ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ ПРЕПАРАТ, ОБЛАДАЮЩИЙ СВОЙСТВОМ УСКОРЯТЬ ПРОЦЕСС КОАГУЛЯЦИИ КРОВИ, СПОСОБ УСКОРЕНИЯ КОАГУЛЯЦИИ КРОВИ IN VITRO И ПРИМЕНЕНИЕ ИНГИБИТОРА EPI АКТИВНОСТИ В КАЧЕСТВЕ ВЕЩЕСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО СВОЙСТВОМ УСКОРЯТЬ ПРОЦЕСС КОАГУЛЯЦИИ КРОВИ Российский патент 1999 года по МПК A61K38/55 

Настоящее изобретение относится к агентам, блокирующим EPI-активность (ингибитор внешнего направления реакции), и применению этих агентов для получения препаратов, которые окажут влияние на баланс остановки кровотечения.

Коагуляция является сложным процессом, который включает множество протеиновых факторов. Процесс коагуляции может быть инициирован внутренним путем за счет контакта с чужеродной поверхностью или внешним путем за счет контакта с поврежденной тканью. При активации внешним путем циркулирующая кровь контактирует с тканевым фактором (TF). TF представляет фактор для фактора коагуляции VII (FVII) и комплекс TF-FVII /TF-FVIIa активирует FX и FIX. За счет активации FIX на "внутреннюю коагуляцию" влияет TF активация и все большее количество факторов свидетельствует о том, что TF-FVII активация является наиболее важной для инициирования реакции коагуляции (Osterud and Rapaport, Proc Natl. Acad Sci USA 74, p 5260, 1977). Факторы коагуляции внешнего направления ингибируются EPI (ингибитор внешнего направления реакции), который называют также L ACI (Broze and Miletich, Blood p 150, 1987). EPI является ингибитором протеазы типа Кунитца, который связывает и ингибирует FXA. Комплекс EP I FXa ингибирует FVIIa-TF (Rapaport, Blood 73, p. 359, 1989). Значение EPI для реакции коагуляции до сих пор не было установлено, так как только нефизиологически высокие концентрации влияют на обычный коагуляционный анализ (Broze et al., Boichemistry,0 29, p. 7539, 1990). Поэтому EPI- активность определяют в сложном анализе, где EPI позволяют связать FXa и EPI-FXa добавляют к TF-FVII реагентам, которые могут активировать FIX или FX (Bajaj et al, y Clin Yirvest 79, p. 1974, 1987. Sandset et al, Thromb Res 47, p. 389, 1987).

В нормальном гемостазе факторы коагуляции находятся в равновесии друг с другом. Однако в некоторых обстоятельствах наблюдается избыточное кровотечение. Примерами могут служить: гемофилия, вызванная недостатком FVIII или FIX, идиопатическая тромбоцитопения (ITP), вызванная пониженным содержанием тромбоцитов. При хирургических операциях также возможны обильные кровотечения. Примерами агентов, которые можно использовать для предотвращения кровотечения являются: FIX, FVIII, FVIIa, апротинин и транэксамовая кислота.

В настоящем изобретении показано, что агенты, которые блокируют EPI-активность способны также снизить тенденции к кровотечению. Это удивительно, так как до сих пор не было показано, что сам EPI влияет на гемостатическое равновесие. Однако сделаны следующие наблюдения.

1. В коагуляционном анализе плазма EPI более активна, нежели EPI, продуцируемая в рекомбинантной методике (гEPI).

2. Коагуляция, вызванная очень разбавленным TF, зависит от к EPI-плазмы, и, таким образом, EPI влияет на гемостатическое равновесие.

3. Антитела, которые блокируют активность EPI (анти-EPI), сокращают время коагуляции нормальной плазмы.

4. Анти-EPI сокращают время коагуляции гемофильной плазмы.

Эти наблюдения показывают, что блокирование EPI снижает тенденцию к кровотечению.

Раньше было возможно только ускорить процесс коагуляции нормальной плазмы за счет добавления инициаторов коагуляции (тканевого фактора, каолина и т.д.) или активного фермента (тромбина, FXA, и т.д.). Эксперименты, описанные в заявке, обеспечивают доказательство того, что возможно также ускорить процесс коагуляции за счет блокирования протеина плазмы (EPI).

