Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к способу ex vivo определения неизвестной концентрации клостридиального нейротоксина в пробе по отношению к известной концентрации клостридиального токсина в стандартном образце. Способ может включать электрическую стимуляцию мышечных тканей, которые подвергались контакту с указанными образцами, и сравнение соответствующих эффектов, вызванных в указанных мышечных тканях, с определением, таким образом, указанной неизвестной концентрации. Способ также может применяться для оценки относительной активности клостридиального нейротоксина в пробе по отношению к стандартному образцу.
Уровень техники
В последние годы ботулинические нейротоксины стали стандартным средством при лечении фокальных дистоний и спазматических симптомов. Лекарственные препараты выпускаются такими компаниями, как например, Ipsen Ltd. (Dysport®) или Allergan Inc. (Botox®). Высокоочищенный нейротоксин, не содержащий других клостридиальных белков, например, выпускает Merz Pharmaceuticals (Xeomin®). Другой препарат был зарегистрирован компанией Solstice Neurosciences, Inc (Myobloc®). Еще один препарат был зарегистрирован Mentor Corporation (PurTox®). Перечисленные препараты либо отличаются по типу используемого ботулинического токсина, либо по биологической эффективности или активности.
Лечение пациентов обычно включает инъекцию нейротоксина в пораженную мышечную ткань с введением средства вблизи нейромышечной концевой пластинки, то есть рядом с клеточным рецептором, который опосредует его поглощение нервной клеткой, контролирующей указанную пораженную мышцу. Наблюдались различные степени распространения нейротоксина. Предполагается, что подобное распространение коррелирует с вводимыми количествами и в частности с вводимым препаратом нейротоксина. В результате распространения могут наблюдаться системные побочные эффекты, вызванные ингибированием секреции ацетилхолина в близкорасположенной мышечной ткани. Случаи непредусмотренной парализации нормальных мышц можно в значительной степени избегать путем уменьшения вводимых доз до терапевтически релевантного уровня. Превышение дозирования также может быть проблемой в отношении иммунной системы пациентов, поскольку введенный нейротоксин может вызывать образование нейтрализующих антител. Если это произойдет, то токсин будет инактивирован с потерей способности к уменьшению непроизвольных сокращений мышц.
Несоответствие эквивалентов дозы или различия в определяемой активности препаратов, таких как коммерческие продукты или партии, произведенные в ходе производственного процесса, создают повышенный риск для пациентов, связанный с возможными побочными эффектами и развитием иммунитета. Таким образом, достоверное (то есть без значимого расхождения) и максимально точное определение концентрации клостридиального нейротоксина, содержащегося в указанных коммерческих продуктах или партиях продуктов, имеет критическое значение при доведении концентрации токсина до подтвержденной эффективной дозы с пользой для пациента. Это также может послужить стимулом для производителей, чтобы они предложили лекарственные формы, обеспечивающие оптимальное использование биологической активности в различных терапевтических целях.
В EP 1597584 B1 предложен способ ex vivo определения количества вещества, блокирующего пресинаптическую нейромышечную передачу, в образце, таком как образец, содержащий ботулинический нейротоксин. Способ включает электрическую стимуляцию мышечной ткани, предпочтительно реберной мышцы мыши, в присутствии образца, содержащего вещество, блокирующее пресинаптическую нейромышечную передачу, и сравнение эффекта, вызванного образцом, с эффектом, вызываемым стандартным веществом, с определением, таким образом, количества вещества, блокирующего пресинаптическую нейромышечную передачу, в образце.
В GB 2416849 A и GB 2398636 A предложен способ ex vivo определения количества вещества, блокирующего пресинаптическую нейромышечную передачу, в образце, таком как образец, содержащий ботулинический нейротоксин. Способ включает электрическую стимуляцию гладкомышечной ткани, предпочтительно реберной мышцы мыши или крысы, в присутствии образца, содержащего вещество, блокирующее пресинаптическую нейромышечную передачу, и сравнение эффекта, вызванного образцом, с эффектом, вызываемым стандартным веществом, с определением, таким образом, количества вещества, блокирующего пресинаптическую нейромышечную передачу, в образце.
В US 2003/0032891 A1 предложен способ in vivo измерения активности вещества, такого как клостридиальный токсин, где указанное вещество вводят млекопитающему, млекопитающее подвергают стимуляции и контролируют рефлекторную реакцию уха указанного млекопитающего на указанную стимуляцию.
В EP 2015065 A1 предложен способ определения количества эффективности нейротоксина, такого как нейротоксин Clostridium, где указанный токсин вводят в заднюю ногу не относящегося к человеку млекопитающего, прикладывают к указанному не относящемуся к человеку млекопитающему электрический стимул, измеряют сокращение указанной задней ноги и сравнивают с сокращением другой задней ноги.
В статье Pearce et al., Toxicon, Vol. 35, No. 9, pp. 1373-1412, 1997, описана пригодность диафрагмального нерва-гемидиафрагмы крысы/мыши для связывания ботулинического нейротоксина.
В статье Wohlfahrt et al., Naunyn-Schmiedeberg's Arch Pharmacol 355, 335-340 (1997) сравнивается эффективность двух коммерческих препаратов ботулинического токсина с применением кривых зависимости эффекта от дозы при использовании диафрагмы мыши.
В статье Chang et al., Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 282, 129-142 (1974) сравниваются пресинаптические действия ботулинического токсина типа A и β-бунгаротоксина на выделенные нервно-мышечные препараты, такие как диафрагмы мыши и крысы.
В статье Sheridan et al., J. Appl. Toxicol. 19, S29-S33 (1999) описывается определение эффективности ботулинических антагонистов на основе классических биоанализов концентрации токсина.
В статье James et al., Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 285, G291-G297 (2003) описываются ингибирующие эффекты ботулинического токсина в отношении привратниковой и антральной гладкой мускулатуры.
В статье Goschel et al., Exp. Neurol., vol. 147, 1, 1997 описаны кривые зависимости эффекта от концентрации для определения относительной активности ботулинического токсина в образце по отношению к активности образца, содержащего известное количество токсина. Различные препараты ботулинического токсина тестировали на гемидиафрагмах мыши.
Вышеуказанные способы количественного анализа из предшествующего уровня техники, впрочем, обладают недостаточной точностью, требуемой для сертификации регулирующими органами. Таким образом, способы, раскрытые в вышеуказанных источниках, не могут применяться в нормативных целях, и вместо этого все еще приходится выполнять устаревший анализ на мышах с их умерщвлением.
Цели изобретения
Одна цель изобретения заключается в улучшении способов предшествующего уровня техники и в разработке надежного и точного способа определения активности или, соответственно, концентрации клостридиального нейротоксина в пробе, дающей указанную активность, который также мог бы применяться в целях контроля. Такой улучшенный способ также мог бы служить для удовлетворения высокой потребности в безопасном и эффективном введении.
Сущность изобретения
В одном аспекте изобретение относится к способу измерения эффекта, вызванного в мышечной ткани клостридиальным нейротоксином, включающему:
(a) контакт мышечной ткани с образцом, включающим указанный клостридиальный нейротоксин;
(c) измерение указанного эффекта, вызванного в указанной мышечной ткани указанным клостридиальныйм нейротоксином;
где этап (c) выполняют в отсутствии указанного образца.
В одном варианте осуществления указанную мышечную ткань подвергают электрической стимуляции.
В одном варианте осуществления способ после этапа (a) включает этап (b):
(b) электрическая стимуляция указанной мышечной ткани, полученной в этапе (a).
В другом варианте осуществления этап (b) выполняют в отсутствии указанного образца.
В другом аспекте изобретение относится к способу определения неизвестной концентрации клостридиального нейротоксина в первом образце по отношению к известной концентрации клостридиального нейротоксина во втором образце, включающему:
(a) контакт мышечной ткани с указанным вторым образцом;
(c) измерение второго эффекта, вызванного в указанной мышечной ткани указанным нейротоксином;
(d) повтор этапов (a)-(c) при различных концентрациях указанного клостридиального нейротоксина;
(e) регистрацию указанного измеренного второго эффекта этапа (d) в зависимости от концентрации, с регистрацией, таким образом, второго набора данных;
(f) контакт мышечной ткани с указанным первым образцом;
(h) измерение первого эффекта, вызванного в указанной мышечной ткани;
(k) определение концентрации, при которой указанный первый и указанный второй эффекты идентичны;
(l) приравнивание указанной концентрации в (k) к указанной неизвестной концентрации.
где этап (c) и/или этап (h) выполняют в отсутствии указанного второго и/или первого образца.
В одном варианте осуществления указанную мышечную ткань подвергают электрической стимуляции.
В одном варианте осуществления способ после этапа (a) включает этап (b), а после этапа (f) - этап (g):
(b) электрическая стимуляция указанной мышечной ткани, полученной в этапе (a);
(g) электрическая стимуляция указанной мышечной ткани, полученной в этапе (f).
В другом аспекте изобретение относится к способу определения относительной активности клостридиального нейротоксина в первом образце по отношению к активности клостридиального нейротоксина во втором образце, включающему:
(a) контакт мышечной ткани с указанным вторым образцом;
(c) измерение второго эффекта, вызванного в указанной мышечной ткани указанным нейротоксином;
(d) повтор этапов (a)-(c) при различных концентрациях указанного клостридиального нейротоксина;
(e) регистрацию указанного измеренного второго эффекта этапа (d) в зависимости от концентрации, с регистрацией, таким образом, второго набора данных;
(f) контакт мышечной ткани с указанным первым образцом;
(h) измерение первого эффекта, вызванного в указанной мышечной ткани;
(i) повтор этапов (f)-(h) при различных концентрациях указанного клостридиального нейротоксина;
(j) регистрацию указанного измеренного первого эффекта этапа (i) в зависимости от концентрации, с регистрацией, таким образом, первого набора данных;
где этап (c) и/или этап (h) выполняют в отсутствии указанного второго и/или первого образца.
В одном варианте осуществления указанную мышечную ткань подвергают электрической стимуляции.
В одном варианте осуществления способ после этапа (a) включает этап (b), а после этапа (f) - этап (g):
(b) электрическая стимуляция указанной мышечной ткани, полученной в этапе (a);
(g) электрическая стимуляция указанной мышечной ткани, полученной в этапе (f).
В одном варианте осуществления способ дополнительно включает этапы (m) и (n):
(m) выбор указанных различных концентраций из диапазона концентраций, который лучше всего соответствует первому и второму набору данных;
(n) определение указанного наилучшего соответствия с помощью статистического критерия, включающего следующие подэтапы (α) - (δ):
(α) представление диапазона значений второго набора данных, полученного в этапе (e), в виде эмпирической кривой;
(β) представление диапазона значений первого набора данных, полученного в этапе (j), в виде эмпирической кривой;
(γ) линеаризация эмпирических кривых, соответственно;
(δ) параллелизация линеаризованных эмпирических кривых.
В одном варианте осуществления статистическим критерием является F-критерий или χ2-критерий, или t-критерий.
В одном варианте осуществления вероятность ложного отклонения для каждого подэтапа (a)-(δ) равна ≤5 (выражена в %).
В одном варианте осуществления способ дополнительно включает этап (ε):
(ε) вычисление на основе смещения линеаризованных и параллелизованных эмпирических кривых относительно друг друга относительной активности первого образца по отношению ко второму образцу.
В одном варианте осуществления изобретения, согласно способам второго и третьего аспекта, этапы (b) или (g) выполняют в отсутствии второго или первого образца, или этапы (b) и (g) выполняют в отсутствии второго и первого образца.
В одном варианте осуществления, в соответствии с любым из способов трех аспектов согласно изобретению, продолжительность периода экспозиции мышечной ткани указанному клостридиальному нейротоксину, то есть периода контакта мышечной ткани с образцом или, соответственно, первым или вторым образцом, включающим клостридиальный нейротоксин, согласно этапу (a) до отсутствия указанного образца или, соответственно, первого или второго образца, или, соответственно, измерения указанного эффекта согласно этапу (c) или этапу (h), или этапу (c) и этапу (h), составляет от 1 до 60 мин.
В одном варианте осуществления, в соответствии с любым из способов трех аспектов согласно изобретению, до указанного измерения в этапе (c) или этапе (h), или этапе (c) и этапе (h) указанную мышечную ткань подвергают контакту с указанным клостридиальным токсином в течение от 5 до 30 мин.
В другом варианте осуществления, в соответствии с любым из способов трех аспектов согласно изобретению, продолжительность периода экспозиции указанной мышечной ткани указанному нейротоксину составляет приблизительно 15 минут.
В одном варианте осуществления, в соответствии с любым из способов трех аспектов согласно изобретению, указанная мышечная ткань уже подвергнута электрической стимуляции до этапа (a) и/или этапа (f).
В другом варианте осуществления указанная мышечная ткань уже подвергнута электрической стимуляции в течение этапа (a) и/или этапа (f).
В другом варианте осуществления указанная мышечная ткань уже подвергнута электрической стимуляции до этапа (a) и в течение этапа (a) и/или до этапа (f) и в течение этапа (f).
В одном варианте осуществления указанную регистрацию указанного измеренного второго эффекта выполняют путем построения кривой зависимости указанного второго эффекта от концентрации, и указанную регистрацию указанного второго набора данных выполняют посредством регистрации калибровочной кривой.
В одном варианте осуществления указанный второй эффект определяют по меньшей мере при одной концентрации, выраженной в мышиных LD50 единицах/мл, равной по меньшей мере 10.
В другом варианте осуществления указанная концентрация составляет от 10 до 1000 или от 10 до 70, или от 15 до 60, или от 20 до 45.
В другом варианте осуществления указанная концентрация составляет от 20 до 400 или от 100 до 800.
В одном варианте осуществления указанные мышиные LD50 единицы являются единицами Xeomin®.
В одном варианте осуществления указанный эффект или, соответственно, указанный первый и второй эффект, выбран из группы, состоящей из времени до наступления паралича указанной мышечной ткани, изменения частоты сокращений указанной мышечной ткани, изменения расстояния сокращения указанной мышечной ткани, изменения силы сокращения указанной мышечной ткани, изменения потенциала концевой пластинки или миниатюрного потенциала концевой пластинки указанной мышечной ткани.
В одном варианте осуществления указанный эффект или, соответственно, указанный первый и второй эффект, является временем до наступления паралича.
В одном варианте осуществления указанная мышечная ткань выбрана из межреберной мышцы, мышцы задней конечности и длинной разгибающей мышцы пальца задней конечности, подошвенных мышц задней лапы, диафрагмального нерва-гемидиафрагмы, длинной поднимающей мышцы уха, нейромышечного соединения лягушки, двубрюшной мышцы шеи цыпленка, реберных мышц, ткани мозга или электрического органа морского ската.
В одном варианте осуществления указанный диафрагмальный нерв-гемидиафрагма является крысиным или мышиным.
В одном варианте осуществления указанный клостридиальный нейротоксин является ботулиническим токсином.
В другом варианте осуществления серотип указанного ботулинического нейротоксина выбран из группы, состоящей из A, B, C, D, E, F и G; или ботулинический нейротоксин является химически или генетически модифицированным производным ботулинического нейротоксина, серотип которого выбран из группы, состоящей из A, B, C, D, E, F и G.
В одном варианте осуществления нейротоксин не содержит комплексообразующих белков.
В другом варианте осуществления указанный нейротоксин имеет серотип A или B.
В одном варианте осуществления указанную электрическую стимуляцию проводят в буфере, включающем противовспенивающее вещество.
В одном варианте осуществления указанное противовспенивающее вещество выбрано из кремнийсодержащих соединений.
В одном варианте осуществления указанный буфер продувают кислородом.
В другом аспекте изобретение относится к компьютерному программному продукту, включающему компьютерную программу, включающую программные средства для осуществления способа согласно изобретению.
В другом аспекте изобретение относится к набору, включающему:
(A) - устройство для стимуляции мышечной ткани, которая была подвергнута воздействию клостридиального нейротоксина, для выбора эффекта, вызванного указанным нейротоксином в указанной мышечной ткани;
- устройство для измерения и регистрации указанного эффекта; и
(B) компьютерный программный продукт, включающий компьютерную программу, включающую программные средства для осуществления способа согласно изобретению.
В другом аспекте изобретение относится к применению мышечной ткани в любом из способов изобретения.
В другом аспекте изобретение относится к применению способа изобретения согласно любому из трех аспектов изобретения для контроля активности образца, включающего клостридиальный нейротоксин.
В одном варианте осуществления образец представляет собой хранящийся образец.
