СПОСОБ ПРОДУЦИРОВАНИЯ И ОЧИСТКИ ОРТОПОКСВИРУСА Российский патент 2015 года по МПК C12N7/02 A61K39/275 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к области получения и очистки вирусов. В частности, настоящее изобретение относится к способу получения и очистки ортопоксвируса дикого типа, а также аттенюированного и/или рекомбинантного ортопоксвируса.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Ортопоксвирусы являются сложными упакованными вирусами диаметром от 200 до 300 нм, что принципиально отличает их по морфологии, их большому ДНК-геному и их цитоплазматическому сайту репликации. Геном нескольких членов рода Ортопоксвирусов, включая штамм Копенгаген вируса осповакцины (W) (GOEBEL et al., 1990, Virol. 179, 247-266 и 517-563; JOHNSON et al., 1993, Virol. 196, 381-401) и штамм Анкара модифицированного вируса осповакцины (MVA) (ANTOINE et al., 1998, Virol. 244, 365-396), был картирован и секвенирован. W содержит геном из двухцепочечной ДНК размером 192 т.п.о., кодирующий около 200 белков, из которых примерно 100 вовлечены в процесс сборки вируса. MVA является штаммом сильно аттеньюированного вируса осповакцины, полученный в ходе более 500 последовательных пассажей вируса осповакцины Анкара на фибробластах эмбрионов цыпленка (MAYR et al., 1975, Infection 3, 6-16). Вирус MVA депонирован в Национальной коллекции культур микроорганизмов (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, CNCM) под номером N602 1-721. Определение полной последовательности генома MVA и сравнение с геномом вируса Копенгаген W позволяет точно идентифицировать изменения, которые произошли в геноме вируса, и определить семь делеций (с I по VII) и множественные мутации, приводящие к получению фрагментированных ОРС (открытых рамок считывания) (ANTOINE etal., 1998, Virology 244, 365-396).

На использование Ортопоксвирусов в качестве векторов для разработки живых рекомбинантных вакцин оказали воздействие факторы безопасности и нормативные инструкции. Перед использованием Ортопоксвирусов для вакцинации необходимо провести очистку указанных вирусов. Доступные в настоящее время способы получения Ортопоксвирусов включают репликацию указанных вирусов в клеточных линиях (например, HelaS3), в яйцеклетках с зародышем или в фибробластах эмбриона цыпленка (CEF). После репликации вируса удаляют культуральную жидкость, клетки лизируют, а ортопоксвирусы, высвобожденные из клеток, очищают путем центрифугирования с использованием слоя сахарозы (KOTWAL and ABRAHAM; Poxvirus growth, Purification and tittering in Vaccinia Virus and Poxvirology, 2004,101-108, Humana Press Inc., Totowa; NJ; USA).

В международной патентной заявке WO 07/147528 описан способ получения MVA дикого типа, а также аттеньюированного и/или рекомбинантного MVA с нецелевой инфекционной специфичностью, включающий получение культуры пакующих клеток (например, CEF; линии клеток), инфицирования указанной культуры клеток, выращивания указанных инфицированных клеток, выделение вирусов MVA, полученных из супернатанта культуры и/или пакующих клеток, и дальнейшую очистку вирусов путем глубокой фильтрации, микрофильтрации и диафильтрации. В заявке WO 07/147528 отмечено, что при осуществлении глубокой фильтрации, микрофильтрации и диафильтрации использование нуклеаз, и, более конкретно, использование Benzonase® в качестве нуклеазы не является необходимым.

В международной патентной заявке WO 08/138533 описан способ очистки биологически активного вируса осповакцины, включающий загрузку твердофазного матрикса с присоединенным к нему лигандом вируса осповакцины, содержащимся в жидкой фазе культуры, отмывку матрикса и элюирование указанного вируса.

Несмотря на то, что описано несколько способов получения и очистки ортопоксвирусов, существует необходимость в альтернативных способах. Настоящее изобретение обеспечивает такие способы.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Во всем тексте настоящей заявки "ортопоксвирус" относится к вирусу оспы человека, вирусу осповакцины (W), такому как, например, штаммы: Элстри (Elstree), Вестерн Резерв (Western Reserve), Вайет (Wyeth), NWAC, NYCBOH, Париж, Копенгаген и производным производные, такие как, например, модифицированный вирус осповакцины Анкара (MVA), в частности, MVA 575 (ЕСАСС V00120707) и MVA-BN (ECACC V00083008). Согласно настоящему изобретению, ортопоксвирус может быть равнозначно незрелым вирусом (IV), зрелым внутриклеточным вирусом (IMV), внутриклеточным вирусом в оболочке (IEV), связанным с клеткой вирусом в оболочке (CEV) или внеклеточым вирусом в оболочке (EEV) (SMITH et al. (2002), J.Gen. Virol., 83, 2915-2931).

По всему тексту заявки формы единственного числа означают «по меньшей мере один», «по меньшей мере первый», «один или более» или «множество» описываемых компонентов или этапов, если контекст явно не указывает на другое.

По всему тексту заявки «и/или» в каждом случае употребления включает значения «и», «или» и "все или любая другая комбинация элементов, связанную указанным термином".

Во всем тексте заявки "содержащий" и "содержать" по замыслу авторов обозначает, что продукты, композиции и способы включают указанные компоненты или этапы, но не исключает присутствия других. "Состоящий по существу из" применительно к определенным продуктам, композициям и способам обозначает исключение других компонентов или этапов, имеющих какое-либо существенное значение. Таким образом, указание, что композиция состоит по существу из перечисленных компонентов, не исключает того, что указанная композиция может содержать следовые примеси и фармацевтически приемлемые носители. "Состоящий из" означает, что более чем следовые элементы или другие компоненты и этапы исключены.

Во всем тексте заявки "примерно" или "приблизительно" означает в пределах 20%, предпочтительно в пределах 10%, и более предпочтительно в пределах 5% данного значения или диапазона.

Настоящее изобретение относится к способу (т.е. Способ А) получения и очистки ортопоксвируса дикого типа, аттеньюированного и/или рекомбинантного ортопоксвируса, включающий следующие этапы:

a) приготовление культуры пакующих клеток;

b) инфицирование культуры пакующих клеток ортопоксвирусом;

c) культивирование инфицированных пакующих клеток до получения потомства ортопоксвируса;

d) инкубация в присутствии одной или более нуклеаз;

e) выделение ортопоксвирусов из супернатанта культуры и/или пакующих клеток;

f) добавление моновалентных солей к ортопоксвирусам, выделенным на этапе е), в условиях, подходящих для ингибирования активности нуклеазы (нукпеаз) и для предотвращения адсорбции указанных ортопоксвирусов к анионообменному адсорбенту на этапе д);

g) осуществление контакта смеси, полученной на этапе f), с анионообменным адсорбентом в условиях, подходящих для захвата нуклеиновых кислот;

h) осветление смеси, полученной на этапе g), в условиях, подходящих для удаления клеточного дебриса;

i) промывка анионообменного адсорбента в условиях, подходящих для выделения оставшихся ортопоксвирусов в фильтрате;

j) концентрирование фильтрата, полученного на этапе h) и фильтрата, полученного на этапе i);

k) диафильтрация содержащей ортопоксвирус фракции, полученной на этапе j).

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, в способе согласно настоящему изобретению не используются продукты животного происхождения (за исключением пакующих клеток). Применительно ко всей заявке, к «продуктам животного происхождения» относится любой продукт или набор продуктов, производимых в клетке или клеткой животного в живом организме.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, способ согласно настоящему изобретению является приемлемым для асептического процесса производства промышленного масштаба, полностью удовлетворяющего нормативным требованиям относительно стерильности вакцин.

Применительно ко всей заявке, "аттеньюированный ортопоксвирус" относится к любому ортопоксвирусу, который был модифицирован таким образом, что его патогенность в целевом субъекте значительно снижена. Предпочтительно, чтобы указанный ортопоксвирус был ослаблен до такой степени, что он является непатогенным с клинической точки зрения, то есть у субъекта, подверженного воздействию указанного ортопоксвируса, не обнаруживается статистически значимого увеличения патологии по отношению к контрольным субъектам. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, указанным аттеньюированным ортопоксвирусом являются аттеньюированный W или аттеньюированный MVA.

Применительно ко всей заявке, "рекомбинантный ортопоксвирус" относится к ортопоксвирусу, содержащему экзогенную последовательность, внедренную в его геном. Использованная здесь экзогенная последовательность относится к нуклеиновой кислоте, которая не присутствует в природном исходном вирусе.

Применительно ко всей заявке, "пакующие клетки" относится к клеткам, которые могут быть инфицированы ортопоксвирусом, который планируется получить. Пакующей клеткой может быть первичная клетка, рекомбинантная клетка и/или линия клеток. Например, может быть использована рекомбинантная клетка, которая содержит элементы, необходимые для получения рекомбинантного вируса и отсутствующие в используемом рекомбинантном вирусном векторе.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, указанные пакующие клетки являются иммортализованными линиями клеток. Применительно ко всей заявке, " иммортализованные линии клеток" относятся к линиям клеток, которые размножаются в культуре со скоростью, большей предела Хейфлика.

В соответствии с настоящим изобретением указанные иммортализованные линии клеток предпочтительно получены из клеток птиц, принадлежащих к семействам Anatidae или Phasianidae. В частности, среди клеток из Anatidae, клетки, принадлежащие к родам Cairina или Anas являются предпочтительными. Еще более предпочтительными являются иммортализованные линии клеток птиц, принадлежащих к видам Cairina moschata или Anas platyrhynchos.

В соответствии с более предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, указанные пакующие клетки являются иммортализованные линиями клеток птиц, полученных из клеток птиц, принадлежащих семейству, а предпочтительно из вида Cairina moschata.

Предпочтительными иммортализованными линиями клеток птиц Cairina moschata в соответствии с настоящим изобретением являются иммортализованные линии клеток птиц Cairina moschata, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую обратную транскриптазу теломеразу (TERT), описанную в патентной заявке WO 2007/077256. Следующие иммортализованные линии клеток птиц являются особенно предпочтительными:

- Т3-17490, депонированная в Европейской коллекции культур клеток (European Collection of Cell Cultures, ЕСАСС) под инвентарным номером 08060502 (см. Фигуры 2, 3 и 4), или ее производная;

- Т6-17490, депонированная в Европейской коллекции культур клеток (European Collection of Cell Cultures, ЕСАСС) под инвентарным номером 08060501 (см. Фигуры 5, 6 и 7), или ее производная.

Другими предпочтительными иммортализованными линиями клеток птиц Cairina moschata в соответствии с настоящим изобретением являются иммортализованные линии клеток птиц Cairina moschata, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты Е1А, кодирующую обратную транскриптазу теломеразу (TERT), описанную в патентной заявке WO 2009/004016.

Применительно ко всей заявке, "производные" депонированных иммортализованных линий клеток птиц относятся к иммортализованным линиям клеток птиц, которые содержат последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую "соединение, представляющее интерес". Используемое здесь "соединение, представляющее интерес" может включать фармацевтически активный белок, например факторы роста, регуляторы роста, антитела, антигены, их производные, пригодные для иммунизации или вакцинации и подобные им, интерлейкины, инсулин, эритропоэтин, G-CSF, GM-CSF, hPG-CSF, M-CSF, интерфероны (интерферон-альфа, интерфенон-бета, интерферон-гамма, факторы свертываемости крови (например, фактор VIII; фактор IX; tPA) или их комбинации, но не ограничивается ими.

Другими иммортализованными линиями клеток, которые могут быть использованы в способе согласно настоящему изобретению, являются:

- линия клеток DF1, защищенная патентом США 5,879,924, которая является спонтанно иммортализованной линией клеток цыпленка, полученная из яйцеклеток в возрасте 10 дней линии East Lansing (ELL-0);

- линия клеток Ebx цыпленка, описанная в патентной заявке WO 2005/007840, которая получена из эмбриональных стволовых клеток путем прогрессирующего отделения от факторов роста и подпитывающего слоя;

- линия клеток DEC 99 (Ivanov et al. Experimental Pathology and Parasitology, 4/2000 Bulgarian Academy of Sciences), которая является устойчивой линией клеток эмбриона утки. В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, указанными пакующими клетками являются первичные клетки.

Применительно ко всей заявке, "первичные клетки" относятся к клеткам, которые были недавно выделены из ткани животного или человека, органа или организма, при этом указанные клетки не способны к продолжительному и неограниченному удвоению и делению. Обычно первичные клетки делятся в клеточной культуре менее 100 раз, часто менее 50 раз, часто менее 25 раз. Поэтому первичные клетки не подвергаются иммортализации. Первичные клетки включают фибробласты животных или лимфоциты пуповинной крови, но не ограничиваются ими.

В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, указанными пакующими клетками являются первичные или вторичные клетки птиц, предпочтительно фибробласты эмбрионов цыплят (CEF).

В соответствии с настоящим изобретением, питательная среда, используемая для получения культуры пакующих клеток (то есть в ходе стадии а)), среда для культивирования, используемая для инфицирования указанной клее точной культуры с ортопоксвирусом (то ест в ходе стадии b)), а также среда для культивирования, используемая для выращивания указанных инфицированных пакующих клеток (то есть в ходе стадии с)) могут быть одинаковыми или различными.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, указанная среда для культуры клеток, используемая в соответствии с настоящим изобретением является свободной от продуктов животного происхождения. Множество сред, свободных от продуктов животного происхождения, уже описаны, некоторые из них являются коммерчески доступными. Например, 293 SFM II; адаптированная среда без сыворотки для клеток 293-F; адаптированная среда без сыворотки для клеток 293-Н; реагент для трансфекции 293fectin™; CD 293 AGT™; среда CD 293; система экспрессии FreeStyle™ 293; среда FreeStyle™ 293; адаптированная среда FreeStyle™ без сыворотки для клеток 293-F; среда для экспрессии аденовирусов (АЕМ); среда для выращивания клеток PER.C6®; CD 293 AGT™; среда CD 293 Medium; адаптированная среда без сыворотки для клеток COS-7L; среды EPISERF®; OptiPro™ SFM; VP-SFM; VP-SFM AGT™ (все доступны у Invitrogen) могут быть использованы в качестве среды для выращивания клеток в способе согласно настоящему изобретению. Среда для выращивания клеток, не содержащая продукты животного происхождения, использующаяся в соответствии с настоящим изобретением также может быть средой, приготовленной самостоятельно.

Этап а) приготовления культуры пакующих клеток хорошо известен специалистам в данной области.

В случае когда пакующие клетки представляют собой иммортализованные линии клеток, указанные иммортализованные линии клеток культивируют в соответствующей культуральной среде. Способы могут включать выращивание клеток, адгезированных на поверхности, выращивание в суспензии в присутствии или или без (микро)носителей или их комбинацию. Культивирование моно осуществлять, например, в чашках, роллерных флаконах или в биореакторах, с использованием периодических, периодических с подпиткой, непрерывных систем, мембранной фильтрации и т.п.. Для обеспечения крупномасштабной продукции вируса путем культивирования клеток в данной области предпочтительно иметь клетки, способные расти в суспензии в присутствии (микро)носителей или без них, и также предпочтительно иметь клетки, которые можно культивировать в среде, не содержащей продуктов животного происхождения. Среда для культивирования клеток, используемая в настоящем изобретении, предпочтительно не содержит продуктов животного происхождения. К настоящему времени уже описано множество сред, не содержащих продуктов животного происхождения, и некоторые из них, как было описано ранее, доступны для приобретения.