Истинную коагуляцию обычно измеряют в анализах APTT, где коагуляцию инициируют каолином, фосфолипидами и Ca²⁺. Высокие концентрации EPI необходимы для того, чтобы повлиять на APTT анализ (Broze, Biochemistry 29, p. 7539, 1990). Внешнюю коагуляцию определяют в PT анализе, где коагуляцию инициируют тканевым фактором (экстракт мозга) и Ca²⁺. В стандартном анализе используют неразбавленный тканевый фактор и добавление EPI оказывает лишь незначительное воздействие на наблюдаемые времена коагуляции (см. пример 2). Гораздо более физиологический анализ получают, когда раствор тканевого фактора значительно разбавляют. Тогда время коагуляции становится зависимым от внешних, а также внутренних факторов коагуляции (Brinkhous et al., Proc. Natl Acad Sci USA 86, p. 1382, 1989). На фиг. 1 показано, что добавление гEPI повышает время коагуляции приблизительно на две секунды на каждую добавляемую EPI-единицу. Неожиданно добавление антител к EPI (удаление одной EPI-единицы) сокращает время коагуляции на 30 секунд. Контрольные эксперименты проводили для достижения уверенности, что эффект действительно связан с ингибированием EPI.

Получены следующие результаты:
A. Добавление дополнительного количества антител не приводит к дальнейшему сокращению времени коагуляции.

B. Титр антител в анализе ингибирования активности EPI соответствует титру, полученному в анализе сокращения времени коагуляции.

C. Антитела афинно очищают чистым гEPI на Сефарозе. Полученный IgC препарат демонстрирует в расчете на мг 10-и кратное повышение титра по отношению к сокращению времени коагуляции так же, как по отношению к EPI активности.

D. Если антитела добавляют в количестве, достаточном для сокращения времени коагуляции, тогда добавление гEPI имеет более выраженный эффект на увеличение времени коагуляции по сравнению с добавлением плазмы без антител (фиг. 2).

E. Плазму с дефицитом EPI получают из нормальной плазмы иммуноабсорбцией. Эта плазма имеет пониженное время коагуляции по сравнению с нормальной плазмой. Добавление антител в коагуляционном анализе дальше не сокращает времени коагуляции плазмы с дефицитом.

Антитела, которые блокируют EPI-активность, были описаны в литературе (Novothy et al Brood 72, p. 2020, 1988). Однако ингибирование EPI-плазмы антитела не было описано и не наблюдалось, что такие тела могут оказывать существенное непосредственное влияние на коагуляцию и соответственно на гемостатическое равновесие.

Для определения EPI Novothy et al использует сложный 3-х стадийный коагуляционный анализ. EPI-образец вначале инкубируют с TF, FVIIa, FX и Ca²⁺ добавляют. Затем FX добавляют и, после инкубирования в течение 1 минуты, добавляют плазму с дефицитом FX и цефалин мозга кролика. В этом анализе EPI ингибирует TF активность, и было показано, что анти-EPI антитела ингибируют действие EPI.

В одностадийном коагуляционном анализе смесь Ca²⁺ и T добавляют непосредственно к плазме и записывают время коагуляции. В таком анализе Broze et al /Biochemistry 29, p. 7543, 1990) обнаружил необходимость добавлять 2,5 мкг EP/мл (50 ед/мл) для достижения 50% снижения кажущейся TF активности.

Неожиданно было обнаружено, что добавление анти-EPI к плазме (удаление 1 ед EPI) существенно влияет на время коагуляции, если коагуляцию инициируют непосредственно добавляя TF. Такой коагуляционый анализ имитирует физиологическую ситуацию, так как это единственный тип коагуляционного анализа, который зависит от наличия как FVII, FVIII, так и FIX - всех факторов, которые необходимы для достижения нормального гемостаза. Кроме того, EPI-плазмы очищали (Novothy et al j Biol Chem 264, p. 18832, 1989). Однако не наблюдалось, чтобы EPI-плазмы оказывают существенное влияние на коагуляцию, по крайней мере, не до такой степени, чтобы ингибирование EPI подействовало бы на гемостатическое равновесие. То есть было подчеркнуто, что документацию физиологической важности EPI остается показать (Broze Biochemistry 29, p. 7539, 1990). Наблюдения того, что EPI-плазмы существенно влияет на время коагуляции плазмы, обеспечивает доказательство того, что EPI играет важную роль для гемостатического равновесия. Более того эксперименты доказали, что блокирование EPI позволит снизить тенденцию к кровотечению.