В одном варианте осуществления образец представляет собой лиофилизированный образец или восстановленный образец.
В одном аспекте изобретение относится к применению способа согласно первому аспекту изобретения для определения неизвестной концентрации клостридиального нейротоксина в первом образце по отношению к известной концентрации клостридиального нейротоксина во втором образце; или для определения относительной активности клостридиального нейротоксина в первом образце по отношению к активности клостридиального нейротоксина во втором образце, например, в ходе контроля качества в процессе производства клостридиального нейротоксина.
Подробное описание изобретения
Было установлено, что непостоянство, наблюдаемое в отношении способов количественного анализа предшествующего уровня техники, может быть сильно уменьшено до незначительной степени с применением способов, раскрытых в настоящей заявке.
Согласно первому аспекту изобретение относится к способу измерения эффекта, вызванного в мышечной ткани клостридиальным нейротоксином, включающему:
(a) контакт мышечной ткани с образцом, включающим указанный клостридиальный нейротоксин;
(c) измерение эффекта, вызванного в указанной мышечной ткани указанным нейротоксином;
где этап (c) выполняют в отсутствии указанного образца.
Термин "контакт мышечной ткани с указанным образцом (который может быть первым или вторым образцом согласно способам в соответствии с другими аспектами изобретения)" означает, что, по меньшей мере, часть указанного нейротоксина указанного образца принимается указанной мышечной тканью в течение указанного контакта, то есть, по меньшей мере, часть нейротоксина, содержавшегося в указанном образце, связывается соответствующими рецепторами, содержащимися в указанной мышечной ткани.
Термин "отсутствие образца" означает, что измерение эффекта в этапе (c) выполняют в среде, как правило, в подходящем буфере, который содержит 10% по весу или меньше, например, совсем не содержит, образца или, другими словами, нейротоксина образца.
В одном варианте осуществления указанная мышечная ткань не подвергается постоянному контакту с образцом (который может быть первым или вторым образцом согласно способам в соответствии с другими аспектами изобретения), включающим клостридиальный нейротоксин, а только временному.
Это означает, что после заданного периода экспозиции указанной мышечной ткани нейротоксину, то есть контакта в этапе (a) для получения реакции указанной мышечной ткани на воздействие, соответствующее измерение эффекта (или, соответственно, первого или второго эффекта согласно способам в соответствии с другими аспектами изобретения), где, например, указанную мышечную ткань подвергают электрической стимуляции, выполняют в отсутствии указанного образца (который может быть указанным первым или указанным вторым образцом согласно способам в соответствии с другими аспектами изобретения) с применением способов, описанных ниже.
В одном варианте осуществления, до указанного измерения, указанную мышечную ткань, например, извлекают из камеры для органов, содержащей указанный образец, и переносят в камеру для органов, содержащей компоненты без нейротоксина, как описано ниже. Затем проводят электрическую стимуляцию и измерение величины эффекта (который может быть первым или вторым эффектом, когда образец является первым или вторым образцом). Это означает, что электрическая стимуляция и реакция на указанную стимуляцию выполняются с мышечной тканью, содержащей полученный нейротоксин.
В другом варианте осуществления содержащие нейротоксин компоненты, то есть образец (который может быть первым или вторым образцом), заменяют компонентами, не содержащими нейротоксин. После замены выполняют измерение величины эффекта (который может быть первым или вторым эффектом, когда образец является первым или вторым образцом).
Термин "клостридиальный нейротоксин (или клостридиальный токсин)" охватывает комплексы клостридиального токсина, а также нейротоксин высокой чистоты, то есть препарат нейротоксина, не содержащий каких-либо других клостридиальных белков.
В одном варианте осуществления указанный клостридиальный нейротоксин является ботулиническим нейротоксином.
В другом варианте осуществления серотип указанного ботулинического нейротоксина выбран из группы, состоящей из A, B, C, D, E, F и G.
Термин "комплекс ботулинического токсина" охватывает ботулинический токсин, связанный, по меньшей мере, с другим нетоксичным белком. Как очевидно, термин комплекс ботулинического токсина, используемый в настоящей заявке, включает 450 кДа и 900 кДа комплекс ботулинического токсина, который, например, может быть получен из культур C. botulinum. Такие препараты на основе комплекса ботулинического токсина типа A производятся коммерчески, например, Ipsen Ltd. (Dysport®) или Allergan Inc. (Botox®). Другой препарат на основе ботулинического комплекса типа B производится компанией Solstice Neurosciences, Inc. (Myobloc®). Высокоочищенный нейротоксин типа A, не содержащий других клостридиальных белков, выпускает Merz Pharmaceuticals (Xeomin®). Это лекарственное средство выбора, предназначенное для улучшения при некоторых формах фокальной дистонии.
В другом варианте осуществления указанный ботулинический нейротоксин является химически или генетически модифицированным производным серотипа, выбранного из группы, состоящей из A, B, C, D, E, F и G.
Химически модифицированное производное указанного нейротоксина может быть производным, которое модифицировано пируватированием, фосфорилированием, сульфатированием, липидированием и/или гликозилированием.
Генетически модифицированное производное указанного нейротоксина является таким производным, которое было модифицировано делецией, присоединением или заменой одной или более аминокислот, содержащихся в белках указанного серотипа.
Такой модифицированный токсин предпочтительно является биологически активным.
Биологически активный токсин является токсином, который способен к поглощению клеткой и производит при этом протеолитическое расщепление одного или нескольких полипептидов, входящих в комплекс SNARE.
В одном варианте осуществления указанную мышечную ткань подвергают электрической стимуляции.
В одном варианте осуществления способ дополнительно включает:
(b) электрическую стимуляцию указанной мышечной ткани, полученной в этапе (a).
В одном варианте осуществления этап (b) выполняют в отсутствии указанного образца.
Неожиданно было обнаружено, что электрическая стимуляция и измерение указанного эффекта в отсутствии указанного образца, после контакта указанной мышечной ткани с нейротоксином, смещает соответствующие кривые зависимости эффекта от дозы так, что чувствительность способа согласно изобретению значительно возрастает. Чувствительность особенно повышается при низких концентрациях, выраженных в мышиных LD50 единицах/мл указанного клостридиального нейротоксина, в указанном образце.
Например, если в качестве эффекта или, соответственно, реакции, установлено время до наступления паралича, указанное время до наступления паралича увеличивается по сравнению со способом, в котором указанный эффект измеряют в присутствии образца. Это приводит к выгодному повышению чувствительности способа, который в особенности применяется в области более низких концентраций нейротоксина. Если активность определяют при более низкой концентрации, нейротоксины обычно могут показывать наибольшую разницу, тогда как при довольно высоких концентрациях активности сходятся друг к другу.
Такое увеличение чувствительности позволяет проводить более точный и более достоверный анализ соответствующих кривых зависимости эффекта от дозы. Это в свою очередь позволяет значительно снизить количество лабораторных животных, например, мышей, которых в противном случае пришлось бы умертвить, чтобы выполнить любой из способов согласно изобретению. Таким образом, данный вариант осуществления изобретения прогрессивен не только в рамках технических аспектов, но также и в рамках этических аспектов.
Термин "чувствительность" используется в настоящем описании в стандартном значении, в каком он обычно используется в физиологии, то есть чувствительность определяет способность мышечной ткани реагировать на внешние стимулы. В данном случае внешние стимулы производятся при контакте мышечной ткани с клостридиальным нейротоксином. В рамках изобретения находится выбор некоторого диапазона концентраций, например, диапазона концентраций при относительно низкой концентрации клостридиального нейротоксина, где указанная чувствительность повышается, то есть реакцию можно определить, что в иных условиях сделать либо невозможно, либо, соответственно, можно определить только в пределах недопустимого отклонения.
Согласно второму аспекту изобретение относится к способу определения неизвестной концентрации клостридиального нейротоксина в первом образце по отношению к известной концентрации клостридиального нейротоксина во втором образце, включающему:
(a) контакт мышечной ткани с указанным вторым образцом;
(c) измерение второго эффекта, вызванного в указанной мышечной ткани указанным нейротоксином;
(d) повтор этапов (a)-(c) при различных концентрациях указанного клостридиального нейротоксина;
(e) регистрацию указанного измеренного второго эффекта этапа (d) в зависимости от концентрации, с регистрацией, таким образом, второго набора данных;
(f) контакт мышечной ткани с указанным первым образцом;
(h) измерение первого эффекта, вызванного в указанной мышечной ткани;
(k) определение концентрации, при которой указанный первый и указанный второй эффекты идентичны;
(l) приравнивание указанной концентрации в (k) к указанной неизвестной концентрации.
где этап (c) и/или этап (h) выполняют в отсутствии указанного второго и/или первого образца.
В одном варианте осуществления указанную мышечную ткань подвергают электрической стимуляции.
В одном варианте осуществления способ после этапа (a) включает этап (b), или этап (b) после этапа (a) и этап (g) после этапа (f):
(b) электрическая стимуляция указанной мышечной ткани, полученной в этапе (a);
(g) электрическая стимуляция указанной мышечной ткани, полученной в этапе (f).
В другом варианте осуществления этапы (b) или (g) выполняют в отсутствии второго или первого образца, или этапы (b) и (g) выполняют в отсутствии второго и первого образца.
Таким образом, в одном варианте осуществления определение второго и/или первого эффекта выполняют в отсутствии указанного второго и/или первого образца.
В другом варианте осуществления электрическую стимуляцию указанной мышечной ткани выполняют в отсутствии указанного второго и/или первого образца. Это означает, что после этапа (a) и до этапа (b), и/или после этапа (f) и до этапа (g) указанную мышечную ткань отделяют от второго и/или первого образца, как описано выше.
Термин "определение концентрации, при которой указанный первый и указанный второй эффекты идентичны" (этапы (k) и (l)) означает, что указанный первый и второй эффект качественно и количественно идентичны, то есть индуцированным эффектом является, например, время до наступления паралича, и что указанные эффекты имеют одну и ту же измеренную величину.
В одном варианте осуществления, для получения результатов, которые можно достоверно сравнить, время экспозиции мышечной ткани нейротоксину, содержащемуся во втором или, соответственно, первом образце, должно быть сопоставимым.
В одном варианте осуществления указанные периоды экспозиции идентичны.
В одном варианте осуществления указанную регистрацию указанного измеренного второго эффекта в этапе (e) выполняют путем измерения указанного второго эффекта при различных концентрациях указанного клостридиального нейротоксина в указанном втором образце и построения графика зависимости указанного измеренного второго эффекта от концентрации, регистрируя, таким образом, калибровочную кривую.
Если эффект, вызванный указанным вторым образцом в указанной мышечной ткани, определяется на основе различных концентраций, выраженных в мышиных LD50 единицах/мл, может быть получена калибровочная кривая, как описано выше.
Например, можно определить указанный эффект, вызванный в этапах от десяти LD50 единиц/мл или от пяти LD50 единиц/мл в пределах выбранного диапазона концентраций.
Соответственно, с помощью второго набора данных, зарегистрированного в этапе (e), строят калибровочную кривую, при помощи которой определяют неизвестную концентрацию указанного клостридиального нейротоксина в указанном первом образце согласно этапам (k) и последующему этапу (l).
В одном варианте осуществления строят калибровочную кривую и указанные этапы определения и приравнивания согласно этапам (k) - (l) выполняют с помощью графического анализа.
Указанная неизвестная концентрация первого образца может быть определена путем определения из калибровочной кривой концентрации, при которой указанный первый и указанный второй эффекты имеют одно и то же значение, например, одинаковое время до наступления паралича, и приравнивания указанной концентрации к указанной неизвестной концентрации согласно этапу (l).
Предварительным условием для указанного определения служит то, что неизвестная концентрация клостридиального токсина в первом образце вызывает в мышечной ткани эффект, который может быть определен количественно с помощью указанной калибровочной кривой. Специалист, квалифицированный в данной области, осведомлен, что может потребоваться разбавить или сконцентрировать первый образец с неизвестной концентрацией один или несколько раз, при необходимости, чтобы получить диапазон концентраций, в котором можно провести сравнение со вторым образцом, то есть получить идентичные первый и второй эффекты. Затем, с учетом фактора разведения или концентрации, может быть вычислена концентрация нейротоксина, первоначально присутствующая в неразведенном или неконцентрированном первом образце.
В другом варианте осуществления указанное определение и приравнивание не проводят с помощью измерения по одной точке только одной концентрации в этапе (h) и последующих этапах (k) и (l), а с помощью измерения при множестве различных концентраций. Это особенно важно с учетом нормативных требований.
Согласно другому аспекту изобретения желательно оптимизировать диапазон концентраций, в котором возможно достоверное сравнение указанного второго и первого образца. Это относится не только к возможности сравнения касательно биологической эффективности известных на настоящий момент и коммерческих препаратов клостридиальных нейротоксинов, но также и к препаратам, которые могли бы быть разработаны в будущем или уже находятся в процессе разработки.
В одном варианте осуществления, для оптимизации диапазона концентраций, выраженных в мышиных LD50 единицах/мл, в котором возможно достоверное сравнение указанного второго и первого образца, желательно, во-первых, определить стандартное отклонение калибровочной кривой, регистрируемой в этапе (e) и/или в этапе (h). При использовании подходящего ступенчатого регрессионного анализа можно создать регрессионную модель для предсказания активности неизвестного образца токсина на основе кривой зависимости эффекта от дозы.
С помощью такого способа можно идентифицировать диапазон концентраций для первого и второго образца, представляющего две различные совокупности данных, в которых корреляция между соответствующими кривыми зависимости эффекта от дозы достигает максимума, то есть, устанавливается наилучшее соответствие.
В одном варианте осуществления критерий может быть дополнительно скорректирован путем представления диапазона значений соответствующих наборов данных первого и второго образца эмпирическими кривыми согласно заданной регрессионной модели, соответственно, а также линеаризации и параллелизации указанных эмпирических кривых в пределах установленного доверительного интервала.
Таким образом, согласно третьему аспекту изобретение относится к способу определения относительной активности клостридиального нейротоксина в первом образце по отношению к активности клостридиального нейротоксина во втором образце, включающему:
(a) контакт мышечной ткани с указанным вторым образцом;
(b) электрическую стимуляцию указанной мышечной ткани, полученной в этапе (a);
(c) измерение второго эффекта, вызванного в указанной мышечной ткани указанным нейротоксином;
(d) повтор этапов (a)-(c) при различных концентрациях указанного клостридиального нейротоксина;
(e) регистрацию указанного измеренного второго эффекта этапа (d) в зависимости от концентрации, с регистрацией, таким образом, второго набора данных;
(f) контакт мышечной ткани с указанным первым образцом;
(g) электрическую стимуляцию указанной мышечной ткани, полученной в этапе (f);
(h) измерение первого эффекта, вызванного в указанной мышечной ткани, полученной в этапе (g);
(i) повтор этапов (f)-(h) при различных концентрациях указанного клостридиального нейротоксина;
(j) регистрацию указанного измеренного первого эффекта этапа (i) в зависимости от концентрации, с регистрацией, таким образом, первого набора данных;
где этап (c) и/или этап (h) выполняют в отсутствии указанного второго и/или первого образца.
В одном варианте осуществления способ дополнительно включает этапы (m) и (n):
(m) подбор указанных различных концентраций из диапазона концентраций, который лучше всего соответствует первому и второму набору данных;
(n) определение указанного наилучшего соответствия с помощью статистического критерия, включающего следующее подэтапы (α)-(δ):
(α) представление диапазона значений второго набора данных, полученного в этапе (e), в виде эмпирической кривой;
(β) представление диапазона значений первого набора данных, полученного в этапе (j), в виде эмпирической кривой;
(γ) линеаризация эмпирических кривых, соответственно;
(δ) параллелизация линеаризованных эмпирических кривых.
В одном варианте осуществления указанную мышечную ткань подвергают электрической стимуляции.
В одном варианте осуществления способ после этапа (a) включает этап (b), а после этапа (f) - этап (g):
(b) электрическая стимуляция указанной мышечной ткани, полученной в этапе (a);
(g) электрическая стимуляция указанной мышечной ткани, полученной в этапе (f).
В одном варианте осуществления этапы (b) или (g) выполняют в отсутствии второго или первого образца, или этапы (b) и (g) выполняют в отсутствии второго и первого образца.
Таким образом, в одном варианте осуществления определение второго и/или первого эффекта выполняют в отсутствии указанного второго и/или первого образца.