Если пакующие клетки представляют собой CEF, указанные СЕР предпочтительно извлечены из яиц, свободных от определенных патогенов (SPF-яиц). SPF-яйца можно приобрести, например, в Charles River Laboratories (Wilmington, MA, США). Возраст указанных яиц предпочтительно больше 9 дней, более предпочтительно между 10 и 14 днями, и еще более предпочтительно, составляет 12 дней. Перед извлечением эмбриона яйца предпочтительно дезинфицируют. Из уровня техники известно много способов и продуктов для дезинфекции яиц. Особенно предпочтительно инкубация в растворе формалина (например, 2% формалина, 1 мин.) с последующей промывкой в 70% этанола. Затем клетки эмбрионов разделяют и очищают. В предпочтительном варианте осуществления изобретения клетки эмбрионов подвергают этапу ферментативного расщепления, что обеспечивает разрушение межклеточного матрикса. Для этой цели особенно полезно использование ферментов, способных расщеплять межклеточный матрикс. Предпочтительные ферменты согласно настоящему изобретению включают перечисленные, но не ограничиваются ими: трипсин, коллегеназа, проназа, диспаза, гиалуронидаза и нейраминидаза. Ферменты, используемые для приготовления CEF согласно настоящему изобретению, предпочтительно имеют рекомбинантное происхождение. Ферменты можно использовать по отдельности или в комбинации. В предпочтительном варианте изобретения используют комбинацию диспазы и трипсина (например, TrypLE select от Gibco™). Специалист в данной области смоет определить концентрацию фермента, температуру и продолжительность инкубации, обеспечивающие эффективное разделение клеток. Приготовление культуры CEF может дополнительно включать этап фильтрации и/или этап центрифугирования, обеспечивающие удаление примесей. Согласно настоящему изобретению, первичные полученные CEF могут также использоваться либо сразу либо после одного дополнительного пассажа в качестве вторичных CEF. Указанные CEF (Т.е. первичные или вторичные) затем культивируют в соответствующей среде для культивирования клеток. Среды для культивирования клеток, используемые согласно настоящему изобретению, предпочтительно не содержат продуктов животного происхождения. К настоящему времени уже описано множество сред, не содержащих продуктов животного происхождения, и некоторые из них, как было описано ранее, доступны для приобретения. В настоящем изобретении СЕР предпочтительно культивируют в среде для культивирования клеток VP-SFM (Invitrogen). CEF предпочтительно культивируют в течение от 1 до 5 дней, более предпочтительно между 1 и 2 днями и еще более предпочтительно 2 дня до инфицирования. CEF предпочтительно культивируют при температуре, лежащей в диапазоне между 30ºС и 36,5ºС.

Этап b) инфицирования культуры пакующих клеток (приготовленной на этапе a)) ортопоксвирусом хорошо известен специалистам в данной области. Во всем тексте настоящей заявки "инфицирование" относится к переносу вирусной нуклеиновой кислоты в клетку, где происходит репликация вирусной нуклеиновой кислоты, синтез вирусных белков или сборка вирусных частиц. Специалист в данной области сможет выбрать наиболее подходящую пакующую клетку для продукции конкретного вируса. В предпочтительном варианте осуществления способ согласно настоящему изобретению включает использование CEF или иммортализованной линии клеток птиц, предусмотренной в патентной заявке WO 2007/077256 или WO 2009/004016 для продукции ортопоксвируса, и предпочтительно MVA или W. Этап b) инфицирования культуры пакующих клеток (приготовленной на этапе а)) ортопоксвирусом осуществляют в соответствующей среде для культивирования клеток, которая может быть такой же среда для культивирования клеток, использованная для приготовления указанной культуры пакующих клеток (т.е в ходе этапа а)), или отличаться от нее. Среды для культивирования клеток, используемая согласно настоящему изобретению предпочтительно не содержат продуктов животного происхождения. К настоящему времени уже описано множество сред, не содержащих продуктов животного происхождения, и некоторые из них, как было описано ранее, доступны для приобретения. В случае, если пакующие клетки представляют собой CEF, этап Ь) инфицирования культуры CEF осуществляют в Basal Medium Eagle (среда для культивирования клеток, Invitrogen). В среду для культивирования клеток предпочтительно высевают от 0,5 до 1,5, более предпочтительно между 1,1 и 1,3 и еще более предпочтительно примерно 1,2 эмбриона/л среды для культивирования клеток. В конкретном варианте осуществления, в котором, продуцируемым ортопоксвирусом является MVA, MVA высевают в сосуд для культивирования клеток при MOI (множественность инфекции), которая предпочтительно находится в диапазоне между 0,001 и 0,1, более предпочтительно между 0,03 и 0,07, и еще более предпочтительно примерно 0,05. В другом конкретном варианте осуществления, в котором продуцируемый ортопоксвирус представляет собой W, высевают в сосуд для культивирования клеток при М01 (множественность инфекции), которая предпочтительно находится в диапазоне между 0,0001 и 0,1, и более предпочтительно примерно 0,0001.

Этап с) культивирования инфицированных пакующих клеток (из этапа b)) до получения потомства ортопоксвируса, хорошо известен специалистам в данной области.

В случае, если пакующие клетки представляют собой CEF, этап с) культивирования инфицированных CEF осуществляют в соответствующей среде для культивирования клеток, которая может быть такой же или отличаться от среды для культивирования клеток, использованной для приготовления культуры CEF (т.е., в ходе этапа а), и от среды для культивирования клеток, использованной для инфицирования указанной культуры CEF ортопоксвирусом (т.е., в ходе этапа b)). Среды для культивирования клеток, используемая согласно настоящему изобретению предпочтительно не содержат продуктов животного происхождения. К настоящему времени уже описано множество сред, не содержащих продуктов животного происхождения, и некоторые из них, как было описано ранее, доступны для приобретения. Согласно настоящему изобретению культивирование инфицированных CEF осуществляют среда для культивирования клеток Basal Medium Eagle (Invitrogen). Инфицированные CEF предпочтительно культивируют в течение от 1 до 6 дней, более предпочтительно от 2 до 4 дней и еще более предпочтительно в течение 3 дней. Инфицированные CEF предпочтительно культивируют при температуре ниже чем 37ºС, предпочтительно между 30ºС и 36,5ºС.

Этап d) инкубации в присутствии одной или более нуклеаз (а именно, эндонуклеаз или экзонулеаз) проводят для того чтобы разрушить нуклеиновые кислоты (например, ДНК; РНК), присутствующие в растворе. Нуклеазы, предпочтительно используемые в соответствии с настоящим изобретение, представляют собой эндонуклеазы. Эндонуклеазы могут быть классифицированы по их субстратам следующим образом: дезоксирибонуклеазы (ДНКазы), которые разрушают ДНК; рибонуклеазы (РНКазы) которые разрушают РНК; и эндонуклеазы, которые разрушают ДНК и РНК. Эндонулкеазы ДНКазы включают, но не ограничиваются, перечисленными: ДНКазу I, ДНКазу II и эндодезоксинуклеазу IV. Эндонуклеазы РНКазы включают, но не ограничиваются, перечисленными: PHKse I, РНКазу III, РНКазу Е, РНКазу F и РНКазу Р. Эндонуклеазы, которые разрушают ДНК и РНК, включают, но не ограничиваются, перечисленными: Benzonase®. В предпочтительном варианте изобретения этап а) инкубирования ортопоксвирусов, полученных на этапе с), осуществляют в присутствии Benzonase®. Benzonase® разрушает нуклеиновую кислоту (например, ДНК; РНК) путем гидролиза внутренних фосфодиэфирных связей между некоторыми нуклеотидами. После полного расщепления все свободные нуклеиновые кислоты (например, ДНК; РНК), присутствующие в растворе, восстанавливаются до олигонуклеотидов с 5'-монофосфатом на конце, имеющих от 3 до 8 оснований в длину. Benzonaze® не обладает протеолитической активностью. Benzonaze®, используемая согласно настоящему изобретению, предпочтительно является фармацевтически приемлемой. Фармацевтически приемлемая Benzonaze® доступна для приобретения (например, продукт Eurogentec под номером МЕ-0280-10; Merck под номером, например, 1.01653.0001).

Предпочтительными условиями для воздействия нуклеазы (нуклеаз) согласно настоящему изобретению являются (как описано в Примере 1):

- рН находится в диапазоне между 7,0 и 9,0, предпочтительно между 7,5 и 8,5, и более предпочтительно, рН равен 8,0;

- концентрация кофакторов, выбранных из Mg²⁺ и Mn²⁺, предпочтительно Mg²⁺, лежит в диапазоне от 1 до 2 мМ, и предпочтительно составляет 2 мМ.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеазу (нуклеазы) инкубируют при температуре в диапазоне между 22ºС и 28ºС, предпочтительно при температуре в диапазоне между 23ºС и 27ºС, более предпочтительно при температуре в диапазоне между 24ºС и 26ºС, и еще более предпочтительно при температуре 25ºС (как описано в Примере 1). В настоящем варианте осуществления продолжительность этапа d) предпочтительно находится в диапазоне между 1 и 5 часами, и более предпочтительно, составляет 2 часа (как описано в Примере 1).

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения нуклеазу (нукпеазы) инкубируют при температуре в диапазоне между 2ºС и 8ºС, предпочтительно при температуре в диапазоне между 3ºС и 7ºС, более предпочтительно при температуре в диапазоне между 4ºС и 6ºС, и еще более предпочтительно при температуре 5ºС. В этом другом варианте осуществления продолжительность этапа d) предпочтительно находится в диапазоне между 10 и 20 часами, и, более предпочтительно, составляет 18 часов.

Согласно настоящему изобретению, концентрация нуклеазы (нуклеаз), используемых на этапе d), находится в диапазоне от 5 до 100 мкл/мин, предпочтительно в диапазоне от 5 до 50 мкл/мин, и более предпочтительно, составляет 10 мкл/мин. Как показано на Фиг.1, применение в тех же условиях 10 мкл/мин Benzonase® неожиданно приводит к снижению концентрации ДНК после 2 часов обработки (температура 25ºС; 2 мМ Mg²⁺; рН 8), эквивалентному достигаемому при использовании 50 мкл/мин Benzonase®.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения этап а) дополнительно включает добавление одного или более детергентов. Детергенты включают, но не ограничиваются перечисленными: Tween, Triton X-100 (нонаэтилен гликоль октил феноловый эфир), сапонин, додецилсульфат натрия, Brij 96, Polidocanol, N-октил β-D-глюкопиранозид и карбонат натрия. Предпочтительным детергентом, используемом на этапе d), является Tween. Tween включает, но не ограничен перечисленными видами: Tween 20 (полиоксиэтилен сорбитан монолаурат), Tween 80 (полиоксиэтилен сорбитан моноолеат) и Tween 85 (полиоксиэтилен сорбитан триолеат). Предпочтительным видом Tween, используемым на этапе d), является Tween 80, Согласно настоящему изобретению, концентрация детергента (детергентов), используемого на этапе d), находится в диапазоне от 10 до 100 мкг/л, предпочтительно в диапазоне от 10 до 55 мкг/л.

Ортопосквирусы, полученные и предварительно обработанные нуклеазу (нуклеазами), затем выделяют из культутрального супернатанта и/или пакующих клеток.

Если ортопоксвирусы выделяют из пакующих клеток (т.е. только из пакующих клеток, или из пакующих клеток и из супернатанта), перед этапом е) можно осуществить этап, обеспечивающий разрушение мембраны пакующих клеток. Этот этап приводит к высвобождению ортопоксвирусов из пакующих клеток. Разрушение мембраны пакующих клеток можно вызвать при помощи различных методик, хорошо известных специалистам. Эти методики включают, но не ограничиваются перечисленными: замораживание/оттаивание, лизис в гипотонической среду, обработку ультразвуком (с использованием соникатора) и микрофлюидизацию (с использованием микрофлюидизатора). Соникаторы доступны для приобретения, например, в Heraeus PSP, Biologies, Misonix или GlenMills. Предпочтительными соникаторами для использования согласно настоящему изобретению являются SONITUBE 20 КГц тип SM 20-120-3, SONITUBE 36 КГц тип SM 35/3WU и SONITUBE 35 КГц тип SM 35-400-3 (Heraeus PSP). Микрофлюидизатоы доступны для приобретения, например, в Microfluidics Corporation. Мембрана пакующих клеток также может быть разрушена с использованием пресса SLM Aminco French. Мембрана пакующих клеток также может быть разрушена с использованием высокоскоростного гомогенизатора. Высокоскоростные гомогенизаторы доступны для приобретения в, например, Silverson Machines или Ika-Labotechnik. Предпочтительным высокоскоротным гомогенизатором для использования согласно настоящему изобретению является SILVERSON L4R (Silverson Machines). Смесь, полученную после разрушения мембраны пакующих клеток, можно затем инкубировать в течение по меньшей мере 1 часа при перемешивании, что обеспечит разрушение ранее добавленной нуклеазой (нуклеазами) (на этапе а)) нуклеиновых кислот (например, ДНК), высвобожденных из пакующих клеток. Соответственно, в конкретном варианте осуществления изобретения перед этапом е) осуществляют:

1) этап, обеспечивающий разрушение мембраны пакующих клеток, предпочтительно с использованием высокоскоростного гомогенизатора или путем обработки ультразвуком; и

2) этап инкубирования смеси, полученной на этапе 1) в течение по меньшей мере 1 часа, что обеспечивает разрушение добавленной на этапе d) нуклеазой (нуклеазами) нуклеиновых кислот (например, ДНК), высвобожденных из пакующих клеток.

Согласно настоящему изобретению, продолжительность этапа 2) предпочтительно находится в диапазоне между 1 и 5 часами, и более предпочтительно, составляют 2 часа (как описано в Примере 1).

Согласно настоящему изобретению, нуклеазу (нуклеазы) (предварительно добавленную (на этапе d) инкубируют) в ходе этапа 2) при температуре в диапазоне между 22ºС и 28ºС, предпочтительно при температуре в диапазоне между 23ºС и 27ºС, более предпочтительно при температуре в диапазоне между 24ºС и 26ºС, и еще более предпочтительно при температуре 25ºС (как описано в Примере 1).

Этап f) добавления моновалентных солей к ортопоксвирусам, выделенным на этапе е), в подходящих условиях позволяет:

- ингибировать активность нуклеазы (нуклеаз); и

- избежать адсорбции ортопоксвирусов на анионообменном адсорбенте на этапе g), т.е. избежать адсорбции более 10% ортопоксвирусов на анионообменном адсорбенте. Соответственно, на этапе g) на анионообменном адсобренте будут адсорбированы только нуклеиновые кислоты (например, ДНК).

Моновалентные соли включают, но не ограничиваются перечисленными: NaCl и KCl. Предпочтительной моновалентной солью для использования на этапе f) является NaCl. Согласно настоящему изобретению, концентрация моновалентных солей на этапе f) находится в диапазоне от 200 до 300 мМ, и предпочтительно составляет 250 мМ или 300 мМ. Согласно настоящему изобретению, этап f) осуществляют при рН, находящемся в диапазоне между 7,0 и 9,0, предпочтительно между 7,5 и 8,5, и, более предпочтительно, при рН 8,0, Согласно настоящему изобретению, этап f) добавления моновалентных солей к ортопоксвирусам, выделенным на этапе е) предпочтительно осуществляют в условия, описанных в Примере 1, с использованием NaCl в количестве 250 мМ, или, более предпочтительно, 300 мМ, при рН 8,0.

Этап g) осуществления контакта смеси, полученной на этапе f), с анионообменным адсорбентом в подходящих условиях обеспечивает захват нуклеиновых кислот (например, ДНК), содержащихся в указанной смеси. Анионообменный сорбент не захватывает отропоксвирусы благодаря обработке, осуществленной на этапе f).

Согласно настоящему изобретению, этап g) осуществляют при рН, находящемся в диапазоне между 7,0 и 9,0, предпочтительно, между 7,5 и 8,5, и, более предпочтительно при рН 8,0 (как описано в Примере 1).

Согласно настоящему изобретению, продолжительность этапа g) предпочтительно находится в диапазоне между 1 и 3 часами, и, более предпочтительно, составляет 1 (как описано в Примере 1).

Согласно настоящему изобретению, функциональные группы анионообменного адсорбента на этапе g) представляют собой первичные, вторичные, третичные и четвертичные аминогруппы, такие как, например, диметиламиноэтил(ОМАЕ), диэтиламиноэтил (DEAE), триметиламиноэтил (ТМАЕ), триэтиламиноэтил (ТЕАЕ), группа -R-СН(ОН)-СН₂-N+-(СН₃)₃ (также называемая Q-группой; см., смолы Streamline®, Pharmacia) и и другие группы, такие как, например, полиэтиленимин (PEI), которая уже имеет или приобретает формально положительный заряд в диапазоне рН от 7,0 до 9,0, Предпочтительными функциональными группами анионообменного адсорбента на этапе д) являются группы, выбранные из группы, состоящей из диметиламиноэтила (DMAE), диэтиламиноэтила (DEAE), триметиламиноэтила (ТМАЕ) и триэтиламиноэтила (ТЕАЕ), и, в более предпочтительном случае, представляют собой триметиламиноэтил (ТМАЕ).

