID NO: 6 или 7).

5. SP1072 (SEQ ID NO: 8) и ее варианты

SP1072, также известный как dnaG, представляет собой фермент ДНК-праймазу, катализирующий образование РНК-праймера, дающего возможность ДНК-полимеразе инициировать репликацию ДНК. SP1072, белок из 586 аминокислот, содержит несколько консервативных мотивов. Начиная от N-конца, аминокислоты 2-96 формируют домен «цинковый палец», каталитическое ядро ДНК-праймазы охватывает аминокислоты 122-250 и высоко консервативный участок нуклеотидилтрансферазного/гидролазного домена топоизомеразы-праймазы (TORPIM) продолжается от аминокислоты 258 до 330. В некоторых вариантах осуществления вакцина или другая композиция содержит усеченный мутант SP1072, содержащий или не содержащий одного или нескольких из указанных доменов и мотивов.

В некоторых вариантах осуществления вакцины или фармацевтические композиции, содержащие полипептид S.pneumoniae, содержат полипептид, содержащий по меньшей мере 20 последовательных аминокислотных остатков, выбранных из SP1072. Полипептид также может представлять собой вариант фрагмента по меньшей мере из 20 остатков. В определенных вариантах осуществления полипептид включает не более 550, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150 или 100 последовательных аминокислот из SP1072.

6. SP2108 (SEQ ID NO: 9) и ее варианты

Полипептид SP2108 имеет длину 423 аминокислоты и альтернативно известен как MalX, ABC-транспортер мальтозы/мальтодекстрина, или мальтоза/мальтодекстрин-связывающий белок. Большая часть этого белка (аминокислоты 3-423) классифицируется как домен MalE (мальтоза-связывающий периплазматический). Кроме того, SP2108 содержит сигнальную последовательность, которая управляет его секрецией и потенциальной липидизацией. В некоторых вариантах осуществления сигнальная последовательность полипептида SEQ ID NO: 9 частично или полностью подвергается процессингу в экспрессирующем хозяине, например, Е.coli. В некоторых вариантах осуществления вакцина или другая композиция содержит усеченный мутант SP2108, содержащий один или несколько из указанных доменов и мотивов.

В некоторых вариантах осуществления композиции и способы в данном документе предусматривают применение варианта SP2108, который не имеет сигнальной последовательности. Этот вариант представлен полипептидной последовательностью SEQ ID NO: 10 и может кодироваться, например, нуклеиновой кислотой согласно SEQ ID NO: 29, хотя из-за вырожденности генетического кода могут использоваться другие последовательности ДНК (включая кодон-оптимизированные последовательности).

В некоторых вариантах осуществления вакцины или фармацевтические композиции, содержащие полипептид S.pneumoniae, содержат полипептид, содержащий по меньшей мере 20 последовательных аминокислотных остатков, выбранных из SP2108. Полипептид также может представлять собой вариант фрагмента по меньшей мере из 20 остатков. В определенных вариантах осуществления полипептид включает не более 400, 350, 300, 250, 200, 150 или 100 последовательных аминокислот из SP2108.

Консенсусные последовательности, иллюстрирующие комбинации последовательностей SP2108 от различных серотипов S.pneumoniae, представлены как SEQ ID NO: 20 и 21. Таким образом, в определенных вариантах осуществления вакцинный состав содержит полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, содержащую или состоящую либо из SEQ ID NO: 20-21, либо из их иммуногенного фрагмента (например, вместо полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, содержащую одну из SEQ ID NO: 9 или 10).

7. SP0641 (SEQ ID NO: 12) и ее варианты

SP0641, длиной в 2144 аминокислоты, также известен как PrtA, сериновая протеаза, связанная с клеточной стенкой. SP0641 полной длины содержит ряд консервативных мотивов: мотив PA_2, продолжающийся от аминокислоты 485 до 597, который может формировать белок-связывающую поверхность; Fn3-подобный домен (аминокислоты 800-939) и два прогнозированных каталитических домена типа S8 C5a, расположенных на аминокислотах 226-449 и 639-777. В некоторых вариантах осуществления вакцина или другая композиция содержит усеченный мутант SP0641, содержащий или не содержащий одного или нескольких из указанных доменов и мотивов.

В некоторых вариантах осуществления вакцины или фармацевтические композиции, содержащие полипептид S.pneumoniae, содержат полипептид, содержащий по меньшей мере 20 последовательных аминокислотных остатков, выбранных из SP0641. Полипептид также может представлять собой вариант фрагмента по меньшей мере из 20 остатков. В определенных вариантах осуществления полипептид включает не более 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 или 100 последовательных аминокислот из SP0641.

Также могут использоваться некоторые другие усеченные мутанты SP0641. Например, полипептид, обозначенный SP0641N (SEQ ID NO: 13), состоит из 661 аминокислоты, что соответствует аминокислотам 24-684 в районе N-конца SP0641. Почти рядом с SP0641N (и что соответствует аминокислотам 686-1333 из SP0641) располагается участок из 648 остатков, занятый усеченным вариантом SP0641M (SEQ ID NO: 11). Полипептид, обозначенный SP0641.1 (SEQ ID NO: 267), состоит из 978 аминокислот, соответствующих аминокислотам 28-1006 из SP0641.

Варианты SP0641 раскрываются, например, в патентах США №№7338786, 6573082 и 7132107, а также в международной заявке WO 00/06738.

SEQ ID NO: 30, 31 и 273 представляют последовательности ДНК SP0641M (SEQ ID NO: 11), SP0641N (SEQ ID NO: 13) и SP641.1 (SEQ ID NO: 267), соответственно, хотя из-за вырожденности генетического кода эти варианты SP0641 могут кодироваться другими последовательностями ДНК (включая кодон-оптимизированные последовательности).

Консенсусные последовательности, иллюстрирующие комбинации последовательностей SP0641N и SP0641M от различных серотипов S.pneumoniae, представлены как SEQ ID NO: 269 и 270. В соответствии с этим, в определенных вариантах осуществления вакцинный состав содержит полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, содержащую или состоящую либо из SEQ ID NO: 269 или 270, либо из их иммуногенного фрагмента (например, вместо полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, содержащую одну из SEQ ID NO: 11 или 13).

Полипептиды, гомологичные полипептидам из таблицы 1 и 2 (например, SP1912, SP1912L, SP0024, SP0882, SP0882N, SP0148 с сигнальной последовательностью или без нее, SP1072, SP2108 с сигнальной последовательностью или без нее, SP0641, SP0641M, SP0641N или SP0641.1) также могут использоваться в композициях и способах, раскрытых в данном документе. Индивидуальные штаммы S.pneumoniae содержат многочисленные мутации относительно друг друга, и некоторые из них приводят в результате к отличающимся белковым последовательностям у различных штаммов. Специалист в данной области техники сможет легко заменить аминокислотную последовательность или ее часть гомологичной аминокислотной последовательностью от отличающегося штамма S.pneumoniae. В определенных аспектах настоящая заявка предусматривает иммуногенные полипептиды по меньшей мере с 90%, 95%, 97%, 98%, 99% или 99,5% идентичностью с полипептидами из таблиц 1 и 2 или их иммуногенным фрагментом. Серотипическая изменчивость может использоваться для разработки таких вариантов полипептидов из таблиц 1 и 2.

В некоторых вариантах осуществления в данном документе вакцинные композиции содержат фрагмент белка из таблицы 1 или 2 (например, фрагменты SP1912, SP1912L, SP0024, SP0882, SP0882N, 0SP148 с сигнальной последовательностью или без нее, SP1072, SP2108 с сигнальной последовательностью или без нее, SP0641, SP0641M, SP0641N или SP0641.1). В некоторых вариантах осуществления настоящая заявка предусматривает усеченные мутанты, которые близки по размеру с полипептидом из таблицы 1 или 2 (например, одной из SEQ ID NO: 1-13, 265, 266 или 267). Например, у них могут отсутствовать не более одной, двух, трех, четырех, пяти, десяти или двенадцати аминокислот с одного или с обоих. Также предусматриваются внутренние делеции, например, из 1-10, 11-20, 21-30 или 31-40 аминокислот.

В определенных вариантах осуществления вакцинный состав содержит один или несколько полипептидов, имеющих аминокислотную последовательность, содержащую или состоящую из любой из SEQ ID NO: 14-21, 268, 269 и 270. В определенных вариантах осуществления фрагмент представляет собой усеченный фрагмент любой из SEQ ID NO: 14-21, 268, 269 и 270, в котором 1-5, 1-10 или 1-20 аминокислотных остатков удалены с N-конца, C-конца или с обоих. В определенных вариантах осуществления фрагмент представляет собой усеченный фрагмент любой из SEQ ID NO: 14-21, 268, 269 и 270, в котором 1-10 аминокислотных остатков удалены с N-конца, С-конца или с обоих. Например, 10 аминокислотных остатков могут быть удалены как с N-конца, так и с C-конца, что приводит в результате к белку с 20 удаленными аминокислотными остатками.

В определенных вариантах осуществления вакцинные составы, предусмотренные в данном документе, содержат или дополнительно содержат один или более, или два или более известных антигена S.pneumoniae. В некоторых случаях известные антигены S.pneumoniae представляют собой преимущественно мишени для антител. В некоторых случаях известные антигены S.pneumoniae защищают от колонизации S.pneumoniae или от сепсиса, вызванного S.pneumoniae. Одним подходящим, общепризнанным в данной области техники классом антигенов S.pneumoniae являются пневмолизоиды. Пневмолизоиды гомологичны белку S.pneumoniae пневмолизину (PLY), но обладают сниженной токсичностью по сравнению с пневмолизином. Пневмолизоиды могут представлять собой природные или сконструированные производные пневмолизина. В некоторых вариантах осуществления пневмолизоид обладает по меньшей мере 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% или 99% идентичностью с пневмолизином. В некоторых вариантах осуществления токсичность пневмолизоида составляет менее 1/2, 1/5, 1/10, 1/20, 1/50, 1/100, 1/200, 1/500 или 1/1000 токсичности пневмолизина при анализе на один или оба типа гемолитической активности в отношении эритроцитов и подавления полиморфноядерных лейкоцитов. Оба анализа описаны в Saunders F.K. et al. ("Pneumolysin, the thiol-activated toxin of Streptococcus pneumoniae, does not require a thiol group for in vitro activity" Infect Immun. 1989 Aug; 57(8): 2547-52.). Иллюстративные пневмолизоиды включают PdT (тройной мутант, дополнительно описанный в Berry A.M. et al. (1995) Infection and Immunity 63:1969-74); Pd-A и Pd-B (Paton J.C. et al. "Purification and immunogenicity of genetically obtained pneumolysin toxoids and their conjugation to Streptococcus pneumoniae type 19F polysaccharide" Infect Immun. 1991 Jul; 59(7): 2297-304); rPd2 и rPd3 (Ferreira et al. "DNA vaccines based on genetically detoxified derivatives of pneumolysin fail to protect mice against challenge with Streptococcus pneumoniae" FEMS Immunol Med Microbiol (2006) 46: 291-297); Ply8, Δ6PLY, L460D или их вариант.В некоторых вариантах осуществления пневмолизин имеет мутацию в каталитическом центре, как, например, в аминокислоте 428 или 433 или поблизости.

Другие подходящие антигены S.pneumoniae для комбинированных вакцин включают пневмококковый поверхностный белок A (PspA); производные PspA, холин-связывающий белок A (CbpA) и его производные (A.D. Ogunniyi et al., "Protection against Streptococcus pneumoniae elicited by immunization with pneumolysin and CbpA", Infect Immun. 2001 Oct; 69(10): 5997-6003); пневмококковый поверхностный адгезии A (PsaA); казеинолитическую протеазу; сортазу A (SrtA); адгезии фимбрии 1 типа RrgA; PpmA; PrtA; PavA; LytA; Stk-PR; PcsB; RrgB и их производные.

Производные PspA включают пролин-богатые сегменты с беспролиновым блоком (PR+NPB, дополнительно описанные ниже, а также в Daniels С.С. et al. (2010) Infection and Immunity 78: 2163-72) и родственные конструкты, содержащие весь пролин-богатые участок PspA или его фрагмент (например, участки, содержащие одну или несколько из последовательностей PAPAP, PKP, PKEPEQ и PEKP, и необязательно, включающие беспролиновый блок). Например, беспролиновый блок обладает иллюстративной последовательностью EKSADQQAEEDYARRSEEEYNRLTQQQ (SEQ ID NO: 306), которая, в целом, не содержит пролиновых остатков в области, которая в противном случае представляет собой пролин-богатую область неспирального участка PspA. Другие варианты осуществления последовательностей беспролинового блока (NPB) включают SEQ ID NO: 307 и 308. PspA и его производные могут включать гены, экспрессирующие аналогичные пролин-богатые структуры (т.е., PKP, PKEPEQ и PEKP) с NPB или без него. Аминокислоты на каждом конце NPB маркируют границы пролин-богатого участка. В одном примере аминоконцевая граница по отношению к PR-участку представляет собой DLKKAVNE (SEQ ID NO: 309), а карбоксиконцевая граница представляет собой (K/G) TGW (K/G) QENGMW (SEQ ID NO: 310). Пептиды, содержащие NPB, являются особенно иммуногенными, что позволяет предположить, что NPB может представлять собой важный эпитоп. Иллюстративные иммуногенные производные полипептида PspA, содержащие суперспиральную структуру, включают SEQ ID NO: 301 и 302. Конкретные варианты осуществления иммуногенных производных полипептида PspA без суперспиральной структуры, имеют аминокислотные последовательности, показанные как SEQ ID NO: 303-305. Иммуногенных полипептиды PspA с SEQ ID NO: 301, 303 и 305 включают одновременно PR- и NPB-последовательности (PR+NPB). Иммуногенные полипептиды PspA с SEQ ID NO: 302 и 304 включают только PR-последовательность (только PR) и не содержат NPB.

В некоторых случаях другой подходящий антиген S.pneumoniae по меньшей мере на 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% или 99% идентичен соответствующему белку S.pneumoniae дикого типа. Последовательности вышеупомянутых полипептидов и нуклеиновые кислоты, которые их кодируют, известны; см., например, полную геномную последовательность S.pneumoniae ATCC 700669 с номером доступа GenBank FM211187.1 и связанные полипептидные последовательности там же.

Дополнительные антигены S.pneumoniae для комбинированных вакцин включают конъюгированные полисахариды S.pneumoniae. Конъюгированные полисахариды могут представлять собой, например, описанные в патенте США №5623057, патенте США №5371197 или в публикации заявки PCT/US 2011/023526.

В дополнение к нуклеиновым кислотам и полипептидам, описываемым в таблице 1 выше, настоящая заявка также предусматривает иммуногенные композиции, которые включают один или несколько полипептидов или генов, перечисленных в таблице 2, или их варианты или фрагменты, описываемые в данном документе. Последовательность ДНК и белка каждого гена и белка можно обнаружить путем поиска по Обозначению локуса в находящейся в свободном доступе базе данных Entrez Gene, как описано выше.

Как правило, полипептиды, присутствующие в составах настоящего изобретения, являются иммуногенными либо сами по себе, либо как вариант, который включает полипептиды, гибридизированные с другим полипептидом или смешанные с адъювантом или в комплексе с ним. Варианты также включают последовательности с менее чем 100% идентичностью последовательности, как описано в данном документе. В определенных вариантах осуществления антиген из таблицы 1 или 2 представлен как полипептид полной длины. Кроме того, можно использовать фрагменты, предшественники и аналоги, которые обладают подходящей иммуногенностью.

Эти полипептиды могут быть иммуногенными для млекопитающих, например, мышей, морских свинок или людей. Иммуногенный полипептид, как правило, способен вызывать значительный иммунный ответ в анализе или у субъекта. Иммунный ответ может быть врожденным, гуморальным, клеточно-опосредованным или мукозным (комбинирующим элементы врожденного, гуморального и клеточно-опосредованного иммунитета). Например, иммуногенный полипептид может повышать количество IL-17, продуцируемого T-клетками. Анализ на IL-17, описанный в примерах 1-4, представляет собой пример анализа, который может использоваться для идентификации иммуногенного полипептида. Альтернативно или дополнительно, иммуногенный полипептид может (i) вызывать продукцию антител, например, нейтрализующих антител, которые связываются с полипептидом и/или целой бактерией, (ii) вызывать Т_Н17-опосредованный иммунитет, (iii) активировать CD4⁺ T-клеточный ответ, например, посредством увеличения количества CD4⁺ T-клеток и/или увеличения локализации CD4⁺ T-клеток в месте инфицирования или повторного инфицирования, (iv) активировать CD8⁺ CTL-ответ, например, путем увеличения количества CD8⁺ T-клеток и/или увеличения локализации CD8⁺ T-клеток в месте инфицирования или повторного инфицирования, (v) вызывать Т_Н1-опосредованный иммунитет и/или (vi) активировать врожденный иммунитет. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный полипептид вызывает продуцирование обнаруживаемого количества антитела, специфичного к данному антигену.

В определенных вариантах осуществления полипептиды характеризуются менее чем 20%, 30%, 40%, 50%, 60% или 70% идентичностью с человеческими аутоантигенами и/или бактериями-комменсалами кишечника (например, некоторые виды Bacteroides, Clostridium, Fusobacterium, Eubacterium, Ruminococcus, Peptococcus, Peptostreptococcus, Bifidobacterium, Escherichia и Lactobacillus). Примеры человеческих аутоантигенов включают инсулин, ядерный антиген пролиферирующих клеток, цитохром Р450 и основной белок миелина.

Настоящее изобретение также предусматривает иммуногенную композицию, содержащую фармацевтически приемлемый носитель, полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, содержащую SEQ ID NO: 265, 266 или 268 или ее иммуногенный фрагмент, и один или несколько полипептидов, имеющих аминокислотную последовательность, содержащую любую из SEQ ID NO: 1-23 и SP1574, SP1655, SP2106, SP1473, SP0605, SP1177, SP0335, SP0906, SP1828, SP2157, SP1229, SP1128, SP1836, SP1865, SP0904, SP0765, SP1634, SP0418, SP1923, SP1313, SP0775, SP0314, SP0912, SP0159, SP0910, SP2148, SP1412, SP0372, SP1304, SP2002, SP0612, SP1988, SP0484, SP0847, SP1527, SP0542, SP0441, SP0350, SP0014, SP1965, SP0117, SP0981, SP2229, SP2136, SP1179, SP1174, SP2216, SP1393, SP0641.1, SP1384 и SP2032, или ее иммуногенный фрагмент.