В другом варианте осуществления электрическую стимуляцию указанной мышечной ткани выполняют в отсутствии указанного второго и/или первого образца. Это означает, что после этапа (a) и до этапа (b), и/или после этапа (f) и до этапа (g) указанную мышечную ткань отделяют от второго и/или первого образца, как описано выше.
Статистические критерии, подходящие для выполнения вышеуказанной последовательности, хорошо известны, например, критерии отношения правдоподобия. Примером такого критерия отношения правдоподобия является известный F-критерий. Также может использоваться такой критерий, как χ2-критерий (критерий хи-квадрат или критерий χ2-распределения) или t-критерий. Указанные критерии также известны в уровне техники.
В одном варианте осуществления указанным статистическим критерием является F-критерий.
С помощью указанного критерия можно решить, в пределах установленного доверительного интервала, отличаются ли существенно два случайных образца, взятых из двух различных популяций, с учетом их отклонения. Таким образом, такой критерий служит для проверки различий в пределах двух статистических образцов, в данном случае второго и первого образцов.
В одном варианте осуществления доверительный интервал должен быть широким для получения достоверных результатов, то есть вероятность ложного отклонения должна быть относительно низкой.
В одном варианте осуществления вероятность ложного отклонения составляет ≤5 (выражена в %; (или 0,05)) или, соответственно, доверительный интервал составляет ≥95 (выражен в %; (или 0,95)).
В одном варианте осуществления вероятность ложного отклонения для каждого подэтапа (a)-(δ) составляет ≤5 (выражена в %).
В одном варианте осуществления линеаризацию в этапе (γ) выполняют путем представления соответствующих наборов данных в виде прямой наилучшего соответствия.
В одном варианте осуществления параллелизацию в этапе (δ) выполняют путем определения общего угла наклона прямых наилучшего соответствия.
После этапа (δ), на основе смещения линеаризованных и параллелизованных эмпирических кривых относительно друг друга, определяют относительную активность первого образца по отношению ко второму образцу.
Таким образом, в одном варианте осуществления способ после этапа (δ) дополнительно включает этап (ε):
(ε) вычисление на основе смещения линеаризованных и параллелизованных эмпирических кривых относительно друг друга относительной активности первого образца по отношению ко второму образцу.
В одном варианте осуществления термин "относительная активность" означает, что активность первого образца по отношению ко второму образцу определяют при идентичной концентрации или, соответственно, идентичных концентрациях, на основе линеаризованных и параллелизованных эмпирических кривых.
В одном варианте осуществления активность второго образца приравнивают к 100% и относительную активность первого образца выражают в %. Например, для первого образца получают активность, например, 110% или 90% по отношению ко второму образцу. Путем соответствующего разведения первого образца, имеющего 110% активность, до 100%-ой активности, получают эффективную концентрацию клостридиального нейротоксина в первом образце, которая до настоящего времени не была известна, применяя правило пропорции. Единицей измерения теперь становится относительная активность, при этом значение выражают как единицу активности, определенную в отношении активности референсного стандарта (второго образца).
В другом варианте осуществления относительную активность выражают как отношение активности первого и второго образца.
В одном варианте осуществления вышеописанная модель применяется для предсказания логарифмического значения примененной дозы нейротоксина.
В другом варианте осуществления количество стимулируемого эффекта и величину дозы нейротоксина в образце регистрируют в логарифмическом масштабе.
В одном варианте осуществления второй эффект или, соответственно, первый эффект, измеряют по меньшей мере при трех различных концентрациях клостридиального нейротоксина во втором образце или, соответственно, первом образце.
В одном варианте осуществления указанную регистрацию указанных наборов данных или, соответственно, указанную регистрацию калибровочной кривой или, соответственно, калибровочных кривых, выполняют в форме полулогарифмического графика.
В другом варианте осуществления применяют двойной (по обеим осям) логарифмический график.
Способ определения относительной активности описан в Европейской Фармакопее.
В одном варианте осуществления, начиная с концентрации, например, 10 мышиных LD50 единиц/мл, способ определения указанной относительной активности применяется в полном диапазоне набора данных. Затем значения, превышающие 10 мышиных LD50 единиц/мл, используют в качестве исходных точек, например, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 мышиных LD50 единиц/мл. Указанную итерацию продолжают так долго, пока применяемая модель не дает желаемую и необходимую точность.
В одном варианте осуществления, после определения наилучшего соответствия и, таким образом, диапазона концентраций с помощью статистического критерия, любой первый образец с неизвестной концентрацией (относительно эффективной концентрации) клостридиального нейротоксина можно сравнить с известной концентрацией указанного клостридиального нейротоксина во втором образце в пределах указанного диапазона концентраций, идентифицированного согласно способу изобретения.
В одном варианте осуществления указанную регистрацию указанного измеренного второго эффекта выполняют путем построения графика зависимости указанного второго эффекта от концентрации, при этом указанную регистрацию указанного второго набора данных выполняют путем регистрации калибровочной кривой.
Применение относительных оценок активности, а также включение референсного стандарта (второго образца) в анализ, дает более точные и более воспроизводимые оценки, что позволяет сократить применение животных.
В одном варианте осуществления согласно любому из способов в соответствии с тремя аспектами согласно изобретению, до указанного измерения в этапе (c) или этапе (h), или этапе (c) и этапе (h), указанную мышечную ткань подвергают контакту с указанным клостридиальным токсином в течение от 5 до 30 мин.
В одном варианте осуществления согласно любому из способов в соответствии с тремя аспектами согласно изобретению указанная мышечная ткань уже была подвергнута электрической стимуляции до этапа (a) и/или этапа (f).
В другом варианте осуществления указанная мышечная ткань уже была подвергнута электрической стимуляции в ходе этапа (a) и/или этапа (f).
В другом варианте осуществления указанная мышечная ткань уже была подвергнута электрической стимуляции до этапа (a) и в ходе этапа (a), и/или до этапа (f) и в ходе этапа (f).
Статистические анализы обычно выполняются с помощью подходящей компьютерной программы и подходящего компьютера.
В одном варианте осуществления статистический анализ выполняют с помощью подходящей компьютерной программы, включающей подходящие программные средства для осуществления статистического анализа.
Таким образом, в одном варианте осуществления, изобретение относится к компьютерному программному продукту, включающему компьютерную программу, включающую программные средства для осуществления способа согласно изобретению.
В одном варианте осуществления второй образец выбирают из коммерческого и зарегистрированного препарата ботулинического токсина. Поскольку такие продукты зарегистрированы и разрешены в качестве лекарственного препарата или, соответственно, лекарственного средства, они включают четко определенное количество или, соответственно, концентрацию ботулинического токсина.
В другом варианте осуществления может применяться любой препарат ботулинического токсина, который был произведен при стандартных условиях.
В одном варианте осуществления коммерческие препараты, указанные выше, могут применяться в качестве второго образца. Таким образом, вторым образцом может являться Xeomin®, Botox®, Dysport®, Myobloc® или PurTox®. Указанные препараты отличаются по типу используемого ботулинического токсина, либо по биологической эффективности/активности, например, по концентрации ботулинического нейротоксина или по типу ботулинического токсина, содержащегося в них.
Мышиная единица, выраженная в LD50 мыши, является стандартной единицей для определения концентрации клостридиального нейротоксина, содержащегося в образце. Значение LD50 определяет смертельную дозу, при которой погибает 50% популяции мышей, если указанное количество применено на мышах указанной популяции мышей. Способ определения указанного значения известен специалисту, квалифицированному в данной области. Такой способ описан в Европейской Фармакопее.
Как известно, единицы LD50 на этикетке продуктов на основе ботулинического нейротоксина могут быть характерны для продукта или, соответственно, для производителя, и могут не быть равноценными вследствие отсутствия стандарта.
В одном варианте осуществления единицы LD50, указанные в настоящей заявке, представляют собой единицы, определеные в описании и этикетке Xeomin®. Например, вторым образцом является Xeomin®. Следовательно, единицы, которые относятся к некоторой активности, являются единицами Xeomin®. Таким образом, система анализа настоящего изобретения может применяться для сравнительной оценки активности любого образца, включающего клостридиальный нейротоксин, по сравнению с Xeomin®. Кроме того, способ позволяет непосредственно сравнивать первые образцы, включающие клостридиальный нейротоксин (в неизвестной концентрации), в единицах Xeomin®.
Xeomin® и Botox® демонстрируют приблизительно сравнимую эффективность или активность. Для получения одинаковой эффективности или активности, как у Xeomin® и Botox®, нужно применить приблизительно 2,5-кратное количество Dysport® или, соответственно, 10-кратное количество Myobloc®.
В одном варианте осуществления указанные коммерческие препараты разводят или концентрируют до заданных концентраций ботулинического нейротоксина, содержащегося в них, и измеряют указанный второй эффект в зависимости от различных концентраций указанного клостридиального нейротоксина в указанном втором образце. Указанный измеренный эффект наносят на график в зависимости от концентрации ботулинического токсина, регистрируя, таким образом, калибровочную кривую. Посредством указанного второго набора данных или, соответственно, указанной калибровочной кривой, может быть определена неизвестная концентрация ботулинического нейротоксина в первом примере.
Было обнаружено, что при концентрации клостридиального нейротоксина в образце (который может быть первым или вторым образцом), выраженной в мышиных LD50 единицах/мл и равной по меньшей мере 10, способы согласно изобретению могут быть полезно применены. Следует отметить, что все концентрации, приведенные в рамках настоящей заявки, указаны в мышиных LD50 единицах/мл.
В одном варианте осуществления указанная концентрация составляет по меньшей мере 15.
В другом варианте осуществления указанная концентрация составляет по меньшей мере 20.
В другом варианте осуществления указанная концентрация составляет от 10 до 1000.
В одном варианте осуществления концентрация составляет от 10 до 70.
В другом варианте осуществления концентрация составляет от 15 до 60.
В еще одном варианте осуществления концентрация составляет от 20 до 45.
В одном варианте осуществления вторым образцом является Xeomin®.
В одном варианте осуществления было обнаружено, что в том случае, если в качестве второго образца применяется Xeomin®, наиболее достоверные результаты могут быть получены, если второй эффект определяют по меньшей мере при одной концентрации от 10 до 70. В другом варианте осуществления концентрация составляет от 15 до 60. В еще одном варианте осуществления концентрация составляет от 25 до 45.
В одном варианте осуществления было обнаружено, что в том случае, если в качестве второго образца применяется Botox®, достоверные результаты могут быть получены, если второй эффект определяют по меньшей мере при одной концентрации от 10 до 70. В другом варианте осуществления концентрация составляет от 15 до 60. В еще одном варианте осуществления концентрация составляет от 25 до 45.
Если второй образец используется для определения калибровочной кривой согласно этапу (e), при этом второй образец имеет более низкую концентрацию или содержит менее эффективный или активный ботулинический нейротоксин, чем Xeomin® или Botox®, более высокие концентрации нейротоксина, то есть более высокие значения LD50 единиц/мл требуются для достижения такой силы второго эффекта, который сопоставим с эффектом, вызываемым Xeomin® или Botox®.
В варианте осуществления, в котором второй образец имеет более низкую концентрацию или активность ботулинического нейротоксина, чем Xeomin® или Botox®, второй эффект определяют по меньшей мере при одной концентрации от 20 до 400, или от 100 до 800.
В одном варианте осуществления, в котором вторым образцом является Dysport®, второй эффект определяют по меньшей мере при одной концентрации от 20 до 400 или от 25 до 300, или от 30 до 250.
В другом варианте осуществления, в котором вторым образцом является Myobloc®, второй эффект определяют по меньшей мере при одной концентрации от 100 до 800 или от 150 до 700, или от 200 до 600.
В других вариантах осуществления концентрация может изменяться в пределах от 30 до 600, или от 30 до 400, или от 30 до 200, или от 30 до 100, или от 30 до 80, или от 40 до 500, или от 40 до 400, или от 40 до 300, или от 40 до 200, или от 40 до 100, или от 40 до 90, или от 50 до 300, или от 50 до 200, или от 50 до 100, или от 60 до 100, в зависимости от концентрации эффективности или активности нейротоксина во втором образце по сравнению с Xeomin® или Botox®.
В одном варианте осуществления единицы LD50 являются единицами Xeomin®.
Согласно первому варианту изобретения эффект, используемый для определения указанной неизвестной концентрации, является временем до наступления паралича мышечной ткани. Время может измеряться, например, в секундах или минутах. Согласно подвариантам, время до наступления паралича может быть определено на основе расстояния сокращения мышцы (паралич достигается, как только расстояние сокращения становится равным 0), или по частоте сокращений мышцы (паралич достигается, как только частота сокращений становится равна 0). Расстояние сокращения, например, может быть измерено в сантиметрах или миллиметрах.
"Время до наступления паралича" может быть определено как период, который прошел до достижения половины от максимального сокращения. Это строго зависит от концентрации токсина.
Согласно другим вариантам изобретения индуцируемым эффектом является изменение частоты сокращений мышечной ткани или изменение в сокращении мышечной ткани, или изменение силы сокращения мышечной ткани, или изменение потенциала концевой пластинки или миниатюрного потенциала концевой пластинки мышечной ткани. Указанные способы известны в уровне техники и раскрыты, например, в EP 1597584 B1.
В одном варианте осуществления эффект или, соответственно, первый и второй индуцированный эффект, является временем до наступления паралича мышечной ткани.
В сущности, для способа изобретения может быть выбрана любая мышечная ткань, которая проявляет нейромышечные характеристики, а именно реагирует на электрическую стимуляцию. Под мышечной тканью понимается препарат, включающий одно или более мышечных волокон, к которым присоединена нервная клетка или нервные клетки, или нерв, которые могут электрически стимулироваться. Может использоваться гладкая и поперечнополосатая мышечная ткань.
Согласно описанию настоящего изобретения, мышечная ткань включает межреберную мышцу, мышцу задней конечности и длинную разгибающую мышцу пальца задней конечности, например, мышей и крыс, подошвенные мышцы задней лапы, например, мыши или крысы, диафрагмальный нерв-гемидиафрагму, например, крысы или мыши, длинную поднимающую мышцу уха, например, мыши и крысы, нейромышечное соединение лягушки, двубрюшную мышцу шеи цыплят. Также могут использоваться реберные мышцы или мозговая ткань, например, мыши и крысы, или электрический орган морского ската.
Кроме того, в одном варианте осуществления эксперименты показали, что использование диафрагмального нерва-гемидиафрагмы мыши служит подходящим инструментом для измерения клостридиальной токсичности. Таким образом, это может применяться в качестве анализа для определения клостридиальной токсичности.
В одном варианте осуществления, благодаря надежности указанного анализа на гемидиафрагме мыши, можно гарантировать соответствие требованиям регулирующих органов и удовлетворение потребности в безопасном и эффективном введении ботулинического токсина, такого как токсин серотипа A или серотипа B.
В одном варианте осуществления гемидиафрагма является гемидиафрагмой грызуна, такого как крыса или мышь.
В одном варианте осуществления гемидиафрагма является гемидиафрагмой мыши.
Термин "гемидиафрагма мыши или крысы" означает диафрагмальный нерв-гемидиафрагму крысы или мыши.
В еще одном варианте осуществления указанный клостридиальный токсин в указанном первом образце и указанный клостридиальный токсин в указанном втором образце являются одинаковыми клостридиальными токсинами.
В еще одном варианте осуществления указанный клостридиальный токсин или нейротоксин в первом образце и указанный клостридиальный токсин или нейротоксин в указанном втором образце отличаются друг от друга.
Для экспериментальной реализации способа, как правило, мышечную ткань с прикрепленными моторными нейронами удаляют у животного, такого как мышь или крыса, и помещают в камеру для органов или тканей, содержащую буфер, такой как физиологический буфер, в котором контролируют такие условия, как ионный состав, глюкозу, температуру, pH и насыщение кислородом, чтобы оптимизировать жизнеспособность и функции ткани. Измерения силы сокращения мышц после электрического возбуждения могут быть сделаны, когда мышца присоединена к датчику силы, что дает возможность напрямую измерять эффект токсина в отношении нейромышечной функции.
В одном варианте осуществления температура в буфере составляет от 35 до 39°C или от 36 до 38°C. В другом варианте осуществления температура составляет от 36,5 до 37,5°C.
В еще одном варианте осуществления температура равна или приблизительно равна 37°C.
В одном варианте осуществления указанный pH в указанном буфере составляет от 7 до 8 или от 7,2 до 7,8. В одном варианте осуществления указанный pH равен или приблизительно равен 7,5.