Анионообменный адсорбент на этапе g) может представлять собой например матрикс, состоящий из гранул, или мембрану.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения анионообменный адсорбент на этапе g) представляет собой матрикс, состоящий из гранул. Матрикс может быть, например, агарозой, гидрофильным полимером, целлюлозой, декстраном или кремниевым. Цепи (например, цепи декстрана) связаны с матриксом. Функциональные группы, описанные ранее, присоединены к указанным цепям химически стабильными связями (например, эфирными связями). Предпочтительными функциональными группами матрикса, состоящего из гранул, являются триметиламиноэтильные группы (ТМАЕ). Согласно настоящему изобретению, диаметр гранул матрикса, состоящего из гранул, превышает размер пор фильтров, используемых на этапе осветления h). Соответственно, гранулы в матриксе, состоящем из гранул, предпочтительно, имеют диаметр более 8 мкм, более предпочтительно, диаметр, лежащий в диапазоне между 50 мкм и 150 мкм, более предпочтительно, диаметр, лежащий в диапазоне между 90 мкм и 120 мкм, и еще более предпочтительно диаметр, равный 120 мкм. В соответствии с признаками настоящего изобретения ортопоксвирусы (имеющие диаметр, равный 200-300 нм) проходят через фильтры с таким размером пор в ходе этапа осветления h) (т.е., ортопксвирусы перейдут в фильтрат h). Анионообменные адсорбенты, представляющие собой матрикс, состоящий из гранул, используемые согласно настоящему изобретению предпочтительно являются автоклавируемыми. Автоклавируемые анионообменные адсорбенты, представляющие собой матрикс, состоящий из гранул, уже описаны и некоторые из них доступны для приобретения, такие как, например, UNOsphere® Q (BioRad), UNOsphere® S (BioRad), STREAMLINE™ Q Sepharose® XL (Amersham Biosciences), STREAMLINE™ SP Sepharose® XL (Amersham Biosciences) или BioSepra® Q hyperZ (Pall Corporation). Предпочтительным автоклавируемым анионообменным адсорбентом, представляющим собой матрикс, состоящий из гранул, в соответствии с настоящим изобретением является UNOsphere® Q (BioRad). UNOsphere® Q (BioRad) состоит из гидрофильных полимерных сферических гранул, имеющих диаметр, равный 120 мкм и несущих триметиламиноэтильные (ТМАЕ) функциональные группы. Этап g) осуществления контакта смеси, полученной на этапе f), с анионообменным адсорбентом, где указанный обменный сорбент представляет собой матрикс, состоящий из гранул, предпочтительно осуществляют в соответствии с условиями, описанными в Примере 1, где используют UNOsphere® Q (BioRad).

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения анионообменный адсорбент на этапе g) состоит из мембраны. Функциональные группы мембраны могут быть такими, как описано ранее. Предпочтительными функциональными группами мембраны являются группы триметиламиноэтила (ТМАЕ). Согласно настоящему изобретению размер пор мембраны превышает диаметр ортопосквирусов (т.е. 200 нм). Соответственно, ортопоксвирусы переходят в фильтрат. В этом отношении размер пор мембраны согласно настоящему изобретению находится в диапазоне между 1 и 5 мкм, и предпочтительно составляет 3 мкм. Анионообменные адсорбенты, состоящие из мембран, используемые согласно настоящему изобретению предпочтительно являются автоклавируемыми. Автоклавируемые анионообменные адсорбенты, состоящие мембран уже описаны и некоторые из них доступны для приобретения, такие как, например Sartobind® 75 Q (Sartorius), CUNO PolyNet™ Filters (например, PolyNet™ PB РОЮ, Р020, Р030, Р050) или CUNO Betapure™ Filters (например, Betapure™ Z13-020, Z13-030, Z13-050). Предпочтительным автоклавируемым анионообменным адсорбентом, состоящим из мембран, используемым согласно настоящему изобретению, является Sartobind® 75 Q (Sartorius).

Если этап g) осуществляют с анионообменным адсорбентом, представляющим собой мембрану, следующий этап h) осветления (обеспечивающий удаление клеточного дебриса) не является необходимым. Клеточный дебрис уже задержан мембранами, размер пор которых находится в диапазоне между 1 и 5 мкм, и предпочтительно составляет 3 мкм.

Этап h) осветления смеси, полученной на этапе g), в подходящих условиях обеспечивает удаление клеточного дебриса. Согласно настоящему изобретению, этап осветления h) is предпочтительно осуществляют путем объемной фильтрации. Объемная фильтрация включает, но не ограничивается, использованием одного или большего числа коммерчески доступных продуктов, таких как фильтры Sartopure® от Sartorius (например, Sartopure® PP2), объемные фильтры серии CUNO Incorporated АР (например, АР01), объемные фильтры серии CUNO Incorporated (например, СР10, СР30, СР50, СР60, СР70, СР90), объемные фильтры серии CUNO Incorporated HP (например, НР10, НР30, НР50, НР60, НР70, НР90), объемные фильтры серии CUNO Incorporated Calif (например, СА10, СА30, СА50, СА60, СА70, СА90), объемные фильтры серии CUNO Incorporated SP (например, SP10, SP30, SP50, SP60, SP70, SP90), фильтры CUNO Delipid и Delipid Plus, объемные фильтры серии Millipore Corporation СЕ (например, СЕ15, СЕ20, СЕ25, СЕ30, СЕ35, СЕ40, СЕ45, СЕ50, СЕ70, СЕ75), объемные фильтры серии Millipore Corporation DE (например, DE25, DE30, DE35, DE40, DE45, DE50, DE55, DE560, DE65, DE70, DE75), объемные фильтры серии Millipore Corporation НС (например, А1НС, В1НС, СОНС), CUNO PolyNet™ Filters (например, PolyNet™ РВ Р050, Р100, Р200, Р300, Р400, Р500, Р700), фильтры Millipore Clarigard и Polygard, фильтры CUNO Life Assure, объемные фильтры ManCel Associates (например, PR 12 UP, PR12, PR 5 UP); и фильтры PALL или SeitzSchenk Incorporated. Для того чтобы повысить производительность осветления доступных блоков для объемной фильтрации, может быть полезно объединить два или более блоков с уменьшающимся размером пор. В этом варианте осуществления смесь, подлежащую очистке, пропускают через первый блок для объемной фильтрации в котором задерживаются самые крупные примеси, и затем пропускают через второй блок для объемной фильтрации. При этом, предпочтительном варианте осуществления изобретения осветление на этапе h) осуществляют путем объемной фильтрации, предпочтительно на фильтрах с размером пор, равным 8 мкм в комбинации с фильтрами с размером пор, равным 5 мкм. Предпочтительными фильтрами, имеющими размер пор 8 мкм и 5 мкм, используемыми согласно настоящему изобретению, являются фильтры Sartopure®, доступные для приобретения в (Sartopure® PP2). Объемную фильтрацию можно осуществлять при скорости потока по меньшей мере 1 Л/минуту, и предпочтительно при скорости потока 1 Л/минуту. Согласно настоящему изобретению, этапа h) осуществляют при рН, находящемся в диапазоне между 7,0 и 9,0, предпочтительно, между 7,5 и 8,5, и более предпочтительно, при рН 8,0, Этап h) осветления смеси, полученной на этапе g) предпочтительно осуществляют в соответствии с условиями, описанными в Примере 1, в котором осветление осуществляют путем объемной фильтрации на фильтрах с размером пор, равным 8 мкм, в комбинации с фильтрами с размером пор, равным 5 мкм, и при скорости потока 1 Л/минуту.

Ортопоксвирусы (имеющие диаметр, равный 200-300 нм) проходят через фильтры с таким размером пор в ходе этапа осветления h). Соответственно, ортопоквирусы переходят в фильтрат.

Этап i) промывки анионообменного адсорбента раствором, содержащим моновалентные соли, в подходящих условиях позволяет выделить оставшиеся Ортопоксвирусы в фильтрат. Используемые моновлентные соли включают, но не ограничиваются перечисленными: NaCl и KCl. Предпочтительные моновалентные соли, используемые на этапе i), представляют собой NaCl. Согласно настоящему изобретению, концентрация моновалентных солей, используемая на этапе i), находится в диапазоне от 200 до 300 мМ, и предпочтительно 25 тавляет 0 мМ или 300 мМ. Согласно настоящему изобретению, этап i) осуществляют при рН, находящемся в диапазоне между 7,0 и 9,0, предпочтительно, между 7,5 и 8,5, и, более предпочтительно, при рН 8,0, В предпочтительном варианте осуществления изобретения раствор, содержащий моновалентные соли, в этапе i), представляет собой фармацевтически приемлемый раствор, содержащий 100 мМ Tris-HCl, сахарозы 5% (масс./об.), 10 мМ глутамат натрия и 50 мМ NaCl, рН 8,0 при физиологической омолярности (290 мОсмоль/кг) (т.е. буфер S08). Согласно другим предпочтительным вариантам осуществления изобретения раствор, содержащий моновалентные соли, в этапе i), представляет собой фармацевтически приемлемый раствор, содержащий, например буфер Tris, триэтаноламиновый буфер или фосфатный буфер. Этап i) промывки анионообменного адсорбента раствором, содержащим моновалентные соли, предпочтительно осуществляют в соответствии с условиями, описанными в Примере 1, в котором промывку осуществляют фармацевтически приемлемым буфером S08, содержащим NaCl в количестве 250 мМ, или, более предпочтительно, 300 мМ.

Этап j) концентрирования фильтрата, полученного на этапе h), и фильтрата, полученного на этапе i), обеспечивает удаление белков, присутствующих в указанных фракциях фильтрата.

В предпочтительном варианте изобретения, этап концентрирования j) осуществляют путем микрофильтрации. Микрофильтрация представляет собой осуществляемый под давлением мембранный процесс, который обеспечивает концентрирование и очистку крупных молекул. Более конкретно, раствор пропускают через фильтры, размер пор которых выбран таким образом, чтобы предотвратить попадание ортопоксвирусов в концентрат не препятствовать прохождению через фильтр в фильтрат небольших молекул (например, белков). Микрофильтрация снижает объем экстрактного раствора. При этом микрофильтрацию, соответственно, осуществляют с использованием фильтров, имеющих объем пор меньше 0,2 мкм, предпочтительном, размер пор находится в диапазоне между 0,09 и 0,15 мкм, и, более предпочтительно, размер пор составляет 0,1 мкм. Фильтры, используемые согласно настоящему изобретению предпочтительно являются автоклавируемыми. Автоклавируемые фильтры, используемые на этапе j), доступны для приобретения, такие как, например, Prostak Microfiltration Modules (Millipore) причем предпочтительны Prostak Microfiltration Module PSWAG021, PSWAG041 и SK2P12E1. Этап j) концентрирования фильтрата, полученного на этапе h), и фильтрата, полученного на этапе i), предпочтительно осуществляют в соответствии с условиями, описанными в Примере 1, в котором концентрирование осуществляют путем микрофильтрации на фильтрах с размером пор, равным 0,1 мкм.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения этап концентрирования j) осуществляют путем ультрафильтрации. Согласно настоящему изобретению, ультрафильтрация предпочтительно представляет собой тангенциальную фильтрацию. Принцип тангенциальной фильтрации известен специалистам (см., например, Richards, G.Р. и Goldmintz, D., J.Virol. Methods (1982), 4 (3), стр.147-153. "Evaluation of a cross-flow filtration technique for extraction of polioviruses from inoculated oyster tissue homogenates").

Этап k) диафильтрации фракции, содержащей ортопоксвирусы, полученной на этапе j), (например, фильтрата, если этап концентрирования k) осуществляемый путем микрофильтрации или путем ультрафильтрации) представляет собой улучшение микрофильтрации и включает разбавление указанной фракции, содержащей ортопоксвирусы, раствором чтобы обеспечить снижение концентрации примесей в указанной фракции. Разбавление фракции, содержащей ортопоксвирусы, позволяет вымыть большую часть загрязнений из указанной фракции. Очевидно, что диафильтрация может быть осуществлена в периодическом режиме, полунеприрывном режиме или непрерывном режиме. Этап диафильтрации k) можно (и предпочтительно) использовать для смены буфера, в котором содержится ортопоксвирус. Например, может быть полезно заменить буфер, используемый в процессе очистки, на фармацевтически приемлемый буфер. Согласно настоящему изобретению микрофильтрацию осуществляют с использованием фильтров, размер пор которых меньше 0,2 мкм, предпочтительно, размер находится в диапазоне между 0,09 и 0,15 мкм, и более предпочтительно, размер пор составляет 0,1 мкм. Фильтры, используемые согласно настоящему изобретению предпочтительно являются автоклавируемыми. Автоклавируемые фильтры, используемые на этапе k), доступны для приобретения, такие как, например, Prostak Microfiltration Modules (Millipore), причем предпочтительны Prostak Microfiltration Module PSVVAG021, PSVVAG041 и SK2P12E1. Этап диафильтрации фракции, содержащей ортопоксвирусы, полученной на этапе j), предпочтительно осуществляют в соответствии с условиями, описанными в Примере 1, в котором осуществляют на фильтрах с размером пор, равным 0,1 мкм.

Этап j) концентрирования и этап k) диафильтрации может быть предпочтительно осуществлять с использованием одного типа фильтров.

Способ А согласно настоящему изобретению может дополнительно включать:

1) этап гель-фильтрации (т.е. этап I)); и

2) этап диафильтрации (т.е. этап т)).

Этап гель-фильтрации (i. т.е. этап I): Согласно настоящему изобретению, образец, полученный на этапе k), обрабатывают на твердой подложке, содержащей гранулы, имеющие диаметр, лежащий в диапазоне между 3 и 160 мкм, предпочтительно, между 80 и 160 мкм, предпочтительно, между 40 и 105 мкм, более предпочтительно, между 25 и 75 мкм, более предпочтительно, между 20 и 80 мкм, и, еще более предпочтительно, между 20 и 60 мкм. Согласно настоящему изобретению, пористость указной подложки близка к диаметру ортопоквируса (т.е. 200-300 нм), благодаря чему последний не проникает в гранулы. С другой стороны, молекулы меньшего размера проникают в гранулы, что замедляет их миграцию. Основой подложек, используемых на этапе I) гель-фильтрации, может быть, например, агароза, декстран, акриламид, кварц, сополимеры этиленгликоль/метакрилат или их смеси, такие как, например агарозы и декстрана. Согласно настоящему изобретению, предпочтительном используют подложки без функциональных групп.Подложки для гельхфроматографии доступны для приобретения, такие как, например:

- Подложки для гель-фильтрационной хроматографии из этиленгликоля/метакрилата (например, Toyopearl® HW 55, Toyopeari® HW 65 и Toyopearl® HW 75, диаметр гранул которых находится в диапазоне между 20 и 60 мкм, Tosohaas);

- Подложки для гель-фильтрационной хроматографии из аллил декстрана/метилен бискриламида (например, Sephacryl™ S300 HR, диаметр гранул которой находится в диапазоне между 25 и 75 мкм; Sephacryl™ S400 HR, диаметр гранул которых находится в диапазоне между 25 и 75 мкм; Sephacryl™ S500 HR, диаметр гранул которых находится в диапазоне между 25 и 75 мкм; Sephacryl™ S1000 SF, диаметр гранул которых находится в диапазоне между 40 и 105 мкм, все производства Pharmacia);

- Подложки для гель-фильтрационной хроматографии из N-акриламиногидроксипропандиола (например, Trisacryl, диаметр гранул которых находится в диапазоне между 80 и 160 мкм, Biosepra);

- Подложки для гель-фильтрационной хроматографии из агарозы (например, Macro-Prep SE, диаметр гранул которых находится в диапазоне между 20 и 80 мкм, Bio-Rad).

Предпочтительными являются подложки для гель-фильтрационной хроматографии из этиленгликоля/метакрилата (например, Toyopearl® HW 55, Toyopearl® HW 65 и Toyopearl® HW 75, диаметр гранул которых находится в диапазоне между 20 и 60 мкм, Tosohaas).

Предпочтительные условия для этапа I) гель-фильтрации согласно настоящему изобретению представляют собой:

- концентрация моновалентных солей, выбранных из NaCl и KCl, предпочтительно NaCl, в диапазоне от 200 мМ до 2 М, предпочтительно, в диапазоне от 200 мМ до 1 М, и более предпочтительно, составляет 500 мМ;

- а рН находится в диапазоне между 7,0 и 9,0, предпочтительно, между 7,5 и 8,5, и, более предпочтительно, рН составляет 8,0,

этап m) диафильтрации осуществляют с использованием средств и условий, описанных ранее для этапа k) диафильтрации.