Первым объектом настоящего изобретения является фармацевтический препарат для лечения пациентов с пролонгированным временем коагуляции, где указанный препарат в качестве активного компонента содержит ингибитор EPI.

Вторым объектом настоящее изобретением является способ лечения пациентов препаратом, содержащим ингибитор EPI.

Третьим аспектом настоящего изобретения является применение ингибиторов EPI для получения фармацевтического препарата для лечения пациентов с пролонгированным временем коагуляции.

Получение анти-EPI антител:
Рекомбинантный человеческий EPI (uEPI) получают из трансфицированных ВНК клеток, как описано Pedersen et al (j Biol Chem, 265, 6786 - 6793, 1990). гEPI очищают афинной хроматографией с гепарином, инообменной хроматографией и хроматографией с обращенной фазой (Nordfand et al., Biotech Plasma Prot p. 98, 1990). гEPI получение таким образом оказываются чистыми по данным SDS-PAGE. Кроликов иммунизуют на 0, 14, 35 день, а затем с интервалами в 21 день. Каждая иминизация представляет собой 0,1 мг гEPI в адьюванте. Первую иммунизацию проводили с полным адьювантом Фраунда, тогда как последующие иммунизации проводили с неполным адьювантом Фреунда. Полученную антисыворотку тестируют на активность по ингибированию EPI в анализе EPI-активности и ингибирование количественно определяют как FVIII ингибирующие антитела в анализе Bethesda равные объемы разбавленной антисыворотки и EPI (1 ед/мл) инкубируют в течение 2 часов при 37^o. Определяют EPI- активность, и разбавление антисыворотки, которое ингибирует активность на 50%, дает титр. Антисыворотка кролика имеет ингибирующие титры между 1000 и 4000 "Bethesda подобных" ед/мл против как гEPI, так и EPI-плазмы человека. Сыворотка ниже 50-кратного разбавления от иммунизованных кроликов не влияет на активность EPI-образца (1 ед/мл)IgC, очищают из антисыворотки анионно-обменной хроматографией. IgC препарат с 8 мг IgC/мл содержал 2000 "Bethesda - подобных" ингибирующих единиц /мл относительно EPI-плазмы человека.

Анализ EPI-активности:
EPi измеряют в хромогенном анализе на микропластинах в модифицированном способе Sandset et al (Thromb Res 47, P. 389, 1989) Термообработанную плазму используют в качестве стандарта. Этот стандарт устанавливают так, чтобы он содержал 1 ед/мл EPI-активности. Стандарты и образцы разбавляют в буфере A (0.05 М трис/0.1 М NaCl/0.01 Na-цитрат/0.02% NaN₃ /pH 8.0/, содержащем 2 мкг/мл полибрена и 0.2 альбумина бычьей сыворотки F VIIa/TF - FX/CaCl₂ комбинационный реагент получили в буфере A и он содержал 1,6 нг/FVIIa(Novo Nozdisk A/S), 60 кратно разбавленный тканевый фактор человека (Hjort, Scand. j Clin Zab Jnvest 9, 1957) 50-нг/мл FX (Сигма) и 18 мМ CaCl₂. Анализ осуществляют на микропластинах при 37^oC. 50 мкл образцов и стандартов пипеткой помещают на микропластины и в каждую ячейку добавляют по 100 мкл комбинационного реагента. Спустя 10 минут инкубации в каждую ячейку добавляют по 50 мкл FX /3,2 мкг/мл) и спустя еще 10 минут 25 мкл хромогенного субстрата для FXa/S 2222/ добавляют спустя 10 минут после добавления субстрата. Реакцию останавливают, добавляя 50 мкл, 1,0 М лимонной кислоты pH 3,0. Микропластину считывают на 405 нм.