В одном варианте осуществления насыщение кислородом проводят газовой смесью, включающей кислород. В одном варианте осуществления насыщение кислородом проводят смесью углекислого газа и кислорода. В одном варианте осуществления используют газовую смесь, состоящую из 95 частей кислорода (по объему) и 5 частей углекислого газа (по объему). Коммерческие смеси известны как карбоген.
Для проведения электрической стимуляции с целью измерения эффекта или, соответственно, второго и первого эффекта, в сущности, могут применяться способы предшествующего уровня техники.
В одном варианте осуществления способ осуществляют так, что электрическую стимуляцию в этапе (b) или (g) выполняют при напряжении, по меньшей мере, равном сверхмаксимальному напряжению. Под сверхмаксимальным напряжением понимается минимальное напряжение, необходимое для получения максимальной сократительной реакции мышечной ткани. Как правило, такой эксперимент повторяют несколько раз, и результаты усредняют для получения достоверного результата.
Электрическая стимуляция может быть выполнена так, что при напряжении, по меньшей мере, равном сверхмаксимальному напряжению указанной ткани, стимуляцию проводят импульсами с некоторыми временными интервалами. Под импульсной стимуляцией понимается стимуляция, длящаяся некоторое время, разделенное некоторыми периодами, в течение которых стимуляцию не проводят. Данный подход описан, например, в Goschel et al., Exp. Neurol., vol. 147, 1, 1997, Wohlfahrt et al., Naunyn-Schmiedeberg's Arch Pharmacol (1997) 355:335-340.
В альтернативе электрическая стимуляция может быть последовательной импульсной стимуляцией. Такой способ раскрыт в EP 1597584 B1.
В одном варианте осуществления импульсной стимуляции продолжительность стимуляции может варьировать от 10 мкс до 1 мс. Продолжительность периодов, в которые стимуляцию не проводят, может варьировать от 0,1 до 10 с. Сверхмаксимальное напряжение может изменяться в пределах, например, от 1 мВ и 15 В. Мышечную ткань, например, подвергают непрерывной электростимуляции импульсами с частотой, например, 1 Гц, с помощью двух электродов.
Микроэлектроды могут быть помещены на или вблизи нейромышечных соединений, при этом можно выполнять внутриклеточную регистрацию спонтанных и индуцированных мембранных потенциалов. Указанные мембранные потенциалы производятся при активации лиганд-регулируемых ионных каналов ацетилхолином, которые в свою очередь служат мишенью для токсина. Анализ потенциалов концевых пластинок может использоваться для получения информации о действии токсина на количественное высвобождение ацетилхолина.
В частности, подходящая мышечная ткань, например, левый диафрагмальный нерв-гемидиафрагма (nervus phrenicus) может быть вырезан, например, у самца или самки мыши и помещен в камеру для органов. В одном варианте осуществления указанная камера для органов представляет собой камеру, содержащую раствор Кребса-Рингера или сбалансированный солевой раствор Эрла (EBSS), или физиологический солевой раствор. Указанные растворы известны квалифицированному специалисту. Затем мышечную ткань стимулируют через диафрагмальный нерв в присутствии первого или, соответственно, второго образца согласно известным способам. Вызванные эффекты регистрируют и оценивают, также используя известные способы, например, способы, описанные в предшествующем уровне техники.
Мышечная ткань может быть погружена в буфер, такой как физиологический буфер. Буфер может включать источник энергии. Источник энергии может быть источником энергии на основе АТФ, например, одним или несколькими из следующего: АТФ, сахар, такой как глюкоза, и/или креатин, жирная кислота, аминокислота, гликоген, поверхностно-активное вещество и пировиноградная кислота.
Буфер может быть насыщен кислородом, особенно в случае более длительного анализа. Предпочтительно в камеру для органов могут быть добавлены кислород и глюкоза (или другой источник АТФ) для увеличения продолжительности жизни указанной мышечной ткани. Добавление поверхностно-активного вещества может быть выгодно в особенности для уменьшения образования пузырей, которые могут оказать нежелательное воздействие на способ изобретения.
В одном варианте осуществления поверхностно-активное вещество является противовспенивающим веществом.
Термин "противовспенивающее вещество" включает все вещества, которые влияют на поверхностное натяжение пузырьков газа, которые содержатся в жидкости.
Один тип противовспенивающих веществ снижает поверхностное натяжение пузырьков газа, которые содержатся в жидкости, разрушая, таким образом, пузырьки газа.
Впрочем, также возможно, что противовспенивающие вещества могут повышать поверхностное натяжение пузырьков газа, вызывая объединение пузырьков в более крупные пузырьки, которые выходят из жидкости легче, чем мелкие пузырьки.
Влияние поверхностного натяжения может быть измерено способами, которые известны специалисту, квалифицированному в данной области, такими как измерения угла контакта и угла смачивания.
Таким образом, противовспенивающим веществом является вещество, которое предотвращает образование пены или разрушает уже образовавшуюся пену.
Стандартными противовспенивающими веществами являются нерастворимые масла, диметилполисилоксаны и другие силиконы, спирты, стеараты и гликоли.
В одном варианте осуществления противовспенивающее вещество выбрано по меньшей мере из одного кремнийсодержащего соединения.
В другом варианте осуществления по меньшей мере одно кремнийсодержащее соединение является силоксаном.
Термин "силоксан" включает олигосилоксаны и полисилоксаны. В одном варианте осуществления указанные силоксаны замещены алкильными группами и/или арильными группами. Такие силоксаны известны из уровня техники. Кремнийсодержащие соединения можно применять в форме отдельного соединения или в форме смеси более чем одного кремнийсодержащего соединения.
Примерами подходящих соединений кремния или, соответственно, подходящих силоксанов, без ограничения, являются α-(триметилсилил)-ω-метилполи[окси(диметилсилилен)] и полидиметил-силоксан. Такие соединения доступны на рынке и используются в лекарственных средствах или в качестве них, например, под названиями симетикон и диметикон.
Специалисту, квалифицированному в данной области техники, известно, что другие соединения, обладающие подобной активностью, такие как диметикон и симетикон, также могут применяться в способе настоящего изобретения.
В другом аспекте изобретение относится к набору, включающему камеру для органов, в которой производится стимуляция мышечной ткани, подвергнутой воздействию клостридиального нейротоксина, и где измеряют эффект указанной стимуляции (например, как описано выше), а также компьютерный программный продукт, с помощью которого выполняют статистический анализ, оптимизируя, таким образом, диапазон концентраций, в котором эффект, вызываемый нейротоксином, нужно измерять, чтобы получить достоверные результаты.
Таким образом, в одном варианте осуществления изобретение относится к набору, включающему:
(A) - устройство для стимуляции мышечной ткани, которая была подвергнута воздействию клостридиального нейротоксина, для выбора эффекта, вызванного указанным нейротоксином в указанной мышечной ткани;
- устройство для измерения и регистрации указанного эффекта; и
(B) - компьютерный программный продукт, включающий компьютерную программу, включающую программные средства для осуществления способа согласно изобретению.
Согласно четвертому аспекту изобретение также предоставляет улучшенный способ определения диапазона концентраций, в котором может быть определена активность первого образца, включающего клостридиальный нейротоксин, по отношению ко второму образцу, включающим клостридиальный нейротоксин, в пределах установленного доверительного интервала или вероятности ложного отклонения.
В одном варианте осуществления такой способ определения диапазона концентраций, в котором может быть определена активность первого образца, включающего клостридиальный нейротоксин, по отношению ко второму образцу, включающим клостридиальный нейротоксин, включает следующие этапы:
(a) контакт мышечной ткани с указанным вторым образцом;
(b) электрическая стимуляция указанной мышечной ткани, полученной в этапе (a);
(c) измерение второго эффекта, вызванного в указанной мышечной ткани указанным нейротоксином;
(d) повтор этапов (a)-(c) при различных концентрациях указанного клостридиального нейротоксина;
(e) регистрация указанного измеренного второго эффекта этапа (d) в зависимости от концентрации, с регистрацией, таким образом, второго набора данных;
(f) контакт мышечной ткани с указанным первым образцом;
(g) электрическая стимуляция указанной мышечной ткани, полученной в этапе (f);
(h) измерение первого эффекта, вызванного в указанной мышечной ткани указанным нейротоксином;
(i) повтор этапов (f)-(h) при различных концентрациях указанного клостридиального нейротоксина;
(j) регистрация указанного измеренного первого эффекта этапа (i) в зависимости от концентрации, с регистрацией, таким образом, первого набора данных;
где указанная концентрация выбрана из диапазона концентрации, который лучше всего соответствует первому и второму набору данных, и где указанное наилучшее соответствие определяется с помощью статистического критерия, включающего следующие подэтапы (a)-(δ):
(a) представление диапазона значений второго набора данных, полученного в этапе (e), в виде эмпирической кривой;
(β) представление диапазона значений первого набора данных, полученного в этапе (j), в виде эмпирической кривой;
(γ) линеаризация эмпирических кривых, соответственно;
(δ) параллелизация линеаризованных эмпирических кривых.
В указанном варианте осуществления указанный второй и указанный первый эффект качественно идентичны. Для уточнения способа могут применяться способы, описанные выше применительно к способу согласно третьему аспекту изобретения.
В следующем аспекте изобретения способы изобретения могут предпочтительно применяться для контроля качества, то есть активности образца, включающего клостридиальный нейротоксин, по сравнению с референсным стандартом, как требуется в процессе производства.
Таким образом, в указанном аспекте изобретение относится к применению способа изобретения для контроля качества, то есть активности образца, включающего клостридиальный нейротоксин.
В одном варианте осуществления определяют активность образца, находящегося на хранении. В одном варианте осуществления образец находился на хранении в течение по меньшей мере одного часа или по меньшей мере одного дня.
В одном варианте осуществления образец является лиофилизированным образцом или восстановленным образцом.
Согласно другому аспекту изобретение относится к применению способа согласно первому аспекту изобретения для определения неизвестной концентрации клостридиального нейротоксина в первом образце по отношению к известной концентрации клостридиального нейротоксина во втором образце; или для определения относительной активности клостридиального нейротоксина в первом образце по отношению к активности клостридиального нейротоксина во втором образце.
Согласно другому аспекту изобретение относится к применению мышечной ткани, в особенности гемидиафрагмы мыши или крысы, для определения клостридиальной активности в любом из способов изобретения, или для определения клостридиальной активности при помощи набора согласно изобретению.
Следующие варианты осуществления также относятся к настоящему изобретению, при этом следует понимать, что варианты осуществления, описанные выше, взаимно применимы в отношении указанных ниже способов.
Таким образом, изобретение также относится к способу ex vivo определения неизвестной концентрации клостридиального нейротоксина в первом образце по отношению к известной концентрации клостридиального нейротоксина во втором образце, включающему:
(a) контакт мышечной ткани с указанным вторым образцом;
(b) электрическую стимуляцию указанной мышечной ткани, полученной в этапе (a);
(c) измерение второго эффекта, вызванного в указанной мышечной ткани указанным нейротоксином;
(d) повтор этапов (a)-(c) при различных концентрациях указанного клостридиального нейротоксина;
(e) регистрацию указанного измеренного второго эффекта этапа (d) в зависимости от концентрации, с регистрацией, таким образом, второго набора данных;
(f) контакт мышечной ткани с указанным первым образцом;
(g) электрическую стимуляцию указанной мышечной ткани, полученной в этапе (f);
(h) измерение первого эффекта, вызванного в указанной мышечной ткани, полученной в этапе (g);
где указанный второй эффект определяют по меньшей мере при одной концентрации, выраженной в мышиных LD50 единицах/мл, равной по меньшей мере 10.
В одном варианте осуществления идентифицируют концентрацию, при которой указанный первый и указанный второй эффекты идентичны, и приравнивают к неизвестной концентрации указанного клостридиального нейротоксина в указанном первом образце.
Таким образом, в одном варианте осуществления способ дополнительно включает этапы (k) и (l):
(k) определение концентрации, при которой указанный первый и указанный второй эффекты идентичны;
(l) приравнивание указанной концентрации в (k) к указанной неизвестной концентрации.
В одном варианте осуществления указанная мышечная ткань уже была подвергнута электрической стимуляции до этапа (a) и/или этапа (f).
В другом варианте осуществления указанная мышечная ткань уже была подвергнута электрической стимуляции в ходе этапа (a) и/или этапа (f).
В другом варианте осуществления указанная мышечная ткань уже была подвергнута электрической стимуляции до этапа (a) и в ходе этапа (a) и/или до этапа (f) и в ходе этапа (f).
Указанная электрическая стимуляция указанной мышечной ткани может быть выполнена в отсутствии или присутствии второго и/или первого образца, если указанная мышечная ткань была подвергнута воздействию указанного клостридиального нейротоксина, присутствующего в указанном втором и/или первом образце.
В одном варианте осуществления изобретение относится к способу ex vivo определения неизвестной концентрации клостридиального нейротоксина в первом образце по отношению к известной концентрации клостридиального нейротоксина во втором образце, включающему:
(i) электрическую стимуляцию мышечной ткани в присутствии указанного второго образца и выбор второго эффекта, вызванного указанным вторым образцом в указанной мышечной ткани,
(ii) измерение указанного второго эффекта в (i) при различных концентрациях указанного клостридиального нейротоксина в указанном втором образце и построение графика зависимости указанного измеренного второго эффекта от концентрации, с регистрацией, таким образом, второго набора данных,
(iii) электрическую стимуляцию указанной мышечной ткани в присутствии указанного первого образца,
(iv) выбор первого эффекта, вызванного указанным первым образцом в указанной мышечной ткани,
(v) определение концентрации, при которой указанный первый и указанный второй эффекты идентичны, и
(vi) приравнивание указанной концентрации в (v) к указанной неизвестной концентрации,
где указанный второй эффект определяют по меньшей мере при одной концентрации, выраженной в мышиных LD50 единицах/мл, равной по меньшей мере 10.
В одном варианте осуществления указанную регистрацию указанного измеренного второго эффекта в этапе (e) или этапе (ii) выполняют путем измерения указанного второго эффекта при различных концентрациях указанного клостридиального нейротоксина в указанном втором образце и построения графика зависимости указанного измеренного второго эффекта от концентрации, с регистрацией, таким образом, калибровочной кривой.
Таким образом, посредством второго набора данных, зарегистрированного в этапе (e) или (ii), строят калибровочную кривую, с помощью которой определяют неизвестную концентрацию указанного клостридиального нейротоксина в указанном первом образце согласно этапам (k) и последующему этапу (l) или, соответственно, этапу (v) и последующему этапу (vi).
В одном варианте осуществления строят калибровочную кривую, и указанные этапы определения и приравнивания согласно этапам (k) - (l) или, соответственно, этапу (v) и последующему этапу (vi), проводят с помощью графического анализа.
В одном варианте осуществления указанная концентрация составляет по меньшей мере 15 или по меньшей мере 20.
В другом варианте осуществления указанная концентрация составляет от 10 до 1000.
В одном варианте осуществления концентрация второго образца составляет от 10 до 70.
В другом варианте осуществления концентрация второго образца составляет от 15 до 60.
В еще одном варианте осуществления концентрация составляет от 20 до 45.
В одном варианте осуществления в качестве второго образца могут использоваться указанные выше коммерческие препараты. Таким образом, вторым образцом может быть Xeomin®, Botox®, Dysport®, Myobloc® или PurTox®.
В одном варианте осуществления используемые единицы являются единицами Xeomin®.
В одном варианте осуществления указанные коммерческие препараты разводят или концентрируют до заданных концентраций ботулинического нейротоксина, содержащегося в них, и измеряют указанный второй эффект в зависимости от различных концентраций указанного клостридиального нейротоксина в указанном втором образце. Строят график зависимости указанного измеренного эффекта от концентрации ботулинического токсина, регистрируя, таким образом, калибровочную кривую. Посредством указанного второго набора данных или, соответственно, указанной калибровочной кривой, определяют неизвестную концентрацию ботулинического нейротоксина в первом примере.
В одном варианте осуществления было обнаружено, что в том случае, если в качестве второго образца используется Xeomin®, наиболее достоверные результаты получают, если второй эффект определят по меньшей мере при одной концентрации от 10 до 70. В другом варианте осуществления концентрация составляет от 15 до 60. В еще одном варианте осуществления концентрация составляет от 25 до 45.