Согласно настоящему изобретению перед каждым этапом от этапа f) до этапа I) способа А, которые были описаны выше, может быть осуществлен этап инкубации образца, содержащего ортопоксвирусы, в присутствии одного или более стабилизаторов. В настоящем описании "стабилизаторы" представляют собой вещества, обеспечивающие сохранение ортопоксвирусов. Стабилизаторы включают, но не ограничиваются перечисленными: сахариды (например, сахарозу, трегалозу, сорбозу, мелезитозу, сорбит, стахиозу, рафинозу, фруктозу, маннозу, мальтозу, лактозу, арабинозу, ксилозу, рибозу, рамнозу, галактозу, глюкозу, маннитол, ксилит, эритриол, треитол, сорбит, глицерин), аминокислоты (например, глицин; лейцин; лизин; аргинин; аспарагин; валин; глютамин), поверхностно-активные вещества (например, Triton X-100; Tween, например, Tween 20, Tween 80 или Tween 85) и соли (например, NaCl; KCl). В предпочтительном варианте осуществления изобретения стабилизаторы, используемые на этом этапе инкубации, представляют собой сахариды и, более предпочтительно, сахарозу. Согласно настоящему изобретению, концентрация сахзарозы, используемая на этом этапе инкубации, находится в диапазоне от 25 до 100 г/л, и предпочтительно составляет 50 г/л. Согласно настоящему изобретению, стабилизатор(ы) могут быть включены в раствор, состоящий из фармацевтически приемлемого раствора, содержащего 100 мМ Tris-HCl, 5% сахарозы (масс./об.), 10 мМ глутамата натрия и 50 мМ NaCl, рН 8,0 с физиологической осмолярностью (290 мОсмоль/кг) (т.е. буфер S08). Согласно настоящему изобретению, стабилизатор(ы) могут быть включены в раствор, состоящий из фармацевтически приемлемого раствора, содержащего, например, буфер Tris, триэтаноламиновый буфер или фосфатный буфер. Согласно настоящему изобретению, этот этап инкубации в присутствии стабилизаторов осуществляют при рН, находящемся в диапазоне между 7,0 и 9,0, предпочтительно между 7,5 и 8,5, и более предпочтительно при рН 8,0, Согласно настоящему изобретению, продолжительность этого этапа инкубации в присутствии стабилизаторов находится в диапазоне между 1 часом и 20 часами, и, более, предпочтительно составляет 18 часов. Согласно настоящему изобретению этот этап инкубации в присутствии стабилизаторов осуществляют при температуре в диапазоне между 2 и 8ºС, предпочтительно, при температуре в диапазоне между 3ºС и 7ºС, более предпочтительно, при температуре в диапазоне между 4ºС и 6ºС, и еще более предпочтительно при температуре 5ºС. Этот этап инкубации в присутствии стабилизаторов предпочтительно осуществляют в присутствии 50 г/л сахарозы в течение 18 часов при температуре 5ºС, как описано в Примере 1.

Согласно другому варианту осуществления способа А согласно изобретению описанного ранее, этап осветления (этап h)) осуществляют после этапа е) выделения ортопоксвирусов из культурального супернатанта и/или пакующих клеток.

Согласно другому этапу осуществления изобретения этап f) добавления моновалентных солей к ортопоксвирусам, выделенным на этапе е), в условиях, подходящих для ингибирования активности нуклеазы (нуклеаз) и для предотвращения адсорбции указанных ортопоксвирусов к анионообменному адсорбенту на этапе g), не осуществляют.

Соответственно, настоящее изобретение также относится к способу, а именно, к способу В) получения и очистки ортопоксвируса дикого типа, аттеньюированного и/или рекомбинантного ортопоксвируса, включающему следующие этапы:

а') приготовление культуры пакующих клеток;

b') инфицирование культуры пакующих клеток ортопоксвирусом;

с') культивирование инфицированных пакующих клеток до получения потомства ортопоксвируса;

d') инкубация в присутствии одной или более нуклеаз;

е') выделение ортопоксвирусов из супернатанта культуры и/или пакующих клеток;

f') инкубирование ортопоксвируса, полученного а этапе е') в присутствии:

1. одного или нескольких агентов, способных ингибировать активность нуклеазы (нуклеаз), и необязательно

2. одного или более стабилизаторов.

g') осуществление контакта смеси, полученной на этапе f') с анионообменным адсорбентом в условиях, подходящих для обеспечения захвата ортопоксвирусов и нуклеиновых кислот;

h') осветление смеси, полученной на этапе g') в условиях, подходящих для удаления клеточного дебриса;

i') элюирование ортопоксвирусов раствором, содержащим моновалентные соли;

j') концентрирование смеси, полученной на этапе i');

k') диафильтрация содержащей ортопоксвирус фракции, полученной на этапе j').

Этап а') приготовления культуры пакующих клеток обозначает этап а) приготовления культуры пакующих клеток, описанный ранее.

Этап b') инфицирования культуры пакующих клеток ортопоксвирусом обозначает этап b) инфицирования культуры пакующих клеток ортопоксвирусом, описанный ранее.

Этап с') культивирования инфицированных пакующих клеток до получения потомства ортопоксвируса обозначает этап с) культивирования инфицированных клеток до получения потомства ортопоксвируса, описанный ранее.

Этап d') инкубации в присутствии одной или более нуклеаз обозначает этап d) инкубации в присутствии одной или более нуклеаз, описанный ранее.

Этап е') выделение ортопоксвирусов из супернатанта культуры и/или пакующих клеток обозначает этап е) выделение ортопоксвирусов из супернатанта культуры и/или пакующих клеток, описанный ранее.

Ортопоксвирусы, выделенные на этапе е'), затем инкубируют (этап f')) в присутствии:

1. одного или нескольких агентов, способных ингибировать активность нуклеазы (нуклеаз), и необязательно

2. одного или более стабилизаторов. Агенты, способный ингибировать активность нуклеаз, включают, но не ограничиваются перечисленными: хелатирующие агенты (например, этилендиаминтетраацетат (EDTA); диэтилентриамин пентаацетат (DTPA); нитрилотриацетат (NTA)), моновалентные соли (например, NaCl или KCl), протеазы, фосфат, моновалентные катионы (например, Na⁺; Li⁺; К⁺; Ag⁺), гуанидин гидрохлорид и аммония сульфат. Хелатирующие агенты, такие какз например, EDTA, DTPA или NTA, удаляют ионы металлов (например, Mg²⁺; Mn²⁺), которые представляют собой, как было описано ранее, необходимые кофакторы активности нуклеазы (нуклеаз). Моновалентные соли (например, NaCl или KCl) вызывают инактивацию нуклеаз в концентрации, находящейся в диапазоне между 50 и 150 мМ, и предпочтительном, в концентрациипримерно 100 мМ. Фосфат и/или моновалентные катионы (например, Na⁺; Li⁺; K⁺; Ag⁺) вызывают инактивацию нуклеаз в концентрации, примерно равной или превышающей 100 мМ. Гуанидина гидрохлорид и сульфат аммония вызывают инактивацию нуклеаз в концентрации выше 100 мМ. В предпочтительном варианте осуществления изобретения агенты, способные ингибировать активность нуклеазы, на этапе f') представляют собой хелатирующие агенты, и более предпочтительно этилендиаминтетраацетат (EDTA). Согласно настоящему изобретению, концентрация EDTA, используемая на этапе f'), находится в диапазоне от 5 до 20 мМ, и предпочтительно составляет 10 мМ. Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения агенты, способные ингибировать активность нуклеазы, на этапе f') представляют собой моновалентные соли, предпочтительно NaCl, и более предпочтительно NaCl в количестве 100 мМ. Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения агенты, способные ингибировать активность нуклеазы, на этапе f) представляют собой моновалентные соли и хелатирующие агенты, предпочтительно NaCl и EDTA, и более предпочтительно NaCl в количестве 100 мМ и EDTA в количестве 10 мМ (как описано в Примере 4). Согласно настоящему изобретению, этап f') осуществляют при рН, находящемся в диапазоне между 7,0 и 9,0, предпочтительно между 7,5 и 8,5, и более предпочтительно при рН 8,0 (как описано в Примере 4).

Согласно настоящему изобретению, этап f') осуществляют при температуре в диапазоне между 2ºС и 8ºС, предпочтительно при температуре в диапазоне между 3ºС и 7ºС, более предпочтительно при температуре в диапазоне между 4ºС и 6ºС, и еще более предпочтительно при температуре 5ºС. Согласно настоящему изобретению, продолжительность этапа f') находится в диапазоне между 5 минутами и 20 часами. В предпочтительном варианте изобретения, продолжительность этапа f') находится в диапазоне между 2 и 20 часами, и предпочтительно составляет 18 часов. В этом настоящем варианте осуществления ортопоксвирусы, полученные на этапе е'), также инкубируют в присутствии одного или более стабилизаторов, в дополнение к агенту (агентам), способному ингибировать активность нуклеазы (нуклеаз) (как было описано ранее). "Стабилизаторы" на этапе f') обозначают агенты, обеспечивающие сохранение ортопоксвирусов в течение обработки агентом (агентами), способными ингибровать активность нуклеазы (нуклеаз) на этапе f'). Стабилизаторы включают, но не ограничиваются перечисленными: сахариды (например, сахарозу, трегалозу, сорбозу, мелезитозу, сорбит, стахиозу, рафинозу, фруктозу, маннозу, мальтозу, лактозу, арабинозу, ксилозу, рибозу, рамнозу, галактозу, глюкозу, маннитол, ксилит, эритриол, треитол, сорбит, глицерин), аминокислоты (например, глицин; лейцин; лизин; аргинин; аспарагин; валин; глютамин), поверхностно-активные вещества (например, Triton X-100; Tween, например, Tween 20, Tween 80 или Tween 85) и соли (например, NaCl; KCl). В предпочтительном варианте осуществления изобретения стабилизаторы, используемые на этапе f'), представляют собой сахариды и, более предпочтительно, сахарозу. Согласно настоящему изобретению, концентрация сахарозы, используемая на этапе f), находится в диапазоне от 25 до 100 г/л, и предпочтительно составляет 50 г/л. Согласно настоящему изобретению, стабилизатор(ы) могут быть включены в раствор, состоящий из фармацевтически приемлемого раствора, содержащего 100 мМ Tris-HCl, 5% сахарозы (масс./об.), 10 мМ глутамата натрия и 50 мМ NaCl, рН 8,0 с физиологической осмолярностью (290 мОсмоль/кг) (т.е. буфер S08).

Согласно настоящему изобретению, стабилизатор(ы) могут быть включены в раствор, состоящий из фармацевтически приемлемого раствора, содержащего 100 мМ Tris-HCl, 5% сахарозы (масс./об.), 10 мМ глутамата натрия и 50 мМ NaCl, рН 8,0 с физиологической осмолярностью (290 мОсмоль/кг) (т.е. буфер S08). Согласно настоящему изобретению, стабилизатор(ы) могут быть включены в раствор, состоящий из фармацевтически приемлемого раствора, содержащего, например, буфер Tris, триэтаноламиновый буфер или фосфатный буфер.

Этап g') осуществления контакта смеси, полученной на этапе f'), с анионообменным адсорбентом в подходящих условиях обеспечивает захват указанного ортопоксвируса и нуклеиновых кислот (например, ДНК), которые также содержатся в указанной смеси.

Согласно настоящему изобретению, этап g') осуществляют при рН, находящемся в диапазоне между 7,0 и 9,0, предпочтительно, между 7,5 и 8,5, и, более предпочтительно, при рН 8,0 (как описано в Примере 4).

Согласно настоящему изобретению, продолжительность этапа g') предпочтительно находится в диапазоне между 1 и 3 часам, и, более предпочтительно, составляет 1 (как описано в Примере 4).

Согласно настоящему изобретению, функциональные группы анионообменного адсорбента на этапе g') представляют собой первичные, вторичные, третичные и четвертичные аминогруппы, такие как, например, диметиламиноэтил(ОМАЕ), диэтиламиноэтил (DEAE), триметиламиноэтил (ТМАЕ), триэтиламиноэтил (ТЕАЕ), группа -R-СН(ОН)-СН₂-N+-(СН₃)₃ (также называемая Q-группой; см., смолы Streamline®, Pharmacia) и другие группы, такие как, например, полиэтиленимин (PEI), которая уже имеют или приобретают формально положительный заряд в диапазоне рН от 7,0 до 9,0, Предпочтительными функциональными группами анионообменного адсорбента на этапе g') являются группы, выбранные из группы, состоящей из диметиламиноэтила (DMAE), диэтиламиноэтила (DEAE), триметиламиноэтила (ТМАЕ) и триэтиламиноэтила (ТЕАЕ), и, в более предпочтительном случае, представляют собой триметиламиноэтил (ТМАЕ).

Анионообменный адсорбент на этапе g) может представлять собой матрикс, состоящий из гранул или мембраны.

Анионообменный адсорбент на этапе g') может представлять собой матрикс, состоящий из гранул или мембраны.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения анионообменный адсорбент на этапе g') представляет собой матрикс, состоящий из гранул. Матрикс может быть, например, агарозой, гидрофильным полимером, целлюлозой, декстраном или кремниевым. Цепи (например, цепи декстрана) связаны с матриксом. Функциональные группы, описанные ранее, присоединены к указанным цепям химически стабильными связями (например, эфирными связями). Предпочтительными функциональными группами матрикса, состоящего из гранул, являются триметиламиноэтильные группы (ТМАЕ).

Согласно настоящему изобретению, диаметр гранул матрикса, состоящего из гранул, превышает размер пор фильтров, используемых на этапе осветления h'). Соответственно, гранулы в матриксе, состоящем из гранул, предпочтительно, имеют диаметр более 8 мкм, более предпочтительно, диаметр, лежащий в диапазоне между 50 мкм и 150 мкм, более предпочтительно, диаметр, лежащий в диапазоне между 90 мкм и 120 мкм, и еще более предпочтительно диаметр, равный 120 мкм.

В соответствии с признаками настоящего изобретения гранулы состоящего из гранул матрикса, несущие ортопоксвирусы, будут задержаны фильтрами в ходе этапа осветления h'), также как клеточный дебрис.

Анионообменные адсорбенты, представляющие собой матрикс, состоящий из гранул, используемые согласно настоящему изобретению предпочтительно подходят для автоклавирования. Автоклавируемые анионообменные адсорбенты, представляющие собой матрикс, состоящий из гранул, уже описаны и некоторые из них доступны для приобретения, такие как, например, UNOsphere® Q (BioRad), UNOsphere® S (BioRad), STREAMLINE™ Q Sepharose® XL (Amersham Biosciences), STREAMLINE™ SP Sepharose® XL (Amersham Biosciences) или BioSepra® Q hyperZ (Pall Corporation).

Предпочтительным автоклавируемым анионообменным адсорбентом, представляющим собой матрикс, состоящий из гранул, в соответствии с настоящим изобретением является UNOsphere® Q (BioRad). UNOsphere® Q (BioRad) состоит из гидрофильных полимерных сферических гранул, имеющих диаметр, равный 120 мкм и несущих триметиламиноэтильные (ТМАЕ) функциональные группы

BioSepra® Q hyperZ (Pall Corporation) состоит из гранул из оксида циркония высокой плотности, имеющих диаметр, равный примерно 75 мкм, и несущих фунциональные группы четвертичного амина - Q-группы.

Этап g') осуществления контакта смеси, полученной на этапе f'), с анионообменным адсорбентом, где указанный обменный сорбент представляет собой матрикс, состоящий из гранул, предпочтительно осуществляют в соответствии с условиями, описанными в Примере 4, где используют BioSepra® Q hyperZ (Pall Corporation).

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения анионообменный адсорбент на этапе g') состоит из мембраны. Функциональные группы мембраны могут быть такими, как описано ранее. Предпочтительными функциональными группами мембраны являются группы триметиламиноэтила (ТМАЕ). В предпочтительном варианте осуществления изобретения размер пор мембраны на этапе g') находится в диапазоне между 1 и 5 мкм, и предпочтительно составляет 3 мкм. Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения размер пор мембраны, используемой на жтапе g'), меньше размера ортопоксвируса (т.е. 200 нм) и, более конкретно, составляет 0,1 мкм. Анионообменные адсорбенты, состоящие из мембран, используемые согласно настоящему изобретению предпочтительно являются автоклавируемыми. Многие анионообменные адсорбенты, состоящие мембран уже описаны и некоторые из них доступны для приобретения, такие как, например Sartobind® 75 Q (Sartorius). Предпочтительным автоклавируемым анионообменным адсорбентом, состоящим из мембран, используемым согласно настоящему изобретению, является Sartobind® 75 Q (Sartorius).

Если g') осуществляют с анионообменным адсорбентом, представляющим собой анионообменную мембрану, следующий этап h') осветления (обеспечивающий удаление клеточного дебриса не является необходимым. Клеточный дебрис уже задержан анионообменными мембранами (как было описано ранее), использованными на этапе f).