Коагуляционный анализ
Коагуляционную активность определяют, используя АС коагуляционные аппараты. 20 мкл раствора антитела или раствора EPI инкубируют с 200 мкл плазмы в течение 15 минут при комнатной температуре. После предварительного нагревания по 37^oC ACZ смеси 75 мкл образцов плазмы с 75 мкл разбавленного TF в 20 мМ CaCl₂. 50 мМ NaCl, 17 мМ имидазола, 33 мкг/мл BSA, pH 7,4.

Пример 1
Коагуляционный анализ осуществляют как описано ранее, используя 20000-кратное разбавление тканевого фактора. В таблице 1 показано влияние добавления анти-EPI к 10 индивидуальным донорным образцам, 7 гемофильным A образцам и одному гемофильному B образцу. Наблюдается существенное сокращение времени коагуляции, особенно для гемофилических образцов. Эти данные отражают на опыте значительную важность сильного внешнего FVII зависимого пути в случае ослабленного внутреннего коагуляционного пути (гемофилия A и B).

Пример 2
Коагуляционный анализ осуществляют с нормальными образцами плазмы, используя различные разбавления TF. В таблице 2 показано, что тем более разбавляют TF, тем большее значение имеет эффект добавления анти-EPI к плазме. Это показывает, что тем большее время коагуляции, тем более эффективно будет анти-EPI в сокращении времени коагуляции.

Пример 3
Цитратную плазму отбирают у пациентов после сердечно-легочной хирургии (СРВ). В этом способе пациенту вводят большую дозу антикоагулянта - гепарина. После операции этот гепарин нейтрализуют, вводя протаминсульфат. По данным хромагенного FXa анализа ингибирования образцы плазмы не содержали гепарина. В Sandset EPI анализе образец содержит 2 ед/мл EPI-активности. В таблице 3 показано время коагуляции разбавленного TF этой плазмы перед и после добавления анти-EPI. По-видимому время коагуляции пролонгировано и анти-EPI может сокращать время коагуляции. Таким образом, повышенные EPI уровни могут быть одной из причин кровотечения у пациентов после операции СРВ.

Пример 4
Протеин связывающий гепарин (НВР) WO89/0866 является протеином из нейтрофильной гранулы, который демонстрирует высокую гомологичность эластазе. Сам по себе НВР не является ферментом, но, по-видимому, связывает ингибиторы энзима. При тестировании в EPI анализе титр НВР по отношению к EPI составляет 10 "Bathesda подобных" единиц/мг. НВР также блокирует ингибированные FXa за счет EPI с соответствующим титром. При добавлении к нормальной плазме в концентрациях 150 мкг/мл, время коагуляции, вызванное разбавленным TF было сокращено (таблица 4).

Скрининг микробных экстрактов на ингибиторы по изобретению, анализа их активности и влияния на коагуляцию позволил идентифицировать соединение ВК201, продуцируемого грибками Ascochyta sp., в качестве активного компонента по изобретению (см. патент США 5,409,951, формула 1а в колонке 4).

При тестировании в процессе анализа на активности EPI (TFPI) плазмы человека титр чистого ВК201 составил 80 "Бетезда"-подобных единиц на ммоль.

При добавке в нормальную человеческую плазму ВК201 в концентрации 150 мкМ, время вызываемой разбавленным TF коагуляции уменьшилось до уровня действия анти-TFPI антител (козы или кролика). То есть результаты показывают, что это низкомолекулярное (567 Дальтон) соединение может быть использовано в качестве EPI (TFPI) ингибитора вместо анти-TFPI антител для сокращения времени коагуляции плазмы.

Исходя из полученных результатов вышеупомянутых экспериментов, предпочтительная дозировка ВК201 и его аналогов составляет приблизительно от 0,05 мг до 500 мг в сутки, предпочтительно от 0,5 до 250 мг, и лучше всего - 2 - 25 мг в сутки, что может составлять около 1 - 10 мг на дозу при назначении взрослым в виде лекарственного препарата.

Введение препарата по изобретению может осуществляться любыми способами, которые способны обеспечить эффективное поступление активного соединения в соответствующий участок тела, то есть препарат может быть введен перорально или парентерально, например, через прямую кишку, через кожу, подкожно, внутривенно, внутримышечно или через нос. Пероральное введение предпочтительнее.

