Штамм бактерий Exiguobacterium mexicanum S4/2 - стимулятор роста растений Российский патент 2023 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к биотехнологии, микробиологии и растениеводству и может быть использовано как для микробных технологий очистки окружающей среды от нефти и нефтепродуктов, так и для управления ростом растений с использованием природного штамма бактерий Exiguobacterium mexicanum S4/2 (BKM B-3549D), проявляющего в отношении растений ростостимулирующую активность.

Уровень техники

Род Exiguobacterium представлен 24 видами, таких как Е. acetylicum, Е. aestuarii, Е. algae, Е. alkaliphilum, Е. antarcticum, Е. aquaticum, Е. arabatum, Е. artemiae, Е. aurantiacum, Е. chiriqhucha, Е. enclense, Е. flavidum, Е. himgiriensis, Е. indicum, Е. marinum, Е. mexicanum, Е. oxidotolerans, Е, panipatensis, Е. profundum, Е. qingdaonense, Е. sibiricum, Е. soli, Е. taiwanense, Е. undae. Экзигуобактерии при относительно небольшом геноме, 2,5-6 миллионов пар оснований (п.о.), характеризуются рядом свойств, позволяющих рассматривать бактерии этого рода перспективными для биотехнологического использования. Среди этих свойств способность расти в широком диапазоне температур в пределах 12-55°С ((Vishnivetskaya et al., 2009Vishnivetskaya, T.A., Katharious, S., Tiedje, J.M., 2009. The Exiguobacterium genus: biodiversity and biogeography J. Extremophiles 13, 541-555; Chaturvedi P, Shivaji S (2006). "Exiguobacterium indicum sp.nov., a psychrophilic bacterium from the Hamta glacier of the Himalayan mountain ranges of India". Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 56 (103): 2765-2770. doi: 10.1099/ijs.0.64508-0), в присутствии высоких концентрации солей (Nitin Srivastava, Sumit Kumar, Sugathan Shiburaj, Anshu Gupta, Sunil Kumar Khare. Cellular adaptation responses in a halotolerant Exiguobacterium exhibiting organic solvent tolerance with simultaneous protease production. Environmental Technology & Innovation 23 (2021) 101803.

https://doi.Org/10.1016/j.eti.2021.101803), в широком диапазоне значений рН (5-11) (White III RA, Grassa CJ, Suttle CA (July-August 2013). "Draft Genome Sequence of an Exiguobacterium pavilionensis Strain RW-2 with Wide Thermal, Salinity, and pH Tolerance, Isolated from Modern Freshwater Microbialites". Genome Announcements. 1 (4): e00597-13. doi:10.1128/genomeA.00597-13. PMC 3738901. PMID 23929485. Ordonez OF, Lanzarotti E, Kurth D, Gorriti MF, Revale S, Cortez N, Vazquez MP, Farias ME, Turjanski AG (July-August 2013). "Draft Genome Sequence of the Polyextremophilic Exiguobacterium sp.Strain SI7, Isolated from Hyperarsenic Lakes in the Argentinian Puna". Genome Announcements. 1 (4): 2037-2042. dor.10.1128/genomeA.00480-13), переносить высокие уровни УФ-излучения и воздействие тяжелых металлов (К. Karami, Н. Zolgharnein, М. Mazaheri Assadi, A. Savari, S. Dadollahi, New report on the occurrence of exiguobacterium sp.AT1b in the Persian Gulf and its resistance to mercury pollution, Curr. Res. Bacteriol. 4 (2011) 23-27; O.F. Ordo~nez, E. Lanzarotti, D. Kurth, M.F. Gorriti, S. Revale, Draft genome sequence of the polyextremophilic Exiguobacterium sp.strain SI7, isolated from hyperarsenic lakes in the Argentinian Puna, Genome Announc. 1 (4) (2013), https://doi.Org/10.1128/genomeA.00480; J C. Belfiore, O.F. Ordo~nez, M.E. Farias, Proteomic approach of adaptive response to arsenic stress in Exiguobacterium sp.SI7, an extremophile strain isolated from a high-altitude Andean Lake stromatolite, Extremophiles 17 (2013) 421-431, https://doi.org/10.1007/s00792-013-0523-y.), в присутствии различных токсикантов, например нефти и продуктов ее переработки (Q. Chen, J. Li, М. Liu, Н. Sun, М. Bao, Study on the biodegradation of crude oil by free and immobilized bacterial consortium in marine environment, PLoS ONE 12 (3) (2017), https://doi.org/10.1371/journal.pone.0174445 e0174445; N.B. Sutton, P. van Gaans, A.A.M. Langenhoff, F. Maphosa, H. Smidt, T. Grotenhuis, H.II.M. Rijnaarts, Biodegradation of aged diesel in diverse soil matrixes: impact of environmental conditions and bioavailability on microbial remediation capacity, Biodegradation 24 (2013) 487-498, https://doi.org/10.1007/sl0532-012-9605-2.). Поскольку нефть и нефтепродукты являются одними из наиболее опасных загрязнителей окружающей среды, то способности экзигуобактерий осуществлять ее деструкцию уделяется особое внимание. Использование бактерий, способных к очистке окружающей среды от остатков нефтезагрязнений, является экономически выгодным, дешевым и эффективным методом. В естественных условиях восстановление биоценозов после нефтезагрязнения занимает до 50 лет, применение микробных препаратов сокращает этот период до 3 лет.

