КОМПОЗИЦИЯ ВОДНОГО РАСТВОРА РЕКОМБИНАНТНОГО ИНТЕРФЕРОНА АЛЬФА-2 ЧЕЛОВЕКА ДЛЯ РЕКТАЛЬНОГО ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2015 года по МПК A61K9/08 A61K38/21 A61K47/30 A61K33/14 

Изобретение относится к препаратам на основе рекомбинантного интерферона альфа-2 человека в жидкой форме для ректального применения, предназначенным для профилактики и лечения различных вирусных, пролиферативных заболеваний и расстройств иммунитета и может быть использовано в области медицины и фармацевтики.

Ректальное введение интерферона не вызывает нежелательных побочных явлений в виде тошноты, головокружения, повышения температуры, как это имеет место при внутривенном, внутримышечном или подкожном введении, и способствует быстрому всасыванию препарата, достижению высокой концентрации его в крови, выпадению барьерной функции печени и удлинению его циркуляции в кровяном русле (В.В. Малиновская и др. «Функционирование системы интерферона при различных способах и дозах введения рекомбинантного альфа-2-интерферона». Вопросы вирусологии. 1989, № 2, с. 180-183).

Известна жидкая форма препарат интерферона (патент РФ №2218934, МПК A61K 38/21, опубл. 20.12.2003 г.), используемая для инъекций, или в виде глазных капель или аэрозоля и содержащая интерферон альфа-2, буферобразующие соли, обеспечивающие pH 7,4, и стабилизатор. В качестве стабилизатора он содержит смесь ацетата альфа-токоферола и органической кислоты при следующем соотношении ингредиентов:

Интерферон альфа-2 1-100 млн ME

Ацетат альфа-токоферола 0,05-0,1 мг

Органическая кислота 0,02-10 мг

Буферобразующие соли, обеспечивающие pH 7,4 - остальное.

В качестве органической кислоты он содержит аскорбиновую, лимонную, мочевую, янтарную кислоту или глицин. В качестве буферобразующих солей он содержит соли, способные образовывать фосфатный, ацетатный, карбонатный или трис-буферные растворы.

Известен водный раствор интерферона с активностью 10000 ME для ректального применения (авт. св. СССР № 1530189, кл. A61K 45/02, 1988 г.). Указанный препарат используется в виде комплекса отдельных препаратов для лечения вирусных инфекций, состоящего из интерферона, который вводят ректально в виде водного раствора в дозе 10000 ME, и витаминов E и C, которые вводят в виде масляного раствора внутримышечно параллельно с интерфероном.

Введение параллельно с интерфероном витаминов E и C веществ, обладающих антиоксидантными свойствами, приводит к предотвращению значительного нарушения липидного обмена вследствие интенсификации перекисного окисления липидов, нормализации функционирования системы интерферона и, в конечном итоге, интенсивному снижению содержания возбудителя инфекций.

Однако такая жидкая форма интерферона имеет малый срок хранения, недостаточно эффективна при ректальном применении, т.к. быстро всасывается через толстую кишку и действует непродолжительное время.

Известна композиция водного раствора альфа 2-интерферона (патент РФ №2232595, МПК A61K 38/21, опубл. 20.07.2004 г.), включающая альфа 2-интерферон от 1×10⁶ до 1×10⁸ МЕ/мл, стабилизатор в виде полисорбата 80 от 0,01 до 0,05 мас./об. %, агент, регулирующий осмотическое давление, представляющий собой хлорид натрия, буферную систему, состоящую из моногидрофосфата натрия (Na₂HPO₄) и дигидрофосфата натрия (NaH₂PO₄) от 5 до 20 мМ с pH 4,5-6,0, а также антимикробные консерванты, выбранные из группы, состоящей из 0,1-0,3 мас./об. % фенола, 0,1-0,2 мас./об. % м-крезола или их смесей. Композиция водного раствора альфа 2-интерферона предназначена для инъекций или в виде глазных капель или аэрозоля.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является водный раствор интерферона (патент РФ №2238758, МПК A61K 38/21, опубл. 27.10.2004 г.), содержащий высокоочищенный рекомбинантный интерферона-альфа-2 (1-36)×10⁶ ME, буфер для поддержания pH раствора 4,5-7,0, неионогенный детергент, консервант, обладающий антимикробной активностью, агент, обеспечивающий изотоничность раствора, воду для инъекций, отличающийся тем, что он дополнительно содержит окисленный глутатион и/или лимонную кислоту при следующем соотношении компонентов на 1 мл:

Интерферон альфа-2 человека, ME (1-36)×10⁶ Неионогенный детергент, мг 0,01-1,0 Буфер для поддержания pH 4,5-7,0, мМ 10,0-25,0 Консервант, мг 0,06-20,0 Окисленный глутатион, мг 0,01-0,1 Хлорид натрия, обеспечивающий изотоничность   раствора в количестве, достаточном для придания   изотоничности раствору, мг 1,0-10,0 Вода для инъекций до 1,0 мл

В качестве буферной системы для поддержания pH 4,5-7,0 содержит фосфатный буфер в концентрации 10-25 мМ или буфер двузамещенный фосфат натрия - лимонная кислота в концентрации 10-25 мМ. В качестве консерванта содержит метилпарабен в концентрации 0,6-1,8 мг/мл, либо смесь метилпарабена в концентрации 0,6-1,8 мг/мл и пропилпарабена в концентрации 0,06-0,18 мг/мл, либо метакрезол в концентрации 0,5-2,0 мг/мл, либо бензиловый спирт 8,0-20,0 мг/мл. Указанный водный раствор рекомбинантного интерферона альфа-2 человека предназначен для внутримышечного, субконъюнктивального введения и закапывания в глаз.

Однако такая жидкая форма интерферона недостаточно эффективна при ректальном применении, например в микроклизмах, т.к. быстро всасывается через толстую кишку и действует непродолжительное время.

Техническим результатом заявляемого изобретения является создание композиции водного раствора рекомбинантного интерферона альфа-2 человека для ректального применения с пролонгированным действием.

Указанный технический результат достигается тем, что в композиции водного раствора рекомбинантного интерферона альфа-2 человека для ректального применения, включающей рекомбинантный интерферон альфа-2 человека, стабилизатор полисорбат 80, антиоксидант глутатион окисленный, хлорид натрия, обеспечивающий изотоничность раствора, буферный состав, антимикробный консервант нипагин и воду, согласно изобретению, она содержит альгинат натрия при следующем количественном содержании компонентов в 1 мл:

рекомбинантный интерферон альфа-2 человека 25,0-200,0 тыс. ME альгинат натрия 10,0-100,0 мг антиоксидант глутатион окисленный 0,006-0,1 мг антимикробный консервант нипагин 0,2-1,8 мг стабилизатор полисорбат 80 (твин 80) 0,01-1,0 мг хлорид натрия 5,8-7,5 мг буферный состав для поддержания pH 4,5-7,0 10,0-25,0 мМ вода остальное до 1 мл

Композиция может дополнительно содержать аскорбиновую кислоту в количестве 0,8-2,0 мг/мл, а буферный состав содержит (мг/мл):

натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный 4,53 натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный 1,5 динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты 0,1

Определение границ содержания альгината натрия в заявляемой композиции

Для определения границ оптимального содержания альгината натрия в композиции был проведен эксперимент на лабораторных животных. Использовали 12 самок кроликов породы «Шиншилла» с массой 1,5-2 кг.

Кролики были разделены на 3 группы по 4 животных. Животным ректально вводилась композиция, содержащая 125 тыс. ME рекомбинантного интерферона альфа-2b с различным содержанием альгината натрия: группе 1 - 10 мг/мл, группе 2 - 100 мг/мл, группе 3 - 40 мг/мл. Во всех группах препараты применялись однократно.

Определение содержания интерферона альфа-2b в сыворотке крови кроликов проводилось методом ИФА с использованием тест-систем «Альфа - интерферон - ИФА - БЕСТ» непосредственно перед введением препарата, через 15 минут после введения, через 30 минут, через 1 час и далее каждый час в течение 24 часов после введения препарата.

Исходный фоновый уровень содержания сывороточного интерферона у животных различных групп не имел существенных различий (11,2-13,4 пг/мл).

При анализе полученных данных, приведенных на фиг. 1 и таблице 1, установлено, что наиболее выраженный максимум повышения до 123,6 пг/мл выявлен через 1 час после введения ректально раствора с содержанием альгината натрия 40 мг/мл. Возвращение содержания сывороточного интерферона к исходному уровню произошло к 17 часу.