В одном варианте осуществления было обнаружено, что в том случае, если в качестве второго образца используется Botox®, достоверные результаты получают, если второй эффект определяют по меньшей мере при одной концентрации от 10 до 70. В другом варианте осуществления концентрация составляет от 15 до 60. В еще одном варианте осуществления концентрация составляет от 25 до 45.
Если второй образец используется для определения калибровочной кривой согласно этапу (ii), и при этом второй образец имеет более низкую концентрацию или содержит менее эффективный или активный ботулинический нейротоксин, чем Xeomin® или Botox®, более высокие концентрации нейротоксина, то есть более высокие значения LD50 единиц/мл требуются для получения второго эффекта такой силы, которая сопоставима с силой эффекта, вызываемого Xeomin® или Botox®.
В варианте осуществления, в котором второй образец имеет более низкую концентрацию или активность ботулинического нейротоксина, чем Xeomin® или Botox®, второй эффект определяют по меньшей мере при одной концентрации от 20 до 400 или от 100 до 800.
В одном варианте осуществления, где вторым образцом является Dysport®, второй эффект определяют по меньшей мере при одной концентрации от 20 до 400 или от 25 до 300, или от 30 до 250.
В другом варианте осуществления, где вторым образцом является Myobloc®, второй эффект определяют по меньшей мере при одной концентрации от 100 до 800 или от 150 до 700, или от 200 до 600.
В других вариантах осуществления концентрация может изменяться в пределах от 30 до 600 или от 30 до 400, или от 30 до 200, или от 30 до 100, или от 30 до 80, или от 40 до 500, или от 40 до 400, или от 40 до 300, или от 40 до 200, или от 40 до 100, или от 40 до 90, или от 50 до 300, или от 50 до 200, или от 50 до 100, или от 60 до 100, в зависимости от концентрации эффективности или активности нейротоксина во втором образце по сравнению с Xeomin® или Botox®.
Если эффект, вызванный указанным вторым образцом в указанной мышечной ткани, определяют на основе различных концентраций, выраженных в мышиных LD50 единицах/мл, калибровочная кривая может быть получена, как описано выше.
Например, можно определять указанный эффект, вызванный в этапах, десяти LD50 единиц/мл или пяти LD50 единиц/мл в пределах указанных диапазонов концентраций.
Указанная неизвестная концентрация первого образца может быть определена путем определения концентрации на основе калибровочной кривой, при которой указанный первый и указанный второй эффект имеют одно и то же значение, например, одинаковое время до наступления паралича, и приравнивания указанной концентрации к указанной неизвестной концентрации согласно этапу (l).
Предварительным условием для указанного определения является то, что неизвестная концентрация клостридиального токсина в первом образце вызывает в мышечной ткани эффект, который можно определить количественно с помощью указанной калибровочной кривой. Специалист, квалифицированный в данной области, осведомлен, что может потребоваться развести или сконцентрировать первый образец, имеющий неизвестную концентрацию, один или несколько раз в случае необходимости, чтобы получить диапазон концентрации, в котором становится возможным сравнение со вторым образцом, то есть получить идентичный первый и второй эффекты. Затем, зная фактор разведения или концентрации, может быть выполнено вычисление концентрации нейротоксина, присутствующего изначально в неразведенном или неконцентрированном образце.
В одном варианте осуществления способ проводят так, что электрическую стимуляцию в этапе (b) или (g), или, соответственно (i) и (iii), проводят при напряжении, по меньшей мере, равном сверхмаксимальному напряжению, с применением способов предшествующего уровня техники, как описано выше.
В одном варианте осуществления мышечная ткань является диафрагмой мыши.
Таким образом, способ определения неизвестной концентрации клостридиального нейротоксина в первом образце по отношению к известной концентрации клостридиального нейротоксина во втором образце включает:
(i) электрическую стимуляцию гемидиафрагмы мыши в присутствии указанного второго образца и выбор второго эффекта, вызванного указанным вторым образцом в указанной гемидиафрагме мыши,
(ii) измерение указанного второго эффекта в (i) при различных концентрациях указанного клостридиального нейротоксина в указанном втором образце и построение графика зависимости указанного измеренного второго эффекта от концентрации, с регистрацией, таким образом, калибровочной кривой,
(iii) электрическую стимуляцию указанной мышечной ткани в присутствии указанного первого образца,
(iv) измерение первого эффекта, вызванного указанным первым образцом в указанной мышечной ткани,
(v) определение концентрации, при которой указанный первый и указанный второй эффекты идентичны, и
(vi) приравнивание указанной концентрации в (v) к указанной неизвестной концентрации,
где указанный второй эффект определяют по меньшей мере при одной концентрации, выраженной в мышиных LD50 единицах/мл, равной по меньшей мере 10.
В одном варианте осуществления указанная мышечная ткань является диафрагмальным нервом-гемидиафрагмой крысы или мыши, вызванный эффект является временем до наступления паралича, и указанный клостридиальный ботулинический токсин является ботулиническим нейротоксином серотипа A.
В определенном варианте осуществления изобретения способ охватывает способ определения неизвестной концентрации ботулинического нейротоксина серотипа A в первом образце по отношению к известной концентрации ботулинического токсина во втором образце, где указанный способ включает:
(i) электрическую стимуляцию гемидиафрагмы мыши в присутствии указанного второго образца и выбор второго времени до наступления паралича, вызванного указанным вторым образцом в указанной гемидиафрагме мыши,
(ii) измерение указанного второго эффекта в (i) при различных концентрациях указанного клостридиального нейротоксина в указанном втором образце и построение графика зависимости указанного измеренного второго эффекта от концентрации, с регистрацией, таким образом, калибровочной кривой,
(iii) электрическую стимуляцию указанной мышечной ткани в присутствии указанного первого образца,
(iv) измерение первого эффекта, вызванного указанным первым образцом в указанной мышечной ткани,
(v) определение концентрации, при которой указанный первый и указанный второй эффекты идентичны, и
(vi) приравнивание указанной концентрации в (v) к указанной неизвестной концентрации,
где указанное второе время до наступления паралича определяют по меньшей мере при одной концентрации, выраженной в мышиных LD50 единицах/мл, равной от 10 до 70 или от 15 до 60, или от 20 до 45, и где вторым образцом является Xeomin® или Botox®.
В одном варианте осуществления указанная концентрация находится в диапазоне от 16,6 мышиных LD50 единиц/мл до 56,3 мышиных LD50 единиц/мл.
В другом варианте осуществления указанная концентрация находится в диапазоне от 20 мышиных LD50 единиц/мл до 55 мышиных LD50 единиц/мл.
В еще одном варианте осуществления указанная концентрация находится в диапазоне от 25 мышиных LD50 единиц/мл до 50 мышиных LD50 единиц/мл.
В другом определенном варианте осуществления изобретения способ охватывает способ определения неизвестной концентрации ботулинического токсина серотипа А в первом образце по отношению к известной концентрации ботулинического токсина во втором образце, где указанный способ включает:
(i) электрическую стимуляцию гемидиафрагмы мыши в присутствии указанного второго образца и выбор второго времени до наступления паралича, вызванного указанным вторым образцом в указанной гемидиафрагме мыши,
(ii) измерение указанного второго эффекта в (i) при различных концентрациях указанного клостридиального нейротоксина в указанном втором образце и построение графика зависимости указанного измеренного второго эффекта от концентрации, с регистрацией, таким образом, калибровочной кривой,
(iii) электрическую стимуляцию указанной мышечной ткани в присутствии указанного первого образца,
(iv) измерение первого эффекта, вызванного указанным первым образцом в указанной мышечной ткани,
(v) определение концентрации, при которой указанный первый и указанный второй эффекты идентичны, и
(vi) приравнивание указанной концентрации в (v) к указанной неизвестной концентрации,
где указанное второе время до наступления паралича определяют по меньшей мере при одной концентрации, выраженной в мышиных LD50 единицах/мл, равной от 20 до 400 или от 25 до 300, или от 30 до 250, и где вторым образцом является Dysport®.
В другом определенном варианте осуществления изобретения способ охватывает способ определения неизвестной концентрации ботулинического нейротоксина серотипа B в первом образце по отношению к известной концентрации ботулинического B токсина или ботулинического A токсина во втором образце, где указанный способ включает:
(i) электрическую стимуляцию гемидиафрагмы мыши в присутствии указанного второго образца и выбор второго времени до наступления паралича, вызванного указанным вторым образцом в указанной гемидиафрагме мыши,
(ii) измерение указанного второго эффекта в (i) при различных концентрациях указанного клостридиального нейротоксина в указанном втором образце и построение графика зависимости указанного измеренного второго эффекта от концентрации, с регистрацией, таким образом, калибровочной кривой,
(iii) электрическую стимуляцию указанной мышечной ткани в присутствии указанного первого образца,
(iv) измерение первого эффекта, вызванного указанным первым образцом в указанной мышечной ткани,
(v) определение концентрации, при которой указанный первый и указанный второй эффекты идентичны, и
(vi) приравнивание указанной концентрации в (v) к указанной неизвестной концентрации,
где указанное второе время до наступления паралича определяют по меньшей мере при одной концентрации, выраженной в мышиных LD50 единицах/мл, равной от 100 до 800 или от 150 до 700, или от 200 до 600, и где вторым образцом является Myobloc®.
Впрочем, анализ для определения концентрации нейротоксина или активности нейротоксина может быть основан не только на ткани, как описано выше, но также и на культурах клеток.
Согласно другому аспекту изобретение относится к анализу для определения активности клостридиального нейротоксина, основанному на культурах клеток, для определения неизвестной концентрации клостридиального нейротоксина в образце по отношению к известной концентрации клостридиального токсина в стандартном образце. В способе используют количественный анализ белков, таких как SNAP25, которые образуются при расщеплении комплекса SNARE при контакте культур клеток, чувствительных к клостридиальному ботулиническому нейротоксину, с указанным нейротоксином. Способ также может применяться для оценки относительной активности клостридиального нейротоксина в пробе при сравнении с референсным стандартом.
В работе Pellet, S., et al., Comparison of the primary rat spinal cord cell (RSC) assay and the mouse bioassay for botulinum neurotoxin type A determination, Journal of Pharmacological and Toxicological Methods (2010), doi: 10.1016/j.vascn.2010.01.003, предложен клеточный анализ для определения активности очищенного ботулинического нейротоксина серотипа A в качестве альтернативы биоанализу на мышах.
В статье Keller, J.E., et al., Persistence of botulinum neurotoxin action in cultured spinal cord cells, FEBS Letters 456 (1999) 137-142, раскрыт механизм, лежащий в основе различий в стойкости активности ботулинического нейротоксина (BoNT/A) и ботулинического нейротоксина E (BoNT/E).
Другая цель изобретения состоит в улучшении указанных способов предшествующего уровня техники и в разработке надежного и точного способа определения активности или, соответственно, концентрации клостридиального нейротоксина в образце, вызывающего указанную активность, который мог бы применяться в целях контроля. Такой улучшенный способ также мог бы служить для удовлетворения высокой потребности в безопасном и эффективном введении.
Указанная другая цель достигается с помощью способа, в котором культуру клеток подвергают воздействию или контакту с образцом, включающим клостридиальный нейротоксин, где до измерения эффекта, который вызван в клетках клеточной культуры указанным клостридиальный нейротоксином, указанный образец заменяют водной средой, такой как буфер или такой как нейтральный буфер, который не содержит клостридиального нейротоксина или указанного клостридиального нейротоксина, и указанную клеточную культуру подвергают воздействию указанной водной среды в течение определенного периода, например, периода продолжительностью более 1 часа или более 2 ч, или более 3 ч, или более 4 ч, или более 5 ч. До измерения клеточная культура может контактировать с указанной водной средой в течение периода продолжительностью до 100 ч или даже больше.
Неожиданно было обнаружено, что измерение указанного эффекта в отсутствии указанного образца и последующий контакт с водной средой, которая не содержит клостридиального ботулинического нейротоксина, после контакта указанной клеточной культуры с образцом, включающим нейротоксин, смещает соответствующие кривые зависимости эффекта от дозы так, что чувствительность способа согласно изобретению значительно возрастает. Чувствительность особенно повышается при низких концентрациях, выраженных в мышиных LD50 единицах/мл указанного клостридиального нейротоксина в указанном образце.
Таким образом, в первом аспекте изобретение относится к способу измерения эффекта, вызванного в клеточной культуре клостридиальным нейротоксином, включающему:
(a) контакт клеточной культуры с образцом, включающим указанный клостридиальный нейротоксин;
(c) измерение указанного эффекта, вызванного в указанной клеточной культуре указанным клостридиальным нейротоксином;
где этап (c) выполняют в отсутствии указанного образца; и
до указанного измерения в этапе (c) и после контакта в этапе (a) указанную клеточную культуру подвергают контакту в течение от 0,5 до 100 ч с водной средой, которая не содержит клостридиального токсина.
Во втором аспекте изобретение относится к способу определения неизвестной концентрации клостридиального нейротоксина в первом образце по отношению к известной концентрации клостридиального нейротоксина во втором образце, включающему:
(a) контакт клеточной культуры с указанным вторым образцом;
(c) измерение второго эффекта, вызванного в указанной клеточной культуре указанным нейротоксином;
(d) повтор этапов (a)-(c) при различных концентрациях указанного клостридиального нейротоксина;
(e) регистрацию указанного измеренного второго эффекта этапа (d) в зависимости от концентрации, с регистрацией, таким образом, второго набора данных;
(f) контакт клеточной культуры с указанным первым образцом;
(h) измерение первого эффекта, вызванного в указанной клеточной культуре;
(k) определение концентрации, при которой указанный первый и указанный второй эффекты идентичны;
(l) приравнивание указанной концентрации в (k) к указанной неизвестной концентрации,
где этап (c) и/или этап (h) выполняют в отсутствии указанного второго и/или первого образца; и
до указанного измерения в этапе (c) или этапе (h), или этапе (c) и этапе (h), и после контакта в этапе (a) или этапе (f), или этапе (a) и этапе (f), указанную клеточную культуру подвергают контакту в течение от 0,5 до 100 ч с водной средой, которая не содержит клостридиального токсина.
В третьем аспекте изобретение относится к способу определения относительной активности клостридиального нейротоксина в первом образце по отношению к активности клостридиального нейротоксина во втором образце, включающему:
(a) контакт клеточной культуры с указанным вторым образцом;
(c) измерение второго эффекта, вызванного в указанной клеточной культуре указанным нейротоксином;
(d) повтор этапов (a)-(c) при различных концентрациях указанного клостридиального нейротоксина;
(e) регистрацию указанного измеренного второго эффекта этапа (d) в зависимости от концентрации, с регистрацией, таким образом, второго набора данных;
(f) контакт клеточной культуры с указанным первым образцом;
(h) измерение первого эффекта, вызванного в указанной клеточной культуре;
(i) повтор этапов (f)-(h) при различных концентрациях указанного клостридиального нейротоксина;
(j) регистрацию указанного измеренного первого эффекта этапа (i) в зависимости от концентрации, с регистрацией, таким образом, первого набора данных;
где этап (c) и/или этап (h) выполняют в отсутствии указанного второго и/или первого образца; и
до указанного измерения в этапе (c) или этапе (h), или этапе (c) и этапе (h), и после контакта в этапе (a) или этапе (f), или этапе (a) и этапе (f), указанную клеточную культуру подвергают контакту в течение от 0,5 до 100 ч с водной средой, которая не содержит клостридиального токсина.
В одном варианте осуществления способ дополнительно включает этапы (m) и (n):
(m) выбор указанных различных концентраций из диапазона концентраций, который лучше всего соответствует первому и второму набору данных;
(n) определение указанного наилучшего соответствия с помощью статистического критерия, включающего следующие подэтапы (α) - (δ):
(α) представление диапазона значений второго набора данных, полученного в этапе (e), в виде эмпирической кривой;
(β) представление диапазона значений первого набора данных, полученного в этапе (j), в виде эмпирической кривой;
(γ) линеаризация эмпирических кривых, соответственно;
(δ) параллелизация линеаризованных эмпирических кривых.
В одном варианте осуществления статистическим критерием является F-критерий или χ2-критерий, или t-критерий.
В одном варианте осуществления вероятность ложного отклонения для каждого подэтапа (a)-(δ) составляет ≤5 (выражена в %).
В одном варианте осуществления способ дополнительно включает этап (ε):
(ε) вычисление на основе смещения линеаризованных и параллелизованных кривых по отношению друг к другу относительной активности первого образца по отношению ко второму образцу.
В одном варианте осуществления указанный эффект (включая первый и/или второй эффект) является расщеплением белка из комплекса SNARE.