Бактерии многих родов способны к деструкции нефти- и нефтепродуктов, поэтому являются основой биопрепаратов для борьбы с нефтезагрязнениями.

Так, в литературе имеется описание ряда представителей вида Е. mexicanum.

Известен штамм Exiguobacterium mexicanum А-ЕМ (Jilin Lei, Minggang Zheng, Ling Wang, Guobin Yin, Yinghua Lou, Lei Shi, Complete genome sequence of Exiguobacterium mexicanum A-EM, isolated from seafloor hydrothermal vents in Atlantic Ocean, Marine Genomics, Volume 55, 2021, 100801, ISSN 1874-7787, https://doi.Org/10.1016/j.margen.2020.100801.). Exiguobacterium mexicanum A-EM был выделен из донных гидротермальных источников (поле Кайфан, 14,0 ю.ш. 14,4 з.д.). Полная последовательность генома состоит из 2 412 492 п. н., с содержанием GC 53,16%. Про бактерий этого штамма известно, что они разлагают токсины и загрязняющие вещества. Авторы предлагают применение штамма А-ЕМ в качестве эффективного средства для разложения загрязнителей окружающей среды. Однако про способность штамма оказывать ростостимулирующий эффект информация отсутствует.

Из литературы известен штамм галофильных бактерий Exiguobacterium mexicanum SND-01, способный к гетеротрофной нитрификации-аэробной денитрификации (HN-AD) (Yuan Cui, You-Wei Cui, Ji-Lin Huang, A novel halophilic Exiguobacterium mexicanum strain removes nitrogen from saline wastewater via heterotrophic nitrification and aerobic denitrification, Bioresource Technology, Volume 333, 2021, 125189, ISSN 0960-8524, https://doi.Org/10.1016/j.biortech.2021.125189). Про бактерии данного штамма известно, что они выживают при солености от 0 до 9% (масса/объем), показывают максимальную скорость удаления азота 2,24±0,14 мг/(л ч), 3,63±0,21 мг/(л ч) и 2,30±0,23 мг/(л ч), соответственно, при использовании аммония, нитрата или нитрита в качестве единственного источника азота в аэробных условиях. Данный штамм Exiguobacterium mexicanum SND-01 демонстрирует значительный потенциал в биологической очистке соленых сточных вод простым и экономичным способом, однако о ростостимуляции растений данным штаммом не сообщалось.

Патентный поиск показал, что известен штамм Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011, обладающий способностью быстро утилизировать нефть, дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат (Ерофеевская Лариса А. Штамм бактерий Exiguobacterium mexicanum -деструктор нефти и нефтепродуктов. Патент РФ RU (11) 2 523 584(13) С1, дата публикации 20.07.2014 Бюл. №20). Штамм может быть использован для очистки почв и водоемов, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, в широком диапазоне температур от +4 до +37°С. Однако о ростостимулирующей активности данного штамма не сообщалось.