Менее выраженный максимум повышения отмечен после введения раствора с содержанием альгината натрия 10 мг/мл - до 66,7 пг/мл через 30 мин, возвращение к исходному уровню произошло к 12 ч.

После введения композиции с содержанием альгината натрия 100 мг/мл максимум содержания интерферона в крови до 47,4 пг/мл наблюдался только к 5 часу, далее уровень интерферона плавно понижался до фоновых значений к 18 часу.

Таким образом, было установлено, что при содержании в составе альгината натрия меньше 10 мг вязкость раствора недостаточна, вследствие чего не обеспечивается присутствие лекарственной композиции в месте ее ректального применения в течение срока, необходимого для пролонгированного высвобождения интерферона и его всасывания через слизистую оболочку.

Ниже приведены примеры составов заявляемой композиции.

Пример 1

натрия альгинат 40 мг/мл рекомбинантный интерферон-альфа 2 25 тыс. МЕ/мл натрия хлорид 7,5 мг/мл натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный 4,53 мг/мл натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный 1,50 мг/мл динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты 0,1 мг/мл полисорбат 80 0,1 мг/мл глутатион окисленный 0,006 мг/мл нипагин 0,20 мг/мл вода для инъекций до 1 мл

Пример 2

натрия альгинат 40 мг/мл рекомбинантный интерферон-альфа 2 100 тыс. МЕ/мл натрия хлорид 7,5 мг/мл натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный 4,53 мг/мл натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный 1,50 мг/мл динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты 0,1 мг/мл полисорбат 80 0,1 мг/мл глутатион окисленный 0,006 мг/мл нипагин 0,20 мг/мл вода для инъекций до 1 мл

Пример 3

натрия альгинат 40 мг/мл рекомбинантный интерферон-альфа 2 200 тыс. МЕ/мл натрия хлорид 7,5 мг/мл натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный 4,53 мг/мл натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный 1,50 мг/мл динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты 0,1 мг/мл полисорбат 80 0,1 мг/мл глутатион окисленный 0,006 мг/мл нипагин 0,20 мг/мл вода для инъекций до 1 мл

Пример 4

натрия альгинат 10 мг/мл рекомбинантный интерферон-альфа 2 25 тыс. МЕ/мл натрия хлорид 5,8 мг/мл натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный 4,53 мг/мл натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный 1,50 мг/мл динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты 0,1 мг/мл полисорбат 80 0,01 мг/мл глутатион окисленный 0,01 мг/мл нипагин 0,8 мг/мл кислота аскорбиновая 1,0 мг/мл вода для инъекций до 1 мл

Пример 5

натрия альгинат 40 мг/мл рекомбинантный интерферон-альфа 2 100 тыс. МЕ/мл натрия хлорид 7,5 мг/мл натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный 4,53 мг/мл натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный 1,50 мг/мл динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты 0,1 мг/мл полисорбат 80 0,1 мг/мл глутатион окисленный 0,006 мг/мл нипагин 0,20 мг/мл кислота аскорбиновая 1,0 мг/мл вода для инъекций до 1 мл

Пример 6

натрия альгинат 100 мг/мл рекомбинантный интерферон-альфа 2 200 тыс. МЕ/мл натрия хлорид 7,5 мг/мл натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный 4,53 мг/мл натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный 1,50 мг/мл динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты 0,1 мг/мл полисорбат 80 0,1 мг/мл глутатион окисленный 0,1 мг/мл нипагин 1,8 мг/мл кислота аскорбиновая 2,0 мг/мл вода для инъекций до 1 мл

Пример 7. Технология приготовления заявляемой композиции

Процесс приготовления композиции в соответствии с примерами 1-6 включает следующие процедуры:

- приготовление геля альгината натрия в зависимости от его содержания (от 1,0 до 10%) в примерах 1-6;

- термическая стерилизация геля при температуре 120°C;

- приготовление смеси геля альгината натрия и рекомбинантного интерферона-альфа 2 в асептических условиях.