В некоторых вариантах осуществления вакцинный состав содержит по меньшей мере два полипептида, причем каждый полипептид принадлежит к различным группам (i)-(vii): (i) SEQ ID NO: 1 или ее иммуногенный фрагмент, (ii) одна из SEQ ID NO: 2-5 и 14-17 или ее иммуногенный фрагмент, (iii) одна из SEQ ID NO: 6-7 и 18-19 или ее иммуногенный фрагмент, (iv) SEQ ID NO: 8 или ее иммуногенный фрагмент, (v) одна из SEQ ID NO: 9-10 и 20-21 или ее иммуногенный фрагмент, (vi) одна из SEQ ID NO: 11-13, 267 и 269-270 или ее иммуногенный фрагмент, и (vii) одна из SEQ ID NO: 265-266 и 268 или ее иммуногенный фрагмент. Примеры таких комбинаций перечислены ниже. Дополнительные комбинации можно получать посредством замещения одной из последовательностей, приведенных ниже, соответствующей консенсусной последовательностью, например, одной из SEQ ID NO: 14-21 или 268-270. В некоторых вариантах осуществления один из полипептидов представляет собой одну из SEQ ID NO: 265-266 и 268 или ее иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления вакцинный состав дополнительно содержит пневмолизоид. В некоторых вариантах осуществления вакцинный состав дополнительно содержит CbpA или его производное. В некоторых вариантах осуществления вакцинный состав дополнительно содержит PspA или его производное, содержащее весь пролин-богатый участок PspA или его фрагмент.

SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2

SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 3

SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 4

SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 5

SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 6

SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 7

SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 8

SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 9

SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 10

SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 11

SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 12

SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 13

SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 267

SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 6

SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 7

SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 8

SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 9

SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 10

SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 11

SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 12

SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 13

SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 267

SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 6

SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 7

SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 8

SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 9

SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 10

SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 11

SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 12

SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 13

SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 267

SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 6

SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 7

SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 8

SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 9

SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 10

SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 11

SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 12

SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 13

SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 267

SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6

SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 7

SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 8

SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 9

SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 10

SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 11

SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 12

SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 13

SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 267

SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 8

SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 9

SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 10

SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 11

SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 12

SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 13

SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 267

SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8

SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 9

SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 10

SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 11

SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 12

SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 13

SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 267

SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9

SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 10

SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 11

SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 12

SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 13

SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 267

SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 11

SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 12

SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 13

SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 267

SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 11

SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 12

SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 13

SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 267

SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 266

В определенных вариантах осуществления вакцинный состав содержит по меньшей мере три различных полипептида, имеющих аминокислотную последовательность, содержащую любую из SEQ ID NO: 1-13, 265, 266 и 267 или ее иммуногенный фрагмент, причем каждый полипептид принадлежит к различным группам (i)-(vii): (i) SEQ ID NO: 1 или ее иммуногенный фрагмент, (ii) одна из SEQ ID NO: 2-5 или ее иммуногенный фрагмент, (iii) одна из SEQ ID NO: 6-7 или ее иммуногенный фрагмент, (iv) SEQ ID NO: 8 или ее иммуногенный фрагмент, (v) одна из SEQ ID NO: 9-10 или ее иммуногенный фрагмент, (vi) одна из SEQ ID NO: 11-13 и 267 или ее иммуногенный фрагмент и (vii) одна из SEQ ID NO: 265-266 или ее иммуногенный фрагмент. Примеры таких комбинаций перечислены ниже. Дополнительные комбинации можно получать посредством замещения одной из последовательностей, приведенных ниже, соответствующей консенсусной последовательностью, например, одной из SEQ ID NO: 14-21 или 268-270. В некоторых вариантах осуществления один из полипептидов представляет собой одну из SEQ ID NO: 265-266 и 268 или ее иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления вакцинный состав дополнительно содержит пневмолизоид. В некоторых вариантах осуществления вакцинный состав дополнительно содержит CbpA или его производное. В некоторых вариантах осуществления вакцинный состав дополнительно содержит PspA или его производное, содержащее весь пролин-богатый участок PspA или его фрагмент.

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 6

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 7

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 8

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 9

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 10

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 11

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 12

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 13

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 267

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 6

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 7

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 8

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 9

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 10

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 11

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 12

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 13

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 267

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 6

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 7

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 8

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 9

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 10

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 11

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 12

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 13

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 267

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 7

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 8

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 9

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 10

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 11

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 12

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 13

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 267

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 8

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 9

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 10

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 11

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 12

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 13

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 267

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 9

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 10

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 11

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 12

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 13

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 267

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 10

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 11

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 12

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 13

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 267

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 11

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 12

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 13

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 267

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 11

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 12

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 13

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 267

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 267 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 267 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 8

SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 9

SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 10

SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 11

SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 12

SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 13

SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 267

SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8

SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 9

SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 10

SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 11

SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 12

SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 13

SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 267

SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9

SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 10

SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 11

SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 12

SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 13

SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 267

SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 11

SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 12

SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 13

SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 267

SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 11

SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 12

SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 13

SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 267

SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 267 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 267 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 8

SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 9

SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 10

SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 11

SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 12

SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 13

SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 267

SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8

SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 9

SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 10

SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 11

SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 12

SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 13

SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 267

SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9

SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 10

SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 11

SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 12

SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 13

SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 267

SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 11

SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 12

SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 13

SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 267

SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 11

SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 12

SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 13

SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 267

SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 267 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 267 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 8

SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 9

SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 10

SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 11

SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 12

SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 13

SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 267

SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8

SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 9

SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 10

SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 11

SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 12

SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 13

SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 267

SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9

SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 10

SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 11

SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 12

SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 13

SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 267

SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 11

SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 12

SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 13

SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 267

SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 11

SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 12

SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 13

SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 267

SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 267 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 267 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 8

SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 9

SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 10

SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 11

SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 12

SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 13

SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 267

SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8

SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 9

SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 10

SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 11

SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 12

SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 13

SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 267

SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9

SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 10

SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 11

SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 12

SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 13

SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 267

SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 11

SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 12

SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 13

SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 267

SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 11

SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 12

SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 13

SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 267

SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 267 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 267 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9

SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 10

SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 11

SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 12

SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 13

SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 267

SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 11

SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 12

SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 13

SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 267

SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 11

SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 12

SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 13

SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 267

SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 267 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 267 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9

SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 10

SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 11

SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 12

SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 13

SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 267

SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 11

SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 12

SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 13

SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 267

SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 11

SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 12

SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 13

SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 267

SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 267 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 267 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 11

SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 12

SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 13

SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 267

SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 11

SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 12

SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 13

SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 267

SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 267 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 267 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 267

SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 267 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 267 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 266

SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 267 и SEQ ID NO: 265

SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 267 и SEQ ID NO: 266

В некоторых вариантах осуществления вакцинный состав содержит по меньшей мере два различных полипептида, имеющих аминокислотную последовательность, содержащую любую из SEQ ID NO: 14-21, 268, 269 и 270 или ее иммуногенный фрагмент. В определенных таких вариантах осуществления вакцинный состав содержит, по меньшей мере, два полипептида, причем каждый полипептидов принадлежит к различным группам (i)-(v): (i) одна из SEQ ID NO: 14-17 или ее иммуногенный фрагмент, (ii) одна из SEQ ID NO: 18-19 или ее иммуногенный фрагмент; (iii) одна из SEQ ID NO: 20-21 или ее иммуногенный фрагмент, (iv) SEQ ID NO: 268 или ее иммуногенный фрагмент и (v) одна из SEQ ID NO: 269-279 или ее иммуногенный фрагмент. Примеры таких комбинаций перечислены ниже. Комбинации ниже устанавливают консенсусные последовательности. Однако дополнительные комбинации можно получать путем замещения одной из консенсусных последовательностей соответствующей неконсенсусной последовательностью, например, одной из SEQ ID NO: 1-13 или 266-267. В некоторых вариантах осуществления один из полипептидов представляет собой SEQ ID NO: 268 или ее иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления вакцинный состав дополнительно содержит пневмолизоид. В некоторых вариантах осуществления вакцинный состав дополнительно содержит CbpA или его производное. В некоторых вариантах осуществления вакцинный состав дополнительно содержит PspA или его производное, содержащее весь пролин-богатый участок PspA или его фрагмент.

SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 18

SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 19

SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 20

SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 21

SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 268

SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 269

SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 270

SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 18

SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 19

SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 20

SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 21

SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 268

SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 269

SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 270

SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 18

SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 19

SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 20

SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 21

SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 268

SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 269

SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 270

SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 18

SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 19

SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 20

SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 21

SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 268

SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 269

SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 270

SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 20

SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 21

SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 268

SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 269

SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 270

SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20

SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 21

SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 268

SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 269

SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 270

SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 268

SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 269

SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 270

SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 268

SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 269

SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 270

SEQ ID NO: 268 и SEQ ID NO: 269

SEQ ID NO: 268 и SEQ ID NO: 270

В некоторых вариантах осуществления фрагмент представляет собой усеченный фрагмент любой из SEQ ID NO: 14-21 и 268-270, где 1-20 аминокислотных остатков удалены с N-конца, C-конца, или с обоих.

В некоторых вариантах осуществления вакцинный состав содержит полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, содержащую любую из SEQ ID NO: 14-17. В некоторых вариантах осуществления вакцинный состав содержит полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, содержащую какую-либо из SEQ ID NO: 18-19. В некоторых вариантах осуществления вакцинный состав содержит полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, содержащую какую-либо из SEQ ID NO: 20-21. В некоторых вариантах осуществления вакцинный состав содержит полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, содержащую любую из SEQ ID NO: 268-270.

В некоторых аспектах вакцинный состав, содержащий одну или несколько из SEQ ID NO: 14-21, 268, 269 и 270, дополнительно содержит полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, содержащую любую из SEQ ID NO: 1-13, 265, 266 и 267.

В определенных вариантах осуществления вакцинный состав содержит по меньшей мере три различных полипептида, имеющих аминокислотную последовательность, содержащую любую из SEQ ID NO: 14-21, 268, 269 и 270, или ее иммуногенный фрагмент. В определенных таких вариантах осуществления вакцинный состав содержит три из (i)-(v): (i) одна из SEQ ID NO: 14-17 или ее иммуногенный фрагмент, (ii) одна из SEQ ID NO: 18-19 или ее иммуногенный фрагмент, (iii) одна из SEQ ID NO: 20-21 или ее иммуногенный фрагмент, (iv) SEQ ID NO: 268 или ее иммуногенный фрагмент и (v) одна из SEQ ID NO: 269-270 или ее иммуногенный фрагмент. Примеры таких комбинаций перечислены ниже. Комбинации, приведенные ниже, устанавливают консенсусные последовательности. Однако дополнительные комбинации можно получать путем замещения одной из консенсусных последовательностей соответствующей неконсенсусной последовательностью, например, одной из SEQ ID NO: 1-13 или 266-267. В некоторых вариантах осуществления один из полипептидов представляет собой SEQ ID NO: 268 или ее иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления вакцинный состав дополнительно содержит пневмолизоид. В некоторых вариантах осуществления вакцинный состав дополнительно содержит CbpA или его производное. В некоторых вариантах осуществления вакцинный состав дополнительно содержит PspA или его производное, содержащее весь пролин-богатый участок PspA или его фрагмент.

SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 20

SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 21

SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 268

SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 269

SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 270

SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20

SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 21

SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 268

SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 269

SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 270

SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 268 и SEQ ID NO: 269

SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 268 и SEQ ID NO: 270

SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 20

SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 21

SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 268

SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 269

SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 270

SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20

SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 21

SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 268

SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 269

SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 270

SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 268 и SEQ ID NO: 269

SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 268 и SEQ ID NO: 270

SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 20

SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 21

SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 268

SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 269

SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 270

SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20

SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 21

SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 268

SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 269

SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 270

SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 268 и SEQ ID NO: 269

SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 268 и SEQ ID NO: 270

SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 20

SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 21

SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 268

SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 269

SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 270

SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20

SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 21

SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 268

SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 269

SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 270

SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 268 и SEQ ID NO: 269

SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 268 и SEQ ID NO: 270

SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 268

SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 269

SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 270

SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 268

SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 269

SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 270

SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 268

SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 269

SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 270

SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 268

SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 269

SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 270

SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 268 и SEQ ID NO: 269

SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 268 и SEQ ID NO: 270

SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 268 и SEQ ID NO: 269

SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 268 и SEQ ID NO: 270

Полипептид может содержать одну или несколько иммуногенных частей и одну или несколько неиммуногенных частей. Иммуногенные части можно идентифицировать различными способами, в том числе микроматричными анализами белка, методиками ELISPOT/ELISA и/или специфическими анализами на различные делеционные мутанты (например, фрагменты) исследуемого полипептида. Иммуногенные части также можно идентифицировать с помощью компьютерных алгоритмов. Некоторые из таких алгоритмов, например EpiMatrix (произведенный EpiVax), применяют вычислительный матричный метод. Другие вычислительные средства для идентификации антигенных эпитопов включают PEPVAC (Promiscuous EPitope-based VACcine, размещенный Институтом рака Даны Фарбер (Dana Faber Cancer Institute) во Всемирной паутине на immunax.dfci.harvard.edu/PEPVAC), MHCPred (который применяет подход дробных наименьших квадратов и размещен Институтом Дженнера (The Jenner Institute) во Всемирной паутине на www.jenner.ас.uk/MHCPred) и алгоритмы базы данных иммунных эпитопов (Immune Epitope Database) во Всемирной паутине на tools.immuneepitope.org. Иммуногенный фрагмент полипептида, описанного в данном документе, содержит по меньшей мере одну иммуногенную часть, измеряемую экспериментально или идентифицируемую с помощью алгоритма. Пептиды, идентифицированные с помощью средств, описанных выше, включают следующие:

Таким образом, в некоторых аспектах настоящая заявка предусматривает иммуногенный фрагмент антигена, описанного в данном документе. Фрагменты в некоторых случаях близки по размеру к полипептиду полной длины или полипептиду из таблицы 1 или 2. Например, у них могут отсутствовать не более одной, двух, трех, четырех, пяти, десяти, двадцати или тридцати аминокислот с одного или с обоих концов. В определенных вариантах осуществления полипептид имеет 100-500 аминокислот в длину, или 150-450, или 200-400, или 250-250 аминокислот в длину. В некоторых вариантах осуществления полипептид имеет 100-200, 150-250, 200-300, 250-350, 300-400, 350-450 или 400-500 аминокислот в длину. В определенных вариантах осуществления фрагменты образуются в результате процессинга или частичного процессинга сигнальных последовательностей в экспрессирующем хозяине, например, Е.coli, линии клеток насекомых (например, бакуловирусной системе экспрессии) или линии клеток млекопитающих (например, человека или яичников китайского хомячка). Фрагменты, описанные выше, или их субфрагменты (например, фрагменты из 8-50, 8-30 или 8-20 аминокислотных остатков) предпочтительно обладают одной из биологических активностей, описанных ниже, как, например, увеличение количества высвобожденного IL-17 по меньшей мере в 1,5 раза или в 2 раза или более (например, либо в абсолютном измерении, либо относительно иммунологически неактивного белка). Фрагмент может использоваться в качестве полипептида в вакцинах, описанных в данном документе, или его можно гибридизовать с другим белком, фрагментом белка или полипептидом.

В некоторых вариантах осуществления фрагмент представляет собой усеченный фрагмент любой из SEQ ID NO: 1-21 или 265-270 с удалением 1-5, 1-10 или 1-20 аминокислотных остатков с N-конца, С-конца или с обоих. В некоторых таких вариантах осуществления одинаковое число остатков удалено с N-конца и C-конца, хотя в других вариантах осуществления различное число остатков удалено с N-конца по сравнению с C-концом.

В определенных аспектах настоящая заявка предусматривает иммуногенные полипептиды по меньшей мере с 90%, 95%, 97%, 98%, 99% или 99,5% идентичностью с полипептидом из таблицы 1 или 2. В определенных вариантах осуществления вакцинный состав содержит по меньшей мере два различных полипептида, имеющих аминокислотную последовательность, содержащую последовательность по меньшей мере, на 90%, 95%, 98% или 99% идентичную любой из SEQ ID NO: 1-21 или 265-270 или их иммуногенному фрагменту.

В некоторых вариантах осуществления один или несколько, например, два, три, четыре или более полипептидов из таблицы 1 или 2 или их иммуногенные фрагменты или варианты предусматриваются в смеси. В некоторых вариантах осуществления смесь содержит одновременно полипептиды полной длины и фрагменты, полученные в результате процессинга или частичного процессинга сигнальных последовательностей в экспрессирующем хозяине, например, Е.coli, линии клеток насекомых (например, бакуловирусной системе экспрессии) или линии клеток млекопитающих (например, человека или яичников китайского хомячка).

В некоторых вариантах осуществления вместо простой физической смеси два, три, четыре или более полипептидов из таблицы 1 или 2 или их иммуногенные фрагменты или варианты ковалентно связаны друг с другом, например, как гибридный белок. В некоторых вариантах осуществления вакцинный состав практически не содержит других полипептидов S.pneumoniae, кроме полипептидов, имеющие аминокислотную последовательность, содержащую любую из SEQ ID NO: 1-23 или 265-270. В некоторых вариантах осуществления вакцинный состав практически не содержит других полипептидов S.pneumoniae, кроме полипептидов из таблицы 1. В некоторых вариантах осуществления вакцинный состав практически не содержит других полипептидов S.pneumoniae, кроме полипептидов из таблицы 1 и/или 2.

В определенных вариантах осуществления вакцинные составы или иммуногенные композиции практически не содержат других полипептидов S.pneumoniae, кроме полипептидов, имеющих аминокислотную последовательность, содержащую любую из SEQ ID NO: 1-23 или 265-270. В определенных таких вариантах осуществления вакцинные составы или иммуногенные композиции практически не содержат других полипептидов S.pneumoniae, кроме полипептидов, имеющих аминокислотную последовательность, состоящую из любой из SEQ ID NO: 1-23 или 265-270. В некоторых вариантах осуществления вакцинные составы или иммуногенные композиции практически не содержат других полипептидов S.pneumoniae, кроме полипептидов, имеющих аминокислотную последовательность, содержащую (или состоящую из) любую из аминокислотных последовательностей полипептидов из таблицы 1 и/или 2. Практически, в данном контексте, относится к менее 50%, менее 40%, менее 30%, менее 20%, менее 10%, менее 5%, менее 3%, менее 2, или даже менее 1% других полипептидов S.pneumoniae.