Известен консорциум бактерий, представленный микроорганизмами Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 и Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017, взятых в соотношении 1:1, для очистки различных типов мерзлотных почв от нефтезагрязнений (Ерофеевская Лариса А. Консорциум микроорганизмов Exiguobacterium mexicanum и Bacillus vallismortis для очистки мерзлотных почв от нефтезагрязнений. Патент РФ 2565817(13) С1. Опубликовано 20.10.2015 Бюл. №29). Консорциум обладает способностью утилизировать нефть и нефтепродукты в относительно короткие сроки в широком диапазоне температур от +8 до +37°С. Однако о способности к росточтимуляции данным консорциумом не сообщалось.

Известен штамм бактерий Exiguobacterium sp.ELA-6, обладающий способностью утилизировать нефть и нефтепродукты, который депонирован в ФГБУН ИБФМ РАН под регистрационным номером ВКМ B-2813D (Ерофеевская Л.А. Патент РФ 2564105(13) С1 Опубликовано: 27.09.2015 Бюл. №27). Бактерии данного штамма могут быть использованы для очистки почв и водоемов, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, в широком диапазоне температур от +4 до +30°С. Изобретение позволяет сократить сроки очистки почвы и водоемов от нефти и нефтепродуктов. Однако о ростостимулирующей активности бактерий данного штамма не сообщалось.

Известен штамм Exiguobacterium sp.(Liang Tan, Yuan-yuan Qu, Ji-ti Zhou, Ang Li, Min Gou. Identification and Characteristics of A Novel Salt-Tolerant Exiguobacterium sp.for Azo Dyes Decolorization. Appl Biochem Biotechnol. DOI 10.1007/s12010-009-8546-7). Бактерии данного штамма выделены с поверхности почвы фармацевтического предприятия и характеризовались высокой солеустойчивостыо. Бактерии данного штамма способны к эффективному обесцвечиванию азо-красителей при температуре 30-40°С, рН 5,4-7,0, 15% (вес/об.) NaCl, и 1 ммоль л-1 Mg2+ или Са2+. Однако видовая принадлежность клеток этого штамма не установлена и не сообщалось об их способности к ростостимуляции.

Из литературы известен штамм Exiguobacterium sp.TNDT2, выделенный из ризосферы финикового дерева (Thennarasu Sugumar, Punithavathi Srinivasan, В. MuthukumarE. Natarajan. Whole Genome Sequencing and Genome Annotation of PGPR 'Exiguobacterium sp.TNDT2' Isolated from Dates Palm Tree Rhizospheric Soil. January 2021 Indian Journal of Agricultural Research DOI: 10.18805/IJARe.A-5665). Его геном состоит из хромосомы длиной 2 891 840 п. н., кодирующей более 3062 белков с содержанием GC 51,63%. Штамм TNDT2 кодирует широкий спектр белков для стимуляции роста растений, детоксикации тяжелых металлов (кадмий, мышьяк, ртуть, медь и теллурит), устойчивости к множеству лекарств и стрессоустойчивости (жара, холод и соль), однако видовая принадлежность этого штамма не определена.

Из литературы известен штамм бактерий Exiguobacterium acetylicum IP (G. Selvakumar ⋅ S. Kundu ⋅ Piyush Joshi ⋅ Sehar Nazim ⋅ A. D. Gupta ⋅ H. S. Gupta Growth promotion of wheat seedlings by Exiguobacterium acetylicum IP (MTCC 8707) a cold tolerant bacterial strain from the Uttarakhand Himalayas. Indian J Microbiol (March 2010) 50:50-56 DOI: 10.1007/s12088-009-0024-y). Бактерии данного вида растут в диапазоне температур от 4 до 42°С, проявляют стимулирование роста растений за счет солюбилизации фосфатов, синтеза индолуксусной кислоты (IAA), сидерофоров и цианистого водорода (HCN), инокулирование семян пшеницы бактериальными клетками оказывало положительное влияние на рост и параметры поглощения питательных веществ проростками пшеницы при субоптимальных холодных температурах выращивания. Однако видовая принадлежность данного штамма отличается.