Фасовка ЛФ в ректиоли

Навеску (4,0±0,1) г альгината натрия помещают в стеклянный стакан с буферным раствором (96±0,1) г следующего состава:

натрия хлорид 7,5 мг/мл натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный 4,53 мг/мл натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный 1,50 мг/мл двунатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты 0,1 мг/мл полисорбат 80 0,1 мг/мл вода для инъекций до 1 мл

Суспензию интенсивно перемешивают до образования однородного геля. Полученный гель альгината натрия стерилизуют в автоклаве при температуре 120±2°C.

В стерильный гель альгината натрия в асептических условиях вносят раствор рекомбинантного интерферона альфа-2 человека и тщательно перемешивают, вносят раствор нипагина из расчета 0,20 мг/мл продукта. Полученный продукт передают на фасовку по 5 мл в ректиоли (микроклизмы в виде ректальной пипетки).

Состав раствора для ректального применения, представленного для экспериментального исследования, приведен в таблице 2.

Материалы и методы

Исследование препарата рекомбинантного интерферона альфа-2b для ректального применения проводили на лабораторных животных. Использовали 20 самок кроликов породы «Шиншилла» с массой 1,5-2 кг.

Кролики были разделены на 5 групп по 4 животных. Кроликам группы 1, 2 и 3 ректально вводился препарат рекомбинантного интерферона альфа-2b в дозировках 1 млн ME, 500 тыс. ME и 125 тыс. ME соответственно. Группы 4 и 5 были использованы в качестве контрольных: группа 4 получала свечи Генферон 125 тыс. ME, группа 5 - свечи Виферон 150 тыс. ME.

Во всех группах препараты применялись однократно (см. табл. 3).

Задачей исследования было сравнительное изучение содержание в сыворотке крови интерферона альфа-2b при ректальном введении препаратов рекомбинантного интерферона в различных дозировках и лекарственных формах.

Определение содержания интерферона альфа-2b в сыворотке крови кроликов проводилось методом ИФА с использованием тест-систем «Альфа - интерферон - ИФА - БЕСТ» непосредственно перед введением препарата, через 15 минут после введения, через 30 минут, через 1 час и далее каждый час в течение 24 часов после введения препарата.

Исходный фоновый уровень содержания сывороточного интерферона у животных различных групп не имел существенных различий (10,3-14,2 пг/мл).

Все цифровые данные, полученные по группам в ходе исследования, были подвергнуты статистической обработке с использованием критерия Стьюдента. Различие средних величин считалось достоверным при P≤0,05.

Результаты

При анализе полученных данных установлено, что степень и скорость повышения содержания сывороточного интерферона после введения исследуемого раствора является дозозависимым явлением. Наиболее выраженный максимум повышения до 1000,7 пг/мл выявлен через 30 мин после введения ректально раствора с содержанием интерферона 1 млн ME. Возвращение содержания сывороточного интерферона к исходному уровню произошло к 21 часу. Менее выраженный максимум повышения отмечен после введения раствора с содержанием интерферона 500 тыс. ME и 125 тыс. ME - до 245,6 пг/мл через 30 мин и 123,6 пг/мл через 1 час соответственно. Возвращение к исходному уровню после введения раствора препарата интерферона в дозе 500 тыс. ME произошло к 19 ч, в дозе 125 тыс. ME - к 17 ч. При этом достоверное повышение по сравнению с исходным уровнем при использовании раствора препарата интерферона разных дозировок произошло уже через 15 мин после введения (см. табл. 4).

При сравнении полученных результатов после введения раствора и после введения препаратов интерферона в сопоставимых дозах (раствор 125 тыс. ME, свечи Генферон 125 тыс. ME, свечи Виферон 150 тыс. ME) выявлено влияние лекарственной формы и состава препарата на скорость повышения содержания сывороточного интерферона.

Так, после введения раствора достоверное повышение уровня сывороточного интерферона до 90,7 пг/мл отмечено уже через 15 мин, максимум 123,6 пг/мл - через 1 час. После введения Генферона в свечах достоверное повышение до 20,6 пг/мл произошло через 1 ч, при этом максимум содержания интерферона 28,5 пг/мл был зафиксирован через 4 ч. При использовании свечей Виферон достоверное повышение сывороточного интерферона до 29,4 пг/мл произошло также через 1 ч, максимум 131,6 пг/мл был отмечен через 3 ч после введения. При этом возвращение к исходному уровню после введения раствора препарата интерферона зафиксировано к 17 ч, после введения свечей Генферон - к 11 ч, свечей Виферон - к 12 ч. Уровень сывороточного интерферона у кроликов, получавших раствор, к 12 ч исследования сохранялся повышенным в 2,2 раза по сравнению с исходным (см. график на фиг. 2).