В определенных вариантах осуществления вакцинная композиция вызывает T_H17-клеточный ответ по меньшей мере в 1,5 раза больший, чем вызванный контрольным неродственным антигеном (таким, как белок ICP47 из HSV-2 с названием гена US12) после контакта с T_H17-клетками. В некоторых вариантах осуществления вакцинный состав подавляет инфицирование S.pneumoniae у неинфицированного субъекта. В определенных вариантах осуществления вакцинный состав снижает возникновение или длительность колонизации S.pneumoniae носоглотки у индивидуума, инфицированного S.pneumoniae. В некоторых вариантах осуществления вакцинный состав подавляет развитие сепсиса у индивидуума, инфицированного S.pneumoniae. В некоторых вариантах осуществления вакцинный состав подавляет развитие пневмонии, менингита, среднего отита, синусита или инфицирование S.pneumoniae других мест или органов.

В определенных вариантах осуществления настоящая заявка предусматривает нуклеиновые кислоты, кодирующие один или несколько полипептидов, описанных выше, такие как ДНК, РНК или их аналог. Последовательности ДНК, лежащие в основе полипептидов, описанных выше, можно модифицировать таким образом, чтобы не повлиять на последовательность белкового продукта, и такие последовательности включены в настоящее изобретение. Например, последовательность ДНК можно кодоноптимизировать для улучшения экспрессии в хозяине, таком как Е.coli, линия клеток насекомых (например, с использованием бакуловирусной системы экспрессии), или линия клеток млекопитающих (например, человека или яичников китайского хомячка).

В определенных вариантах осуществления настоящая заявка предусматривает нуклеиновые кислоты (такие как ДНК, РНК или их аналог), которые по меньшей мере на 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичны гену в таблице 1 или 2, или варианту или части указанного гена. В определенных вариантах осуществления нуклеиновая кислота имеет 600-2000, 800-1800, 1000-1600, 1200-1400 нуклеотидов в длину. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота имеет 600-1600, 800-1800 или 1000-2000 нуклеотидов в длину. Нуклеиновые кислоты можно использовать, например, для рекомбинантного получения полипептидов из таблиц 1 и 2, или их иммуногенных фрагментов.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная или иммуногенная композиция может содержать гибридные белки и/или гибридные ДНК-конструкты. Полипептиды, описанные в данном документе, можно использовать без модификации. В определенных вариантах осуществления при использовании родственных полипептидов меньшего размера, таких как фрагменты и т.п., и их молекулярный вес составляет менее приблизительно 5000 дальтон, например 1500-5000 дальтон, для вызывания желаемого иммунного ответа могут быть полезны модификации. Например, полипептиды меньшего размера можно конъюгировать с подходящим иммуногенным носителем, таким как столбнячный анатоксин, пневмолизин, гемоцианин морского блюдечка и т.п.

В определенных вариантах осуществления вакцинный состав содержит по меньшей мере один липидированный полипептид. Конъюгация с липидной молекулой может быть прямой или опосредованной (например, через линкер). Липидная молекула может быть синтетической или природного происхождения. В определенных вариантах осуществления полипептид из таблицы 1 или 2 можно химически конъюгировать с липидной молекулой. В определенных вариантах осуществления конструкт может содержать ген или полипептид из таблицы 1 или 2, или его иммуногенный фрагмент или вариант, и последовательность для липидизации, в том числе lipobox-мотив. Канонический lipobox-мотив показан как SEQ ID NO: 274. Последовательность для липидизации может находиться на N-конце или C-конце белка, и может быть встроена в сигнальную или другую последовательность, или в гибридный белок. Иллюстративные последовательности для липидизации включают сигнальную последовательность SP2108 (SEQ ID NO: 275) и сигнальную последовательность гена RlpB Е.coli (SEQ ID NO: 276). Сигнальная последовательность может представлять собой, например, сигнальную последовательность Е.coli или S.pneumoniae. Иллюстративные сигнальные последовательности Е.coli включают сигнальную последовательность mlpA (Lin J.J. et al., "An Escherichia coli mutant with an amino acid alteration within the signal sequence of outer membrane prolipoprotein" Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978 Oct; 75(10): 4891-5), сигнальную последовательность lamB (Emr S.D. et al. "Mutations altering the cellular localization of the phage lambda receptor, an Escherichia coli outer membrane protein", Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978 Dec; 75(12): 5802-6), сигнальную последовательность MBP (Bassford P.J., "Use of gene fusion to study secretion of maltose-binding protein into Escherichia coli periplasm" J Bacteriol. 1979 Jul; 139(1): 19-31). Lpp представляет собой иллюстративную сигнальную последовательность Е.coli, которая управляет липидизацией (Cullen P.A. et al. "Construction and evaluation of a plasmid vector for the expression of recombinant lipoproteins in Escherichia coli" Plasmid. 2003 Jan; 49(1): 18-29). Сигнальные последовательности E.coli, которые управляют липидизацией, также описаны в Legrain М. et al. ("Production of lipidated meningococcal transferrin binding protein 2 in Escherichia coli" Protein Expr Purif. 1995 Oct; 6(5): 570-8), например, сигнальная последовательность гена RlpB (SEQ ID NO: 276). Многочисленные сигнальные последовательности S.pneumoniae известны из уровня техники. Одна из таких сигнальных последовательностей представляет собой SEQ ID NO: 275.

В других вариантах осуществления конструкт может содержать ген или белок из таблицы 1 или 2, или его иммуногенный фрагмент или вариант, и метку. Метка может быть N-концевой или C-концевой. Например, метки можно добавлять к нуклеиновой кислоте или полипептиду для облегчения очистки, обнаружения, растворимости или для придания других желаемых свойств белку или нуклеиновой кислоте. Например, метка для очистки может представлять собой пептид, олигопептид или полипептид, который можно использовать в аффинной очистке. Примеры включают His, GST, TAP, FLAG, myc, HA, MBP, VSV-G, тиоредоксин, V5, авидин, стрептавидин, BCCP, кальмодулин, Nus, S-метки, липопротеин D и β-галактозидазу. Конкретные примеры His-меток включают HHHHHH (SEQ ID NO: 32) и MSYYHHHHHH (SEQ ID NO: 33). В других вариантах осуществления полипептиды не содержат меток, таких как метки для очистки белков, и их очищают с помощью способа, не зависящего от аффинности в отношении метки для очистки. В некоторых вариантах осуществления гибридная часть является короткой. В некоторых случаях такой гибридный белок содержит не более 1, 2, 3, 4, 5, 10 или 20 дополнительных аминокислот на одном или обоих концах полипептида из таблицы 1 или 2.

B. Иммуногенные композиции

Настоящее раскрытие также предусматривает фармацевтические композиции, содержащие иммуногенные полипептиды или полинуклеотиды, кодирующие эти иммуногенные полипептиды, вместе с фармацевтическим носителем. Антигены от S.pneumoniae идентифицировали путем скрининга иммунных клеток от мышей, инфицированных S.pneumoniae, или здоровых людей-доноров. Люди-доноры предположительно подвергались воздействию S.pneumoniae в какой-то момент на протяжении их жизни, поскольку S.pneumoniae представляет собой широко распространенный возбудитель заболевания и колонизирующий патоген. Коротко, библиотеку антигенов S.pneumoniae экспрессировали в бактериях и смешивали с антигенпрезентирующими клетками (APC). APC, в свою очередь, презентировали полипептиды, происходящие от S.pneumoniae, лимфоцитам, которые были выделены из мышей или из людей-доноров. Лимфоцитарные ответы проанализировали в отношении реактивности к S.pneumoniae. Люди-доноры, также как и мыши, иммунизированные S.pneumoniae, продуцируют лимфоциты, специфичные к антигенам S.pneumoniae. Таким образом, в настоящем раскрытии рассматриваются композиции антигенов S.pneumoniae, которые вызывают сильный иммунный ответ у иммунизированных или инфицированных мышей или людей для противодействия инфицированию S.pneumoniae.

В таблицах 1 и 2 перечислены белковая последовательность и соответствующая нуклеотидная последовательность для антигенов S.pneumoniae, идентифицированных в соответствии со способами скрининга, описанным в данном документе. Антигены идентифицировали при скрининге T-клеток мышей и человека. При скрининге T-клеток мышей идентифицированные антигены подвергали по меньшей мере двум циклам скрининга: полногеномному циклу для идентификации пулов из 4 антигенов, которые вызывают иммунный ответ, с последующим циклом деконволюции для тестирования по отдельности и идентификации единичных антигенов, которые вызывают иммунный ответ, из пула, идентифицированного при полногеномном цикле. В отличие от этого, при скрининге T-клеток человека были созданы два различных набора антигенных пулов, так что полипептид комбинировали с различными полипептидами первого и второго пулов. Вследствие этого, можно определить, какие полипептиды являются антигенами, путем идентификации какие полипептиды находятся в положительных пулах, как в первом, так и во втором наборах. В таблице 1 перечислены антигены (и их варианты), которые идентифицировали одним из вышеупомянутых способов скрининга и затем подвергли дополнительному тестированию на мышиных моделях, как описано в примерах 5-12. Таким образом, композиции по настоящему раскрытию могут включать один или два или более генов, перечисленных в таблице 1 или 2, или соответствующие генные продукты.

Иммуногенная композиция также может содержать части указанных полипептидов Streptococcus, например, делеционных мутантов, усеченных мутантов, олигонуклеотиды и пептидные фрагменты. В некоторых вариантах осуществления части указанных полипептидов являются иммуногенными. Иммуногенность части белка легко определить с применением тех же анализов, которые используются для определения иммуногенности белка полной длины. В некоторых вариантах осуществления часть полипептида обладает практически такой же иммуногенностью, что и белок полной длины. В некоторых вариантах осуществления иммуногенность не более чем на 10%, 20%, 30%, 40% или 50% меньше, чем у белка полной длины (например, полипептидов из таблиц 1 и 2). Пептидные фрагменты могут быть, например, линейными, кольцевыми или разветвленными.

Некоторые варианты осуществления вакцинных составов и иммуногенных композиций, описанных в данном документе, включают иммуногенный полипептид (например, полипептид из таблицы 1 или 2), который содержит последовательность для переноса через мембрану (MTS) для облегчения введения полипептида в клетку млекопитающего и последующей стимуляции клеточно-опосредованного иммунного ответа. Иллюстративные последовательности для переноса через мембрану включают гидрофобный участок в сигнальной последовательности фактора роста фибробластов Капоши, MTS α-синуклеина, β-синуклеина или γ-синуклеина, третью спираль гомеодомена Antennapedia, SN50, h-участок интегрина β3, HIV Tat, pAntp, PR-39, абецин, апидецин, Bac5, Bac7, белок CS P. berghei и MTS, описываемые в патентах США №№6248558, 6432680 и 6248558.

В определенных вариантах осуществления антиген (например, полипептид из таблицы 1 или 2) ковалентно связан с другой молекулой. Это, например, может повышать период полураспада, растворимость, биодоступность или иммуногенность антигена. Молекулы, которые можно ковалентно связывать с антигеном, включают углевод, биотин, поли(этиленгликоль) (PEG), полисиаловую кислоту, N-пропионированную полисиаловую кислоту, нуклеиновые кислоты, полисахариды и PLGA. Существует множество различных типов PEG с молекулярным весом в диапазоне от менее 300 г/моль до более 10000000 г/моль. Цепи PEG могут быть линейными, разветвленными или с конфигурацией соты или звезды. В некоторых вариантах осуществления природная форма белка ковалентно связана с молекулой, которая стимулирует иммунную систему. Примером такой молекулы является липидная молекула. В некоторых случаях липидные молекулы распознаются толл-подобным рецептором (TLR), таким как TLR-2 или TLR-4, и активируют врожденную иммунную систему.

C. Антитела, специфичные к белкам из таблиц 1 и 2

Другой аспект, раскрытый в данном документе, представляет собой препарат антител, выработанных в ответ на антигенную композицию (например, на один из белков, перечисленных в таблице 1 или 2, или его иммуногенный фрагмент). Например, настоящее раскрытие предусматривает комбинации из двух, трех, четырех или пяти антител, причем каждое распознает различный белок из таблицы 1 или 2. Включается любое из множества антител. Такие антитела включают, например, поликлональные, моноклональные, рекомбинантные, гуманизированные или частично гуманизированные, одноцепочечные, Fab и их фрагменты и т.д. Антитела могут представлять любой изотип, например IgG, различные изотипы IgG, такие как IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4 и т.д.; и они происходит от любого вида животных, который продуцирует антитела, в том числе козы, кролика, мыши, курицы и т.п. В некоторых вариантах осуществления молекулы Fab экспрессируются и собираются в генетически трансформированном хозяине, таком как Е.coli. При этом система вектора лямбда подходит для экспрессии популяции Fab с потенциальным разнообразием, равным или превосходящим таковое субъекта, вырабатывающего антитело-предшественник. См. Huse et al., (1989), Science 246, 1275-81.

D. Компоненты вакцинной или иммуногенной композиции, содержащей антигены S.pneumoniae или распознающие их антитела

В определенных вариантах осуществления вакцинная или иммуногенная композиция содержит антиген и одно или несколько из следующего: адъювант, стабилизатор, буфер, поверхностно-активное вещество, компонент для контролируемого высвобождения, соль, консервант и/или антитело, специфичное к указанному антигену.

1. Адъюванты

Вакцинные составы и иммуногенные композиции, описанные в данном документе, могут включать адъювант. Адъюванты могут быть в целом разделены на два класса на основании их принципиальных механизмов действия: системы доставки вакцин и иммуностимулирующие адъюванты (см., например, Singh et al., Curr. HIV Res. 1:309-20, 2003). Во многих вакцинных составах адъювант подает сигнал иммунной системе таким образом, что она дает ответ на антиген, а антиген требуется для управления специфичностью ответа на патоген. Системы доставки вакцин часто представляют собой составы в форме частиц, например, эмульсии, микрочастицы, иммуностимулирующие комплексы (ISCOM), наночастицы, которые могут быть, например, частицами и/или матрицами, и липосомы. В отличие от этого, иммуностимулирующие адъюванты иногда получают из патогенов и они могут представлять собой патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (PAMP), например, липополисахариды (LPS), монофосфориллипид (MPL) или CpG-содержащие ДНК, которые активируют клетки врожденной иммунной системы.

Альтернативно, адъюванты можно классифицировать на органические и неорганические. Неорганические адъюванты включают квасцовые соли, такие как фосфат алюминия, аморфный сульфат гидроксифосфата алюминия и гидроксид алюминия, которые обычно используются в вакцинах для человека. Органические адъюванты включают органические молекулы, в том числе макромолекулы. Примером органического адъюванта является холерный энтеротоксин.

Адъюванты также можно классифицировать по ответу, который они вызывают. В некоторых вариантах осуществления адъювант вызывает активацию T_H1-клеток или T_H2-клеток. В других вариантах осуществления адъювант вызывает активацию В-клеток. В других вариантах осуществления адъювант вызывает активацию антиген-презентирующих клеток. Эти категории не являются взаимоисключающими; в некоторых случаях, адъювант активирует более одного типа клеток.

В определенных вариантах осуществления адъювант вызывает активацию T_H17-клеток. Он может стимулировать CD4⁺ или CD8⁺ T-клетки для секреции IL-17. В некоторых вариантах осуществления адъювант, который вызывает активацию T_H17-клеток, представляет собой таковой, обеспечивающий по меньшей мере 2-кратное, а в некоторых случаях 10-кратное отношение экспериментального образца к контролю в следующем анализе. В анализе экспериментатор сравнивает уровни IL-17, секретированные двумя популяциями клеток: (1) клетками от животных, иммунизированных адъювантом и полипептидом, который, как известно, вызывает активацию T_H17, и (2) клетками от животных, обработанных адъювантом и нерелевантным (контрольным) полипептидом. Адъювант, который вызывает активацию T_H17-клеток, может привести к тому, что клетки популяции (1) произведут более чем 2-кратное, или более чем 10-кратное количество IL-17 по сравнению с клетками популяции (2). IL-17 можно измерять, например, методом ELISA или ELISPOT. Определенные токсины, такие как холерный энтеротоксин и лабильный токсин (производимый энтеротоксигенными Е.coli или ETEC) активируют T_H17-ответ. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления адъювант представляет собой токсин. Холерный энтеротоксин успешно использовали на мышиной модели, чтобы вызвать защитного иммунитет, связанный с определенными полипептидами из таблицы 1 (см. примеры 5-8). Одна из форм лабильного токсина производится Intercell. Также можно использовать мутантные производные лабильного токсина, которые действенны в качестве адъювантов, но значительно менее токсичны. Иллюстративные детоксифицированные мутантные производные лабильного токсина включают мутантов без АДФ-рибозилтрансферазной активности. Конкретные детоксифицированные мутантные производные лабильного токсина включают LTK7 (Douce et al., "Mutants of Escherichia coli heat-labile toxin lacking ADP-ribosyltransferase activity act as nontoxic, mucosal adjuvants" PNAS Vol.92, pp.1644-1648, February 1995) и LTK63 (Williamset al., "Innate Imprinting by the Modified Heat-Labile Toxin of Escherichia coli (LTK63) Provides Generic Protection against Lung Infectious Disease" The Journal of Immunology, 2004, 173: 7435-7443), LT-G192 (Douce et al. "Genetically detoxified mutants of heat-labile toxin from Escherichia coli are able to act as oral adjuvants" Infect Immun. 1999 Sep; 67(9): 4400-6) и LTR72 ("Mucosal adjuvanticity and immunogenicity of LTR72, a novel mutant of Escherichia coli heat-labile enterotoxin with partial knockout of ADP-ribosyltransferase activity." J Exp Med. 1998 Apr 6; 187(7): 1123-32).

В некоторых вариантах осуществления адъювант содержит VLP (вирусоподобные частицы). Одна из таких адъювантных платформ, альфавирусные репликоны, вызывает активацию T_H17-клеток с использованием альфавируса и производится в Alphavax. В определенных вариантах осуществления системы альфавирусных репликонов альфавирус можно конструировать для экспрессии представляющего интерес антигена, представляющего интерес цитокина (например, IL-17 или цитокина, который стимулирует продукцию IL-17), или обоих, и он может продуцироваться линией клеток-хелперов. Более подробную информацию можно найти в патентах США №№5643576 и 6783939. В некоторых вариантах осуществления вакцинный состав вводят пациенту в комбинации с нуклеиновой кислотой, кодирующей цитокин.