Известен штамм Exiguobacterium aurantiacum SW-20, способный к разложению нефти и нефтепродуктов, но он является представителем другого вида бактерий. (Su Z, Wang S, Yang S, Yin Y, Cao Y, Li G, Ma T. Genetic and Comparative Genome Analysis of Exiguobacterium aurantiacum SW-20, a Petroleum-Degrading Bacteria with Salt Tolerance and Heavy Metal-Tolerance Isolated from Produced Water of Changqing Oilfield, China. Microorganisms. 2021 Dec 29;10(1):66. doi: 10.3390/microorganismsl0010066.)

Из литературы известен только один штамм бактерий Е. mexicanum, способный к ростостимуляции. (Новая грамположительная бактерия рода Exuguobacterium sp.S4/2 - эффективный многофункциональный стимулятор роста растений. Абашина Т.Н., Звонарев А.Н., Шорохова А.П., Поливцева В.Н., Сузина Н.Е. Актуальная биотехнология. ISSN: 2304-4691. Материалы конференции. Номер: 1 Год: 2022 Страницы: 11-14), описываемый в данном изобретении штамм бактерий. С поверхности кожного покрова водной лягушки-когтеносца Беттгера Hymenochirus boettgeri выделен штамм бактерий S4/2, принадлежащий к роду Exiguobacterium (наиболее близкий вид Ex. mexicanum) с уникальными свойствами, сочетающими в себе способность к многофункциональной стимуляции роста растений с защитными в отношении растений сопутствующими характеристиками и способностью роста на продуктах переработки нефти. Шт.S4/2 обладает слабой антибактериальной активностью (хотя на некоторых модельных штаммах бактерий-жертв наблюдали «отложенный» эффект, выражающийся в проявлении антибактериальной активности спустя длительное время, через 7-9 дней), но эффективно подавляет рост двух штаммов фитопатогенных грибов, один из которых является патогеном рапса. Для шт. S4/2 получена и частично проанализирована полногеномная нуклеотидная

последовательность. Показано, что шт. S4/2 является продуцентом растительных гормонов - ауксинов - стимуляторов роста растений. Что также было подтверждено фотоколориметрическим методом.

Задачей изобретения является получение штамма-ростостимулятора растений на фоне способности к деструкции устойчивых поллютантов в широком диапазоне температур.

Задача решается тем, что предлагается штамм бактерий Exiguobacterium mexicanum S4/2 ВКМ B-3549D, способный стимулировать рост и развитие растений.

Штамм бактерий Exiguobacterium mexicanum S4/2 депонирован во Всероссийской Коллекции Микроорганизмов (ВКМ) Федерального государственного бюджетного учреждения науки ФИЦ Пущинский научный центр Биологических исследований, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук (ИБФМ РАН) под регистрационным под номером ВКМ В-3549 D.

Штамм бактерий Exiguobacterium mexicanum S4/2 ВКМ B-3549D выделен с поверхности кожного покрова водной лягушки-коггеносца Беттгера Hymenochirus boettgeri.

Штамм бактерий Exiguobacterium mexicanum S4/2 ВКМ B-3549D обладает следующими свойствами.

Культурально-морфологические свойства штамма Exiguobacterium mexicanum S4/2 ВКМ B-3549D. На богатой среде 5/5 (аналог лизогенного бульона) образует колонии бледно-розового цвета.

Физиолого-биохимические свойства штамма: аэроб, диапазон роста температур - +7- (+42)°С, с оптимумом +30°С, оптимум рН нейтральный или слегка щелочной: 7-8, каталазоположительный, не требует для роста тиамина, хорошо растет на стандартных лабораторных средах. На минеральной среде в качестве ростовых субстратов использует сахарозу, мальтозу, лактозу, глицерин, способен к росту в морской воде, в качестве источника углерода способен использовать сырую нефть (пример 4).

Штамм не вирулентный, не токсичный, не токсигенный (в соответствии с видовой характеристикой, представленной в литературе).

Штамм может поддерживаться регулярными пересевами (1 раз в 21-30 дней) на скошенном мясопептонном агаре или храниться в лиофилизированном состоянии в ампулах при температуре +4°С.

При хранении на агаризованной среде 5/5 в качестве единственного источника углерода и энергии штамм длительное время сохраняет жизнеспособность.