Этап h') осветления смеси, полученной на этапе g'), обозначает этап h) осветления смеси, полученной на этапе g) описанный ранее.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения если этап g') осуществляют с анионообменным адсорбентом, представляющим собой матрикс, состоящий из гранулам, перед этапом h') может быть осуществлен этап, обеспечивающий удаление указанного матрикса, состоящего из гранул, несущего ортопоксвирусы. При этом указанный этап осуществляют с использованием например, фильтровальных мешков, размер пор которых, соответственно, меньше размера пор гранул, образующих матрикс, состоящий из гранул. Согласно настоящему изобретению, размер пор фильтровальных мешков находится в диапазоне между 10 и 100 мкм, предпочтительно, между 25 и 100 мкм, и, более предпочтительно, составляет 50 мкм. Фильтровальные мешки, используемые согласно настоящему изобретению, предпочтительно являются автоклваируемыми. Автоклавируемые фильтровальные мешки описаны и некоторые из них доступны для приобретения, такие как, например, CUNO™ Felt Filter Bags (CUNO), причем предпочтительными являются полиэстеровые Felt Filter Bags (например, NB EES 0010, 0025, 0050, 0100), Felt Filter Bags из полиэстера/полипропилена (например, NB PES 0010, 0025, 0050, 0100) и Felt Filter Bags из нейлоновых монофиламентов (например, NB NYS 0025, 0050, 0100).

Этап i') элюирования ортопоксвирусов раствором, содержащим моновалентные соли, обеспечивает выделение захваченных ортопоксвирусов с обменного адсорбента. Используемые моновалентные соли включают, но не ограничиваются перечисленными: NaCl и KCl. Предпочтительные моновалентные соли на этапе i') представляют собой NaCl. Согласно одному варианту осуществления изобретения элюирование осуществляют путем увеличения градиента концентрации моновалентных солей в диапазоне предпочтительно от 0 до 2,5 М, более предпочтительно, от 0 до 2 М и еще более предпочтительно, от 0 до 1.5 М. Согласно другому этапу осуществления изобретения элюирование осуществляют путем одноэтапного элюирования при концентрации моновалентных солей ниже 1 М, предпочтительно, в диапазоне между 300 мМ и 750 мМ, и более предпочтительно, составляющей 500 мМ. Согласно настоящему изобретению, этап i') осуществляют при рН, находящемся в диапазоне между 7,0 и 9,0, предпочтительно, между 7,5 и 8,5, ,и более предпочтительно, при рН 8,0., В предпочтительном варианте осуществления изобретения раствор, содержащий моновалентные соли, на этапе i') представляет собой фармацевтически приемлемый раствор, содержащий 100 мМ Tris-HCl, 5% сахарозы (масс./об.), 10 мМ глутамата натрия и 50 мМ NaCI, pH 8,0, с физиологической осмолярностью (290 мОсмоль/кг) (т.е. буфер S08). Согласно другим предпочтительным вариантам осуществления изобретения раствор, содержащий моновалентные соли, на этапе i') представляет собой фармацевтически приемлемый раствор, содержащий, например, буфер Tris, триэтаноламиновый буфер или фосфатный буфер. Этап i') элюирования ортопоксвирусов раствором, содержащим моновалентные соли, предпочтительно осуществляют в соответствии с условиями, описанными в Примере 4, в котором элюирование осуществляют by путем градиента концентрации NaCl (300 мМ; 400 мМ; 500 мМ) в буфере S08 buffer.

Этап j') концентрирования смеси, полученной на этапе i'), обеспечивает удаление белков, присутствующих в указанных фракциях фильтрата.

В предпочтительном варианте изобретения, этап концентрирования j') осуществляют путем микрофильтрации (как было описано ранее для этапа j)).

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения этап концентрирования j') осуществляют путем ультрафильтрации (как было описано ранее для этапа j)).

Этап k') диафильтрации фракции, содержащей ортопоксвирусы, полученной на этапе j'), обозначает этап k) диафильтрации содержащей ортопоксвирус фракции,полученной на этапе j) описанном ранее.

Данный способ В согласно настоящему изобретению может дополнительно включать:

1) этап гель-фильтрации (т.е. этап I')); и

2) этап диафильтрации (т.е. этап m')).

Этап i') гель-фильтрации обозначает этап I) гель-фильтрации.

Этап m') диафильтрации обозначает этап m) диафильтрации.

Согласно настоящему изобретению перед каждым этапом от этапа f') до этапа i') способа В, описанного выше, может быть осуществлен этап инкубации образца, содержащего ортопоксвирусы, в присутствии одного или более стабилизаторов.

В настоящем описании "стабилизаторы" представляют собой вещества, обеспечивающие сохранение ортопоксвирусов. Стабилизаторы включают, но не ограничиваются перечисленными: сахариды (например, сахарозу, трегалозу, сорбозу, мелезитозу, сорбит, стахиозу, рафинозу, фруктозу, маннозу, мальтозу, лактозу, арабинозу, ксилозу, рибозу, рамнозу, галактозу, глюкозу, маннитол, ксилит, эритриол, треитол, сорбит, глицерин), аминокислоты (например, глицин; лейцин; лизин; аргинин; аспарагин; валин; глютамин), поверхностно-активные вещества (например, Triton X-100; Tween, например, Tween 20, Tween 80 или Tween 85) и соли (например, NaCl; KCl). В предпочтительном варианте осуществления изобретения стабилизаторы, используемые на этом этапе инкубации, представляют собой сахариды и, более предпочтительно, сахарозу. Согласно настоящему изобретению, концентрация сахзарозы, используемая на этом этапе инкубации, находится в диапазоне от 25 до 100 г/л, и предпочтительно составляет 50 г/л. Согласно настоящему изобретению, стабилизатор(ы) могут быть включены в раствор, состоящий из фармацевтически приемлемого раствора, содержащего 100 мМ Tris-HCl, 5% сахарозы (масс./об.), 10 мМ глутамата натрия и 50 мМ NaCl, рН 8,0 с физиологической осмолярностью (290 мОсмоль/кг) (т.е. буфер S08). Согласно настоящему изобретению, стабилизатор(ы) могут быть включены в раствор, состоящий из фармацевтически приемлемого раствора, содержащего, например, буфер Tris, триэтаноламиновый буфер или фосфатный буфер. Согласно настоящему изобретению, этот этап инкубации в присутствии стабилизаторов осуществляют при рН, находящемся в диапазоне между 7,0 и 9,0, предпочтительно между 7,5 и 8,5, и более предпочтительно при рН 8,0, Согласно настоящему изобретению, продолжительность этого этапа инкубации в присутствии стабилизаторов находится в диапазоне между 1 часом и 20 часами, и, более, предпочтительно составляет 18 часов.

Согласно настоящему изобретению, этот этап инкубации в присутствии стабилизаторов осуществляют при температуре в диапазоне между 2ºС и 8ºС, предпочтительно при температуре в диапазоне между 3ºС и 7ºС, более предпочтительно при температуре в диапазоне между 4ºС и 6ºС, и еще более предпочтительно при температуре 5ºС. Этот этап инкубации в присутствии стабилизаторов предпочтительно осуществляют в присутствии 50 г/л сахарозы в течение 18 часов при температуре 5ºС.

Согласно другому варианту осуществления способа В согласно настоящему изобретению, описанному ранее, этап осветления (этап h')) осуществляют после этапа е') выделения ортопоксвирусов из культурального супернатанта и/или пакующих клеток.

Настоящее изобретение также относится к способу, совмещающему этап (этапы) способа А и этап (этапы) В, описанных ранее.

При этом настоящее изобретение более конкретно относится к способу (т.е. способу С) получения и очистки ортопоксвируса дикого типа, аттеньюированного и/или рекомбинантного ортопоксвируса, включающий следующие этапы:

а”) приготовление культуры пакующих клеток;

b”) инфицирование культуры пакующих клеток ортопоксвирусом;

с”) культивирование инфицированных пакующих клеток до получения потомства ортопоксвируса;

d”) инкубация в присутствии одной или более нуклеаз;

е”) выделение ортопоксвирусов из супернатанта культуры и/или пакующих клеток;

f”) инкубация ортопоксвируса, полученного а этапе е”) в присутствии:

1. одного или нескольких агентов, способных ингибировать активность нуклеазы (нуклеаз), и необязательно

2. одного или более стабилизаторов;

g”) осуществление контакта смеси, полученной на этапе f”) с анионообменным адсорбентом в условиях, подходящих для захвата указанных ортопоксвирусов и нуклеиновых кислот;

h”) осветление смеси, полученной на этапе g”) в условиях, подходящих для удаления клеточного дебриса;

i”) элюирование ортопоксвирусов раствором, содержащим моновалентные соли;

j”) добавление моновалентных солей с ортопоксвирусам, элюированным на этапе i”), для предотвращения адсорбции указанных ортопоксвирусов на анионообменном адсорбенте на этапе k”);

k”) осуществление контакта смеси, полученной на этапе j”), с анионообменным адсорбентов в условиях, подходящих для захвата нуклеиновых кислот;

I”) промывка анионообменного адсорбента в условиях, подходящих для выделения оставшихся ортопоксвирусов в фильтрате;

m”) концентрирование фильтрата, полученного на этапе I”);

n”) диафильтрация содержащей ортопоксвирус фракции, полученной на этапе m”).

Этап а”) приготовления культуры пакующих клеток обозначает этап а) приготовления культуры пакующих клеток, описанный ранее.

Этап b”) инфицирования культуры пакующих клеток ортопоксвирусом обозначает этап b) инфицирования культуры пакующих клеток ортопоксвирусом, описанный ранее.

Этап с”) культивирования инфицированных пакующих клеток до получения потомства ортопоксвируса обозначает этап с) культивирования инфицированных клеток до получения потомства ортопоксвируса, описанный ранее.

Этап d”) инкубации в присутствии одной или более нуклеаз обозначает этап d) инкубации в присутствии одной или более нуклеаз, описанный ранее.

Этап е”) выделения ортопоксвирусов из супернатанта культуры и/или пакующих клеток обозначает этап е) выделение ортопоксвирусов из супернатанта культуры и/или пакующих клеток, описанный ранее.

Этап f”) инкубации ортопоксвирусов, выделенных на этапе е”), в присутствии (1) одного или нескольких агентов, способных ингибировать активность нуклеазы (нуклеаз), и необязательно (2) одного или более стабилизаторов, обозначает этап f') инкубации ортопоксвирусов, выделенных на этапе е'), в присутствии (1) одного или нескольких агентов, способных ингибировать активность нуклеазы (нуклеаз), и необязательно (2) одного или более стабилизаторов, описанный ранее.

Этап g”) осуществления контакта смеси, полученной на этапе f”), с анионообменным адсорбентом в условиях, подходящих для захвата указанных ортопоксвирусов и нуклеиновых кислот, обозначает этап g') осуществления контакта смеси, полученной на этапе f'), с анионообменным адсорбентом в условиях, подходящих для захвата указанных ортопоксвирусов и нуклеиновых кислот, описанный ранее.

Этап h”) осветления смеси, полученной на этапе g”), обозначает этап h) осветления смеси, полученной на этапе g), описанный ранее.

Этап i”) элюирования ортопоксвирусов раствором, содержащим моновалентные соли, обозначает этап i') элюирования ортопоксвирусов раствором, содержащим моновалентные соли, описанный ранее.

Этап j”) добавления моновалентных солей к ортопоксвирусам, предварительно элюированным на этапе i”), позволяет в подходящих условиях избежать адсорбции указанных ортопоксвирусов на анионообменном адсорбенте на этапе k”) (т.е. избежать адсорбции более чем 10 % ортопоксвирусов на анионообменном адсорбенте). Соответственно, нуклеиновые кислоты (например, ДНК) будут адсорбированы только на анионообменном адсорбенте на этапе k”). Моновалентные соли включают, но не ограничиваются перечисленными: NaCl и KCl. Предпочтительные моновалентные соли, используемые на этапе j”), представляют собой NaCl. Согласно настоящему изобретению, концентрация моновалентных солей на этапе j”) находится в диапазоне от 200 до 300 мМ, и предпочтительно составляет 250 мМ или 300 мМ. Согласно настоящему изобретению, этап j”) осуществляют при рН, находящемся в диапазоне между 7,0 и 9,0, предпочтительно, между 7,5 и 8,5, и более предпочтительно при рН 8,0,

Этап k”) осуществления контакта смеси, полученной на этапе j”), с анионообменным адсорбентов в условиях, подходящих для захвата нуклеиновых кислот, обозначает этап g) осуществления контакта смеси, полученной на этапе f) с анионообменным адсорбентов в условиях, подходящих для захвата нуклеиновых кислот, описанный ранее.

Этап I”) промывки анионообменного адсорбента в условиях, подходящих для выделения оставшихся ортопоксвирусов в фильтрате, обозначает этап i) промывки анионообменного адсорбента в условиях, подходящих для выделения оставшихся ортопоксвирусов в фильтрате как описанный ранее.

Этап m”) концентрирования фильтрата, полученного на этапе I”), обеспечивает удаление белков, присутствующих в указанной фракции фильтрата. В предпочтительном варианте изобретения, этап концентрирования m”) осуществляют путем микрофильтрации (как было описано ранее для этапа j)). В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения этап концентрирования m”) осуществляют путем ультрафильтрации (как было описано ранее для этапа j)).

Этап n”) диафильтрации фракции, содержащей ортопоксвирусы, полученной на этапе m”), обозначает этап k) диафильтрации содержащей ортопоксвирус фракции, полученной на этапе j), как описанный ранее.

Данный способ С согласно настоящему изобретению может дополнительно включать:

3) этап гель-фильтрации (т.е. этап о”)); и

4) этап диафильтрации (т.е. этап p”)).

Этап о”) гель-фильтрации обозначает этап I) гель-фильтрации.

Этап p”) диафильтрации обозначает этап m) диафильтрации.

Согласно настоящему изобретению перед каждым этапом с этапа f”) до этапа p”) (и, предпочтительно, каждым этапом от этапа k”) до этапа p”)) способа С, описанного выше, может быть осуществлен этап инкубации of образца, содержащего ортопоксвирусы, в присутствии одного или более стабилизаторов.

В настоящем описании "стабилизаторы" представляют собой вещества, обеспечивающие сохранение ортопоксвирусов. Стабилизаторы включают, но не ограничиваются перечисленными: сахариды (например, сахарозу, трегалозу, сорбозу, мелезитозу, сорбит, стахиозу, рафинозу, фруктозу, маннозу, мальтозу, лактозу, арабинозу, ксилозу, рибозу, рамнозу, галактозу, глюкозу, маннит, ксилит, эритриол, треитол, сорбит, глицерин), аминокислоты (например, глицин; лейцин; лизин; аргинин; аспарагин; валин; глютамин), поверхностно-активные вещества (например, Triton X-100; Tween, например, Tween 20, Tween 80 или Tween 85) и соли (например, NaCl; KCl). В предпочтительном варианте осуществления изобретения стабилизаторы, используемые на этом этапе инкубации, представляют собой сахариды и, более предпочтительно, сахарозу. Согласно настоящему изобретению, концентрация сахарозы, используемая на этом этапе инкубации, находится в диапазоне от 25 до 100 г/л, и предпочтительно составляет 50 г/л. Согласно настоящему изобретению, стабилизатор(ы) могут быть включены в раствор, состоящий из фармацевтически приемлемого раствора, содержащего 100 мМ Tris-HCl, 5% сахарозы (масс./об.), 10 мМ глутамата натрия и 50 мМ NaCl, рН 8,0 с физиологической осмолярностью (290 мОсмоль/кг) (т.е. буфер S08). Согласно настоящему изобретению, стабилизатор(ы) могут быть включены в раствор, состоящий из фармацевтически приемлемого раствора, содержащего, например, буфер Tris, триэтаноламиновый буфер или фосфатный буфер. Согласно настоящему изобретению, этот этап инкубации в присутствии стабилизаторов осуществляют при рН, находящемся в диапазоне между 7,0 и 9,0, предпочтительно между 7,5 и 8,5, и более предпочтительно при рН 8,0, Согласно настоящему изобретению, продолжительность этого этапа инкубации в присутствии стабилизаторов находится в диапазоне между 1 часом и 20 часами, и, более, предпочтительно составляет 18 часов. Согласно настоящему изобретению этот этап инкубации в присутствии стабилизаторов осуществляют при температуре в диапазоне между 2 и 8ºС, предпочтительно, при температуре в диапазоне между 3ºС и 7ºС, более предпочтительно, при температуре в диапазоне между 4ºС и 6ºС, и еще более предпочтительно при температуре 5ºС. Этот этап инкубации в присутствии стабилизаторов предпочтительно осуществляют в присутствии 50 г/л сахарозы в течение 18 часов при температуре 5ºС

Согласно другому варианту осуществления способа С согласно настоящему изобретению, описанному ранее, этап осветления (этап h”)) осуществляют после этапа е”) выделения ортопоксвирусов из культурального супернатанта и/или пакующих клеток.