Определенные классы адъювантов активируют толл-подобные рецепторы (TLR), чтобы активировать T_H17-ответ. TLR представляют собой хорошо известные белки, которые можно обнаружить на мембранах лейкоцитов, и они распознают чужеродные антигены (в том числе микробные антигены). Введение известных лигандов TLR вместе с представляющим интерес антигеном (например, в виде гибридного белка) может стимулировать развитие иммунного ответа, специфичного к представляющему интерес антигену. Один иллюстративных адъювантов, который активирует TLR, включает монофосфориллипид A (MPL). Традиционно, MPL производился в качестве детоксифицированного липополисахаридного (LPS) эндотоксина, полученного из грамотрицательных бактерий, таких как S.minnesota. Так, в ходе последовательного кислотного и щелочного гидролиза из LPS образуется иммуноактивная фракция липида A (которая представляет собой MPL) и убираются сахаридные группы и все, кроме одного, фосфаты, присутствующие в LPS. Ряд синтетических агонистов TLR (в частности, агонисты TLR-4) раскрывается в Evans J.Т. et al. "Enhancement of antigen-specific immunity via the TLR-4 ligands MPL adjuvant and Ribi.529." Expert Rev Vaccines 2003 Apr; 2(2): 219-29. Подобно MPL-адъювантам эти синтетические соединения активируют врожденную иммунную систему через TLR. Другой тип агонистов TLR представляет собой синтетический фосфолипидный димер, например, E6020 (Ishizaka S.T. et al. "E6020: a synthetic Toll-like receptor 4 agonist as a vaccine adjuvant." Expert Rev. Vaccines. 2007 Oct; 6(5): 773-84.). Различные агонисты TLR (включая агонисты TLR-4) были получены и/или реализовывались, например. Научно-исследовательским Институтом инфекционных заболеваний (IRDI), Corixa, Esai, Avanti Polar Lipids, Inc. и Sigma Aldrich. Другой иллюстративный адъювант, который активирует TLR, содержит смесь из MPL, димиколата трегалозы (TDM) и диоктадецилдиметиламмония бромида (DDA). Другим TLR-активирующим адъювантом является R848 (резиквимод).

В некоторых вариантах осуществления адъювант представляет собой или содержит сапонин. Как правило, сапонин представляет собой тритерпеновый гликозид, как, например, выделенный из коры дерева Quillaja saponaria. Сапониновый экстракт из биологического источника можно дополнительно фракционировать (например, с помощью хроматографии) для выделения частей экстракта с наилучшей адъювантной активностью и с приемлемой токсичностью. Типичные фракции экстракта из дерева Quillaja saponaria, используемые в качестве адъювантов, известны как фракции A и C.

Конкретная форма сапонинов, которые могут использоваться в вакцинных составах, описанных в данном документе, представляет собой иммуностимулирующие комплексы (ISCOM). ISCOM являются признанным в уровне техники классом адъювантов, которые обычно содержат сапониновые фракции Quillaja и липиды (например, холестерин и фосфолипиды, такие как фосфатидилхолин). В определенных вариантах осуществления ISCOM собирают с представляющим интерес полипептидом или нуклеиновой кислотой. При этом различные сапониновые фракции могут использоваться в различных соотношениях. Кроме того, различные сапониновые фракции могут находиться вместе в одних и тех же частицах, или практически в частице имеется одна фракция (так что указанное соотношение фракций A и C создается путем смешивания частиц с различными фракциями). В этом контексте "практически" относится к менее 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% или даже 1%. Такие адъюванты могут содержать фракцию A и фракцию C, смешанные в соотношении 70-95 A:30-5 C, как, например, от 70 A:30 C до 75 A:5 C, от 75 A:5 C до 80 A:20 C, от 80 A:20 C до 85 A:15 C, от 85 A:15 C до 90 A:10 C, от 90 A:10 C до 95 A:5 C или от 95 A:5 C до 99 A:1 C.

В определенных вариантах осуществления используются комбинации адъювантов. Три иллюстративные комбинации адъювантов представляют собой MPL и квасцы, E6020 и квасцы, а также MPL и ISCOM.

Адъюванты могут быть ковалентно связаны с антигенами. В некоторых вариантах осуществления адъювант может включать белок, который вызывает воспалительные ответы через активацию антиген-презентирующих клеток (APC). В некоторых вариантах осуществления один или несколько этих белков можно рекомбинантно гибридизировать с выбранным антигеном, так что полученная гибридная молекула стимулирует созревание дендритных клеток, активирует дендритные клетки для продуцирования цитокинов и хемокинов и, в конечном итоге, улучшает презентирование антигена Т-клеткам и инициацию T-клеточных ответов (см. Wu et al. Cancer Res 2005; 65(11), pp 4947-4954). В определенных вариантах осуществления полипептид, описанный в данном документе, презентируется в условиях трехвалентной конъюгированной системы, содержащей гибридный белок из пневмококкового поверхностного адгезина A (PsaA) S.pneumoniae с пневмолизоидом PdT и полисахарид клеточной стенки (PsaA:PdT-CP), описанной в Lu et al. ("Protection against Pneumococcal colonization and fatal pneumonia by a trivalent conjugate of a fusion protein with the cell wall polysaccharide." Infect Immun. 2009 May; 77(5): 2076-83). PdT несет три аминокислотные замены (W433F, D385N и C428G), которые делают молекулу нетоксичной, но не затрагивают ее TLR-4-опосредованных воспалительных свойств. Конъюгация полисахарида с гибридом полипептида с TLR-4-агонистом PdT приводит к существенному повышению иммунологического ответа на полипептид. В некоторых вариантах осуществления вместо PsaA в трехвалентном конъюгате используют один или несколько полипептидов, описанных в данном документе. Трехвалентная конъюгированная система, как правило, включает квасцы и обычно вводится парентерально. Другие иллюстративные адъюванты, которые могут быть ковалентно связаны с антигенами, включают полисахариды, пневмолизин, синтетические пептиды, липопептиды и нуклеиновые кислоты.

Как правило, один и тот же адъювант или смесь адъювантов присутствует в каждой дозе вакцины. Необязательно, однако, адъювант может вводиться с первой дозой вакцины и не вводиться с последующими дозами (т.е. бустер-дозами). Альтернативно, сильный адъювант может вводиться с первой дозой вакцины и более слабый адъювант или более низкая доза сильного адъюванта могут вводиться с последующими дозами. Адъювант можно вводить до введения антигена, одновременно с введением антигена или после введения антигена субъекту (иногда в течение 1, 2, 6 или 12 часов, а иногда в течение 1, 2 или 5 дней). Определенные адъюванты подходят для пациентов-людей, для животных, кроме человека, или для тех и других.

2. Дополнительные компоненты вакцинной или иммуногенной композиции

В дополнение к антигенам и адъювантам, описанным выше, вакцинный состав или иммуногенная композиция могут включать один или несколько дополнительных компонентов.

В определенных вариантах осуществления вакцинный состав или иммуногенная композиция могут включать один или несколько стабилизаторов, таких как сахара (как, например, сахароза, глюкоза или фруктоза), фосфат (как, например, двухосновный фосфат натрия, одноосновный фосфат калия, двухосновный фосфат калия или дигидрофосфат натрия), глутамат (как, например, L-глутамат натрия), желатин (как, например, обработанный желатин, гидролизованный желатин или свиной желатин), аминокислоты (как, например, аргинин, аспарагин, гистидин, L-гистидин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, серии, треонин, лизин, фенилаланин, тирозин и их сложные алкиловые эфиры), инозин или борат натрия.

В определенных вариантах осуществления вакцинный состав или иммуногенная композиция включают один или несколько буферов, таких как смесь бикарбоната натрия и аскорбиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления вакцинный состав может вводиться в физиологическом растворе, таком как забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), или дистиллированной воде.

В определенных вариантах осуществления вакцинный состав или иммуногенная композиция включает одно или несколько поверхностно-активных веществ, таких как полисорбат 80 (Tween 80), Triton Х-100, полиэтиленгликоль-трет-октилфениловый эфир, т-октилфеноксиполиэтоксиэтанол, 4-(1,1,3,3-тетраметилбутил)фенил-полиэтиленгликоль, (TRITON X-100), полиоксиэтиленсорбитан монолаурат, полиэтиленгликольсорбитан монолаурат (TWEEN 20); и полимер 4-(1,1,3,3-тетраметилбутил)фенола с формальдегидом и оксираном (TYLOXAPOL). Поверхностно-активное вещество может быть ионным или неионным.

В определенных вариантах осуществления вакцинный состав или иммуногенная композиция включают одну или несколько солей, таких как хлорид натрия, хлорид аммония, хлорид кальция или хлорид калия.

В определенных вариантах осуществления в вакцинную или иммуногенную композицию включается консервант. В других вариантах осуществления консервант не используется. Консервант наиболее часто используют в многодозовых вакцинных флаконах, и он реже необходим в однодозовых вакцинных флаконах. В определенных вариантах осуществления консервант представляет собой 2-феноксиэтанол, метил- и пропилпарабены, бензилозый спирт и/или сорбиновую кислоту.

В определенных вариантах осуществления вакцинный состав или иммуногенная композиция представляет собой состав с контролируемым высвобождением.

E. ДНК-вакцины

В определенных аспектах вакцина содержит одну или несколько нуклеиновых кислот, раскрытых в данном документе, или соответствующих полипептидам, описанным в данном документе. Когда вакцину с нуклеиновой кислотой вводят пациенту, соответствующий генный продукт (как, например, желаемый антиген) продуцируется в организме пациента. В некоторых вариантах осуществления вакцинные векторы с нуклеиновой кислотой, которые включают оптимизированные рекомбинантные полинуклеотиды, можно доставлять в млекопитающего (в том числе человека), чтобы вызвать терапевтический или профилактический иммунный ответ. Нуклеиновая кислота может представлять собой, например, ДНК, РНК или синтетическую нуклеиновую кислоту. Нуклеиновая кислота может быть одноцепочечной или двухцепочечной.

Вакцинные векторы с нуклеиновой кислотой (например, аденовирусы, липосомы, папилломавирусы, ретровирусы и т.д.) можно вводить прямо в млекопитающего для трансдукции клеток in vivo. Вакцины с нуклеиновой кислотой могут составляться как фармацевтические композиции для введения любым подходящим способом, в том числе парентеральным введением. Плазмидные векторы, как правило, более эффективны для переноса генов в мышечную ткань. О возможности доставки ДНК-векторов на слизистые поверхности при пероральном введении также сообщалось (ротавирус и вирус гепатита B, инкапсулированные в PLGA), и ДНК-плазмиды были использованы для прямого введения генов в другие ткани. ДНК-вакцины вводились животным преимущественно с помощью внутримышечной инъекцией, с помощью доставки генной пушкой или с помощью электропорации. После введения плазмиды, как правило, сохраняются эписомально без репликации. Как было показано, экспрессия кодируемых белков сохраняется в течение длительных периодов времени, что обеспечивает стимуляцию B- и T-клеток.

При определении эффективного количества вектора, подлежащего введению при лечении или профилактике инфекции или другого состояния, врач оценивает токсичность вектора, развитие заболевания и продукцию антител к вектору, если она имеет место. Часто эквивалентная доза депротеинизированной нуклеиновой кислоты из вектора составляет от около 1 мкг до 1 мг для обычного пациента весом 70 кг, и дозы векторов, используемых для доставки нуклеиновой кислоты, рассчитывают для получения эквивалентного количества терапевтической нуклеиновой кислоты. Введение можно выполнять путем однократных доз или доз, повторяемых через определенные интервалы времени. Токсичность и терапевтическая эффективность вакцинных векторов с нуклеиновой кислотой могут определяться с использованием стандартных фармацевтических процедур в клеточных культурах или на экспериментальных животных.

Вакцина с нуклеиновой кислотой может содержать ДНК, РНК, модифицированную нуклеиновую кислоту или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления вакцина содержит один или несколько векторов для клонирования или экспрессии; например, вакцина может содержать несколько векторов для экспрессии, каждый из которых способен к автономной экспрессии нуклеотидного кодирующего участка в клетке млекопитающего с образованием по меньшей мере одного иммуногенного полипептида. Вектор для экспрессии часто включает эукариотическую промоторную последовательность, как, например, нуклеотидную последовательность сильного эукариотического промотора, функционально связанную с одним или несколькими кодирующими участками. Композиции и способы по данному документу могут подразумевать применение любого специфического эукариотического промотора, и большое множество их известно, как, например, промотор CMV или RSV. Промотор может быть гетерологичным по отношению к клетке-хозяину. Используемый промотор может представлять собой конститутивный промотор.

Вектор, пригодный для композиций и способов, может быть кольцевым или линейным, одноцепочечным или двухцепочечным и может представлять собой плазмиду, космиду или эписому. В подходящем варианте осуществления каждый нуклеотидный кодирующий участок находится на отдельном векторе; однако, следует понимать, что на одном векторе могут присутствовать один или несколько кодирующих участков, и эти кодирующие участки могут находиться под контролем одного или нескольких промоторов.

Для получения вакцин с нуклеиновыми кислотами можно использовать множество плазмид. В подходящих вариантах осуществления вакцины с нуклеиновой кислотой применяются конструкты с использованием плазмид VR1012 (Vical Inc., Сан-Диего, Калифорния), pCMVI.UBF3/2 (S. Johnston, University of Texas) или pcDNA3.1 (InVitrogen Corporation, Карлсбад, Калифорния) в качестве вектора. Кроме того, векторный конструкт может содержать иммуностимулирующие последовательности (ISS), такие как неметилированные мотивы dCpG, которые стимулируют иммунную систему животного. Вакцина с нуклеиновой кислотой также может кодировать гибридный продукт, содержащий иммуногенный полипептид. Плазмидная ДНК может также доставляться с использованием ослабленных бактерий в качестве системы доставки, способ, который подходит для ДНК-вакцин, вводимых перорально. Бактерий трансформируют с помощью независимо реплицирующейся плазмиды, которая высвобождается в цитоплазму клетки-хозяина после гибели ослабленной бактерии в клетке-хозяине.

ДНК-вакцины, включающие ДНК, которая кодирует требуемый антиген, могут вводиться в клетку-хозяина в любой подходящей форме, в том числе в виде отдельного фрагмента, линеаризованной плазмиды, кольцевой плазмиды, плазмиды, способной к репликации, эписомы, РНК и т.д. Предпочтительно, ген содержится в плазмиде. В некоторых вариантах осуществления плазмида представляет собой вектор для экспрессии. Индивидуальные векторы для экспрессии, способные экспрессировать генетический материал, можно получать с использованием стандартных рекомбинантных методик. См., например, Maniatis et al., 1985 Molecular Cloning: A Laboratory Manual or DNA Cloning, Vol.I and II (D.N. Glover, ed., 1985) для общих способов клонирования.

Пути введения включают, но без ограничений, внутримышечный, интраназальный, внутрибрюшинный, внутрикожный, подкожный, внутривенный, внутриартериальный, интраокулярный и пероральный, а также местно, чрескожно, с помощью ингаляции или суппозитория или на слизистую ткань, как, например, путем орошения вагинальной, ректальной, уретральной, буккальной и сублингвальной ткани. Типичные пути введения включают внутримышечную, внутрибрюшинную, внутрикожную и подкожную инъекцию. Генетические конструкты можно вводить с помощью, в том числе, но без ограничений, традиционных шприцов, безыгольных инъекционных устройств, «генных пушек с бомбардировкой микрочастицами» или других физических методов, таких как электропорация («EP»), «гидродинамический способ» или ультразвук. ДНК-вакцины можно доставлять любым способом, который можно использовать для доставки ДНК, лишь бы ДНК экспрессировалась и желаемый антиген производился в клетке.

В некоторых вариантах осуществления ДНК-вакцину доставляется с помощью известных реагентов для трансфекции, таких как катионные липосомы, эмульсии фторуглеродов, кохлеаты, трубочки, частицы золота, биоразлагаемые микросферы или катионные полимеры. Кохлеатные средства доставки представляют собой стабильные выпавшие в осадок фосфолипиды с кальцием, состоящие из фосфатидилсерина, холестерина и кальция; этот нетоксичный и не вызывающий воспаления реагент для трансфекции может передаваться в пищеварительной системе. Биоразлагаемые микросферы содержат полимеры, такие как сополимер (лактида и гликолида), сложный полиэфир, который можно использовать в получении микрокапсул ДНК для трансфекции. Микротрубочки на липидной основе часто состоят из липида из двух спирально намотанных слоев, упакованных так, что их края соединены друг с другом. При использовании трубочки нуклеиновая кислота может быть расположена в ее центральной полой части для доставки и контролируемого высвобождения в организме животного.

В некоторых вариантах осуществления ДНК-вакцина доставляется к слизистым поверхностям с помощью микросфер. Биоадгезивные микросферы можно получать с применением различных методик, и их можно приспособить для прилипания к любой слизистой ткани, в том числе к находящимся в глазу, носовой полости, мочевыводящих путях, толстой кишке и желудочно-кишечном тракте, что предоставляет возможности для локализованного, а также системного контролируемого высвобождения вакцин. Применение биоадгезивных микросфер к определенным слизистым тканям также может использоваться для локализованного действия вакцины. В некоторых вариантах осуществления альтернативный подход для доставки вакцины через слизистую оболочку представляет собой непосредственное введение в слизистые поверхности плазмидного вектора для экспрессии ДНК, который кодирует ген определенного белкового антигена.

Плазмидные ДНК-вакцины по настоящему изобретению составляют с учетом способа введения, который будет использоваться. В некоторых вариантах осуществления, когда плазмидные ДНК-вакцины представляют собой инъецируемые композиции, они являются стерильными и/или апирогенными и/или не содержащими частиц. В некоторых вариантах осуществления предпочтительно используется изотонический состав. Как правило, добавки для изотоничности могут включать хлорид натрия, декстрозу, маннит, сорбит и лактозу. В некоторых вариантах осуществления предпочтительны изотонические растворы, такие как забуференный фосфатом физиологический раствор. В некоторых вариантах осуществления стабилизаторы включают желатин и альбумин. В некоторых вариантах осуществления к составу добавляют сосудосуживающее средство. В некоторых вариантах осуществления к составу добавляют стабилизирующее средство, которое позволяет составу оставаться стабильным при комнатной температуре или температуре окружающей среды в течение продолжительных периодов времени, такое как LGS или другие поликатионы или полианионы.

В некоторых вариантах осуществления ДНК-вакцина может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. Подходящие носители для вакцины хорошо известны специалистам в данной области техники и включают, но без ограничений, белки, сахара и т.п. Такие носители могут представлять собой водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. Примеры неводных носителей представляют собой пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и инъецируемые органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Водные носители включают воду, спиртовые/водные растворы, эмульсии или суспензии, в том числе солевые и буферные среды. Парентеральные среды включают раствор хлорида натрия, раствор Рингера с декстрозой и хлоридом натрия, лактатный раствор Рингера или нелетучие масла. Внутривенные среды включают жидкие и нутриентные добавки, электролитные добавки, как, например, на основе раствора Рингера с декстрозой, и тому подобное. Консерванты и противомикробные средства включают антиоксиданты, хелатирующие средства, инертные газы и тому подобное. Предпочтительные консерванты включают формалин, тимеросал, неомицин, полимиксин B и амфотерицин B.