В одном варианте осуществления белком является SNAP25.
В одном варианте осуществления до указанного измерения в этапе (c) или этапе (h), или этапе (c) и этапе (h), указанную клеточную культуру подвергают контакту с указанным клостридиальным токсином в течение от 5 до 45 ч или от 15 до 40 ч, или от 25 до 35 ч.
В одном варианте осуществления до указанного измерения в этапе (c) или этапе (h), или этапе (c) и этапе (h), и после контакта в этапе (a) или этапе (f), или этапе (a) и этапе (f), указанную клеточную культуру подвергают контакту в течение от 0,5 до 100 ч или от 1 до 95 ч, или от 6 до 90 ч, или от 7 до 80 ч, или от 8 до 70 ч, или от 9 до 60 ч, или от 10 до 50 ч, или от 11 до 50 ч, или от 12 до 40 ч, или от 15 до 40 ч, с водной средой, которая не содержит клостридиальный токсин.
В одном варианте осуществления до указанного измерения в этапе (c) или этапе (h), или этапе (c) и этапе (h), и после контакта в этапе (a) или этапе (f), или этапе (a) и этапе (f), клеточную культуру подвергают лизису.
В другом варианте осуществления клеточную культуру подвергают лизису до контакта в этапе (a) или этапе (f), или этапе (a) и этапе (f).
В одном варианте осуществления указанное измерение проводят с помощью Вестерн-блот анализа или ELISA.
В одном варианте осуществления указанная клеточная культура выбрана из клеточных культур линий нервных клеток или первичных нервных клеток.
В одном варианте осуществления указанную регистрацию указанного измеренного второго эффекта выполняют путем построения графика зависимости указанного второго эффекта от концентрации, а указанную регистрацию указанного второго набора данных выполняют путем регистрации калибровочной кривой.
В одном варианте осуществления указанный второй эффект определяют по меньшей мере при одной концентрации, выраженной в мышиных LD50 единицах/мл, равной по меньшей мере 10.
В другом варианте осуществления указанная концентрация составляет от 10 до 1000 или от 10 до 70, или от 15 до 60, или от 20 до 45.
В другом варианте осуществления указанная концентрация составляет от 20 до 400 или от 100 до 800.
В одном варианте осуществления указанные единицы LD50 мыши являются единицами Xeomin®.
В одном варианте осуществления указанный клостридиальный нейротоксин является ботулиническим токсином.
В другом варианте осуществления серотип указанного ботулинического нейротоксина выбран из группы, состоящей из A, B, C, D, E, F и G; или он является химически или генетически модифицированным производным ботулинического нейротоксина серотипа, выбранного из группы, состоящей из A, B, C, D, E, F и G.
В другом варианте осуществления указанный нейротоксин имеет серотип A или C, или E.
В одном варианте осуществления нейротоксин не содержит комплексообразующих белков.
В другом аспекте изобретение относится к компьютерному программному продукту, включающему компьютерную программу, включающую программные средства для осуществления способа согласно изобретению.
В другом аспекте изобретение относится к применению клеточной культуры в любом из способов изобретения.
В другом аспекте изобретение относится к применению способа изобретения согласно любому из первого, второго и третьего аспекта изобретения для контроля активности образца, включающего клостридиальный нейротоксин.
В одном варианте осуществления образец является хранящимся образцом.
В одном варианте осуществления образец является лиофилизированным образцом или восстановленным образцом.
В другом аспекте изобретение относится к применению способа согласно первому аспекту изобретения для определения неизвестной концентрации клостридиального нейротоксина в первом образце по отношению к известной концентрации клостридиального нейротоксина во втором образце; или для определения относительной активности клостридиального нейротоксина в первом образце по отношению к активности клостридиального нейротоксина во втором образце, например, при контроле качества в ходе процесса производства клостридиального нейротоксина.
По сравнению со способами, известными из предшествующего уровня техники, в которых используют клеточные культуры, способы согласно изобретению обеспечивают значительное повышение точности количественного определения биологической активности клостридиального ботулинического нейротоксина. Способы согласно изобретению удовлетворяют нормативным требованиям.
Было установлено, что нестабильность, наблюдаемая в отношении способов количественного анализа предшествующего уровня техники, в которых используют клеточные культуры, может быть существенно снижена до незначительной степени, посредством применения способов, раскрытых в настоящей заявке.
В одном варианте осуществления изобретение относится к способу измерения эффекта, вызванного в клеточной культуре клостридиальным нейротоксином, включающему:
(a) контакт клеточной культуры с образцом, включающим указанный клостридиальный нейротоксин;
(c) измерение эффекта, вызванного в указанной клеточной культуре указанным нейротоксином;
где этап (c) выполняют в отсутствии указанного образца.
Термин "контакт клеточной культуры с указанным образцом (который может быть первым или вторым образцом согласно способам в соответствии с другими аспектами изобретения)" означает, что, по меньшей мере, часть указанного нейротоксина указанного образца получена указанной клеточной культурой в течение указанного контакта, то есть, по меньшей мере, часть нейротоксина, содержащегося в указанном образце, была связана соответствующими рецепторами, содержащимися в указанных клетках клеточных культур.
Термин "отсутствие образца" означает, что измерение эффекта в этапе (c) выполняют в среде, как правило, в подходящем буфере, который содержит 10% по весу или меньше, например, вообще не содержит, образец или, другими словами, нейротоксин образца.
В одном варианте осуществления указанную клеточную культуру не подвергают непрерывному воздействию (контакту с) образца (который может быть первым или вторым образцом согласно способам в соответствии с другими аспектами изобретения), включающего клостридиальный нейротоксин, а только временному.
Это означает, что после установленного периода экспозиции указанной клеточной культуры нейротоксину, то есть контакта в этапе (a), с целью получения реакции указанной клеточной культуры на воздействие, проводят соответствующее измерение эффекта (первого или, соответственно, второго эффекта согласно способам в соответствии с другими аспектами изобретения), в отсутствии указанного образца (который может быть указанным первым или указанным вторым образцом согласно способам в соответствии с другими аспектами изобретения), с применением способов, как описано ниже.
В одном варианте осуществления до указанного измерения указанную клеточную культуру, например, удаляют из камеры, содержащей указанный образец, и переносят в камеру, содержащую компоненты без нейротоксина, как описано ниже. Затем проводят измерение величины эффекта (который может быть первым или вторым эффектом, когда образец является первым или вторым образцом), то есть эффект определяют количественно. Это означает, что реакцию на указанную стимуляцию производят в клеточной культуре, содержащей полученный нейротоксин.
В другом варианте осуществления содержащие нейротоксин компоненты, то есть образец (который может быть первым или вторым образцом), заменяют компонентами, не содержащими нейротоксин. В одном варианте осуществления образец удаляют из клеточной культуры, например, с помощью фильтрования, и заменяют компонентами, не содержащими нейротоксин, как описано ниже. После замены проводят измерение величины эффекта (который может быть первым или вторым эффектом, когда образец является первым или вторым образцом).
Термин "клостридиальный нейротоксин (или клостридиальный токсин)" охватывает комплексы клостридиального токсина, а также нейротоксин высокой чистоты, то есть препарат нейротоксина, который не содержит каких-либо других клостридиальных белков.
В одном варианте осуществления указанный клостридиальный нейротоксин является ботулиническим нейротоксином.
В другом варианте осуществления указанный ботулинический нейротоксин является серотипом, выбранным из группы, состоящей из A, B, C, D, E, F и G.
Термин "комплекс ботулинического токсина" охватывает ботулинический токсин, связанный, по меньшей мере, с другим нетоксичным белком. Как очевидно, термин комплекс ботулинического токсина, используемый в настоящей заявке, включает 450 кДа и 900 кДа комплекс ботулинического токсина, который может быть получен, например, из культур C. botulinum. Такие препараты на основе комплекса ботулинического токсина типа A выпускаются, например, Ipsen Ltd. (Dysport®) или Allergan Inc. (Botox®). Другой препарат на основе ботулинического комплекса типа B выпускает Solstice Neurosciences, Inc. (Myobloc®). Нейротоксин типа A высокой чистоты, не содержащий других клостридиальных белков, выпускает Merz Pharmaceuticals (Xeomin®). Это препарат выбора для улучшения при нескольких формах фокальной дистонии.
В другом варианте осуществления указанный ботулинический нейротоксин является химически или генетически модифицированным производным серотипа, выбранного из группы, состоящей из A, B, C, D, E, F и G.
Химически модифицированное производное указанного нейротоксина может быть производным, которое модифицировано пируватированием, фосфорилированием, сульфатированием, липидированием и/или гликозилированием.
Генетически модифицированное производное указанного нейротоксина является производным, которое было модифицировано делецией, присоединением или заменой одной или более аминокислот, содержавшихся в белках указанного серотипа.
Такой модифицированный токсин предпочтительно биологически активен.
Биологически активный токсин является токсином, способным к поглощению клеткой и вызывающим при этом протеолитическое расщепление одного или более полипептидов, таких как SNAP25, входящий в комплекс SNARE. Если концентрацию протеолитически расщепляемого полипептида, такого как SNAP25, измерять и определять количественно, то можно вычислить концентрацию или активность используемого токсина.
В одном варианте осуществления согласно любому из способов в соответствии с тремя аспектами согласно изобретению, до указанного измерения в этапе (c) или этапе (h), или этапе (c) и этапе (h), указанную клеточную культуру подвергают воздействию (контакту с) указанного клостридиального токсина в течение от 5,0 до 45 ч или от 15 до 40 ч, или от 25 до 35 ч.
В другом варианте осуществления до указанного измерения в этапе (c) или этапе (h), или этапе (c) и этапе (h), и после контакта в этапе (a) или этапе (f), или этапе (a) и этапе (f), указанную клеточную культуру подвергают контакту в течение от 0,5 до 100 ч или от 1 до 95 ч, или от 6 до 90 ч, или от 7 до 80 ч, или от 8 до 70 ч, или от 9 до 60 ч, или от 10 до 50 ч, или от 11 до 50 ч, или от 12 до 40 ч, или от 15 до 40 ч, с водной средой, которая не содержит клостридиального токсина.
Термин "водная среда" определяет жидкость или текучую среду, включающую воду.
В одном варианте осуществления указанная водная среда является буфером.
В одном варианте осуществления указанный буфер является нейтральным буфером. Термин "нейтральный" охватывает диапазон pH от 6 до 8 или от 6,5 до 7,5, или приблизительно 7.
В одном варианте осуществления указанный буфер является фосфатным буфером.
В одном варианте осуществления температура указанной водной среды составляет от 20 до 40°C или от 25 до 40°C, или от 30 до 40°C. В одном варианте осуществления температура составляет приблизительно 37°C.
В одном варианте осуществления, до указанного измерения в этапе (c) или этапе (h), или этапе (c) и этапе (h), и после контакта в этапе (a) или этапе (f), или этапе (a) и этапе (f), клеточную культуру подвергают лизису.
Термин "лизис" относится к разрушению клетки, например, вирусными, ферментативными или осмотическими механизмами, которые нарушают ее целостность. Жидкость, содержащую компоненты лизированных клеток, называют "лизатом". Например, лизис может использоваться в Вестерн и Саузерн-блоттинге для анализа состава определенных белков, липидов и нуклеиновых кислот, отдельных или в виде комплексов. Для лизиса могут использоваться стандартные лизисные буферы.
В другом варианте осуществления клеточную культуру подвергают лизису до контакта в этапе (a) или этапе (f), или этапе (a) и этапе (f).
Неожиданно было обнаружено, что измерение указанного эффекта в отсутствии указанного образца и последующий контакт с водной средой, которая не содержит клостридиального ботулинического нейротоксина, после контакта или воздействия на указанную клеточную культуру нейротоксина, смещает соответствующие кривые зависимости эффекта от дозы так, что чувствительность способа согласно изобретению значительно возрастает. Чувствительность особенно повышается при низких концентрациях, выраженных в мышиных LD50 единицах/мл указанного клостридиального нейротоксина в указанном образце.
Например, если в качестве эффекта или, соответственно, реакции, определяют расщепление белка, такого как SNAP25 из комплекса SNARE, способ приводит к выгодному повышению чувствительности способа, который в особенности применяется в области более низких концентраций нейротоксина. Если активность определяют при более низкой концентрации, нейротоксины, как правило, могут проявлять наибольшее различие, тогда как при довольно высоких концентрациях активности сходятся друг к другу.
Такое увеличение чувствительности обеспечивает более точный и более достоверный анализ соответствующих кривых зависимости эффекта от дозы. Это в свою очередь позволяет значительно уменьшить количество используемых лабораторных животных, таких как мыши, которых в ином случае нужно будет умертвить для осуществления любого из способов согласно изобретению. Таким образом, данный вариант осуществления изобретения прогрессивен не только в рамках технических аспектов, но также и в рамках этических аспектов.
Термин "чувствительность" используется в настоящем описании в стандартном значении, в каком он обычно используется в физиологии, то есть чувствительность определяет способность мышечной ткани реагировать на внешние стимулы. В данном случае внешние стимулы производятся при контакте мышечной ткани с клостридиальным нейротоксином. В рамках изобретения находится выбор некоторого диапазона концентраций, например, диапазона концентраций при относительно низкой концентрации клостридиального нейротоксина, где указанная чувствительность повышается, то есть реакцию можно определить, что в иных условиях сделать либо невозможно, либо, соответственно, можно определить только в пределах недопустимого отклонения.
В другом варианте осуществления изобретение относится к способу определения неизвестной концентрации клостридиального нейротоксина в первом образце по отношению к известной концентрации клостридиального нейротоксина во втором образце, включающему:
(a) контакт клеточной культуры с указанным вторым образцом;
(c) измерение второго эффекта, вызванного в указанной клеточной культуре указанным нейротоксином;
(d) повтор этапов (a)-(c) при различных концентрациях указанного клостридиального нейротоксина;
(e) регистрацию указанного измеренного второго эффекта этапа (d) в зависимости от концентрации, с регистрацией, таким образом, второго набора данных;
(f) контакт клеточной культуры с указанным первым образцом;
(h) измерение первого эффекта, вызванного в указанной клеточной культуре;
(k) определение концентрации, при которой указанный первый и указанный второй эффекты идентичны;
(l) приравнивание указанной концентрации в (k) к указанной неизвестной концентрации;
где этап (c) и/или этап (h) выполняют в отсутствии указанного второго и/или первого образца.
Таким образом, в одном варианте осуществления определение второго и/или первого эффекта выполняют в отсутствии указанного второго и/или первого образца. Это означает, что после этапа (a) и/или после этапа (f) указанную клеточную культуру отделяют от второго и/или первого образца или, соответственно, второй и/или первый образец отделяют от клеточной культуры, как описано выше.
Термин "определение концентрации, при которой указанный первый и указанный второй эффекты идентичны" (этапы (k) и (l)) означает, что указанный первый и второй эффекты качественно и количественно идентичны, то есть вызванный эффект является, например, расщеплением белка или полипептида, такого как SNAP25 из комплекса SNARE, и что указанные эффекты имеют одно и то же измеренное значение.
В одном варианте осуществления для получения результатов, которые могут быть с достоверностью сравнены, периоды экспозиции клеточной культуры нейротоксину, содержащемуся во втором или, соответственно, первом образце, должны быть сопоставимыми.
В одном варианте осуществления указанные периоды экспозиции идентичны.
В одном варианте осуществления указанную регистрацию указанного измеренного второго эффекта в этапе (e) проводят путем измерения указанного второго эффекта при различных концентрациях указанного клостридиального нейротоксина в указанном втором образце и построения графика зависимости указанного измеренного второго эффекта от концентрации, с регистрацией, таким образом, калибровочной кривой.
Если эффект, вызванный указанным вторым образцом в указанной клеточной культуре, определяют на основе различных концентраций, выраженных в мышиных LD50 единицах/мл, может быть получена калибровочная кривая, как описано выше.
Например, можно определить указанный эффект, вызванный в этапах, десяти LD50 единиц/мл или пяти LD50 единиц/мл в пределах выбранного диапазона концентраций.
Таким образом, посредством второго набора данных, зарегистрированного в этапе (e), строят калибровочную кривую, с помощью которой определяют неизвестную концентрацию указанного клостридиального нейротоксина в указанном первом образце согласно этапам (k) и последующему этапу (l).
В одном варианте осуществления строят калибровочную кривую и указанные этапы определения и приравнивания согласно этапам (k)-(l) проводят с помощью графического анализа.