Согласно настоящему изобретению образцы, содержащие ортопоксвирусы, полученные после каждого этапа способов согласно настоящему изобретению, могут быть сохранены путем замораживания, хорошо известного специалистам в данной области.

Согласно настоящему изобретению, способы согласно настоящему изобретению осуществляют при рН, находящемся в диапазоне между 7,0 и 9,0, предпочтительно, между 7,5 и 8,5, и, более предпочтительно, при рН 8,0,

В предпочтительном варианте изобретения, ортопоксвирус представляет собой вирус коровьей оспы (VV). Предпочтительные VV согласно настоящему изобретению представляют собой VV, описанные, например в заявках на патент РСТ/ЕР2008/009720 (WO 2009/065546, описывающая W, содержащий дефектный ген(ы) I4L и/или F4L) или РСТ/ЕР2008/009721 (WO 2009/065547, описывающая W, содержащий дефектный ген I4L F2L).

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения ортопоксвирус представляет собой модифицированный вирус осоповакцины Анкара (MVA). Предпочтительные MVA согласно настоящему изобретению представляют собой MVA, депонированные в Национальной Коллекции Культур Микроорганизмов Франции (CNCM) под номерами № I-721, MVA 575 (ЕСАСС V00120707) и MVA-BN (ЕСАСС V00083008).

Термин "рекомбинантный ортопоксвирус" относится к ортопоквирусу, содержащей экзогенную последовательность, встроенную в его геном. В настоящее описании, экзогенной последовательностью называется нуклеиновая кислота, которая обычно не встречается в исходном ортопоксвирусе.

В одном варианте осуществления указанная экзогенная последовательность кодирует молекулу, обладающая прямой или непрямой цитотоксической функцией. Под "прямой или непрямой" цитотоксичностью мы понимаем, что молекула, кодируемая экзогенной последовательностью может быть токсична сама по себе (например, рицин, фактор некроза опухолей (ОНО), интерлейкин-2 (IL2), интерферон-гамма (IFNγ), рибонуклеаза, резоксирибонуклеаза, экзотоксин Pseudomonas А) или, она может превращаться в токсический продукт в ходе метаболизма, или она вызывать превращение чего-то в токсический продукт. Последовательность кДНК рицина раскрыта в работе Lamb et al (Eur. J. Biochem., 1985, 148, 265-270).

В предпочтительном варианте изобретения экзогенная последовательность представляет собой суицидальный ген. Суицидальный ген кодирует белок, способный превращаться относительно нетоксичное пролекарство в токсичное лекарственное средство. Например, фермент цитозиндеаминаза превращает 5-фторцитозин (5-FC) в 5-фторурацил (5-FU) (Mullen et al (1922) PNAS 89, 33); фермент тимидинкиназа вируса простого герпеса сенсибилизирует клетки к обработке противовирусным агентом ганцикловиром (GCV) или ацикловиром (Moolten (1986) Cancer Res. 46, 5276; Ezzedine et al (1991) New Biol 3, 608). Может быть использована Цитозиндеаминаза любого организма, например, E. coli или Saccharomyces cerevisiae. Так, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения суицидальный ген кодирует белок, обладающий активностью цитозиндеаминазы, и, более предпочтительно, белок FCU1 или белок FCU1-8, описанные в заявках на патент WO 99/54481, WO 05/07857, РСТ/ЕР2008/009720 и РСТ/ЕР2008/009721, которые включены в настоящее описание посредством ссылки.

При этом, предпочтительные ортопоксвирусы, получаемые способом согласно настоящему изобретению, переставляют собой:

- MVA-FCU1 (см. WO 99/54481), называемый также TG4023;

- MVA-FCU1-8 (см. WO 05/07857); и

- W-FCU1, причем указанный W содержит, более конкретно, дефектный ген I4L и/или F4L и дефектный ген J2R (см. РСТ/ЕР2008/009720/ W02009/065546 и PCT/EP2008/009721/W02009/065547).

Другими примерами комбинаций пролекарство/фермент являются комбинации, описанные Bagshawe и др. (WO 88/07378), а именно различные алкилирующие агенты и фермент CPG2 из Pseudomonas spp., и комбинации, описанные Epenetos и Rowlinson-Busza (WO 91/11201), а именно цианогенные пролекарства (например амигдалин) и полученные из растений бета-глюкозидазы. К ферментам, пригодным в этом варианте осуществления настоящего изобретения относятся щелочная фосфатаза, пригодная для превращения пролекарств, содержащих фосфат, в свободные лекарства; арилсульфатаза, пригодная для превращения пролекарств, содержащих сульфат, в свободные лекарства; протеазы, такие как протеаза из серратии, термолизин, субтилизин, карбоксипептидазы и катепсины (такие как катепсины В и L), пригодные для превращения пролекарств, содержащих пептид, в свободные лекарства; D-аланилкарбоксипептидазы, пригодные для превращения пролекарств, модифицированных D-аминокислотами; ферменты, расщепляющие углеводы, такие как бета-галактозидаза и нейраминидаза, пригодные для превращения гликозилированных пролекарств в свободные лекарства; бета-лактамаза, пригодные для превращения лекарств, содержащих бета-лактамы, в свободные лекарства; и пенициллинамидазы, такие как пенициллин-V-амидаза или пенициллин-G-амидаза, пригодные для превращения лекарств, содержащих феноксиацетильную или фенилацетильную группы, соответственно, на атоме азота их аминогруппы, в свободные лекарства, но не ограничиваются ими. С другой сторон, антитела с ферментативной активностью, также известные в данной области техники как абзимы, могут использоваться для превращения пролекарств согласно настоящему изобретению в свободные активные лекарства (Massey R. et al., Nature, 1987, 328, 457-458). Аналогичным образом к пролекарствам относятся упомянутые выше пролекарства, например, пролекарства, содержащие фосфат, пролекарства, содержащие тиофосфат, пролекарства, содержащие сульфатфат, пролекарства, содержащие пептид, пролекарства, модифицированные D-аминокислотой, гликозилированные пролекарства, пролекарства, содержащие бета-пактам, пролекарства, по выбору замещенные феноксиацетамидом или фенилацетамидом, 5-фторцитозин и другие 5-фторуридиновые пролекарства, которые могут быть подвергнуты превращению, но не ограничиваются ими. Примерами цитотоксических лекарств, которые могут быть модифицированы с получением пролекарственной формы для применения в настоящем изобретении являются этопозид, тенипозид, адриамицин, дауномицин, карминомицин, аминоптерин, дактиномицин, митомицины, цисплатин и аналоги цисплатина, блеомицины, эсперамицины (см., например, патент США 4, 675, 187), 5-фторурацил, мелфалан и другие родственные горчичные азотистые соединения, но не ограничиваются ими.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанный экзогенный ген кодирует рибозим, обладающий способностью к расщеплению целевой РНК или ДНК. Целевыми РНК и ДНК, которые предполагается расщеплять, могут быть РНК или ДНК, которые являются жизненно необходимыми для функционирования клетки и их расщепление приводит к гибели клетки, или РНК или ДНК, которые предполагается расщеплять, могут быть РНК или ДНК, которые кодируют нежелательный белок, например продукт онкогена, и расщепление такой РНК или ДНК могут предотвратить превращение этой клетки в раковую.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный экзогенный ген кодирует антисмысловую РНК. Под "антисмысловой РНК" понимается молекула РНК, которая гибридизуется с молекулой мРНК и мешает экспрессии с молекулы мРНК, кодирующей белок, или с другой молекулой РНК в клетке, такой как пре-мРНК или тРНК или рРНК, или гибридизуется с геном и мешает экспрессии этого гена.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанная экзогенная последовательность замещает функцию дефектного гена в целевой клетке. Известны несколько тысяч наследственных заболеваний млекопитающих, включая человека, которые обусловлены дефектными генами. Примерами таких генетических заболеваний являются муковисцидоз, про который известно, что он обусловлен мутацией в гене CFTR; мышечная дистрофия Дюшенна, про которую известно, что она обусловлена мутацией в гене дистрофина; серповидноклеточная анемия, про которую известно, что она обусловлена мутацией в гене HbA. Множество видов рака обусловлены дефектными генами, особенно протоонкогенами, и генами, кодирующими супрессоры опухоли, которые подвергаются мутациям. Примерами протоонкогенов являются ras, src, bcl и так далее; примерами генов, кодирующих супрессоры опухоли, являются р53 и Rb.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанная экзогенная последовательность кодирует опухольассоциированный антиген (ОАА). ОАА означает молекулу, которая детектируется в клетках опухоли с частотой или плотностью большей, чем в неопухолевых клетках того же типа ткани. Примерами ТАА являются СЕА, MART1, MAGE1, MAGE3, GP-100, MUC1 (см. WO 92/07000, WO 95/09241 и Rochlitz et al. J Gene Med. 2003 Aug; 5(8):690-9, включенная в настоящий документ посредством ссылки), MUC2, онкоген ras с точечными мутациями, нормальный р53 или р53 с точечными мутациями, сверхэкспрессированный р53, СА-125, PSA, C-erb/B2, BRCA I, BRCA II, PSMA, тирозиназа, TRP1, TRP2, NY-ESO-1, TAG72, KSA, HER-2/neu, bcr-abl, рах3-fkhr, ews-fli-1, «surviving» и LRP, но не ограничиваются ими. В соответствии с более предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, ОАА является MUC1.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанный экзогенный ген кодирует антиген. Использованный здесь термин "антиген" относится к лиганду, который может связываться с антителом; сам по семе антиген может быть не иммуногенным. Предпочтительно, чтобы указанный антиген был получен из вируса, такого как, например, ВИЧ-1, (такой как gp 120 или gp 160), любого из вирусов иммунодефицита кошачьих, вирусов герпеса человека или животного, таких как gD или его производные, или предранний белок, такой как ICP27 из вируса герпеса HSV1 или HSV2, цитомегаловируса (такой как gB или его производные), вируса ветряной оспы (такой как gpl, II или III), или из вируса гепатита, такого как вирус гепатита В (HBV), например, поверхностный антиген вируса гепатита В или его производное, вируса гепатита A (HAV), вируса гепатита С (HCV; см. WO 04/111082; предпочтительно не структурный белок вируса HCV генотипа 1Ь штамма ja), вируса гепатита Е (HEV), или из других вирусных патогенов, таких как респираторно-синцитиальный вирус, вирус папилломы человека (HPV; см. WO 90/10459, WO 95/09241, WO 98/04705, WO 99/03885 WO 07/121894 и WO 07/121894; белки Е6 и Е7 из штамма HPV16 являются предпочтительными; см. также Liu и др. Proc Natl Acad Sci USA. 2004 Oct 5; 101 Suppl 2:14567-71) или вирус гриппа, или полученных из бактериальных патогенов, таких как Salmonella, Neisseria, Borrelia (например OspA или OspB, или их производные), или Chlamydia, или Bordetella, например Р.69, РТ и FHA, или полученных из паразитов, таких как плазмодий или токсоплазма. В соответствии с более предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения указанный антиген выбран из HCV или HPV.

В этой связи, предпочтительными рекомбинантными ортопоксвирусами, полученными в соответствии со способом согласно настоящему изобретению, являются вирусы MVA-HCV (см. WO 04/111082), также называемые TG4040.

Указанный рекомбинантный ортопоксвирус может содержать более одной экзогенной последовательности и каждая экзогенная последовательность может кодировать более одной молекулы. Например, может быть полезно объединить в одном и том же рекомбинантном ортопоксвирусе экзогенную последовательность, кодирующую, например, ОАА (как описано выше) или антиген (как описано выше) с экзогенной последовательностью, кодирующей цитокин (например, интерлейкин (ИЛ, например ИЛ2); фактор некроза опухоли (ФИО); интерферон (IFN); фактор, стимулирующий образование колоний (CSF)).

В этой связи, предпочтительными ортопоксвирусами, получаемыми в соответствии со способом согласно настоящему изобретению являются:

- MVA-[MUC1-IL2] (см. WO 92/07000 и WO 95/09241), также называемый TG4010; и

MVA-[HPV-IL2] (см. WO 90/10459, WO 95/09241, WO 98/04705, WO 99/03885, WO 07/121894 и WO 07/121894) также называемый TG4001. Преимущественно, указанный рекомбинантный ортопоксвирус дополнительно содержит элементы, необходимые для экспрессии указанных экзогенных последовательностей. Указанные элементы, необходимые для экспрессии, содержат набор элементов, позволяющих осуществлять транскрипцию последовательности нукпеотидов в РНК и трансляцию мРНК в полипептид, в частности последовательность промотора и/или регуляторные последовательности, которые являются эффективными в клетке, которую предполагается инфицировать указанным рекомбинантным ортопоксвирусом согласно настоящему изобретению, и, необязательно, последовательности, требующиеся для осуществления секреции или экспрессии указанного полипептида на поверхности клеток. Такие элементы могут быть индуцируемыми или конститутивными. Конечно же, указанный промотор адаптируется для выбранного рекомбинантного ортопоксвируса и для клетки-хозяина. В качестве примера можно отметить промоторы вируса осповакцины р7.5К pH5R, pK1L, p28, p11 или комбинацию указанных промоторов. В литературных источниках предоставляется большое количество информации, относящейся к таким последовательностям промоторов. Необходимые элементы могут дополнительно содержать дополнительные элементы, которые улучшают экспрессию указанной экзогенной последовательности или ее стабильность в клетке-хозяине. В частности можно отметить последовательности интронов (WO 94/29471), последовательности сигналов секреции, последовательности локализации в ядре, внутренние сайты реинициации трансляции типа IRES, последовательности поли-А для терминации транскрипции.

Настоящее изобретение также относится к очищенному ортопоксвирусу дикого типа, аттеньюированному и/или рекомбинантному ортопоксвирусу, полученному способом согласно настоящему изобретению лдя применения в качестве фармацевтической композиции, предпочтительно в качестве вакцины.

В данном документе термин "фармацетическая композиция" относится к композиции, содержащей фармацевтически приемлемый носитель. Указанный фармацевтически приемлемый носитель является предпочтительно изотоническим, гипотоническим или слабо гипертоническим и обладает относительно невысокой ионной силой, например, такой как раствор сахарозы. Кроме того, такой носитель может содержать какой-либо растворитель, либо водную или частично водную жидкость, такую, как непирогенная стерильная вода. Кроме того, рН данной фармацевтической композиции корректируют и буферизуют таким образом, чтобы он соответствовал требованиям для использования in vivo. Фармацевтические композиции могут также включать фармацевтически приемлемый разбавитель, адъювант или наполнитель, а также солюбилизирующие, стабилизирующие и консервирующие вещества. Для применения в виде инъекций предпочтительной является лекарственная форма в виде водного, неводного или изотонического раствора. Она может быть представлена в виде разовой дозы или мультидозы в жидкой или сухой (порошок, лиофилизат и т.п.) форме, которая может быть восстановлена в процессе использования при помощи подходящего разбавителя.

Настоящее изобретение также относится к очищенному дикому типу, аттеньюированному и / или рекомбинантному ортопоксвирусу, полученным способом согласно настоящему изобретению, для лечения и / или профилактики рака, инфекционных заболеваний и / или аутоиммунных расстройств.

В данном описании термин "рак" включает, но не ограничивается перечисленными: рак легких (такой, как мелкоклеточная карцинома легкого и немелкоклеточный рак легкого), рак бронхов, рак пищевода, рак глотки, раковым образованиям головы и шеи (таким, как рак гортани, рак губы, рак полости носа и околоносовых пазух, рак горла), рак полости рта (такой, как рак языка), рак ЖКТ (такому, как рак желудка), рак кишечника, гастроинтестинальному рак, рак толстой кишки, рак прямой кишки, колоректальному рак, рак анального канала, рак печени, рак поджелудочной железы, рак мочевыводящих путей, рак мочевого пузыря, рак щитовидной железы, рак почек, карциноме, аденокарциному, рак кожи (такой, как меланома), рак глаза (такому, как ретинобластома), рак мозга (такой, как глиома, медуллобластома или церебральная астроцитома), рак центральной нервной системы, лимфому (такую как кожная В-клеточная лимфома, лимфома Беркита, синдром Ходжкина и неходжкинская лимфома), рак костей, лейкеми, рак груди, рак половых путей, рак шейки матки (такойу, как интраэпителиальная цервикальная неоплазия), рак матки (такой, как рак эндометрия), рак яичников, рак влагалища, рак вульвы, рак простаты, рак яичка. Термин "рак" также относится к вирус-индуцированным опухолям, в том числе, помимо прочих, к папилломе, вирус-индуцированной карциноме, герпетическим вирус-индуцированным опухолям, индуцированной вирусом Эпштейна-Барра В-клеточной лимфоме, индуцированным вирусом гепатита В опухолям, лимфоме, индуцированной Т-лимфотропным вирусом человека 1 типа и лимфоме, индуцированной Т-лимфотропным вирусом человека 2 типа.