Альтернативный подход к доставке нуклеиновой кислоты в животное включает применение вирусного или бактериального вектора. Примеры подходящих вирусных векторов включают аденовирус, вирус полиомиелита, вирусы оспы, как, например, коровьей оспы, оспы канареек и оспы птиц, вирусы герпеса, в том числе вирус герпеса канального сомика, аденовирус-ассоциированный вектор и ретровирусы. Иллюстративные бактериальные векторы включают ослабленные формы Salmonella, Shigella, Edwardsiella ictaluri, Yersinia ruckerii и Listeria monocytogenes. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота представляет собой вектор, такой как плазмида, который способен к аутологичной экспрессии нуклеотидной последовательности, кодирующей иммуногенный полипептид.

F. Применение вакцин

Вакцины против S.pneumoniae, описанные в данном документе, могут использоваться для профилактического и/или терапевтического лечения S.pneumoniae. Соответственно, настоящая заявка предусматривает способ лечения субъекта, страдающего от инфекции S.pneumoniae или восприимчивого к ней, включающий введение эффективного количества любого из вакцинных составов, описанных в данном документе. В некоторых аспектах при помощи способа подавляют колонизацию S.pneumoniae у субъекта. В некоторых аспектах при помощи способа подавляют симптомы или осложнения, вызванные S.pneumoniae, такие как сепсис. Вакцинируемый субъект может быть мужчиной или женщиной, а также может быть ребенком или взрослым. В некоторых вариантах осуществления субъект, подлежащий лечению, является человеком. В других вариантах осуществления субъект представляет собой любое животное, кроме человека.

1. Профилактическое применение

В профилактических вариантах осуществления вакцину вводят субъекту для того, чтобы вызывать иммунный ответ, который может помочь защитить от закрепления S.pneumoniae, например, путем защиты от колонизации, первого и необходимого этапа заболевания. Таким образом, в некоторых аспектах при помощи способа препятствуют инфицированию S.pneumoniae неколонизированного или неинфицированного субъекта. В другом аспекте при помощи способа можно уменьшить продолжительность колонизации у индивидуума, который уже колонизирован.

В некоторых вариантах осуществления вакцинные композиции по настоящему изобретению придают защитный иммунитет, что обеспечивает возможность проявиться задержке появления симптомов или осложнений или сниженной тяжести симптомов или осложнений у вакцинированного индивидуума, в результате воздействия на него или нее вакцины. В определенных вариантах осуществления снижение тяжести симптомов или осложнений составляет по меньшей мере 25%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или даже 90%. В конкретных вариантах осуществления у провакцинированных индивидуумов могут не проявляться симптомы или осложнения при контакте с S.pneumoniae, они не подвергаются колонизации S.pneumoniae или и то, и другое. Защитный иммунитет обычно достигается с помощью одного или нескольких из следующих механизмов: мукозального, гуморального или клеточного иммунитета. Мукозальный иммунитет прежде всего является результатом секреторных антител IgA (sIGA) на слизистых поверхностях дыхательных путей, желудочно-кишечного и мочеполового трактов. Антитела sIGA вырабатываются после серии событий, опосредованных клетками, процессирующими антиген, B и T-лимфоцитами, которые приводят к продуцированию sIGA в B-лимфоцитах на выстланных слизистыми тканях тела. Гуморальный иммунитет, как правило, обусловлен антителами IgG и антителами IgM в сыворотке. Клеточный иммунитет может достигаться с помощью цитотоксических T-лимфоцитов или с помощью гиперчувствительности замедленного типа, в которую вовлечены макрофаги и T-лимфоциты, а также других механизмов, вовлекающих T-клетки без необходимости в антителах. В частности, клеточный иммунитет может опосредоваться T_H1 или T_H17-клетками.

Практически любой индивидуум имеет определенный риск инфицирования S.pneumoniae. Тем не менее, определенные подгруппы населения имеют повышенный риск инфицирования. В некоторых вариантах осуществления вакцинный состав, описываемый в данном документе (например, композиция, содержащая один или несколько полипептидов из таблицы 1 или 2, или нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды, или антитела, активные в отношении полипептидов) вводят пациентам с ослабленным иммунитетом.

Состояние ослабленного иммунитета, возникающее в результате лечения лекарственными средствами, вероятно, подвергает рассматриваемого индивидуума более высокому риску инфицирования S.pneumoniae. Возможно проведение профилактического лечения инфекции у индивидуума с состоянием ослабленного иммунитета до или во время курса лечения, известного как ослабляющее иммунную функцию. С помощью профилактического лечения антигенной композицией (например, двумя или более антигенами из таблицы 1 или 2 или нуклеиновыми кислотами, кодирующими антигены) или антителами, активными в отношении двух или более антигенов из таблицы 1 или 2, до или во время лечения, известного как ослабляющее иммунную функцию, возможно предупредить последующее инфицирование S.pneumoniae или снизить риск заражения индивидуума инфекцией из-за состояния ослабленного иммунитета. Если же индивидуум заразился инфекцией S.pneumoniae, например, после лечения, приводящего к состоянию ослабленного иммунитета, инфекцию также возможно лечить путем введения индивидууму антигенной композиции.

Следующие группы имеют повышенный риск пневмококковой инфекции или ее осложнений и, следовательно, прием вакцинного состава, описанного в данном документе предпочтителен для субъектов, попадающих в одну или несколько из этих групп: дети, особенно от 1 месяца до 5 лет или от двух месяцев до 2 лет; дети возрастом по меньшей мере 2 года с аспленией, дисфункцией селезенки или серповидно-клеточной анемией; дети возрастом по меньшей мере 2 года с нефротическим синдромом, хроническим просачиванием спинномозговой жидкости, ВИЧ-инфекцией или другими состояниями, связанными с иммуносупрессией.

В другом варианте осуществления по меньшей мере одну дозу композиции с пневмококковым антигеном дают взрослым в следующих группах с повышенным риском пневмококковой инфекции или ее осложнений: все лица в возрасте 65 лет; взрослые с аспленией, дисфункцией селезенки или серповидно-клеточной анемией; взрослые со следующими болезнями: хроническое кардиореспираторное заболевание, цирроз печени, алкоголизм, хроническая почечная недостаточность, нефротический синдром, сахарный диабет, хроническая просачивание спинномозговой жидкости, ВИЧ-инфекция, СПИД и другие состояния, связанные с иммуносупрессией (болезнь Ходжкина, лимфома, множественная миелома, иммуносупрессия при трансплантации органов), индивидуумы с кохлеарными имплантатами, индивидуумы с длительными проблемам со здоровьем, такими как заболевание сердца и заболевание легких, а также индивидуумы, которые принимают любые лекарственные средства или лечение, снижающее сопротивляемость организма к инфекции, как, например, длительно принимаемые стероиды, определенные лекарственные средства от рака, лучевая терапия; коренное население Аляски и определенные группы североамериканских индейцев.

2. Терапевтическое применение

При терапевтических применениях вакцину можно вводить пациенту, страдающему от инфекции S.pneumoniae, в количестве, достаточном для лечения пациента. В данном случае, лечение пациента относится к уменьшению симптомов, вызванных S.pneumoniae, и/или бактериальной обсемененности и/или осложнений у инфицированного индивидуума. В некоторых вариантах осуществления лечение пациента относится к сокращению продолжительности симптомов или осложнений или снижению интенсивности симптомов или осложнений. В некоторых вариантах осуществления вакцина снижает трансмиссивность S.pneumoniae от вакцинированного пациента. В определенных вариантах осуществления снижения, описанные выше, составляют по меньшей мере 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или даже 90%.

В терапевтических вариантах осуществления вакцину вводят индивидууму после инфицирования. Вакцину можно вводить вскоре после инфицирования, например, перед явным проявлением симптомов или осложнений, или ее можно вводить во время или после явного проявления симптомов или осложнений.

Терапевтическая вакцина против S.pneumoniae может снижать интенсивность или продолжительность различных симптомов или осложнений инфекции S.pneumoniae. Симптомы или осложнения инфекции S.pneumoniae могут принимать различные формы. В некоторых случаях у инфицированного пациента развивается пневмония, острый синусит, средний отит (инфекция уха), менингит, бактериемия, сепсис, остеомиелит, септический артрит, эндокардит, перитонит, перикардит, панникулит или абсцесс головного мозга.

Сепсис является редким, но опасным для жизни осложнением инфекции S.pneumoniae, когда бактерия проникает в кровоток и приводит к системному воспалению. Как правило, наблюдается лихорадка и увеличивается количество белых клеток крови. Дополнительное описание сепсиса находится в Goldstein В. et al. "International pediatric sepsis consensus conference: definitions for sepsis and organ dysfunction in pediatrics." Pediatr Crit Care Med. Jan 2005; 6(1): 2-8.

3. Анализ эффективности вакцинации

Эффективность вакцинации вакцинами, раскрытыми в данном документе, можно определить различными способами, кроме клинических результатов, описанных выше. Во-первых, можно анализировать уровни IL-17 (в частности, IL-17A) посредством стимуляции T-клеток, полученных от субъекта после вакцинации. Уровни IL-17 можно сравнить с уровнями IL-17 у того же субъекта перед вакцинацией. Повышение уровней IL-17 (например, IL-17A), как, например, 1,5-кратное, 2-кратное, 5-кратное, 10-кратное, 20-кратное, 50-кратное или 100-кратное или более повышение, будет указывать на повышенный ответ на вакцину. Альтернативно (или в сочетании) можно анализировать нейтрофилы в присутствии T-клеток или антител от пациента в отношении уничтожения пневмококков. Повышенное уничтожение пневмококков, как, например 1,5-кратное, 2-кратное, 5-кратное, 10-кратное, 20-кратное, 50-кратное или 100-кратное или более повышение, будет указывать на повышенный ответ на вакцину. Кроме того, можно измерять активацию T_H17-клеток, где повышенная активация T_H17-клеток, как, например, 1,5-кратное, 2-кратное, 5-кратное, 10-кратное, 20-кратное, 50-кратное или 100-кратное или более повышение, коррелирует с повышенным ответом на вакцину. Можно также измерять уровни антител, специфичных к вакцине, где повышенные уровни специфических антител, как, например, 1,5-кратное, 2-кратное, 5-кратное, 10-кратное, 20-кратное, 50-кратное или 100-кратное или более повышение, коррелирует с повышенной эффективностью вакцины. В определенных вариантах осуществления используют два или более из этих анализов. Например, можно измерять уровни IL-17 и уровни антител, специфичных к вакцине. Альтернативно, можно отслеживать эпидемиологические маркеры, такие как частота, тяжесть или продолжительность пневмококковой инфекции у вакцинированных индивидуумов по сравнению с невакцинированными индивидуумами.

Эффективность вакцины также можно анализировать на различных модельных системах, таких как мышиная модель. Например, можно использовать мышей линий BALB/c или C57BL/6. После введения тестируемой вакцины субъекту (в виде одной дозы или нескольких доз) экспериментатор вводит дозу контрольного заражения S.pneumoniae. В некоторых случаях дозы контрольного заражения, введенной интраназально, достаточно, чтобы вызвать колонизацию S.pneumoniae (особенно колонизацию носа) у невакцинированного животного, и в некоторых случаях дозы контрольного заражения, введенной путем аспирации, достаточно, чтобы вызвать сепсис и высокий уровень летальности у невакцинированных животных. Затем можно измерять снижение колонизации или снижение летальности у вакцинированных животных. В примерах 5-8 и 10 показана эффективность полипептидов из таблицы 1 в подавлении колонизации S.pneumoniae носа после интраназального контрольного заражения на мышиной модели. В примерах 11 и 12 показана эффективность полипептидов из таблицы 1 в защите от сепсиса и смерти после заражения S.pneumoniae путем аспирации на мышиной модели.

G. Применение иммуногенных композиций

1. Защита против инфекции S.pneumoniae

Иммуногенные композиции по настоящему раскрытию разработаны, чтобы вызвать иммунный ответ против S.pneumoniae. Композиции, описанные в данном документе (например, содержащие один или несколько полипептидов из таблицы 1 или 2 или нуклеиновые кислоты, кодирующие данные полипептиды), могут стимулировать образование антител или клеточно-опосредованный иммунный ответ, или их оба у млекопитающего, которому введены. В некоторых вариантах осуществления композиция стимулирует T_H1-смещенный CD4⁺ T-клеточный ответ, T_H17-смещенный CD4⁺ T-клеточный ответ и/или CD8⁺ T-клеточный ответ. В некоторых вариантах осуществления композиция стимулирует образование антител. В некоторых вариантах осуществления композиция стимулирует T_H1-смещенный CD4⁺ T-клеточный ответ, T_H17-смещенный CD4⁺ T-клеточный ответ и/или CD8⁺ T-клеточный ответ и образование антител.

В определенных вариантах осуществления композиция (например, содержащая один или несколько полипептидов из таблицы 1 или 2, или нуклеиновые кислоты, кодирующие данные полипептиды, или антитела, активные в отношении пептидов) включает цитокин или нуклеотидный кодирующий участок, кодирующий цитокин, такой как IL-17, для обеспечения дополнительной стимуляции иммунной системы млекопитающего. В определенных вариантах осуществления композиция содержит цитокин, такой как IL-17.

Без желания ограничиваться теорией, в некоторых вариантах осуществления T_H17-клеточный ответ требуется для увеличения иммунного ответа на композиции, раскрытые в данном документе, например, содержащие один или несколько полипептидов из таблицы 1 или 2. В определенных вариантах осуществления активный T_H17-ответ является преимущественным для устранения пневмококковой инфекции. Например, у мышей, не имеющих рецептора к IL-17A, показана сниженная защита, обусловленная цельноклеточными вакцинами, от контрольного пневмококкового заражения (Lu et al., "Interleukin-17A mediates acquired immunity to pneumococcal colonization" PLoS Pathog. 2008 Sep 19; 4(9)).

Таким образом, в данном документе предусмотрен способ повышения продуцирования IL-17 с помощью введения субъекту композиций, описанных в данном документе (например, содержащих один или несколько полипептидов из таблицы 1 или 2). Более того, настоящая заявка предусматривает способ активации T_H17-клеток с помощью введения указанных композиций субъекту. В определенных вариантах осуществления повышенные уровни IL-17A приводят к повышенному уничтожению пневмококков нейтрофилами и нейтрофилоподобными клетками, например, вызывают рекрутинг и активацию нейтрофилов и нейтрофилоподобных клеток. В определенных вариантах осуществления такое уничтожение пневмококков не зависит от антител и комплемента. Однако продуцирование специфических антител и активация комплемента могут представлять собой полезные дополнительные механизмы, которые способствуют устранению пневмококковой инфекции.

Также предусматриваются иммуногенные композиции, содержащие иммуногенные полипептиды или полинуклеотиды, кодирующие иммуногенные полипептиды, вместе с фармацевтическим носителем.

В некоторых случаях иммуногенная композиция содержит одну или несколько нуклеиновых кислот, кодирующих один или несколько полипептидов с SEQ ID NO: 1-13, 265, 266 и 267, как, например, одна или несколько нуклеиновых кислот, выбранных из SEQ ID NO: 24-31, 271, 272 и 273. В некоторых вариантах осуществления эти нуклеиновые кислоты экспрессируются в иммунизированном индивидууме, при этом продуцируются кодируемые антигены S.pneumoniae, и антигены S.pneumoniae, полученные таким образом, могут вызывать иммуностимулирующий эффект у иммунизированного индивидуума.

Такая иммуностимулирующая композиция, содержащая нуклеиновую кислоту, может содержать, например, начало репликации и промотор, управляющий экспрессией одной или нескольких нуклеиновых кислот, кодирующих один или несколько полипептидов в SEQ ID NO: 1-13, 265, 266 и 267. Такая композиция может также содержать бактериальной плазмидный вектор, в который вставлен промотор (иногда сильный вирусный промотор), одна или несколько нуклеиновых кислот, кодирующих один или несколько полипептидов с SEQ ID NO: 1-13, 265, 266 и 267, и последовательность полиаденилирования/завершения транскрипции. В некоторых случаях нуклеиновая кислота представляет собой ДНК.

H. Применения в диагностических целях

Настоящая заявка предусматривает, inter alia, быстрый, дешевый, чувствительный и специфичный способ обнаружения S.pneumoniae у пациентов. В этом отношении он должен быть полезен для всех лечебных учреждений и врачей, обследующих и лечащих пациентов с инфекцией S.pneumoniae или риском ее возникновения. Наборы для обнаружения могут быть достаточно простыми для установки в любой местной больничной лаборатории, а антитела и их антиген-связывающие части могут быть совершенно доступны для всех лечебных учреждений, проводящих лечение пациентов с инфекцией S.pneumoniae или риском ее возникновения. Как используется в данном документе, "пациент" относится к индивидууму (такому как человек), у которого имеется инфекция S.pneumoniae, либо он имеет возможность контакта с инфекцией S.pneumoniae. Пациент может представлять собой индивидуума (такого как человек), у которого имеется инфекция S.pneumoniae, который имеет возможность контакта с инфекцией S.pneumoniae, который выздоровел от инфекции S.pneumoniae, и/или индивидуума, инфекционный статус которого неизвестен.

В некоторых вариантах осуществления для обнаружения S.pneumoniae у индивидуума можно выполнять диагностический анализ с использованием двух или более антител, каждое из которых связывает один из антигенов из таблицы 1 или 2. В некотором варианте осуществления один из антигенов представляет собой SEQ ID NO: 265, 266 или 268. Настоящее раскрытие также предусматривает способ фенотипирования биологических образцов от пациентов с подозрением на инфекцию S.pneumoniae: (a) получение биологического образца от пациента; (b) обеспечение контакта образца с двумя или более антителами, специфичными к S.pneumoniae, или их антитело-связывающими частями в условиях, которые обеспечивают связывание антитела или антиген-связывающего части с эпитопом S.pneumoniae; где связывание указывает на присутствие S.pneumoniae в образце. В некоторых вариантах осуществления связывание с биологически образцом сравнивают со связыванием этого же антитела с тканью отрицательного контроля, где в случае, если биологический образец показывает присутствие S.pneumoniae в сравнении с тканью отрицательного контроля, пациента идентифицируют как вероятно имеющего инфекцию S.pneumoniae. В некоторых случаях связывание одного антитела указывает на присутствие S.pneumoniae; в других случаях связывание двух или более антител указывает на присутствие S.pneumoniae. Вышеупомянутое тестирование может быть соответствующим образом приспособлено для обнаружения других бактериальных инфекций, например, путем использования антитела, с иммунной активностью к гомологу (от другого вида бактерий) одного из белков, описанных в таблице 1. В некоторых вариантах осуществления антитела, индуцированные в ответ на белок S.pneumoniae из таблицы 1 или 2, будут также связывать гомолог от другого вида Streptococcus, особенно если гомологи имеют высокий процент идентичности последовательности.