Выводы

1. Степень и скорость повышения содержания сывороточного интерферона после введения исследуемого раствора препарата интерферона являются дозозависимыми - при введении больших доз уровень интерферона значительнее и быстрее повышается и дольше сохраняется в сыворотке крови.

2. Выявлено влияние лекарственной формы и состава препарата в сопоставимых дозах на степень, скорость и длительность повышения содержания сывороточного интерферона. После введения заявляемого раствора препарата интерферона повышение уровня в 6,8 раз отмечено уже через 15 мин, максимум достигнут через 1 ч. После введения свечей Генферон и Виферон достоверное повышение выявлено через 1 час в 2,0 и 2,7 раз соответственно, максимум после введения свечей Генферон - через 4 ч, после введения свечей Виферон - через 3 ч. При этом максимальные значения после введения раствора и свечей Виферон были сопоставимы - 123,6 пг/мл и 131,6 пг/мл соответственно. Максимальное содержание сывороточного интерферона после использования свечей Генферон было существенно ниже - 28,5 пг/мл. Возвращение к исходному уровню после введения раствора препарата интерферона зафиксировано к 17 ч, после введения свечей Генферон к 11 ч, свечей Виферон - к 12 ч.

Таким образом, по результатам исследования новой формы рекомбинантного интерферона - раствора для ректального введения, выявлено, что по сравнению с традиционной формой (ректальными свечами) исследуемый препарат вызывает повышение сывороточного интерферона практически сразу после введения и дольше циркулирует в крови, тем самым давая возможность оказывать интерферону более эффективное терапевтическое действие.

Длительная циркуляция интерферона в крови дает возможность уменьшить кратность применения препарата в течение суток.

Также препарат интерферона в виде раствора в ректальных пипетках (ректиолях) более удобен в применении, чем традиционные формы препаратов для ректального применения - легче вводится и не вытекает, как мягкая плавящаяся основа свечей.

Изобретение относится к медицине, а именно к фармацевтике, и может быть использовано для создания препарата на основе рекомбинантного интерферона альфа-2 человека в жидкой форме для ректального применения. Композиция водного раствора рекомбинантного интерферона альфа-2 человека включает: рекомбинантный интерферон альфа-2 человека 25,0-200,0 тыс. ME, альгинат натрия 10,0-100,0 мг, антиоксидант глутатион окисленный 0,006-0,1мг, антимикробный консервант нипагин 0,2-1,8мг, стабилизатор полисорбат 80 (твин 80) 0,01-1,0 мг, хлорид натрия 5,8-7,5 мг, буферный состав для поддержания рН 4,5-7,0 10,0-25,0 мМ, вода - остальное до 1 мл. Использование данной композиции позволяет создать водный раствор рекомбинантного интерферона альфа-2 человека для ректального применения с пролонгированным действием. 2 з.п. ф-лы, 4 табл., 2 ил.

1. Композиция водного раствора рекомбинантного интерферона альфа-2 человека для ректального применения, включающая рекомбинантный интерферон альфа-2 человека, стабилизатор полисорбат 80, антиоксидант глутатион окисленный, хлорид натрия, обеспечивающий изотоничность раствора, буферный состав, антимикробный консервант нипагин и воду, отличающаяся тем, что она содержит альгинат натрия при следующем количественном содержании компонентов в 1 мл:
рекомбинантный интерферон альфа-2 человека 25,0-200,0 тыс. ME альгинат натрия 10,0-100,0 мг антиоксидант глутатион окисленный 0,006-0,1 мг антимикробный консервант нипагин 0,2-1,8 мг стабилизатор полисорбат 80 (твин 80) 0,01-1,0 мг хлорид натрия 5,8-7,5 мг буферный состав для поддержания рН 4,5-7,0 10,0-25,0 мМ вода остальное до 1 мл

2. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит аскорбиновую кислоту в количестве 0,8-2,0 мг/мл.

3. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что буферный состав содержит (мг/мл):
натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный 4,53 натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный 1,50 двунатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты 0,1