В данном документе термин "инфекционное заболевание" относится к любой болезни, вызываемой в том числе инфекционными возбудителями. Инфекционные возбудители включают, помимо прочих, вирусы (например, вирусы с одноцепочечной РНК, вирусы с одноцепочечной ДНК, вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), вирусы гепатита А, В и С, вирус простого герпеса (ВПГ), цитомегаловирус (ЦМВ), респираторно-синцитиальный вирус (РСВ), вирус Эпштейна-Барра (ВЭБ) или вирус папилломы человека (ВПЧ)), паразитов (например, простейшие и многоклеточные патогены, такие как плазмодии, лейшмании, шистосомы или трипаносомы), бактерии (например, микобактерии, в частности, М. tuberculosis, сальмонеллы, стрептококки, кишечная палочка Е. coli и стафилококки), грибы (например, виды родов Candida или Aspergillus), Pneumocystis carinii, и прионы.

В данном документе термин "аутоиммунное нарушение" относится к двум основным категориям: 'Системные аутоиммунные заболевания' (т.е., нарушения, поражающие многие органы или ткани), и 'местные аутоимммунные заболевания' (т.е. нарушения, поражающие только один орган или ткань). Тем не менее, эффект 'местных аутоиммунных заболеваний» может быть системным за счет косвенного влияния на другие органы и системы тела. "Системные аутоиммунные заболевания" включают, но не ограничиваются перечисленными:, ревматоидный артрит, который может поражатьсуставы, и, возможно, легкие и кожу; волчанку, в том числе системную красную волчанку (СКВ), которая может поражать кожу, суставы, почки, сердце, мозг, красные кровяные клетки, а также других ткани и органы; склеродермию, которая может поражать кожу, кишечник и легкие; синдром Шегрена, который может поражать слюнные железы, слезные железы и суставы; синдром Гудпасчера, который может поражать легкие и почки; гранулематоз Вегенера, который может поражать придаточные пазухи носа, легкие, почки; ревматическую полимиалгию, которая может поражать большие группы мышц; и темпоральный артериит / гигантоклеточный артериит, который может влиять на артерии головы и шеи. «Местные аутоиммунные заболевания» включают, помимо прочих, инсулинозависимый сахарный диабет, который поражает островковые клетки поджелудочной железы; тиреоидит Хашимото и базедова болезнь, которые поражают щитовидную железу; целиакия, болезни Крона и язвенный колит, которые влияют на желудочно-кишечный тракт; множественный склероз (МС) и синдром Гийена-Барре, которые поражают центральную нервную систему; болезнь Аддисона, которая влияет на надпочечники; первичный склероз желчных путей, склерозирующий холангит и аутоиммунный гепатит, которые влияют на печень; а также феномен Рейно, который может повлиять на пальцы рук, ног, нос, уши.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, предпочтительно - вакцине, содержащей очищенный ортопоксвирус дикого типа, аттеньюированный и / или рекомбинантный ортопоксвирус, полученный посредством метода, предложенного в настоящем изобретении. Согласно настоящему изобретению, указанная фармацевтическая композиция предназначена для лечения и / или профилактики рака, инфекционных заболеваний и / или аутоиммунных нарушений.

Настоящее изобретение также относится к использованию очищенного ортопоксвируса дикого типа, аттеньюированного и / или рекомбинантного ортопоксвируса, полученного посредством метода, предложенного в настоящем изобретении, для приготовления фармацевтической композиции, предпочтительно - вакцины, для лечения и / или профилактики рака, инфекционных заболеваний и / или аутоиммунных нарушений.

Фармацевтическая композиция, и, в частности, вакцина может быть изготовлена обычным способом для введения местно, парентерально или через пищеварительные пути. Например, могут быть использованы следующие способы введения: внутрижелудочный, подкожный, внутрисердечный, внутримышечный, внутривенный, внутрибрюшинный, внутриопухолевый, интраназальный, внутрилегочный или интратрахеальный. В случае трех последних вариантов введения более эффективно использование аэрозоля или капельной формы. Введение может быть выполнено в виде разовой дозы или повторяться один или несколько раз через определенные промежутки времени. Подходящий способ введения и дозы варьирует в зависимости от различных факторов, например, особенностей пациента, болезни или гена(ов), представляющих интерес для передачи. В соответствии с первой возможностью, фармацевтическая композиция и, в частности, вакцина может быть введена непосредственно in vivo (например, в форме внутривенной инъекции, инъекции внутрь доступной опухоли или в ее периферическую зону, подкожно для терапевтической или профилактической вакцинации). Также существует возможность использовать подход ех vivo, который заключается в сборе клеток у пациента (стволовые клетки костного мозга, лимфоциты периферической крови, мышечные клетки и т.п.), трансфецировать или инфицировать их in vitro при помощи известных специалистам методик, и затем вновь ввести их пациенту. Кроме того, можно предположить, что в тех случаях, когда это является уместным, и без выхода за пределы объема настоящего изобретения, возможно назначение одновременных или последовательных введений разными способами различных компонентов, содержащихся в фармацевтической композиции, и, в частности, в вакцине.

Настоящее изобретение также относится к применению иммортализованной линии клеток птиц, полученных из клеток птиц, принадлежащих к семейству для получения ортопоксвируса дикого типа, а также аттеньюированного и/или рекомбинантного ортопоксвируса в соответствии со способом согласно настоящему изобретению. Среди клеток из Anatidae, клетки из птиц, принадлежащих родам Cairina или Anas, являются особенно предпочтительными. Даже более предпочтительными являются иммортализованные линии клеток птиц, принадлежащих виду Cairina moschata или виду Anas platyrhynchos.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, иммортализованными линиями клеток птиц Cairina moschata являются иммортализованные линии клеток птиц Cairina moschata, содержащих последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей обратную транскриптазу теломеразы (TERT), описанную в патентной заявке WO 2007/077256. Особенно предпочтительными являются следующие иммортализованные линии клеток птиц:

- Т3-17490, депонированная в Европейской Коллекции Культур Клеток (ЕСАСС) под инвентарным номером 08060502 (см. Фигуры 2, 3 и 4), или ее производные;

- Т6-17490, депонированная в Европейской Коллекции Культур Клеток (ЕСАСС) под инвентарным номером 08060501 (см. Фигуры 5, 6 и 7), или ее производные.

В связи с этим, настоящее изобретение также относится к:

- Применению иммортализованной линии клеток птиц Cairina moschata, содержащих последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей обратную транскриптазу теломеразы (TERT) для получения ортопоксвируса дикого типа, а также аттеньюированного и/или рекомбинантного ортопоксвируса в соответствии со способом согласно настоящему изобретению.

- Применению иммортализованной линии клеток птиц Т3-17490 Cairina moschata, депонированной в Европейской Коллекции Культур Клеток (ЕСАСС) под инвентарным номером 08060502 (как описано в Примере 2), или ее производных для получения ортопоксвируса дикого типа, а также аттеньюированного и/или рекомбинантного ортопоксвируса в соответствии со способом согласно настоящему изобретению.

- Применению иммортализованной линии клеток птиц Т6-17490 Cairina moschata, депонированной в Европейской Коллекции Культур Клеток (ЕСАСС) под инвентарным номером 08060501 (как описано в Примере 3), или ее производных для получения ортопоксвируса дикого типа, а также аттеньюированного и/или рекомбинантного ортопоксвируса в соответствии со способом согласно настоящему изобретению.

В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, иммортализованными линиями клеток птиц Cairina moschata являются иммортализованные линии клеток птиц Cairina moschata, содержащих последовательность нуклеиновой кислоты Е1А и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей обратную транскриптазу теломеразу (TERT), описанной в патентной заявке WO 2009/004016.

В связи с этим, настоящее изобретение также относится к применению иммортализованной линии клеток птиц Cairina moschata, содержащих последовательность нуклеиновой кислоты Е1А и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей обратную транскриптазу теломеразу (TERT для получения ортопоксвируса дикого типа, а также аттеньюированного и/или рекомбинантного ортопоксвируса в соответствии со способом согласно настоящему изобретению.

Применительно ко всей заявке, "производные" депонированных иммортализованных линий клеток птиц относятся к иммортализованным линиям клеток птиц, которые содержат последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую "соединение, представляющее интерес". Используемое здесь "соединение, представляющее интерес" может включать фармацевтически активный белок, например факторы роста, регуляторы роста, антитела, антигены, их производные, пригодные для иммунизации или вакцинации и подобные им, интерлейкины, инсулин, эритропоэтин, G-CSF, GM-CSF, hPG-CSF, M-CSF, интерфероны (интерферон-альфа, интерфенон-бета, интерферон-гамма, факторы свертываемости крови (например, фактор VIII; фактор IX; tPA) или их комбинации, но не ограничивается ими.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На Фиг. 1 показано влияние различных концентраций Benzonase® (то есть 10 мМ; 50 мМ) на активность эндонуклеазы Benzonase® (температура 25ºС; Mg²⁺ 2 мМ; рН8).

На Фиг. 2 показан вид в микроскоп иммортализованной линии клеток Т3-17490 (ЕСАСС 08060502) птиц Cairina moschata (пассаж 39).

На Фиг. 3 показана кривая роса иммортализованной линии клеток Т3-17490 (ЕСАСС 08060502) птиц Cairina moschata (с пассажа 7 до пассажа 75).

На Фиг. 4 показано изменение времени удвоения иммортализованной линии клеток Т3-17490 (ЕСАСС 08060502) птиц Cairina moschata (с пассажа 7 до пассажа 75).

На Фиг. 5 показан вид в микроскоп иммортализованной линии клеток Т6-17490 (ЕСАСС 08060501) (пассаж 45).

На Фиг. 6 показана кривая роса иммортализованной линии клеток Т6-17490 (ЕСАСС 08060501) птиц Cairina moschata (с пассажа 15 до пассажа 51).

На Фиг. 7 показано изменение времени удвоения иммортализованной линии клеток Т6-17490 (ЕСАСС 08060501) птиц Cairina moschata (с пассажа 16 до пассажа 51).

Для иллюстрации настоящего изобретения приведены следующие примеры. Указанные примеры не ограничивают каким-либо образом рамки настоящего изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Пример 1: Способ А.

Стадия а): Получение культуры пакующих клеток.

Шестьдесят шесть СПФ-яйцекпеток инкубировали в течение 60 секунд в 2% растворе формальдегида. После отмывки 70% этанолом указанные яйцеклетки вскрывали, эмбрионы извлекали и препарировали. Полученные ткани расщепляли при 36.5ºС в течение 120 минут с помощью диспазы (UI/мл) и triple select (UI/мл). Смесь отфильтровывали для удаления нерасщепленных тканей, а СПФ-клетки собирали центрифугированием (2300 об/мин, 15 минут). Указанные СПФ-клетки инкубировали в 55 л VP-SFM (Invitrogen) в течение 2 дней при 36.5ºС.

Стадия b): Инфицирование культуры пакующих клеток ортопоксвирусом.

Затем удаляли культуральный супернатант и добавляли MVA-[MUC1-IL2], также называемый TG4010 (0.05 MOI) (MVA депонирован в Национальной коллекции культур микроорганизмов (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, CNCM) под номером № 1-721) в 55 л базальной (минимальной) среды Игла (Invitrogen).

Стадия с): Выращивание инфицированных пакующих клеток до продукции потомства ортопоксвируса.

Затем инфицированные СПФ-клетки инкубировали в течение трех дней при 36.5ºС.

Стадия d): Инкубирование в присутствии одной или более нуклеаз.

Затем инфицированные СПФ-клетки, содержащие потомство MVA, инкубировали в присутствии Benzonase® 10 U/мл или 50 U/мл (Merck; номер в каталоге 1.01653.0001) в следующих условиях:

- 2 часа с взбалтыванием при температуре 25ºС;

- Mg²⁺ 2 мМ;

- рН 8.0.

Стадия е): Выделение ортопоксвирусов из супернатанта культуры и/или пакующих клеток.

Собирали клеточную культуральную среду и СПФ-клетки. Затем указанную смесь гомогенизировали в течение 15 минут при 11 мл/мин с использованием высокоскоростного гомогенизатора Silverson® L4R (Silverson), или в течение 75 минут при 1500 мл/мин с использованием 36 кГц SONITUBE SM 35/3WU (Heraeus PSP).

Затем полученную смесь инкубировали в течение 2 часов с взбалтыванием при температуре 25ºС и рН 8.0.

Стадия f): Добавление моновалентной соли к ортопоксвирусам, извлеченным на стадии е), в подходящих условиях для ингибирования активности нуклеаз(ы) и предотвращения адсорбции указанных ортопоксвирусов на анионообменном адсорбенте на стадии g).

Затем полученную смесь инкубировали в присутствии 250 мМ NaCl и рН 8.0.

Стадия g): Осуществление контакта, полученной на стадии f), с анионообменным адсорбентом в подходящих условиях для связывания нуклеиновых кислот.

Затем полученную смесь добавляли к UNOsphere® Q (BioRad). Указанный матрикс, состоящий из гранул, UNOsphere® Q (BioRad) сначала промывали стерильной водой, затем автоклавировали в буфере Трис 10 мМ (рН 8.0), а затем уравновешивали с помощью буфера 250 мМ или 300 мМ NaCI (рН 8.0).

Затем указанный матрикс, состоящий из гранул, UNOsphere® Q (BioRad) с использованием перистальтического насоса Watson-Marlow (номер в каталоге 323ES/4D, 520S; Watson-Marlow) добавляли к смеси, полученной на стадии f), содержащейся в мешочке Flexboy® (номер в каталоге FFB101961; Sartorius Stedim biotech).

Указанные матрикс, состоящий из гранул, UNOsphere® Q (BioRad) и смесь, полученную на стадии f), выдерживали в контакте в течение 1 часа при слабом перемешивании при комнатной температуре (от 20ºС до 22ºС).

Стадия i): Осветление смеси, полученной на стадии g), в подходящих условиях для удаления клеточного дебриса.

Затем полученную смесь осветляли глубокой фильтрацией на Sartopure® РР2 8 мкм (Sartorius), связанном с Sartopure® PP2 5 мкм (Sartorius), при скорости потока 1 л/мин.

Стадия i): Отмывка анионообменного адсорбента раствором, содержащим моновалентные соли, в подходящих условиях для выделения в фильтрате оставшихся ортопоксвирусов.

Затем UNOsphere® Q (BioRad) отмывали (v/v) с помощью NaCl 250 мМ или 300 мМ в буфере S08 (10 мМ Трис-HCl; сахароза 5 вес. %; 10 мМ глютамат натрия; 50 мМ NaCl; рН 8.0 с физиологической осмоляльностью (290 мосмоль/кг)) с использованием перистальтического насоса Watson-Marlow (номер в каталоге 323ES/4D, 520S; Watson-Marlow).

Затем фильтрат, полученный на стадии h), и фильтрат, полученный на стадии i), инкубировали в течение ночи (то есть 18 часов) при 5ºС в присутствии сахарозы в конечной концентрации 50 г/л.

Стадия j): Концентрирование фильтрата, полученного на стадии h), и фильтрата, полученного на стадии i).

Затем фильтрат, полученный на стадии h), и фильтрат, полученный на стадии i), концентрировали в 18 раз с использованием 0.1 мкм модуля для микрофильтрации Prostak (номер в каталоге PSVVAG021, Millipore).

Стадия k): Диафильтрация фракции, содержащей ортопоксвирусы, полученной на стадии]).

Затем полученный концентрат подвергали диафильтрации в том же модуле, то есть 0.1 мкм модуле для микрофильтрации Prostak (номер в каталоге PSVVAG021, Millipore).

Определение количества ДНК осуществляли с использованием набора для анализа двухцепочечной ДНК Quant-iT™ Picogreen® (номер в каталоге Р7589, Invitrogen).

Результаты: Остаточной ДНК не обнаружено.

Пример 2: Иммортализованная линия клеток Т3-17490 мускусной утки (cairina moschata) (депонированная в ЕСАСС под инвентарным номером 08060502), использованная для получения ортопоксвируса в соответствии со способом согласно настоящему изобретению.