Указанная неизвестная концентрация первого образца может быть определена путем определения концентрации из калибровочной кривой, при которой указанный первый и указанный второй эффект имеют одинаковое значение, например, одинаковая концентрация образовавшегося SNAP25, и приравнивания указанной концентрации к указанной неизвестной концентрации согласно этапу (l).
Предварительным условием для указанного определения является то, что неизвестная концентрация клостридиального токсина в первом образце производит эффект в отношении клеточной культуры, который может быть определен количественно с помощью указанной калибровочной кривой. Специалист, квалифицированный в данной области, осведомлен, что может потребовать развести или сконцентрировать первый образец, имеющий неизвестную концентрацию, один или несколько раз в случае необходимости, чтобы получить диапазон концентрации, в котором возможно выполнить сравнение со вторым образцом, то есть достигать идентичных первого и второго эффектов. Затем, зная фактор разведения или концентрации, можно вычислить концентрацию нейротоксина, первоначально присутствующего в неразведенном или неконцентрированном первом образце.
В другом варианте осуществления указанную идентификацию и приравнивание выполняют не с помощью измерения по одной точке только при одной концентрации в этапе (h) и последующих этапах (k) и (l), а с помощью измерения при различных концентрациях. Это особенно важно с учетом нормативных требований.
Согласно другому варианту осуществления изобретения желательно оптимизировать диапазон концентраций, в котором возможно достоверное сравнение указанного второго и первого образца. Это относится не только к возможности сравнения биологической эффективности известных на настоящий момент и коммерческих препаратов клостридиальных нейротоксинов, но также и к препаратам, которые могли бы быть разработаны в будущем или уже находятся в процессе разработки.
В одном варианте осуществления для оптимизации диапазона концентраций, выраженных в мышиных LD50 единицах/мл, в котором возможно достоверное сравнение указанного второго и первого образца, желательно, во-первых, определить стандартное отклонение калибровочной кривой, зарегистрированной в этапе (e) и/или в этапе (h). При использовании подходящего ступенчатого регрессионного анализа можно создать регрессионную модель для предсказания активности неизвестного образца токсина на основе кривой зависимости эффекта от дозы.
С помощью такого способа можно идентифицировать диапазон концентраций для первого и второго образца, представляющего две различные совокупности данных, в которых корреляция между соответствующими кривыми зависимости эффекта от дозы достигает максимума, то есть, устанавливается наилучшее подобие.
В одном варианте осуществления критерий может быть дополнительно скорректирован путем представления диапазона значений соответствующих наборов данных первого и второго образца эмпирическими кривыми согласно заданной регрессионной модели, соответственно, а также линеаризации и параллелизации указанных эмпирических кривых в пределах установленного доверительного интервала.
Таким образом, согласно третьему аспекту изобретение относится к способу определения относительной активности клостридиального нейротоксина в первом образце по отношению к активности клостридиального нейротоксина во втором образце, включающему:
(a) контакт клеточной культуры с указанным вторым образцом;
(c) измерение второго эффекта, вызванного в указанной клеточной культуре указанным нейротоксином;
(d) повтор этапов (a)-(c) при различных концентрациях указанного клостридиального нейротоксина;
(e) регистрацию указанного измеренного второго эффекта этапа (d) в зависимости от концентрации, с регистрацией, таким образом, второго набора данных;
(f) контакт клеточной культуры с указанным первым образцом;
(h) измерение первого эффекта, вызванного в указанной клеточной культуре, полученной в этапе (g);
(i) повтор этапов (f)-(h) при различных концентрациях указанного клостридиального нейротоксина;
(j) регистрацию указанного измеренного первого эффекта этапа (i) в зависимости от концентрации, с регистрацией, таким образом, первого набора данных;
где этап (c) и/или этап (h) выполняют в отсутствии указанного второго и/или первого образца.
В одном варианте осуществления способ дополнительно включает этапы (m) и (n):
(m) выбор указанных различных концентраций из диапазона концентраций, который лучше всего соответствует первому и второму набору данных;
(n) определение указанного наилучшего соответствия с помощью статистического теста, включающего следующие подэтапы (a) - (δ):
(a) представление диапазона значений второго набора данных, полученного в этапе (e), в виде эмпирической кривой;
(β) представление диапазона значений первого набора данных, полученного в этапе (j), в виде эмпирической кривой;
(γ) линеаризация эмпирических кривых, соответственно;
(δ) параллелизация линеаризованных эмпирических кривых.
В одном варианте осуществления определение второго и/или первого эффекта выполняют в отсутствии указанного второго и/или первого образца.
В другом варианте осуществления измерение эффекта выполняют в отсутствии указанного второго и/или первого образца. Это означает, что после этапа (a) и/или после этапа (f) указанную клеточную культуру отделяют от второго и/или первого образца, как описано выше, или второй и/или первый образец отделяют от клеточной культуры.
Статистические критерии, подходящие для выполнения вышеуказанной последовательности, хорошо известны, например, критерии отношения правдоподобия. Примером такого критерия отношения правдоподобия является известный F-критерий. Также может использоваться такой критерий, как χ2-критерий (критерий хи-квадрат или критерий χ2-распределения) или t-критерий. Указанные критерии также известны в уровне техники.
В одном варианте осуществления указанным статистическим критерием является F-критерий.
С помощью указанного критерия можно решить, в пределах установленного доверительного интервала, отличаются ли существенно два случайных образца, взятых из двух различных популяций, с учетом их отклонения. Таким образом, такой критерий служит для проверки различий в пределах двух статистических образцов, в данном случае второго и первого образцов.
В одном варианте осуществления доверительный интервал должен быть широким для получения достоверных результатов, то есть вероятность ложного отклонения должна быть относительно низкой.
В одном варианте осуществления вероятность ложного отклонения составляет ≤5 (выражена в %; (или 0,05)) или, соответственно, доверительный интервал составляет ≥95 (выражен в %; (или 0,95)).
В одном варианте осуществления вероятность ложного отклонения для каждого подэтапа (a)-(δ) составляет ≤5 (выражена в %).
В одном варианте осуществления линеаризацию в этапе (γ) выполняют путем представления соответствующих наборов данных в виде прямой наилучшего соответствия.
В одном варианте осуществления параллелизацию в этапе (δ) выполняют путем определения общего угла наклона прямых наилучшего соответствия.
После этапа (δ), на основе смещения линеаризованных и параллелизованных эмпирических кривых относительно друг друга, определяют относительную активность первого образца по отношению ко второму образцу.
Таким образом, в одном варианте осуществления способ после этапа (δ) дополнительно включает этап (ε):
(ε) вычисление, на основе смещения линеаризованных и параллелизованных эмпирических кривых относительно друг друга, относительной активности первого образца по отношению ко второму образцу.
В одном варианте осуществления термин "относительная активность" означает, что активность первого образца по отношению ко второму образцу определяют при идентичной концентрации или, соответственно, идентичных концентрациях, на основе линеаризованных и параллелизованных эмпирических кривых.
В одном варианте осуществления активность второго образца приравнивают к 100% и относительную активность первого образца выражают в %. Например, для первого образца получают активность, например, 110% или 90% по отношению ко второму образцу. Путем соответствующего разведения первого образца, имеющего 110% активность, до 100%-ой активности, получают эффективную концентрацию клостридиального нейротоксина в первом образце, которая до настоящего времени не была известна, применяя правило пропорции. Единицей измерения теперь становится относительная активность, при этом значение выражают как единицу активности, определенную в отношении активности референсного стандарта (второго образца).
В другом варианте осуществления относительную активность выражают как отношение активности первого и второго образца.
В одном варианте осуществления вышеописанная модель применяется для предсказания логарифмического значения примененной дозы нейротоксина.
В другом варианте осуществления количество стимулируемого эффекта и величину дозы нейротоксина в образце регистрируют в логарифмическом масштабе.
В одном варианте осуществления второй эффект или, соответственно, первый эффект, измеряют по меньшей мере при трех различных концентрациях клостридиального нейротоксина во втором образце или, соответственно, первом образце.
В одном варианте осуществления указанную регистрацию указанных наборов данных или, соответственно, указанную регистрацию калибровочной кривой или, соответственно, калибровочных кривых, выполняют в форме полулогарифмического графика.
В другом варианте осуществления применяют двойной (по обеим осям) логарифмический график.
Способ определения относительной активности описан в Европейской Фармакопее.
В одном варианте осуществления, начиная с концентрации, например, 10 мышиных LD50 единиц/мл, способ определения указанной относительной активности применяется в полном диапазоне набора данных. Затем значения, превышающие 10 мышиных LD50 единиц/мл, используют в качестве исходных точек, например, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 мышиных LD50 единиц/мл. Указанную итерацию продолжают так долго, пока применяемая модель не дает желаемую и необходимую точность.
В одном варианте осуществления, после определения наилучшего соответствия и, таким образом, диапазона концентраций с помощью статистического критерия, любой первый образец с неизвестной концентрацией (относительно эффективной концентрации) клостридиального нейротоксина можно сравнить с известной концентрацией указанного клостридиального нейротоксина во втором образце в пределах указанного диапазона концентраций, идентифицированного согласно способу изобретения.
В одном варианте осуществления указанную регистрацию указанного измеренного второго эффекта выполняют путем построения графика зависимости указанного второго эффекта от концентрации, при этом указанную регистрацию указанного второго набора данных выполняют путем регистрации калибровочной кривой.
Применение относительных оценок активности, а также включение референсного стандарта (второго образца) в анализ, дает более точные и более воспроизводимые оценки, что позволяет сократить количество применяемых животных.
Статистические тесты обычно выполняют с помощью подходящей компьютерной программы и подходящего компьютера.
В одном варианте осуществления статистический тест выполняют с помощью подходящей компьютерной программы, включающей подходящие программные средства для осуществления статистического теста.
Таким образом, в одном варианте осуществления, изобретение относится к компьютерному программному продукту, включающему компьютерную программу, включающую программные средства для осуществления способа согласно изобретению.
В одном варианте осуществления второй образец выбран из коммерческого и зарегистрированного препарата ботулинического токсина. Поскольку такие продукты зарегистрированы и разрешены в качестве лекарственного препарата или, соответственно, лекарственного средства, они включают четко определенное количество или, соответственно, концентрацию ботулинического токсина.
В другом варианте осуществления может использоваться любой препарат ботулинического токсина, который был произведен при стандартных условиях.
В одном варианте осуществления коммерческие препараты, указанные выше, могут использоваться в качестве второго образца. Таким образом, вторым образцом может являться Xeomin®, Botox®, Dysport®, Myobloc® или PurTox®. Указанные препараты отличаются по типу используемого ботулинического токсина, либо по биологической эффективности/активности, например, по концентрации ботулинического нейротоксина или по типу ботулинического токсина, содержащегося в них.
Мышиная единица, выраженная в LD50 мыши, является стандартной единицей для определения концентрации клостридиального нейротоксина, содержащегося в образце. Значение LD50 определяет смертельную дозу, при которой погибает 50% популяции мышей, если указанное количество применено на мышах указанной популяции мышей. Способ для определения указанного значения известен специалисту, квалифицированному в данной области. Такой способ описан в Европейской Фармакопее.
Как известно, единицы LD50 на этикетке продуктов на основе ботулинического нейротоксина могут быть характерны для продукта или, соответственно, для производителя, и могут не быть равноценными вследствие отсутствия стандарта.
В одном варианте осуществления единицы LD50, указанные в настоящей заявке, представляют собой единицы, определеные в описании и этикетке Xeomin®. Например, вторым образцом является Xeomin®. Следовательно, единицы, которые относятся к некоторой активности, являются единицами Xeomin®. Таким образом, система анализа настоящего изобретения может применяться для сравнительной оценки активности любого образца, включающего клостридиальный нейротоксин, по сравнению с Xeomin®. Кроме того, способ позволяет непосредственно сравнивать первые образцы, включающие клостридиальный нейротоксин (в неизвестной концентрации), в единицах Xeomin®.
Xeomin® и Botox® демонстрируют приблизительно сравнимую эффективность или активность. Для получения одинаковой эффективности или активности, как у Xeomin® и Botox®, нужно применить приблизительно 2,5-кратное количество Dysport® или, соответственно, 10-кратное количество Myobloc®.
В одном варианте осуществления указанные коммерческие препараты разводят или концентрируют до заданных концентраций ботулинического нейротоксина, содержащегося в них, и измеряют указанный второй эффект в зависимости от различных концентраций указанного клостридиального нейротоксина в указанном втором образце. Указанный измеренный эффект наносят на график в зависимости от концентрации ботулинического токсина, регистрируя, таким образом, калибровочную кривую. Посредством указанного второго набора данных или, соответственно, указанной калибровочной кривой, может быть определена неизвестная концентрация ботулинического нейротоксина в первом примере.
Было обнаружено, что при концентрации клостридиального нейротоксина в образце (который может быть первым или вторым образцом), выраженной в мышиных LD50 единицах/мл и равной по меньшей мере 10, способы согласно изобретению могут быть полезно применены. Следует отметить, что все концентрации, приведенные в рамках настоящей заявки, указаны в мышиных LD50 единицах/мл.
В одном варианте осуществления образец помимо нейротоксина включает воду. В одном варианте осуществления образец включает раствор или суспензию нейротоксина в воде.
В одном варианте осуществления указанная концентрация нейротоксина в указанном образце составляет по меньшей мере 15.
В другом варианте осуществления указанная концентрация составляет по меньшей мере 20.
В другом варианте осуществления указанная концентрация составляет от 10 до 1000.
В одном варианте осуществления концентрация составляет от 10 до 70.
В другом варианте осуществления концентрация составляет от 15 до 60.
В еще одном варианте осуществления концентрация составляет от 20 до 45.
В одном варианте осуществления вторым образцом является Xeomin®.
В одном варианте осуществления было обнаружено, что в том случае, если в качестве второго образца применяется Xeomin®, наиболее достоверные результаты могут быть получены, если второй эффект определяют по меньшей мере при одной концентрации от 10 до 70. В другом варианте осуществления концентрация составляет от 15 до 60. В еще одном варианте осуществления концентрация составляет от 25 до 45.
В одном варианте осуществления было обнаружено, что в том случае, если в качестве второго образца применяется Botox®, достоверные результаты могут быть получены, если второй эффект определяют по меньшей мере при одной концентрации от 10 до 70. В другом варианте осуществления концентрация составляет от 15 до 60. В еще одном варианте осуществления концентрация составляет от 25 до 45.
Если второй образец используется для определения калибровочной кривой согласно этапу (e), при этом второй образец имеет более низкую концентрацию или содержит менее эффективный или активный ботулинический нейротоксин, чем Xeomin® или Botox®, более высокие концентрации нейротоксина, то есть более высокие значения LD50 единиц/мл требуются для достижения второго эффекта такой силы, который сопоставим с эффектом, вызываемым Xeomin® или Botox®.
В варианте осуществления, в котором второй образец имеет более низкую концентрацию или активность ботулинического нейротоксина, чем Xeomin® или Botox®, второй эффект определяют по меньшей мере при одной концентрации от 20 до 400 или от 100 до 800.
В одном варианте осуществления, в котором вторым образцом является Dysport®, второй эффект определяют по меньшей мере при одной концентрации от 20 до 400 или от 25 до 300, или от 30 до 250.
В другом варианте осуществления, в котором вторым образцом является Myobloc®, второй эффект определяют по меньшей мере при одной концентрации от 100 до 800 или от 150 до 700, или от 200 до 600.
В других вариантах осуществления концентрация может изменяться в пределах от 30 до 600 или от 30 до 400, или от 30 до 200, или от 30 до 100, или от 30 до 80, или от 40 до 500, или от 40 до 400, или от 40 до 300, или от 40 до 200, или от 40 до 100, или от 40 до 90, или от 50 до 300, или от 50 до 200, или от 50 до 100, или от 60 до 100, в зависимости от концентрации эффективности или активности нейротоксина во втором образце по сравнению с Xeomin® или Botox®.
В одном варианте осуществления единицы LD50 являются единицами Xeomin®.
В одном варианте осуществления, благодаря достоверности указанного анализа на клеточной культуре, можно выполнять нормативные требования регулирующих органов и удовлетворять потребность в безопасном и эффективном введении ботулинического токсина, например, серотипа A или серотипа C, или серотипа E.
В еще одном варианте осуществления указанный клостридиальный токсин в указанном первом образце и указанный клостридиальный токсин в указанном втором образце являются одинаковыми клостридиальными токсинами.