Альтернативно, для обнаружения антител к S.pneumoniae у индивидуума можно применять антиген из таблицы 1 или 2 (такой как SEQ ID NO: 265, 266 или 268). Настоящее раскрытие также предусматривает способ фенотипирования биологических образцов пациентов с подозрением на инфекцию S.pneumoniae: (a) получение биологического образца от пациента; (b) обеспечение контакта образца с двумя или более антителами, специфичными к S.pneumoniae, выбранными из таблицы 1 или 2, или их частями в условиях, которые обеспечивают возможность связывания антигена (или его части) с любыми антителами хозяина, присутствующими в образце; где связывание указывает на присутствие антител к S.pneumoniae в образце. В некоторых вариантах осуществления связывание с биологическим образцом сравнивают со связыванием этого же антигена с тканью отрицательного контроля, где, если биологический образец показывает присутствие антител к S.pneumoniae по сравнению с тканью отрицательного контроля, пациента идентифицируют как возможно либо (1) имеющего инфекцию S.pneumoniae, либо (2) имевшего инфекцию S.pneumoniae в прошлом. В некоторых случаях обнаружение одного антитела указывает на текущую или прошлую инфекцию S.pneumoniae; в других случаях обнаружение двух или более антител указывает на текущую или прошлую инфекцию S.pneumoniae. Вышеупомянутое тестирование может быть соответствующим образом скорректировано для обнаружения других бактериальных инфекций, например, путем использования гомолога (от другого вида бактерий, например, вида стрептококков) белков, описанных в таблице 1.

В некоторых вариантах осуществления клеточный иммунный ответ клетки млекопитающего может быть количественно оценен ex vivo. Способ для такой количественной оценки включает введение композиций, раскрытых в данном документе, в T-клетку млекопитающего ex vivo и количественную оценку изменения продукции цитокинов в T-клетке млекопитающего в ответ на композицию. В этих способах цитокин может представлять собой, например, IL-17.

Связывание антитела против S.pneumoniae с антигеном (например, полипептидом из таблицы 1 или 2, таким как SEQ ID NO: 265, 266 или 268) можно измерять с использованием любого подходящего способа. Такие способы включают ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), вестерн-блоттинг, анализ конкурентного связывания и спот-блоттинг. Этап обнаружения может быть, например, хемилюминесцентным, флуоресцентным или колориметрическим. Подходящим способом измерения связывания антитело-белок является система Luminex xMAP, где пептиды связываются с микросферой, содержащей краситель. Некоторые системы, в том числе системе xMAP, пригодны для измерения несколько различных маркеров в мультиплексе, и они могут использоваться для одновременного измерения уровней антител. В некоторых вариантах осуществления для анализа нескольких маркеров в мультиплексе используются другие системы. Например, анализ спектра антител может выполняться с использованием следующих систем: микрочипы с антигенами, микрочипы на гранулах, технология на основе частиц-«наноштрих-кодов», упорядоченные белковые матрицы из библиотек экспрессии кДНК, белковые матрицы in situ, белковые матрицы из живых трансформантов, универсальная белковая матрица, микрофлюидная лаборатория на чипе и пептиды на «булавках». Другим типом клинического анализа является хемилюминесцентный анализ для обнаружения связывания антител. В некоторых таких анализах, в том числе в анализе против HCV VITROS Eci, антитела связываются с твердофазной подложкой, изготовленной из микрочастиц в жидкой суспензии, а поверхностный флуориметр используют для количественной оценки ферментативного образования флуоресцентного продукта.

В некоторых вариантах осуществления, если биологический образец демонстрирует присутствие S.pneumoniae (например, при обнаружении одного или нескольких полипептидов из таблицы 1 или 2, таких как SEQ ID NO: 265, 266 или 268, или антитела, которое связывает один из указанных полипептидов), пациенту можно вводить терапевтически эффективное количество композиций и терапий, описанных в данном документе. Биологический образец может включать, например, кровь, сперму, мочу, влагалищные выделения, слизь, слюну, фекалии, мочу, спинномозговую жидкость или образец ткани. В некоторых вариантах осуществления биологический образец представляет собой орган, предназначенный для трансплантации. В определенных вариантах осуществления перед этапом обнаружения биологический образец подвергают культивированию при условиях, которые способствуют росту S.pneumoniae.

Диагностические тесты в данном документе (например, обнаруживающие полипептид из таблицы 1 или 2, такой как SEQ ID NO: 265, 266 или 268, или антитело, которое связывает один из указанных полипептидов) могут использоваться для обнаружения S.pneumoniae в различных образцах, в том числе образцах, взятых от пациентов, и образцах, полученных из других источников. Например, диагностические тесты можно использовать для обнаружения S.pneumoniae в продуктах питания, напитках или ингредиентах для продуктов питания и напитков; на объектах, таких как медицинские инструменты, медицинские устройства, такие как кохлеарные имплантаты и кардиостимуляторы, обувь, одежда, мебель, в том числе мебель лечебных учреждений, и шторы, в том числе шторы лечебных учреждений; или в образцах, взятых из окружающей среды, таких как растительные образцы. В некоторых вариантах осуществления тесты в данном документе могут выполняться на образцах, взятых от животных, таких как сельскохозяйственные животные (коровы, свиньи, куры, козы, лошади и т.п.), домашние животные (собаки, кошки, птицы и т.п.) или дикие животные. В определенных вариантах осуществления тесты в данном документе могут выполняться на образцах, взятых из клеточных культур, таких как культуры человеческих клеток, которые продуцируют терапевтический белок, культуры бактерий, предназначенные для продукции полезной биологической молекулы, или культуры клеток, выращенных для исследовательских целей.

Данное раскрытие также предусматривает способ определения локализации инфекции S.pneumoniae у пациента, включающий: (а) введение пациенту фармацевтической композиции, содержащей меченое антитело к S.pneumoniae или его антиген-связывающую часть и (б) обнаружение метки, где связывание указывает на инфекцию S.pneumoniae в определенной локализации у пациента. Такая диагностика также может включать сравнение уровней связывания у пациента с контролем. В определенных вариантах осуществления способ дополнительно включает, если у пациента имеется инфекция S.pneumoniae, лечение инфекции путем введения пациенту терапевтически эффективного количества антитела или его антиген-связывающего участка, связывающих S.pneumoniae. В определенных вариантах осуществления способ дополнительно включает, если у пациента имеется инфекция S.pneumoniae, лечение инфекции путем введения пациенту терапевтически эффективного количества белка S.pneumoniae из таблицы 1 или 2, или его иммуногенной части. Способ может дополнительно включать определение локализации и/или интенсивности S.pneumoniae у пациента. Этот способ может использоваться для оценки распространения S.pneumoniae у пациента и для определения того, где целесообразна локализованная терапия.

В некоторых вариантах осуществления антитела или T-клетки против S.pneumoniae, описанные в данном документе, могут использоваться для прогнозирования течения инфекции. В некоторых вариантах осуществления антитела или T-клетки против S.pneumoniae, описанные в данном документе, можно обнаруживать в образце, взятом у пациента. Если антитела или T-клетки присутствуют на нормальных уровнях, это будет указывать на то, что у пациента развился иммунный ответ против S.pneumoniae. Если антитела или T-клетки отсутствуют или присутствуют со сниженными уровнями, это будет указывать на то, что у пациента не может развиться достаточный ответ против S.pneumoniae, и будет рекомендовано белее агрессивное лечение. В некоторых вариантах осуществления «антитела или T-клетки, присутствующие на сниженном уровне» относится к антителам, которые присутствуют на уровне менее 50%, 20%, 10%, 5%, 2% или 1% от уровня антител или T-клеток, обычного у пациента с нормальной иммунной системой. Антитела можно обнаруживать по аффинности в отношении любого из антигенов, описанных в данном документе (например, приведенных в таблице 1 и/или 2), например, с помощью ELISA. T-клетки можно обнаруживать по ex vivo ответам в отношении любого из антигенов, описанных в данном документе (например, приведенных в таблице 1 и/или 2), например, с помощью анализов ELISA или ELISPOT.

В некоторых вариантах осуществления обнаружение специфичных антигенов S.pneumoniae (например, приведенных в таблице 1 и/или 2, таких как SEQ ID NO: 265, 266 или 268) можно использовать для прогнозирования развития и симптомов инфекции S.pneumoniae у пациента. Специалисту в данной области техники будет понятно, что способы по данному документу не ограничиваются обнаружением S.pneumoniae. Другие варианты осуществления включают обнаружение родственных бактерий, в том числе бактерий с белками, гомологичными белкам, описанным в таблице 1 или 2. Такие родственные бактерии включают, например, другие штаммы Streptococcus.

I. Дозы и пути введения

1. Лекарственные формы, количества и интервалы приема

Количество антигена в каждой дозе вакцины или иммуногенной композиции выбирают как эффективное количество, которое вызывает профилактический или терапевтический ответ, как описано выше, или при разовой дозе, или за несколько доз. Предпочтительно, доза не имеет выраженных побочных эффектов для обычных вакцин. Такое количество будет варьировать в зависимости от того, какой конкретный антиген используется. Обычно предполагается, что доза будет содержать 1-1000 мкг каждого белка, в некоторых случаях 2-100 мкг, например 4-40 мкг. В некоторых аспектах вакцинный состав содержит 1-1000 мкг полипептида и 1-250 мкг адъюванта. В некоторых вариантах осуществления подходящее количество антигена, подлежащего доставке, будет зависеть от возраста, веса и состояния здоровья (например, состояния ослабленного иммунитета) субъекта. Если он присутствует, как правило, адъювант будет иметь количество от 1 мкг до 250 мкг на дозу, например 50-150 мкг, 75-125 мкг или 100 мкг.

В некоторых вариантах осуществления только одну дозу вакцины вводят для достижения результатов, описанных выше. В других вариантах осуществления после первичной вакцинации субъект получает одну или несколько бустерных вакцинаций, в общей сложности две, три, четыре или пять вакцинаций. Преимущественно, число составляет три или менее. Бустерную вакцинацию можно вводить, например, через приблизительно 1 месяц, 2 месяца, 4 месяца, 6 месяцев или 12 месяцев после первичной вакцинации, так что одна схема вакцинации включает введение в 0, 0,5-2 и 4-8 месяцы. Преимущественным может быть введение дробных доз вакцин, которые могут вводиться одним или различным путями.

Вакцины и иммуногенные композиции, описанные в данном документе, могут приобретать вид множества лекарственных форм. В определенных вариантах осуществления композиция предусматривается в твердой или порошкообразной (например, лиофилизированной) форме; она также может предусматриваться в виде раствора. В определенных вариантах осуществления лекарственная форма предусматривается в виде дозы лиофилизованной композиции и по меньшей мере одного отдельного стерильного контейнера с разбавителем.

В некоторых вариантах осуществления композиция будет вводиться способом с повышением дозы таким образом, что последующие введения композиции содержат более высокую концентрацию композиции, чем предыдущие введения. В некоторых вариантах осуществления композиция будет вводиться таким образом, что последующие введения композиции содержат более низкую концентрацию композиции, чем предыдущие ведения.

При терапевтических применениях композиции вводят пациенту, страдающему от заболевания, в количестве, достаточном для лечения пациента. Терапевтические применения композиции, описанной в данном документе, включают снижение трансмиссивности, замедление прогрессирования заболевания, снижение жизнеспособности или репликации бактерий или подавление экспрессии белков, требуемых для токсичности, как, например, на 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20% или 10% от уровней, при которых они должны наблюдаться у индивидуумов, которых не обрабатывали композицией.

В профилактических вариантах осуществления композиции вводят человеку или другому млекопитающему, чтобы вызвать иммунный ответ, который может подавлять закрепление инфекционного заболевания или другого состояния. В некоторых вариантах осуществления композиция может частично препятствовать бактериям в закреплении инфекции.

В некоторых вариантах осуществления композиции вводят в комбинации с антибиотиками. Это совместное введение особенно уместно, когда фармацевтическую композицию вводят пациенту, который не так давно подвергался действию (или как подозревают, в последнее время подвергался действию) S.pneumoniae. Для лечения пневмококковой инфекции используют множество антибиотиков, в том числе пенициллин, амоксициллин, амоксициллин/клавуланат, цефуроксим, цефотаксим, цефтриаксон и ванкомицин. Подходящий антибиотик можно выбирать, исходя из типа и тяжести инфекции, а также любой известной устойчивости к антибиотикам у инфекции (Jacobs M.R. "Drug-resistant Streptococcus pneumoniae: rational antibiotic choices" Am J Med. 1999 May 3; 106 (5A): 19S-25S).

2. Пути введения

Вакцинные составы и фармацевтические композиции по данному документу можно доставлять путем введения индивидууму, как правило, путем системного введения (например, внутривенным, внутрибрюшинным, внутримышечным, внутрикожным, подкожным, субдермальным, чрескожным, внутричерепным, интраназальным, мукозальным, анальным, вагинальным, пероральным, буккальным путем, или их можно вдыхать), или они могут вводиться путем местной аппликации. В некоторых вариантах осуществления путь введения является внутримышечным. В других вариантах осуществления путь введения является подкожным. В еще одних вариантах осуществления путь введения является мукозальным. В определенных вариантах осуществления путь введения является чрескожным или внутрикожным.

Определенные пути введения являются особенно подходящими для вакцинных составов и иммуногенных композиций, содержащих определенные адъюванты. В частности, трансдермальное введение является одним из подходящих путей введения для вакцин против S.pneumoniae, содержащих токсины (например, холерный энтеротоксин или лабильный токсин); в других вариантах осуществления введение является интраназальным. Вакцины, составленные с репликонами альфавируса, можно вводить, например, внутримышечным или подкожным путем. Вакцины, содержащие монофосфориллипид A (MPL), димиколат трегалозы (TDM) и диоктадецилдиметиламмония бромид (DDA), подходят (inter alia) для внутримышечного и подкожного введения. Вакцина, содержащая резиквимод, может вводиться, например, местно или подкожно.

3. Составы

Вакцинный состав или иммуногенная композиция может подходить для введения пациенту-человеку, и препарат вакцинной или иммуногенной композиции может соответствовать нормам USFDA. В некоторых вариантах осуществления вакцинный состав или иммуногенная композиция подходит для введения животному, кроме человека. В некоторых вариантах осуществления вакцинная или иммуногенная композиция практически не содержит ни эндотоксинов, ни экзотоксинов. Эндотоксины могут включать пирогены, такие как липополисахаридные (LPS) молекулы. Вакцинная или иммуногенная композиция может также практически не содержать неактивных белковых фрагментов, которые могут вызывать лихорадку или другие побочные эффекты. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит менее 1%, менее 0,1%, менее 0,01%, менее 0,001% или менее 0,0001% эндотоксинов, экзотоксинов и/или неактивных белковых фрагментов. В некоторых вариантах осуществления вакцинная или иммуногенная композиция имеет более низкие уровни пирогенов, чем промышленная вода, водопроводная вода или дистиллированная вода. Другие компоненты вакцинной или иммуногенной композиции можно очищать с использованием способов, известных в данной области техники, таких как ионообменная хроматография, ультрафильтрация или дистилляция. В других вариантах осуществления пирогены можно инактивировать или разрушать до введения пациенту. Сырьевые материалы для вакцин, такие как вода, буферы, соли и другие химические вещества, также можно подвергнуть скринингу и удалению пирогенов. Все материалы в вакцине могут быть стерильными, и каждая партия вакцин может тестироваться на стерильность. Таким образом, в определенных вариантах осуществления уровни эндотоксина в вакцине опускаются ниже уровней, установленных USFDA, например, 0,2 единицы эндотоксина (EU)/кг продукта для интратекальной инъекционной композиции; 5 EU/кг продукта для неинтратекальной инъекционной композиции и 0,25-0,5 EU/мл для стерильной воды.

В определенных вариантах осуществления препарат содержит менее 50%, 20%, 10% или 5% (по сухому весу) загрязняющего белка. В определенных вариантах осуществления требуемая молекула представлена при фактическом отсутствии других биологических макромолекул, таких как другие белки (в частности, другие белки, которые могут практически маскировать, уменьшать, перепутывать или изменять характеристики составляющих белков либо в очищенных препаратах, либо их функции в заявленной восстановленной смеси). В определенных вариантах осуществления присутствуют по меньшей мере 80%, 90%, 95%, 99% или 99,8% (по сухому весу) биологических макромолекул одного типа (однако могут присутствовать вода, буферы и другие малые молекулы, особенно молекулы, имеющие молекулярный вес менее 50000,). В некоторых вариантах осуществления вакцинная или иммуногенная композиция, содержащая очищенные субъединичные белки, содержит менее 5%, 2%, 1%, 0,5%, 0,2%, 0,1% белков из клетки-хозяина, где экспрессировались данные субъединичные белки, относительно количества очищенных субъединиц. В некоторых вариантах осуществления требуемые полипептиды практически не содержат нуклеиновые кислоты и/или углеводы. Например, в некоторых вариантах осуществления вакцинная или иммуногенная композиция содержит менее 5%, менее 2%, менее 1%, менее 0,5%, менее 0,2% или менее 0,1% ДНК и/или РНК клетки-хозяина. В определенных вариантах осуществления в препарате присутствует по меньшей мере 80%, 90%, 95%, 99% или 99,8% (по сухому весу) биологических макромолекул одного типа (однако могут присутствовать вода, буферы и другие малые молекулы, особенно молекулы, имеющие молекулярный вес менее 5000).

Предпочтительно, чтобы вакцинная или иммуногенная композиция обладала низкой токсичностью, или она отсутствовала, в пределах целесообразного соотношения риск-польза. В определенных вариантах осуществления вакцинная или иммуногенная композиция содержит ингредиенты в концентрациях, меньших, чем измерения LD₅₀ для животного, подлежащего вакцинации. Измерения LD₅₀ можно получать на мышах или других экспериментальных модельных системах и экстраполировать на людей и других животных. Способы оценки LD₅₀ соединений у человека и других животных хорошо известны в данной области техники. Вакцинный состав или иммуногенная композиция и любой компонент в ней могут иметь значение LD₅₀ для крыс более 100 г/кг, более 50 г/кг, более 20 г/кг, более 10 г/кг, более 5 г/кг, более 2 г/кг, более 1 г/кг, более 500 мг/кг, более 200 мг/кг, более 100 мг/кг, более 50 мг/кг, более 20 мг/кг или более 10 мг/кг. Вакцинный состав или иммуногенная композиция, которая содержит токсин, такой как ботулотоксин (который может использоваться в качестве адъюванта), должна содержать существенно меньше LD₅₀ ботулотоксина.