Фармацевтические композиции, содержащие соединение по изобретению, могут приготавливаться обычными способами (см. например, "Remingtos's Phatmaceutocal Science@, 1985. Из композиций можно приготавливать обычные лекарственные препараты в виде капсул, таблеток, аэрозолей, растворов, суспензий или препаратов для местного применения.

В качестве носителя или разбавителя могут использоваться обычные жидкие носители, такие как сироп, арахисовое масло, оливковое масло, фосфолипиды, жирные кислоты, амины жирных кислот, полиоксиэтилен, вода и т.п., или твердые носители, такие как лактоза, мел, сахароза, циклодекстрин, тальк, целлюлоза.

Носитель/разбавитель может также содержать любой подходящий материал, замедляющий высвобождение активного компонента, такой как глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат, отдельно или в смеси с воском.

если изготавливают препарат для введения через рот, на твердом носителе, то он может быть составлен в форме таблеток, порошка или гранул, возможно, в желатиновых капсулах или в виде лепешек. Обычное количество твердого носителя в этом случае составляет приблизительно от 25 мг до 1 г.

При использовании жидкого носителя, препарат можно назначать в виде сиропа, эмульсии, в мягких желатиновых капсулах, или в виде стерильного раствора для инъекций, такого как водный раствор или иной раствор, или в виде суспензии.

Пример состава таблеток с активным компонентом по изобретению
Ядро:
Активное соединение по изобретению (свободное соединение или соль) - 100 мг
Коллоидная двуокись кремния ("Aerosil") - 1,5 мг
Микрокристаллическая целлюлоза ("Avicel") - 70 мг
Модифицированная целлюлоза ("Ac-Di-Sol") - 7,5 мг
Оболочка:
Гидроксипропилметилцеллюлоза - около 9 мг
"Mywacett 9-40 T" - около 0,9 мг
("Mywacett 9-40 T" - это ацилированный моноглицерид, используемый в качестве пластификатора для покрытий небольшой толщины).

Если препарат предназначен для введения через нос, то он может содержать соединение формулы I, растворенное или суспендированное в жидком носителе, в частности в водном носителе, для введения методом распыления. Носитель может содержать такие добавки, как агенты, повышающие растворимость, например пропиленгликоль, поверхностно-активные вещества, агенты, повышающие абсорбцию, такие как лецитин (фосфатидилхолин) или циклодекстрин, или консерванты, такие как парабены.

Фармацевтический препарат, содержащий в качестве активного компонента агент, который блокирует EPI-активность (EPI-ингибитор), является полезным препаратом для лечения пациентов с пролонгированным временем коагуляции. Способ ускорения коагуляции крови in vitso с использованием заявленного препарата. Применение ингибитора EPI-активности в качестве вещества, обладающего свойством ускорять процесс коагуляции крови. Препарат обладает свойством снижать тенденцию к кровотечению у больных. 3 с. и 4 з.п. ф-лы, 4 табл., 2 ил.

1. Фармацевтический препарат, обладающий свойством ускорять процесс коагуляции крови, включающий активный компонент и фармацевтически приемлемые добавки, отличающийся тем, что в качестве активного компонента содержит ингибитор EPI-активности в эффективном количестве. 2. Препарат по п.1, отличающийся тем, что недостаточная функция коагуляции связана с гемофилией А или В. 3. Препарат по п.1, отличающийся тем, что недостаточная функция коагуляции связана с идиопатической тромбоцитопенией (ITP), хирургическими операциями или DIC - (коагулопатией потребления). 4. Способ ускорения коагуляции крови in vitro, отличающийся тем, что включает введение эффективной дозы препарата по п.1. 5. Способ по п.4, отличающийся тем, что недостаточная функция коагуляции связана с гемофилией А или В. 6. Способ по п.4, отличающийся тем, что недостаточная функция коагуляции связана с идиопатической тромбоцитопенией (ITP), хирургической операцией или DIC. 7. Применение ингибитора EPI - активности в качестве вещества, обладающего свойством ускорять процесс коагуляции крови.