Клетки Т3-17490 (пассаж 39) обладают гомогенной морфологией, похожей на фибробласты (Фигура 2). Статичный монослой является стабильным вплоть до 100% сосредоточения и является объектом для ингибирования в результате контакта. Указанные клетки протестировали на предмет отсутствия заражения микоплазмой, а также заражения микробами. Кривая роста указанной линии клеток Т3-17490 (с пассажа 7 до пассажа 75) (Фигура 3) указывает на постоянную экспоненциальную фазу роста с пассажа 19 до пассажа 75. При концентрации внимания на изменение времени удвоения популяции (PDT) обнаруживается нарастающая стабилизация и снижение, в частности отмечается, что PDT стабилизируется после отметки в 48 часов в течение 10 последних пассажей (Фигура 4). Соответствующее число удвоения популяции (уровень удвоения популяции, PDL) рассчитывали добавления 2 экспоненциальных фаз роста: в течение 75 пассажей клетки подверглись, по крайней мере, 147 удвоениям популяции (PD). Указанное количество удвоений популяции, которым первичные клетки могут подвергаться до начала старения, является зависящим от ткани и вида. Общепризнанно, что верхний предел находится между 50 и 60 PD. Таким образом, указанные клетки Т3-17490 находятся далеко за пределом Хейфлика, и, следовательно, считаются иммортализованной линией клеток.

Важно:

- Уровень удвоения популяции (PDL) относится к количеству генераций клеток (удвоение биомассы). Расчет PDL:PDL=Ln(конечное количество клеток/начальное количество клеток)/Ln(2);

- Время удвоения популяции (PDT), также называемое временем генерации, является временем, необходимым для одного удвоения популяции. Расчет PDT:PDT=∆t*Ln(2)/Ln(конечное количество клеток/начальное количество клеток).

Пример 3: Иммортализованная линия клеток Т6-17490 мускусной утки (cairina moschata) (депонированная в ЕСАСС под инвентарным номером 08060501), использованная для получения ортопоксвируса в соответствии со способом согласно настоящему изобретению.

Клетки Т6-17490 (пассаж 45) обладают гомогенной морфологией, похожей на фибробласты (Фигура 5). Статичный монослой является стабильным вплоть до 100% сосредоточения и является объектом для ингибирования в результате контакта. Указанные клетки протестировали на предмет отсутствия заражения микоплазмой, а также заражения микробами. Кривая роста указанной линии клеток Т6-17490 (с пассажа 15 до пассажа 51) (Фигура 6) указывает на постоянную экспоненциальную фазу роста с пассажа 19. В течение этого периода измеренное время удвоения популяции (PDT) прогрессирующе уменьшалось. Среднее PDT изменилось с 94 часов (пассажи с 20 по 35) до 52 часов (пассажи с 36 до 51) (Фигура 7). Количество расчетных удвоений популяции (PDL), соответствующих 51 пассажу, составляет, по крайней мере, 71 удвоению популяции. Таким образом, клетки Т6-17490 находятся далеко за пределом Хейфлика, и, следовательно, считаются иммортализованной линией клеток.

Важно:

- Уровень удвоения популяции (PDL) относится к количеству генераций клеток (удвоение биомассы). Расчет PDL:PDL=Ln(конечное количество клеток/начальное количество клеток)/Ln(2);

- Время удвоения популяции (PDT), также называемое временем генерации, является временем, необходимым для одного удвоения популяции. Расчет PDT:PDT=∆t*Ln(2)/Ln(конечное количество клеток/начальное количество клеток).

Пример 4: Способ В.

Стадия а'): Получение культуры пакующих клеток.

Шестьдесят шесть СПФ-яйцеклеток инкубировали в течение 60 секунд в 2% растворе формальдегида. После отмывки 70% этанолом указанные яйцеклетки вскрывали, эмбрионы извлекали и препарировали. Полученные ткани расщепляли при 36.5ºС в течение 120 минут с помощью диспазы (UI/мл) и Triple select (UI/мл). Смесь отфильтровывали для удаления нерасщепленных тканей, а СПФ-клетки собирали центрифугированием (2300 об/мин, 15 минут). Указанные СПФ-клетки инкубировали в 55 л VP-SFM (Invitrogen) в течение 2 дней при 36.5ºС

Стадия b'): Инфицирование пакующей культуры клеток ортопоксвирусом.

Затем удаляли культуральный супернатант и добавляли MVA-[MUC1-IL2], также называемый TG4010 (0.05 MOI) (MVA депонирован в Национальной коллекции культур микроорганизмов (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, CNCM) под номером № 1-721) в 55 л базальной (минимальной) среды Игла (Invitrogen).

Стадия с'): Выращивание инфицированных пакующих клеток до продукции потомства ортопоксвируса.

Затем инфицированные СПФ-клетки инкубировали в течение трех дней при 36.5ºС.

Стадия d'): Инкубирование в присутствии одной или более нуклеаз.

Затем инфицированные СПФ-клетки, содержащие потомство MVA, инкубировали в присутствии Benzonase® 10 U/мл (Merck; номер в каталоге 1.01653.0001) в следующих условиях:

- 2 часа с взбалтыванием при температуре 25ºС;

- Mg²⁺ 2 мМ;

- рН 8.0.

Стадия е'): Выделение ортопоксвирусов из супернатанта культуры и/или пакующих клеток.

Собирали клеточную культуральную среду и СПФ-клетки. Затем указанную смесь гомогенизировали в течение 15 минут при 11 мл/мин с использованием высокоскоростного гомогенизатора Silverson® L4R (Silverson), или в течение 75 минут при 1500 мл/мин с использованием 36 кГц SONITUBE SM 35/3WU (Heraeus PSP).

Стадия f'): Инкубирование ортопоксвирусов, извлеченных в стадии е'), в присутствии одного или более агентов, ингибирующих активность нуклеаз(ы).

Затем полученную смесь инкубировали в присутствии 100 мМ NaCl и 10 мМ ЭДТА, рН 8.0.

Стадия g'): Осуществление контакта, полученной на стадии f'), с анионообменным адсорбентом в подходящих условиях для связывания указанных ортопоксвирусов и нуклеиновых кислот.

Затем полученную смесь добавляли к BioSepra® Q hyperZ (Pall Corporation). Указанный матрикс, состоящий из гранул, BioSepra® Q hyperZ (Pall Corporation сначала промывали стерильной водой, затем санировали с помощью 0,5 N NaOH, отмывали 10 мМ буфером Трис (рН 8.0), а затем уравновешивали буфером 10 мМ Трис, 10 mM NaCl, 5% сахароза (рН 8.0).

Затем указанный матрикс, состоящий из гранул, BioSepra® Q hyperZ (Pall Corporation) с использованием перистальтического насоса Watson-Marlow (номер в каталоге 323ES/4D, 520S; Watson-Marlow) добавляли к смеси, полученной на стадии f'), содержащейся в мешочке Flexboy® (номер в каталоге FFB101961; Sartorius Stedim biotech).

Указанные матрикс, состоящий из гранул, BioSepra® Q hyperZ (Pall Corporation) и смесь, полученную на стадии f'),), выдерживали в контакте в течение 1 часа при слабом перемешивании при комнатной температуре (от 20ºС до 22ºС).

Стадия h'): Осветление смеси, полученной на стадии g'), в подходящих условиях для удаления клеточного дебриса.

Затем полученную смесь осветляли глубокой фильтрацией на Sartopure® РР2 8 мкм (Sartorius), связанном с Sartopure® PP2 5 мкм (Sartorius), при скорости потока 1 л/мин.

Стадия i'): Элюирование ортопоксвирусов раствором, содержащим моновалентные соли.

Ортопоксвирусы элюировали путем повышающегося градиента концентрации NaCI (300 мМ; 400 мМ; 500 мМ) в буфере S08 (10 мМ Трис-HCl; сахароза 5 вес. %; 10 мМ глютамат натрия; 50 мМ NaCl; pH 8.0 с физиологической осмоляльностью (290 мосмоль/кг)) с использованием перистальтического насоса Watson-Marlow (номер в каталоге 323ES/4D, 520S; Watson-Marlow).

Стадия j'): Концентрирование смеси, полученной на стадии i').

Затем фильтрат, полученный на стадии i'), концентрировали в 18 раз с использованием 0.1 мкм модуля для микрофильтрации Prostak (номер в каталоге PSVVAG021, Millipore).

Стадия k'): Диафильтрация фракции, содержащей ортопоксвирусы, полученной на стадии j').

Затем полученный концентрат подвергали диафильтрации в том же модуле, то есть 0.1 мкм модуле для микрофильтрации Prostak (номер в каталоге PSVVAG021, Millipore).

Определение количества ДНК осуществляли с использованием набора для анализа двухцепочечной ДНК Quant-iT™ Picogreen® (номер в каталоге Р7589, Invitrogen).

Результаты: Остаточной ДНК не обнаружено.

Все документы (например, патенты, патентные заявки, публикации), процитированные выше в описании, включены в настоящее описание посредством ссылки. Различные модификации и вариации настоящего изобретения очевидны специалисту в данной области техники и не выходят за рамки и не изменяют сущность настоящего изобретения. Несмотря на то, что настоящее изобретение описано с использованием конкретных предпочтительных вариантов его осуществления, следует понимать, что настоящее изобретение, как оно заявлено, не следует ненадлежащее ограничивать такими конкретными вариантами его осуществления. В действительности имеется в виду, что различные модификации описанных способов осуществления настоящего изобретения, которые очевидны специалисту в данной области техники, включены в рамки, определенные следующей формулой изобретения

Настоящее изобретение относится к способу получения и очистки ортопоксвируса. Предложенный способ включает следующие этапы: приготовление культуры пакующих клеток; инфицирование культуры пакующих клеток ортопоксвирусом; культивирование инфицированных пакующих клеток до получения потомства ортопоксвируса; инкубация в присутствии одной или более нуклеаз до разрушения нуклеиновых кислот; выделение ортопоксвирусов из супернатанта культуры и/или пакующих клеток; добавление моновалентных солей в концентрации от 200 до 300 мМ в условиях, подходящих для ингибирования активности нуклеазы и для предотвращения адсорбции указанных ортопоксвирусов к анионообменному адсорбенту; осуществление контакта полученной смеси с анионообменным адсорбентом в условиях, подходящих для захвата нуклеиновых кислот. Охарактеризованное изобретение может быть использовано для разработки вакцин. 23 з.п. ф-лы, 7 ил., 4 пр.

1. Способ получения и очистки ортопоксвируса дикого типа, аттеньюированного и/или рекомбинантного ортопоксвируса, включающий следующие этапы:
a) приготовление культуры пакующих клеток;
b) инфицирование культуры пакующих клеток ортопоксвирусом;
c) культивирование инфицированных пакующих клеток до получения потомства ортопоксвируса;
d) инкубация в присутствии одной или более нуклеаз до разрушения нуклеиновых кислот;
e) выделение ортопоксвирусов из супернатанта культуры и/или пакующих клеток;
f) добавление моновалентных солей в концентрации от 200 до 300 мМ к ортопоксвирусам, выделенным на этапе е), в условиях, подходящих для ингибирования активности нуклеазы и для предотвращения адсорбции указанных ортопоксвирусов к анионообменному адсорбенту на этапе g);
g) осуществление контакта смеси, полученной на этапе f) с анионообменным адсорбентом в условиях, подходящих для захвата нуклеиновых кислот;
где этапы f) и g) проводят при pH от 7.0 до 9.0.

2. Способ по п. 1, в котором пакующие клетки представляют собой иммортализованные клеточные линии, предпочтительно иммортализованные линии клеток птиц.

3. Способ по п. 2, где иммортализованные линии клеток птиц способны расти в суспензии без (микро)носителей, причем указанные клетки предпочтительно культивируют в среде, свободной от продуктов животного происхождения.

4. Способ по п. 1, в котором пакующие клетки представляют собой первичные или вторичные клетки птиц, и предпочтительно представляют собой фибробласты куриного эмбриона (CEF).

5. Способ по п. 1, в котором pH лежит в диапазоне между 7,5 и 8,5, и более предпочтительно равен 8,0,

6. Способ по п. 1, в котором нуклеаза представляет собой эндонуклеазу и предпочтительно представляет собой Benzonase®.

7. Способ по п. 1, в котором нуклеазу применяют на этапе d) при концентрации в диапазоне от 5 до 100 ед/мл, предпочтительно в диапазоне от 5 до 50 ед/мл, и более предпочтительно составляет 10 ед/мл.

8. Способ по п. 1, в котором перед этапом выделения ортопоксвирусов осуществляют:
1) этап обеспечения разрушения мембран пакующих клеток, предпочтительно путем использования высокоскоростного гомогенезатора или путем обработки ультразвуком; и
2) этап инкубирования смеси, полученной на этапе 1), в течение по меньшей мере 1 часа, что обеспечивает разрушение ранее добавленной нуклеазой нуклеиновых кислот, высвобождаемых из пакующих клеток.

9. Способ по п. 1, в котором анионообменный адсорбент состоит из матрикса, состоящего из гранул, имеющих диаметр, превышающий размер пор фильтров, используемых на этапе осветления, предпочтительно диаметр более 8 мкм, более предпочтительно диаметр, лежащий в диапазоне между 50 мкм и 150 мкм, более предпочтительно диаметр, лежащий в диапазоне между 90 мкм и 120 мкм, и еще более предпочтительно диаметр, равный 120 мкм.

10. Способ по п. 1, в котором анионообменный адсорбент, применяемый на этапе g), несет функциональные группы, выбранные из группы, состоящей из диметиламиноэтила (DMAE), диэтиламиноэтила (DEAE), триметиламиноэтила (ТМАЕ) и триэтиламиноэтила (ТЕАЕ), и предпочтительно представляет собой триметиламиноэтил (ТМАЕ).

11. Способ по п. 1, дополнительно включающий после этапа g) этап h) осветления смеси, полученной на этапе g), для удаления клеточного дебриса.

12. Способ по п. 11, в котором этап осветления осуществляют путем глубинной фильтрации и предпочтительно на фильтрах с размером пор, равным 8 мкм, в комбинации с фильтрами с размером пор, равным 5 мкм.

13. Способ по п. 11, дополнительно включающий после этапа h) этап i) промывки анионообменного адсорбента раствором, содержащим моновалентные соли при концентрации от 200 до 300 мМ при pH между 7.0 и 9.0, в условиях, подходящих для выделения оставшихся ортопоксвирусов в фильтрате.

14. Способ по п. 13, дополнительно включающий после этапа i) этап j) концентрирования фильтрата, полученного на этапе h), и фильтрата, полученного на этапе i).

15. Способ по п. 14, в котором этап концентрирования осуществляют путем микрофильтрации на фильтрах с размером пор, лежащим в диапазоне между 0,09 и 0,15 мкм, и предпочтительно на фильтрах с размером пор, равным 0,1 мкм.

16. Способ по п. 14, дополнительно включающий после этапа j) этап k) диафильтрации, содержащей ортопоксвирус фракции, полученной на этапе j).

17. Способ по п. 16, в котором этап диафильтрации осуществляют на фильтрах с размером пор, лежащим в диапазоне между 0,09 и 0,15 мкм, и предпочтительно на фильтрах с размером пор, равным 0,1 мкм.

18. Способ по п. 16, в котором способ дополнительно включает после этапа k):
1) этап l) гель-фильтрации; и
2) этап m) диафильтрации.

19. Способ по п. 1, в котором моновалентные соли, используемые на этапе f), представляют собой NaCl.

20. Способ по п. 1, дополнительно включающий следующие этапы:
h) осветление смеси, полученной на этапе g), для удаления клеточного дебриса;
j) концентрирование фильтрата, полученного на этапе h).

21. Способ по п. 1, дополнительно включающий следующие этапы:
h) осветление смеси, полученной на этапе g), для удаления клеточного дебриса;
j) концентрирование фильтрата, полученного на этапе h),
k) диафильтрации, содержащей ортопоксвирус фракции, полученной на этапе j).

22. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором указанный ортопоксвирус представляет собой вирус осповакцины или модифицированный вирус осповакцины анкара (MVA).

23. Способ по п. 22, в котором указанные вирус осповакцины или модифицированный вирус осповакцины анкара (MVA) являются рекомбинантными и содержат по меньшей мере одну экзогенную последовательность, введенную в их геном.

24. Способ по п. 23, в котором указанные вирус осповакцины или модифицированный вирус осповакцины анкара (MVA) содержат:
суцидальный ген, предпочтительно ген, кодирующий белок, обладающий активностью цитозин дезаминазы,
экзогенную последовательность, кодирующую опухольассоциированный антиген (ОАА), предпочтительно MUC1,
экзогенную последовательность, кодирующую антиген, предпочтительно антиген, полученный из вируса, такого как ВГС или ВПЧ, из бактериальных патогенов или из паразитов,
экзогенную последовательность, кодирующую JFF или антиген, и
экзогенную последовательность, кодирующую цитокин, предпочтительно
экзогенную последовательность, кодирующую MUC1, и экзогенную последовательность, кодирующую интерлейкин-2 (IL2).