Составы, подходящие для введения вакцинных составов или фармацевтической композиции, варьируют в зависимости от пути введения. Составы, подходящие для парентерального введения, такого как, например, внутрисуставное (в суставы), внутривенное, внутримышечное, внутрикожное, внутрибрюшинное, интраназальное и подкожное, включают водные и неводные изотонические стерильные растворы для инъекций, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатические факторы и растворенные вещества, которые делают состав изотоничным с кровью предполагаемого реципиента, а также водные и неводные стерильные суспензии, которые могут включать суспендирующие средства, солюбилизаторы, загустители, стабилизаторы и консерванты. Составы могут быть представлены в однодозовых или в многодозовых герметизированных контейнерах, таких как ампулы и флаконы.

Растворы и суспензии для инъекции можно приготовить из стерильных порошков, гранул и таблеток ранее описанного типа. В случае адоптивного переноса терапевтических T-клеток, клетки могут вводиться внутривенно или парентерально.

Составы, пригодные для перорального введения, могут состоять из (a) жидких растворов, как, например, эффективное количество полипептидов или упакованных нуклеиновых кислот, суспендированных в разбавителях, таких как вода, физиологический раствор или PEG 400; (b) капсул, саше или таблеток, каждая из которых содержит заранее определенное количество активного ингредиента в виде жидкостей, твердых веществ, гранул или желатина; (c) суспензий в подходящей жидкости и (d) подходящих эмульсий. Таблетированные формы могут включать одно или несколько из лактозы, сахарозы, маннита, сорбита, фосфатов кальция, кукурузного крахмала, картофельного крахмала, трагаканта, микрокристаллической целлюлозы, гуммиарабика, желатина, коллоидного диоксида кремния, кроскармеллозы натрия, талька, стеарата магния, стеариновой кислоты и других наполнителей, пигментов, заполнителей, связующих веществ, разбавителей, буферных средств, увлажняющих средств, консервантов, ароматизаторов, красителей, разрыхлителей и фармацевтически совместимых носителей. Леденцовые формы могут содержать активный ингредиент в ароматизаторе, обычно в сахарозе и гуммиарабике или трагаканте, также как пастилки, содержащие активный компонент в инертной основе, такой как желатин и глицерин или сахароза и эмульсия гуммиарабика, гели и т.п., содержащие кроме активного ингредиента носители, известные в данной области техники. Фармацевтические композиции могут быть инкапсулированы, например, в липосомы, или в состав, который предусматривает медленное высвобождение активного ингредиента.

Антигены, отдельно или в комбинации с другими подходящими компонентами, можно получать в аэрозольных составах (например, их можно "распылять") для введения с помощью ингаляции. Аэрозольные составы можно помещать в находящиеся под давлением подходящие пропелленты, такие как дихлордифторметан, пропан, азот и т.п. Аэрозольные составы могут доставляться перорально или назально.

Подходящие составы для вагинального или ректального введения включают, например, суппозитории, которые состоят из полипептидов или упакованных нуклеиновых кислот с основой суппозитория. Подходящие основы суппозитория включают природные или синтетические триглицериды или парафиновые углеводороды. Кроме того, можно также применять желатиновые ректальные капсулы, которые состоят из комбинации полипептидов или упакованных нуклеиновых кислот с основой, включающей, например, жидкие триглицериды, полиэтиленгликоли и парафиновые углеводороды.

J. Подготовка и хранение вакцинных составов и иммуногенных композиций

Вакцинные и иммуногенные композиции против S.pneumoniae, описанные в данном документе, можно получать с использованием различных методик. Например, полипептид можно получить с использованием технологии рекомбинантной ДНК в подходящей клетке-хозяине. Подходящая клетка-хозяин может представлять собой бактериальную, дрожжевую клетку, клетку млекопитающего или клетку другого типа. Клетку-хозяина можно модифицировать для экспрессии экзогенной копии одного из соответствующих генов полипептида. Как правило, ген функционально связан с соответствующими регуляторными последовательностями, такими как сильный промотор и последовательность полиаденилирования. В некоторых вариантах осуществления промотор является индуцируемым или репрессируемым. Другие регуляторные последовательности могут предусматривать секрецию или экскрецию представляющего интерес полипептида или удержание представляющего интерес полипептида в цитоплазме или в мембране в зависимости от того, как желают очищать полипептид. Ген может присутствовать на внехромосомной плазмиде или может интегрироваться в геном хозяина. Специалисту в данной области техники будет понятно, что не обязательно использовать нуклеиновую кислоту на 100% идентичную последовательности, встречающейся в природе. Напротив, некоторые изменения в этих последовательностях допустимы и могут быть желательными. Например, нуклеиновую кислоту можно изменять, воспользовавшись вырожденностью генетического кода таким образом, что кодируемый полипептид остается тем же. В некоторых вариантах осуществления ген является кодон-оптимизированным для улучшения экспрессии в конкретном хозяине. Нуклеиновую кислоту можно получать, например, с помощью ПЦР или путем химического синтеза.

После того, как получена рекомбинантная клеточная линия, из нее можно выделять полипептид. Выделение может осуществляться, например, с помощью методик аффинной очистки или методик физического разделения (например, колонка для разделения по размеру).

В дополнительном аспекте настоящего раскрытия предусматривается способ производства, включающий смешивание одного или нескольких полипептидов или их иммуногенного фрагмента или варианта с носителем и/или адъювантом.

В некоторых вариантах осуществления антигены для включения в вакцинные составы и иммуногенные композиции можно получать в культуре клеток. Один способ включает обеспечение одного или нескольких векторов для экспрессии и клонирование нуклеотидов, кодирующих один или несколько полипептидов, выбранных из полипептидов, имеющих аминокислотную последовательность из таблицы 1 или 2, такую как SEQ ID NO: 265, 266 или 268, затем осуществление экспрессии и выделения полипептидов.

Иммуногенные полипептиды, описанные в данном документе, и композиции нуклеиновых кислот, которые экспрессируют полипептиды, могут быть упакованы в пакеты, дозирующие устройства и наборы для введения композиций нуклеиновых кислот млекопитающему. Например, предусматриваются пакеты или дозирующие устройства, содержащие одну или несколько единичных лекарственных форм. Обычно вместе с упаковкой предусматриваются инструкции для введения соединений, наряду с соответствующим указанием на этикетке, что соединение подходит для лечения указанного состояния, такого как раскрытые в данном документе.

V. Примеры

Пример 1. Идентификация антигенов и объединенные скрининги на мышах

Каждую открытую рамку считывания, предсказанную в геноме S.pneumoniae TIGR4, клонировали в вектор для экспрессии, содержащий метку, которая дает возможность презентироваться с помощью главного комплекса гистосовместимости (MHC). Затем каждый конструкт экспрессировали в Е.coli и экспрессию полной длины подтверждали с помощью заместительного анализа, который идентифицирует метку в связи с МНС. Скрининг описан подробнее в международной заявке WO 2010/002993. Чтобы облегчить скрининг большой библиотеки, библиотеки объединяли таким образом, что в каждой лунке присутствовало по четыре индуцированных клона библиотеки. Для проведения скрининга T-клеток от мышей, иммунизированных против S.pneumoniae, аликвоту объединенной библиотеки добавляли к макрофагам перитонеального происхождения. Макрофагам обеспечили возможность связать антигены S.pneumoniae с меткой с помощью MHC. Через 2 ч. при 37°C макрофаги промывали PBS. Затем макрофаги фиксировали 1% параформальдегидом в течение 15 мин. и интенсивно промывали PBS. В каждую лунку добавляли 105 T-клеток в 200 мкл среды RP-10. T-клетки были предварительно выделены от мышей, дважды иммунизированных убитыми бактериями S.pneumoniae с адъювантом, холерным энтеротоксином. Аналитические планшеты инкубировали в течение 72 ч. при 37°C. Количество IL-17 в надосадочной жидкости каждой лунки определяли с применением анализа ELISA для IL-17. Порог для положительного результата установили как два стандартных отклонения выше среднего всех образцов.

Пример 2. Деконволюция положительных мышиных пулов

Второй скрининг использовали для определения того, какой антиген(ы) из четырех клонов в каждой лунке вызвал положительный ответ, наблюдаемый в объединенном скрининге, описанном в примере 1. Всеми клонами из каждого положительного пула индивидуально сенсибилизировали перитонеальные макрофаги в лунках в двух повторностях. T-клетки, выделенные от иммунизированных мышей с таким же генетическим фоном, что и при первоначальном скрининге, использовали для скрининга сенсибилизированных макрофагов с помощью анализа на IL-17, описанного в примере 1. Индивидуальные антигены, которые вызывали усредненный ответ в лунках в двух повторностях больший, чем два стандартных отклонения сверх среднего для отрицательных контрольных образцов, рассматривали как положительные ответы. Плазмиды библиотеки, присутствующие в этих положительных клонах, секвенировали для подтверждения идентичности антигена. С применением данного способа подтвердили антигены SP1574, SP1655, SP2106, SP0148, SP1473, SP0605, SP1177, SP0335, SP0906, SP1828, SP2157, SP1229, SP1128, SP1836, SP1865, SP0904, SP0882, SP0765, SP1634, SP0418, SP1923, SP1313, SP0775, SP0314, SP0912, SP0159, SP0910, SP2148, SP1412, SP0372, SP1304, SP2002, SP0612, SP1988, SP0484, SP0847, SP1527, SP0542, SP0441, SP0350, SP0014, SP1965, SP0117 и SP2108.

Пример 3. Идентификация антигенов и объединенные скрининги на человеке

CD4+ T-клетки и CD14⁺ моноциты выделяли из периферической крови, полученной от доноров-людей. Моноциты дифференцировали в дендритные клетки путем культивирования их в среде, содержащей GM-CSF и IL-4, фактически как описано в Tedder T.F. и Jansen P.J. (1997 "Isolation and generation of human dendritic cells." Current Protocols in Immunology Supp 23: 7.32.1-7.32.16). После пяти дней культивирования дендритные клетки высевали на 384-луночные планшеты. CD4⁺ T-клетки неспецифично размножали в культуре для обеспечения их достаточного количества.

Каждую открытую рамку считывания, предсказанную в геноме S.pneumoniae TIGR4, клонировали в вектор для экспрессии, содержащий метку, которая дает возможность презентироваться с помощью главного комплекса гистосовместимости (MHC). Затем каждый конструкт экспрессировали в Е.coli, и экспрессию полной длины подтверждали с помощью заместительного анализа, который идентифицирует метку в связи с MHC. Чтобы облегчить скрининг большой библиотеки, библиотеку объединяли таким образом, что в каждой лунке присутствовали по четыре индуцированных клона библиотеки. Для проведения скрининга T-клеток человека аликвоту из объединенной библиотеки добавляли к дендритным клеткам, высеянным в 384-луночные планшеты. Через 2 ч. при 37°C дендритные клетки фиксировали 1% параформальдегидом в течение 15 мин. и интенсивно промывали фосфатным буфером и лизиновым буфером. В каждую лунку 384-луночного планшета добавляли 40000 CD4⁺ T-клеток в 70 мкл среды RP-10. Аналитические планшеты инкубировали в течение 3 дней при 37°C. Количество IL-17 в надосадочной жидкости каждой лунки определяли с помощью анализа ELISA в отношении IL-17. В разных повторах скрининга порог для положительного результата установили как два стандартных отклонения выше среднего всех образцов, два стандартных отклонения выше среднего отрицательных контролей или 1,78 медианного абсолютного отклонения для набора данных. Затем была проведена деконволюция положительных пулов, как описано в примере 4.

Пример 4. Деконволюция положительных пулов человека

Для всех антигенов деконволюцию выполняли путем сравнения результатов скринингов двух пулов. В этом способе подготавливали два разных набора пулов, так что полипептид в первом и втором пулах находился с тремя различными полипептидами. Следовательно, можно определить, какие полипептиды представляют собой антигены с помощью идентификации того, какие полипептиды находятся в положительных пулах одновременно в первом и втором наборах. В этом способе деконволюции пул идентифицировали как положительный, если значение для него составляло по меньшей мере 1,78 медианного абсолютного отклонения для набора данных.

Антиген идентифицировали как положительный «хит», если он был положительным по меньшей мере в двух повторных вторичных скринингах. С помощью вышеуказанного подхода идентифицировали антигены SP2108, SP0641, SP1393, SP0024, SP0641.1, SP1072, SP1384 и SP2032.

Пример 5

Полипептиды SP2108, SP0148 и SP1634

Полипептид SP2108 (SEQ ID NO: 9), полипептид SP0148 (SEQ ID NO: 7) и полипептид SP1634 (см. таблицу 2) составляли в виде вакцинных композиций с использованием 4 мкг полипептида в комбинации с 1 мкг адъюванта, холерного энтеротоксина (CT). Для комбинаций использовали по 4 мкг каждого полипептида. Композиции вводили интраназально мышам линии C57BL/6 трижды с интервалом в одну неделю. Затем субъектам предоставили перерыв на 3 недели и после этого взяли кровь на иммуногенность. Для этого анализа собирали гепаринизированную цельную кровь из ретроградного орбитального синуса. Общие PBMC стимулировали либо убитыми неинкапсулированными цельноклеточными S.pneumoniae (WCC), либо комбинацией трех полипептидов в круглодонных пробирках в течение трех дней. Затем надосадочные жидкости собирали и оценивали уровни IL-17 с помощью ELISA. Холерный энтеротоксин (CT) отдельно или неродственный антиген из HSV (003) использовали в качестве отрицательных контролей. Результаты анализа иммуногенности по IL-17 показаны на ФИГ.1 и 2, где на левой панели показаны данные в формате диаграммы рассеивания, а на правой панели показаны данные как средние арифметические со стандартными отклонениями. Субъектам предоставили перерыв на дополнительные 2 недели, после чего проводили контрольное заражение путем интраназального введения живых инкапсулированных S.pneumoniae. Субъектов умерщвляли через неделю и подсчитывали число колониеобразующих единиц (КОЕ) в смывах из носа. Результаты анализа колонизации показаны на ФИГ.3.

Пример 6

Полипептиды SP0882 и SP0314

В этом примере применяли те же протоколы, что и в примере 5, за исключением того, что вводили только две дозы вакцинной композиции. В этих экспериментах полипептид SP0882 (SEQ ID NO: 2) и полипептиды SP0314 (см. таблицу 2) тестировали параллельно с двумя из трех полипептидов, протестированных в примере 5. Результаты анализа иммуногенности по IL-17 показаны на ФИГ.4 и 5. Результаты анализа колонизации показаны на ФИГ.6.

Пример 7

Полипептиды SP1072, SP0641N и SP0024

В этом примере применяли протокол, аналогичный протоколу из примера 5, за исключением того, что вводили две дозы вакцинных композиций с интервалом в одну неделю. Вакцинные композиции содержали полипептиды SP1072 (SEQ ID NO: 8), SP0641N (SEQ ID NO: 13) или SP0024 (SEQ ID NO: 1) и адъювант, холерный энтеротоксин (CT). Через четыре недели после последней иммунизации провели интраназальное контрольное заражение мышей живыми S.pneumoniae серотипа 6B. Через неделю оценили бактериальную инвазию каждой мыши путем посева жидкости носового лаважа на селективную среду и подсчета полученных КОЕ. Число КОЕ, выделенных от каждой мыши, отображали на графике для каждой иммунизированной когорты. Результаты этого анализа колонизации показаны на ФИГ.7. Статистически значимые результаты указаны на фигуре (*=p-значение <0,05).

Пример 8

Полипептиды SP0148, SP0314, SP0882 и SP2108, протестированные на мышах линии BALB/c

Для определения того, наблюдаются ли аналогичные иммунные ответы у мышей с различными генотипами, вакцинные композиции вводили мышам BALB/c. Вакцинные композиции содержали полипептиды SP0148 (SEQ ID NO: 2), SP0314 (см. таблицу 2), SP0882 (SEQ ID NO: 2) или SP2108 (SEQ ID NO: 9) и адъювант, холерный энтеротоксин (СТ). Используя протокол, аналогичный таковому из примера 5, мышей иммунизировали, проводили интраназальное контрольное заражение S.pneumoniae и фиксировали число КОЕ. Результаты этого эксперимента по колонизации показаны на ФИГ.8.

Пример 9

Полипептиды SP1912, SP2108 и SP0148: анализ иммуногенности по IL-17A

Полипептиды SP1912 (SEQ ID NO: 265), SP2108 (SEQ ID NO: 9) или SP0148 (SEQ ID NO: 7) составляли в виде вакцинных композиций с адъювантом, холерным энтеротоксином (CT). Вакцинные композиции вводили мышам два раза с интервалом в одну неделю. Положительным контролем служили убитые неинкапсулированные цельноклеточные S.pneumoniae + CT (WCB), а отрицательными контролями были CT отдельно или рекомбинантные белки без CT (за исключением SP1912). Через три недели после последней иммунизации собирали периферическую кровь из ретроорбитального синуса и оценивали в анализе цельной крови. Коротко, гепаринизированную цельную кровь развели в среде и затем культивировали в двух повторностях с A) белком иммунизации или с B) цельноклеточной вакциной в течение шести дней. Собирали надосадочные жидкости и измеряли уровни IL-17А с помощью ELISA. Результаты анализа иммуногенности по IL-17A показаны на ФИГ.9. Каждый символ на графике представляет собой ответы от отдельных мышей, а линия указывает медианный ответ группы.

Пример 10

Полипептиды SP1912, SP2108 и SP0148: анализ колонизации

Животных иммунизировали вакцинными составами, содержащими полипептиды SP1912 (SEQ ID NO: 265), SP2108 (SEQ ID NO: 9) или SP0148 (SEQ ID NO: 7) и адъювант, холерный энтеротоксин (CT), как описано в примере 9, и затем проводили интраназальное контрольное заражение 10⁷ живых S.pneumoniae серотипа 6B через четыре недели после последней иммунизации (и через одну неделю после сбора ретроорбитальной крови). Через семь дней после контрольного заражения животных умерщвляли и промывали носоглоточные полости, и лаважные жидкости культивировали на пермиссивной среде для оценки титров S.pneumoniae. Результаты показаны на ФИГ.10 как колониеобразующие единицы бактерий (КОЕ) на лаважную жидкость. Каждый символ представляет собой титр от ответа индивидуальной мыши, а горизонтальная линия представляет собой медиану группы (***=p-значение <0,05).