В еще одном варианте осуществления указанный клостридиальный токсин или нейротоксин в первом образце и указанный клостридиальный токсин или нейротоксин в указанном втором образце отличаются друг от друга.
Для экспериментальной реализации способа, как правило, используют клеточную культуру, которая реагирует на воздействие ботулинического токсина, то есть ботулинический токсин оказывает действие на клеточную культуру, например, вызывает расщепление белка или полипептида в комплексе SNARE.
Термин "клеточная культура" охватывает клетки, которые выращены в регулируемых условиях вне организма.
В одном варианте осуществления термин "клеточная культура" относится к культивированию клеток, полученных из многоклеточных эукариотов, в особенности клеток животных. Впрочем, данный термин также охватывает клеточные культуры растений, грибов и микроорганизмов, включая вирусы, бактерии и простейшие.
Способы культивирования клеток известны в уровне техники. В одном варианте осуществления клетки могут быть выделены из тканей для получения ex vivo культуры. В одном варианте осуществления фрагменты ткани могут быть помещены в питательные среды, и выросшие клетки становятся доступны для получения культуры. В другом варианте осуществления клетки могут быть очищены от мягких тканей посредством ферментативного расщепления такими ферментами, как коллагеназа, трипсин или проназа, которые разрушают внеклеточный матрикс. Если применяются иммортализованные линии клеток, такие линии клеток часто обладают способностью к неограниченной пролиферации в результате случайной мутации или направленной модификации. Клетки могут выращиваться в суспензионных или адгезионных культурах. В зависимости от типа клеток, клетки могут естественно жить в суспензии, оставаясь неприкрепленными к поверхности. Адгезионные клетки требуют поверхности, например, пластик для культур тканей или микроноситель, который может быть покрыт компонентами внеклеточного матрикса для повышения адгезивных свойств, а также обеспечения других сигналов, необходимых для роста и дифференцировки.
В одном варианте осуществления для экспериментальной реализации способа согласно изобретению клетки могут выращиваться и поддерживаться при подходящей температуре и составе газовой смеси, например, при 37°C и 5% CO2 в клеточном инкубаторе. Условия культивирования могут сущестенно изменяться для каждого типа клеток, причем изменение условий для специфического типа клеток может приводить к проявлению различных фенотипов. Кроме температуры и газовой смеси наиболее часто изменямым фактором в системах культур является питательная среда. Составы питательных сред могут отличаться по pH, концентрации глюкозы, факторам роста и присутствию других питательных веществ, и т.п. Специалист, квалифицированный в данной области, знаком с указанными различными способами культивирования клеток.
После сбора выращенные клетки могут использоваться в любом из способов согласно изобретению.
В одном варианте осуществления клетки выбраны из линий нервных клеток или культур первичных нервных клеток.
Термин "линия клеток" охватывает клетки одного типа, которые пролиферируют неограниченно.
Термин "первичные клетки" охватывает неиммортализованную линию клеток, которая была получена непосредственно из ткани.
В одном варианте осуществления клетки клеточной культуры включают клетки спинного мозга.
В одном варианте осуществления клетки, например, клетки спинного мозга, клеточной культуры получены у грызуна. В одном варианте осуществления клетки клеточной культуры являются клетками спинного мозга мыши или клетками спинного мозга крысы.
В одном варианте осуществления клеточные культуры, используемые в разделе предшествующий уровень техники (см. Pellet, S. et al.; Keller, J.E. et al.), могут использоваться в рамках настоящего изобретения.
Согласно одному аспекту изобретение также предоставляет улучшенный способ определения диапазона концентраций, в котором активность первого образца, включающего клостридиальный нейротоксин, по отношению ко второму образцу, включающему клостридиальный нейротоксин, может быть определена в пределах установленного доверительного интервала или вероятности ложного отклонения.
В одном варианте осуществления такой способ определения диапазона концентраций, в котором может быть определена активность первого образца, включающего клостридиальный нейротоксин, по отношению ко второму образцу, включающему клостридиальный нейротоксин, включает следующие этапы:
(a) контакт клеточной культуры с указанным вторым образцом;
(c) измерение второго эффекта, вызванного в указанной клеточной культуре указанным нейротоксином;
(d) повтор этапов (a)-(c) при различных концентрациях указанного клостридиального нейротоксина;
(e) регистрацию указанного измеренного второго эффекта этапа (d) в зависимости от концентрации, с регистрацией, таким образом, второго набора данных;
(f) контакт клеточной культуры с указанным первым образцом;
(h) измерение первого эффекта, вызванного в указанной клеточной культуре указанным нейротоксином;
(i) повтор этапов (f)-(h) при различных концентрациях указанного клостридиального нейротоксина;
(j) регистрация указанного измеренного первого эффекта этапа (i) в зависимости от концентрации, с регистрацией, таким образом, первого набора данных;
где указанная концентрация выбрана из диапазона концентраций, который лучше всего соответствует первому и второму набору данных, и где указанное наилучшее соответствие определено с помощью статистического теста, включающего следующие подэтапы (a)-(δ):
(a) представление диапазона значений второго набора данных, полученного в этапе (e), в виде эмпирической кривой;
(β) представление диапазона значений первого набора данных, полученного в этапе (j), в виде эмпирической кривой;
(γ) линеаризация эмпирических кривых, соответственно;
(δ) параллелизация линеаризованных эмпирических кривых.
В указанном варианте осуществления указанный второй и указанный первый эффекты качественно идентичны. Для уточнения способа могут применяться способы, описанные выше применительно к способу согласно третьему аспекту изобретения.
В другом аспекте изобретения способы изобретения могут предпочтительно применяться для контроля качества, то есть активности образца, включающего клостридиальный нейротоксин, по сравнению с референсным стандартом, как требуется в процессе производства.
Таким образом, в указанном аспекте изобретение относится к применению способа изобретения для контроля качества, то есть активности образца, включающего клостридиальный нейротоксин.
В одном варианте осуществления определяют активность образца, находившегося на хранении. В одном варианте осуществления образец находился на хранении в течение по меньшей мере одного часа или по меньшей мере одного дня.
В одном варианте осуществления образец является лиофилизированным образцом или восстановленным образцом.
Согласно другому аспекту изобретение относится к применению способа в соответствии с первым аспектом изобретения для определения неизвестной концентрации клостридиального нейротоксина в первом образце по отношению к известной концентрации клостридиального нейротоксина во втором образце; или для определения относительной активности клостридиального нейротоксина в первом образце по отношению к активности клостридиального нейротоксина во втором образце.
Согласно другому аспекту изобретение относится к применению клеточной культуры, в особенности клеточной культуры, включающей клетки спинного мозга, такие как клетки крысы или мыши, для определения клостридиальной активности в любом из способов изобретения.
Следующие варианты осуществления также относятся к изобретению, при этом следует понимать, что варианты осуществления, описанные выше, взаимно применимы к перечисленным ниже способам.
На Фиг. 1 показан график зависимости времени до наступления паралича (время, требуемое для достижения половины от начальной силы сокращения гемидиафрагмы), выраженного в минутах, от концентрации ботулинического нейротоксина NT, выраженной в мышиных LD50 единицах, введенного в камеру для органов (полулогарифмический масштаб). Кривая ■ представляет образец, где вызванный эффект измеряли в присутствии нейротоксина, и кривая ♦ представляет образец, где ткань подвергали воздействию образца, содержащего нейротоксин, на 15 минут. Затем мышечную ткань извлекали из ванны и заменяли образец компонентами, не содержащими нейротоксин. После проведения электрической стимуляции измеряли вызванный эффект. Кривые представляют собой эмпирические линии, определенные согласно способу изобретения.
Пример 1
Для стандартного измерения гемидиафрагму мыши приготавливали и переносили в камеру для органов, наполненную сбалансированным солевым раствором Эрла. Диафрагмальный нерв (nervus phrenicus) гемидиафрагмы помещали на платиновый электрод, с помощью которого проводили электрическую стимуляцию нерва, вызывавшую впоследствии сокращение гемидиафрагмы. Гемидиафрагму фиксировали зажимами в камере для органов. В ходе фиксации стимуляцию отключали, но сразу включали после нее. Интенсивность электрического тока для стимуляции подбирали так, чтобы можно было измерять силу сокращения гемидиафрагмы. После того, как можно было измерять постоянную силу сокращения, среду заменяли средой, содержащей ботулинический нейротоксин. Время, требуемое для достижения половины силы сокращения (время паралича) определяли для каждой концентрации (по меньшей мере, для периода на концентрацию) и наносили на график в зависимости от концентрации ботулинического нейротоксина, введенного в камеру для органов.
Изобретение относится к области биохимии, а именно к способу определения неизвестной концентрации клостридиального нейротоксина в первом образце по отношению к известной концентрации клостридиального нейротоксина во втором образце и к способу определения относительной активности клостридиального нейротоксина в первом образце по отношению к активности клостридиального нейротоксина во втором образце, где способ включает следующие этапы: (а) контактирование клеточной культуры с указанным вторым образцом, содержащим клостридиальный нейротоксин в известной концентрации; (c) измерение второго эффекта, вызванного в указанной клеточной культуре указанным клостридиальным нейротоксином в известной концентрации; (d) повторение этапов (а)-(с) при различных концентрациях указанного клостридиального нейротоксина; (e) регистрацию измеренного второго эффекта этапа (d) в зависимости от концентрации клостридиального нейротоксина с регистрацией, таким образом, второго набора данных; (f) контактирование клеточной культуры с указанным первым образцом, содержащим указанный клостридиальный нейротоксин в неизвестной концентрации; (h) измерение первого эффекта, вызванного в указанной клеточной культуре указанным клостридиальным нейротоксином в неизвестной концентрации; (k) определение концентрации клостридиального нейротоксина, при которой указанный первый и указанный второй эффекты идентичны; и (l) сравнение концентрации клостридиального токсина, определенной в (k), с указанной неизвестной концентрацией клостридиального нейротоксина; где до указанного измерения в этапе (с) и этапе (h), и после контакта в этапе (а) и этапе (f), указанную клеточную культуру подвергают контакту в течение от 0,5 до 100 ч с водной средой, которая не содержит клостридиальный нейротоксин, и где этап (с) выполняют при отсутствии указанного второго образца, а этап (h) выполняют при отсутствии указанного первого образца. Применение способа для определения неизвестной концентрации клостридиального нейротоксина в первом образце по отношению к известной концентрации клостридиального нейротоксина во втором образце. Использование заявленного способа позволяет повысить точность определения неизвестной концентрации клостридиального нейротоксина и относительной активности клостридиального нейротоксина в образце. 3 н. и 5 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 пр.
1. Способ определения неизвестной концентрации клостридиального нейротоксина в первом образце по отношению к известной концентрации клостридиального нейротоксина во втором образце, включающий:
(а) контактирование клеточной культуры с указанным вторым образцом, включающим указанный клостридиальный нейротоксин в известной концентрации;
(c) измерение второго эффекта, вызванного в указанной клеточной культуре указанным клостридиальным нейротоксином в известной концентрации;
(d) повторение этапов (а)-(с) при различных концентрациях клостридиального нейротоксина;
(e) регистрацию измеренного второго эффекта этапа (d) в зависимости от концентрации клостридиального нейротоксина с регистрацией, таким образом, второго набора данных;
(f) контактирование клеточной культуры с указанным первым образцом, содержащим указанный клостридиальный нейротоксин в неизвестной концентрации;
(h) измерение первого эффекта, вызванного в указанной клеточной культуре указанным клостридиальным нейротоксином в неизвестной концентрации;
(k) определение концентрации клостридиального нейротоксина, при которой указанный первый и указанный второй эффекты идентичны; и
(l) сравнение концентрации клостридиального нейротоксина, определенной в (k), с указанной неизвестной концентрацией клостридиального нейротоксина;
где до указанного измерения в этапе (с) и этапе (h), и после контакта в этапе (а) и этапе (f), указанную клеточную культуру подвергают контакту в течение от 0,5 до 100 ч с водной средой, которая не содержит клостридиальный нейротоксин, и где этап (с) выполняют при отсутствии указанного второго образца, а этап (h) выполняют при отсутствии указанного первого образца.
2. Способ определения относительной активности клостридиального нейротоксина в первом образце по отношению к активности клостридиального нейротоксина во втором образце, включающий:
(а) контактирование клеточной культуры с указанным вторым образцом, содержащим указанный клостридиальный нейротоксин в известной концентрации;
(c) измерение второго эффекта, вызванного в указанной клеточной культуре указанным клостридиальным нейротоксином в известной концентрации;
(d) повторение этапов (а)-(с) при различных концентрациях клостридиального нейротоксина;
(e) регистрацию измеренного второго эффекта этапа (d) в зависимости от концентрации клостридиального нейротоксина, с регистрацией, таким образом, второго набора данных;
(f) контактирование клеточной культуры с указанным первым образцом, содержащим указанный клостридиальный нейротоксин в неизвестной концентрации;
(h) измерение первого эффекта, вызванного в указанной клеточной культуре указанным клостридиальным нейротоксином в неизвестной концентрации;
(i) повторение этапов (f)-(h) при различных концентрациях клостридиального нейротоксина;
(j) регистрацию измеренного первого эффекта этапа (i) в зависимости от концентрации клостридиального нейротоксина с регистрацией, таким образом, первого набора данных;
где до указанного измерения в этапе (с) и этапе (h), и после контакта в этапе (а) и этапе (f), указанную клеточную культуру подвергают контакту в течение от 0,5 до 100 ч с водной средой, которая не содержит клостридиальный нейротоксин, и где этап (с) выполняют при отсутствии указанного второго образца, а этап (h) выполняют при отсутствии указанного первого образца.
3. Способ по п. 2, дополнительно включающий этапы (m) и (n):
(m) выбор указанных различных концентраций клостридиального нейротоксина из диапазона концентраций, который лучше всего соответствует первому и второму наборам данных;
(n) определение указанного наилучшего соответствия с помощью статистического критерия, включающего следующие подэтапы (α)-(δ):
(α) представление диапазона значений второго набора данных, полученного в этапе (е), в виде эмпирической кривой;
(β) представление диапазона значений первого набора данных, полученного в этапе (j), в виде эмпирической кривой;
(γ) линеаризацию эмпирических кривых, соответственно;
(δ) параллелизацию линеаризованных эмпирических кривых.
4. Способ по п. 3, дополнительно включающий этап (ε):
(ε) вычисление на основе смещения линеаризованных и параллелизованных эмпирических кривых относительно друг друга относительной активности первого образца по отношению ко второму образцу.
5. Способ по любому из пп. 1-4, где указанный эффект является расщеплением белка из комплекса SNARE.
6. Способ по любому из пп. 1-4, где до указанного измерения в этапе (с) и этапе (h) указанную клеточную культуру подвергают контакту с указанным клостридиальным нейротоксином в течение от 5 до 45 ч, или от 15 до 40 ч, или от 25 до 35 ч; или
где до указанного измерения в этапе (с) и этапе (h) указанную клеточную культуру подвергают контакту с указанным клостридиальным нейротоксином в течение от 5 до 45 ч, или от 15 до 40 ч, или от 25 до 35 ч; и до указанного измерения в этапе (с) и этапе (h), и после контакта в этапе (а) и этапе (f), указанную клеточную культуру подвергают контакту в течение от 0,5 до 100 ч, или от 1 до 95 ч, или от 6 до 90 ч, или от 7 до 80 ч, или от 8 до 70 ч, или от 9 до 60 ч, или от 10 до 50 ч, или от 11 до 50 ч, или от 12 до 40 ч, или от 15 до 40 ч с водной средой, которая не содержит клостридиальный нейротоксин.
7. Способ по любому из пп. 1-4, где указанную регистрацию указанного измеренного второго эффекта проводят путем построения графика зависимости указанного второго эффекта от концентрации указанного клостридиального нейротоксина, и указанную регистрацию указанного второго набора данных проводят посредством регистрации калибровочной кривой.
8. Применение способа по п. 1 для определения неизвестной концентрации клостридиального нейротоксина в первом образце по отношению к известной концентрации клостридиального нейротоксина во втором образце.
| Способ приготовления мыла | 1923 |
|
SU2004A1 |
| Способ и приспособление для нагревания хлебопекарных камер | 1923 |
|
SU2003A1 |
| Способ приготовления мыла | 1923 |
|
SU2004A1 |
| Способ обработки целлюлозных материалов, с целью тонкого измельчения или переведения в коллоидальный раствор | 1923 |
|
SU2005A1 |