Пример 11

Полипептид SP1912: аспирационное контрольное заражение (анализ в отношении сепсиса)

Полипептид SP1912 оценивали в отношении его способности защищать мышей от сепсиса. Группы из десяти мышей подкожно иммунизировали трижды с интервалом в две недели вакцинными композициями, содержащими либо полипептид SP1912 (SEQ ID NO: 265), либо пневмолизоид (PdT), адсорбированные на квасцах. Положительным контролем служили убитые неинкапсулированные цельноклеточные S.pneumoniae + квасцы (WCB), а отрицательным контролем квасцы отдельно. Через три недели после последней иммунизации собирали кровь для оценки ответа по IL-17A и уровней антител, и затем через неделю мышей подвергали аспирационному контрольному заражению 10⁷ живых S.pneumoniae штамма 0603 (серотип 6B). Регистрировали выживаемость животных в течение восьми дней. Результаты аспирационного контрольного заражения показаны на ФИГ.11 в виде кривых выживаемости для каждой иммунизированной группы.

Пример 12

Пневмолизоид PdT, полипептиды SP0148 и SP0641N: аспирационное контрольное заражение (анализ в отношении сепсиса)

Полипептид SP0148 оценивали в отношении его способности защищать мышей от сепсиса при иммунизации отдельно или в комбинации с SP0641N и/или пневмолизоидом (PdT). Группы из десяти мышей подкожно иммунизировали трижды с интервалом в две недели вакцинными композициями, содержащими полипептид SP0148 (SEQ ID NO: 7), отдельно или в комбинации с полипептидом SP0641N (SEQ ID NO: 13), и/или PdT, адсорбированными на квасцах. Положительным контролем служили убитые неинкапсулированные цельноклеточные S.pneumoniae + квасцы (WCB), а отрицательным контролем квасцы отдельно. Через три недели после последней иммунизации собирали кровь для оценки IL-17 и антитела, и затем через неделю мышей подвергали аспирационному контрольному заражению 10⁷ живых S.pneumoniae штамма 0603 (серотип 6B). Регистрировали выживаемость животных в течение восьми дней. Данные показаны на ФИГ.12 в виде кривых выживаемости для каждой иммунизированной группы.

Пример 13

Полипептиды SP1912, SP2108 и SP0148: анализ колонизации

Дополнительные исследования выполнили, по существу, как описано в примере 10, всего четыре отдельных исследования. Коротко, животных иммунизировали вакцинными составами, содержащими полипептиды SP1912 (SEQ ID NO: 265), SP2108 (SEQ ID NO: 9), SP0148 (SEQ ID NO: 7) или дополнительно SP2108 плюс SP0148, и адъювант, холерный энтеротоксин (CT), как описано в примере 9. Контрольных животных иммунизировали убитыми неинкапсулированными цельноклеточными S.pneumoniae плюс CT (WCB) или CT отдельно. Иммунизированных животных подвергали контрольному заражению интраназально 10⁷ живых S.pneumoniae серотипа 6B через четыре недели после последней иммунизации. Через семь дней после контрольного заражения животных умерщвляли и промывали носоглоточные полости, и лаважные жидкости культивировали на пермиссивной среде для оценки титров S.pneumoniae. Объединенные результаты четырех исследований показаны на ФИГ.13 как колониеобразующие единицы бактерий (КОЕ) на лаважную жидкость. Каждый символ представляет собой титр ответа индивидуальной мыши, а горизонтальная линия представляет собой медиану группы.(***=p-значение <0,05). N указывает общее число оцененных животных. Процентные доли относятся к числу животных, защищенных от колонизации.

Пример 14

Полипептиды SP1912 и SP0148: анализ иммуногенности по IL-17A

Группы из десяти мышей иммунизировали подкожно дважды с интервалом в две недели вакцинными композициями, содержащими либо полипептид SP1912 (SEQ ID NO: 265), либо полипептид SP0148 (SEQ ID NO: 7), либо оба, адсорбированные на квасцах. Контрольных животных иммунизировали квасцами отдельно. Через три недели после последней иммунизации собирали гепаринизированную кровь с помощью сердечной пункции и оценивали в отношении уровней IL-17A в анализе цельной крови. Коротко, гепаринизированную цельную кровь разводили в среде и затем культивировали в течение шести дней с белком(ами) иммунизации. Собирали надосадочные жидкости и измеряли уровни IL-17A с помощью ELISA. Результаты анализа иммуногенности по IL-17A показаны на ФИГ.14. Каждый символ на графике представляет собой ответы индивидуальных мышей, а линия указывает на медианный ответ группы.

Пример 15

Полипептиды SP1912 и SP0148: анализ колонизации

Животных подкожно иммунизировали трижды с интервалом в две недели вакцинными составами, содержащими полипептид SP0148 (SEQ ID NO: 7) в различных дозах плюс и минус SP1912 (SEQ ID NO: 265), адсорбированные на квасцах. Контрольных животных иммунизировали убитыми неинкапсулированными цельноклеточными S.pneumoniae плюс квасцы (WCV) или квасцами отдельно. Иммунизированным животным провели контрольное заражение интраназально 10⁷ живых S.pneumoniae серотипа 6B через четыре недели после последней иммунизации. Через семь дней после контрольного заражения животных умерщвляли и промывали носоглоточные полости, а лаважные жидкости культивировали на пермиссивной среде для оценки титров S.pneumoniae. Результаты показаны на ФИГ.15 как колониеобразующие единицы бактерий (КОЕ) на лаважную жидкость. Каждый символ представляет собой титр ответа индивидуальной мыши, а горизонтальная линия представляет собой медиану группы. Число животных, защищенных от колонизации, из числа животных в группе указано в верхней части фигуры.

Пример 16

Полипептиды SP1912, SP0148 и SP2108: анализ колонизации

В двух отдельных исследованиях животных подкожно иммунизировали трижды с интервалом в две недели вакцинными составами, содержащими полипептиды SP0148 (SEQ ID NO: 7) и SP0148 плюс SP1912 (SEQ ID NO: 265), либо дополнительно SP2108 (SEQ ID NO: 9), SP2108 плюс SP0148 и SP2108 плюс SP1912, адсорбированными на квасцах. Контрольных животных иммунизировали убитыми неинкапсулированными цельноклеточными S.pneumoniae плюс квасцы (WCV) или квасцами отдельно. Иммунизированным животным провели контрольное заражение интраназально 10⁷ живых S.pneumoniae серотипа 6B через четыре недели после последней иммунизации. Через семь дней после контрольного заражения животных умерщвляли и промывали носоглоточные полости, а лаважные жидкости культивировали на пермиссивной среде для оценки титров S.pneumoniae. Объединенные результаты двух исследований показаны на ФИГ.16 как колониеобразующие единицы бактерий (КОЕ) на лаважную жидкость. Каждый символ представляет собой титр ответа индивидуальной мыши, а горизонтальная линия представляет собой медиану группы. Число животных, защищенных от колонизации, из числа животных в группе и соответствующая процентная доля животных, защищенных от колонизации, указаны в верхней части фигуры (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 по тесту множественных сравнений Данна по сравнению с контролем квасцами).

Пример 17

Пневмолизоид L460D, PR+NPB производное PspA, полипептиды SP1912, SP0148 и SP2108: анализ колонизации

Животных подкожно иммунизировали трижды с интервалом в две недели вакцинными составами, содержащими полипептиды SP0148 (SEQ ID NO: 7), SP2108 (SEQ ID NO: 9), SP0148 плюс SP2108 и SP0148 плюс SP2108 в комбинации с SP1912 (SEQ ID NO: 265) или известными антигенами S.pneumoniae L460D плюс PR+NPD, адсорбированными на квасцах. Проводили два отдельных исследования. Контрольных животных иммунизировали квасцами отдельно. Иммунизированным животным провели контрольное заражение интраназально 10⁷ живых S.pneumoniae серотипа 6B через четыре недели после последней иммунизации. Через семь дней после контрольного заражения животных умерщвляли и промывали носоглоточные полости, а лаважные жидкости культивировали на пермиссивной среде для оценки титров S.pneumoniae. Результаты второго исследования показаны на ФИГ.17 как колониеобразующие единицы бактерий (КОЕ) на лаважную жидкость. Каждый символ представляет собой титр ответа индивидуальной мыши, а горизонтальная линия представляет собой медиану группы. Число животных, защищенных от колонизации, из числа животных в группе указано в верхней части фигуры.

Таблица ниже показывает абсолютное число и соответствующую процентную долю животных, защищенных от колонизации в четырех исследованиях, описанных в примерах 16 и 17.

Пример 18

Пассивный перенос антител против PspA, SP0148 и SP2108 и аспирационное контрольное заражение (анализ в отношении сепсиса)

Группам из десяти мышей инъекционно вводили моноклональные антитела, специфичные к PspA, инактивированную нагреванием сыворотку кролика, специфичную к SP0148, SP2108, или их комбинацию. Концентрации антител и иммунной сыворотки и общие объемы инъекции скорректировали с помощью нормальной сыворотки кролика (NRS) и PBS. Контрольных животных инъецировали NRS или сывороткой против убитых неинкапсулированных цельноклеточных S.pneumoniae (WCB). Через день после инъекции мышей подвергали аспирационному контрольному заражению 10⁶ живых S.pneumoniae серотипа WU-2 (ST-3). Регистрировали выживаемость животных в течение восьми дней. Данные показаны на ФИГ.18 как кривые выживаемости для каждой иммунизированной группы.

На ФИГ.19 показан процент животных, защищенных от сепсиса в исследованиях, описанных в примерах 12 и 18, а также в двух дополнительных исследованиях.

Изобретения касаются вакцинных составов против Streptococcus pneumoniae и их применения. Представленные вакцинные составы содержат фармацевтически приемлемый носитель и первый полипептид, имеющий по меньшей мере 95% идентичность с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 265, 266 или 268, и второй полипептид, имеющий по меньшей мере 90% идентичности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 9, 10, 20, 21, 6, 7, 18 или 19. Изобретения могут быть использованы для профилактики или лечения заболеваний, вызванных S. pneumoniae. 3 н. и 55 з.п. ф-лы, 19 ил., 4 табл., 18 пр.

1. Вакцинный состав против S. pneumoniae, содержащий фармацевтически приемлемый носитель и первый полипептид, имеющий по меньшей мере 95% идентичность с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 265, 266 или 268, и второй полипептид, имеющий по меньшей мере 90% идентичности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 9, 10, 20 или 21.

2. Вакцинный состав по п. 1, дополнительно содержащий третий полипептид, имеющий по меньшей мере 95% идентичности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 6, 7, 18 или 19.

3. Вакцинный состав против S. pneumoniae, содержащий фармацевтически приемлемый носитель и первый полипептид, имеющий по меньшей мере 95% идентичность с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 265, 266 или 268, и второй полипептид, имеющий по меньшей мере 90% идентичности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 6, 7, 18 или 19.

4. Вакцинный состав по п. 1 или 3, где первый полипептид состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 265.

5. Вакцинный состав по п. 1 или 3, где первый полипептид состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 266.

6. Вакцинный состав по п. 1 или 3, где первый полипептид состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 268.

7. Вакцинный состав по п. 1, где второй полипептид состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9.

8. Вакцинный состав по п. 2, где третий полипептид состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6.

9. Вакцинный состав по п. 2, где третий полипептид состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7.

10. Вакцинный состав по п. 3, где второй полипептид состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6.

11. Вакцинный состав по п. 3, где второй полипептид состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7.

12. Вакцинный состав по любому из пп. 1-3, 7-11, который по существу не содержит других полипептидов S. pneumoniae.

13. Вакцинный состав по п. 1, дополнительно содержащий один или более полипептидов, имеющих аминокислотную последовательность с по меньшей мере 95% идентичностью с SEQ ID NO: 22 или 23.

14. Вакцинный состав по любому из пп. 1-3, 7-11 или 13, где один или более полипептидов конъюгированы с иммуногенным носителем.

15. Вакцинный состав по любому из пп. 1-3, 7-11 или 13, который содержит по меньшей мере один липидированный полипептид.

16. Вакцинный состав по п. 3, где второй полипептид имеет по меньшей мере 95% идентичности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 6, и указанный состав дополнительно содержит третий полипептид, имеющий по меньшей мере 95% идентичности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7.

17. Вакцинный состав по п. 16, где второй полипептид является липидированным.

18. Вакцинный состав по п. 16 или 17, дополнительно содержащий четвертый полипептид, имеющий по меньшей мере 95% идентичность с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 9, и пятый полипептид, имеющий по меньшей мере 95% идентичности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 10.

19. Вакцинный состав по п. 18, где пятый полипептид является липидированным.

20. Вакцинный состав по п. 1, где второй полипептид имеет по меньшей мере 95% идентичность с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 9, и указанный состав дополнительно содержит третий полипептид, имеющий по меньшей мере 95% идентичности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 10.

21. Вакцинный состав по п. 20, где третий пептид является липидированным.

22. Вакцинный состав по любому из пп. 1-3, 7-11, 16, 19-21, дополнительно содержащий адъювант.

23. Вакцинный состав по п. 22, где адъювант является агонистом толл-подобных рецепторов (TLR).

24. Вакцинный состав по п. 22, где адъювант представляет собой квасцы.

25. Вакцинный состав по любому из пп. 1-3, 7-11, 16, 19-21 или 23-24, где вакцинный состав препятствует инфицированию S. pneumoniae субъекта.

26. Вакцинный состав по любому из пп. 1-3, 7-11, 16, 19-21 или 23-24, где вакцинный состав подавляет колонизацию S. pneumoniae у субъекта.

27. Вакцинный состав по любому из пп. 1-3, 7-11, 16, 19-21 или 23-24, где вакцинный состав подавляет один или более симптомов, вызываемых S. pneumoniae, у субъекта.

28. Вакцинный состав по любому из пп. 1-3, 7-11, 16, 19-21 или 23-24, где вакцинный состав подавляет сепсис, вызванный S. pneumoniae, у субъекта.

29. Вакцинный состав по любому из пп. 1-3, 7-11, 16, 19-21 или 23-24, где вакцинный состав снижает длительность колонизации S. pneumoniae у субъекта.

30. Вакцинный состав по любому из пп. 1-3, 7-11, 16, 19-21 или 23-24, где вакцинный состав вызывает В-клеточный, Т-клеточный или В-клеточный и Т-клеточный иммунный ответ на S. pneumoniae у субъекта.

31. Вакцинный состав по любому из пп. 1-3, 7-11, 16, 19-21 или 23-24, где вакцинный состав вызывает Т-клеточный ответ на S. pneumoniae у субъекта.

32. Вакцинный состав по любому из пп. 1-3, 7-11, 16, 19-21 или 23-24, где вакцинный состав вызывает CD4⁺ Т-клеточный ответ на S. pneumoniae у субъекта.

33. Вакцинный состав по любому из пп. 1-3, 7-11, 16, 19-21 или 23-24, где вакцинный состав вызывает Т_Н17-клеточный ответ на S. pneumoniae у субъекта.

34. Вакцинный состав по любому из пп. 1-3, 7-11, 16, 19-21 или 23-24, где вакцинный состав вызывает увеличенную активацию ТН17-клеток по сравнению с контролем у субъекта.

35. Вакцинный состав по любому из пп. 1-3, 7-11, 16, 19-21 или 23-24, где вакцинный состав вызывает Т_Н1-клеточный ответ на S. pneumoniae у субъекта.

36. Вакцинный состав по любому из пп. 1-3, 7-11, 16, 19-21 или 23-24, где вакцинный состав вызывает CD8⁺ Т-клеточный ответ на S. pneumoniae у субъекта.

37. Вакцинный состав по любому из пп. 1-3, 7-11, 16, 19-21 или 23-24, где вакцинный состав вызывает CD8⁺ CTL (цитотоксический Т-лимфоцит) - ответ на S. pneumoniae у субъекта.

38. Вакцинный состав по любому из пп. 1-3, 7-11, 16, 19-21 или 23-24, где вакцинный состав вызывает врожденный иммунный ответ на S. pneumoniae у субъекта.

39. Вакцинный состав по любому из пп. 1-3, 7-11, 16, 19-21 или 23-24, где вакцинный состав подавляет развитие среднего отита у субъекта.

40. Вакцинный состав по любому из пп. 1-3, 7-11, 16, 19-21 или 23-24, где вакцинный состав снижает интенсивность и/или тяжесть среднего отита у субъекта.

41. Вакцинный состав по любому из пп. 1-3, 7-11, 16, 19-21 или 23-24, где вакцинный состав подавляет пневмонию, вызванный с S. pneumoniae, у субъекта.

42. Вакцинный состав по любому из пп. 1-3, 7-11, 16, 23-24 или 26-28, где вакцинный состав подавляет менингит, вызванный с S. pneumoniae, у субъекта.

43. Вакцинный состав по любому из пп. 1-3, 7-11, 16, 19-21 или 23-24, где вакцинный состав подавляет синусит, вызванный с S. pneumoniae, у субъекта.

44. Вакцинный состав по любому из пп. 1-3, 7-11, 16, 19-21 или 23-24, где вакцинный состав подавляет повреждение органов, вызванное с S. pneumoniae, у субъекта.

45. Применение вакцинного состава по любому из пп. 1-24 для лечения субъекта, страдающего от колонизации или инфекции S. pneumoniae или восприимчивого к ним, где лечение включает введение эффективного количества вакцинного состава субъекту.

46. Применение по п. 45, где лечение препятствует инфицированию S. pneumoniae субъекта.

47. Применение по п. 45, где лечение подавляет колонизацию S. pneumoniae у субъекта.

48. Применение по п. 45, где лечение подавляет симптомы, вызываемые S. pneumoniae, у субъекта.

49. Применение по п. 45, где лечение подавляет сепсис, вызванный с S. pneumoniae, у субъекта.

50. Применение по п. 45, где лечение подавляет развитие среднего отита у субъекта.

51. Применение по п. 45, где лечение снижает интенсивность и/или тяжесть среднего отита у субъекта.

52. Применение по п. 45, где лечение подавляет пневмонию, вызванную с S. pneumoniae, у субъекта.

53. Применение по п. 45, где лечение подавляет менингит, вызванный с S. pneumoniae, у субъекта.

54. Применение по п. 45, где лечение подавляет синусит, вызванный с S. pneumoniae, у субъекта.

55. Применение по п. 45, где лечение подавляет повреждение органов, вызванное с S. pneumoniae, у субъекта.

56. Применение по п. 45, где лечение включает введение одной дозы субъекту.

57. Применение по п. 45, где лечение включает введение трех доз субъекту.

58. Применение по п. 45, где субъект является человеком.