Изучаемый нами штамм напоминает слабо галотолерантный штамм Exiguobacterium mexicanum SND-01 по способности расти в присутствии соли. Штамм SND-01 рос при концентрации хлорида натрия в среде 0-9%, однако ничего не известно про способность данного штамма разлагать нефть и нефтепродукты (Yuan Cui, You-Wei Cui, Ji-Lin Huang, A novel halophilic Exiguobacterium mexicanum strain removes nitrogen from saline wastewater via heterotrophic nitrification and aerobic denitrification, Bioresource Technology, Volume 333, 2021, 125189, ISSN 0960-8524, https://doi.org/10.1016/j.biortech.2021.125189). Штамм Exiguobacterium mexicanum S4/2 показал способность расти в среде, содержащей до XX % хлорида натрия и способен к разложению нефти и нефтепродуктов.

Возможность осуществления предлагаемого изобретения подтверждается следующими примерами, но не ограничивается ими.

Пример 1. Для культивирования штамма бактерий Exiguobacterium mexicanum S4/2 ВКМ B-3549D используют или богатую среду 5/5 ИБФМ РАН или минеральную среду следующего состава (г/л): К₂НРО₄ 3.0; MgCO₃ 0.3; NaCl 0.2; KNO₃ 0.75; FeSO₄ х 7H₂O 0.001, мел 0.5, в которой используют 20 г глюкозы/ мальтозы/ сахарозы/ глицерина в качестве ростового субстрата.

Культуру для посевного материала выращивают в колбах объемом 750 мл с рабочим объемом 200 мл на одной из указанных выше сред. Клетки выращивают при перемешивании на качалке при 220 об/мин до плотности 0.5-1.5 оптических единиц. Способность к стимулированию роста растений определяют следующим образом. Полученную клеточную суспензию разбавляют стерильной водопроводной водой по ОП 0,2 единицы (длина волны 600 нм). Из данных, представленных на Фигуре 1, понятно, что при инокулировании семян свеклы клетками бактерий штамма Exiguobacterium mexicanum S4/2 ВКМ B-3549D происходило стимулирование прорастания семян и развития проростков по сравнению с контролем, в качестве которого использовали водопроводную воду.

Пример 2. Для определения основного фитогормона типа ауксинов, определяющего фитостимуляцию, индолил-3-уксусной кислоты, был проведен сравнительный анализ на фотоэлектрическом колориметре Шимадзу. Для анализа использовался реактив Сальковского, приготовленный согласно Гордону и Веберу [Gordon S.A., Weber R.P. Colorimetric estimation of indole acetic acid // Plant Physiol. 1951. 26: 192-195.], дающий характерное розово-красное окрашивание с ИУК. Количество фитогормонов в исследуемых образцах рассчитывали с помощью стандартного раствора, в котором концентрация ауксинов была заранее известна.

Фотоколомитрическим методом с реактивом Сальковского было выявлено, что концентрация ауксинов в культуралыюй жидкости бактерий Exiguobacterium mexicanum составляет примерно 4,8 мг/мл. Из приведенного примера видно, что штамм S4/2 является продуцентом растительных гормонов -ауксинов - стимуляторов роста растений.

Пример 3. Объектами исследования служили растения рапса (Brassica napus) отечественного сорта «Галант», полученного из ВНИИМК имени B.C. Пустовойта, Краснодар. Семена стерилизовали 1,5 мин в 70%-ном этаноле, затем 2 мин в 20%-ном растворе гипохлорита натрия и промывали 3 раза по 10 мин в стерильной дистиллированной воде. Семена проращивали на безгормональной среде Мурасига-Скуга (МС) [2], содержащей 7 г/л агара, 30 г/л сахарозы (рН 5,8) и стандартный набор солей («Лабтех»). Колонизация растений ассоциативными бактериями. Семена рапса обрабатывали суспензией ассоциативных бактерий. Для этого семена помещали в жидкую культуру бактерий с титром 10³ на 2 мин, подсушивали на фильтровальной бумаге и переносили на чашки Петри, со средой МС. В качестве контроля на среду МС помещали необработанные бактериями семена и культивировали при 22-24°С и 16-часовом фотопериоде при освещенности 2 клк. Колонизированные и контрольные растения культивировали при температуре 22-24°С, при 16-часовом дне и освещенности 2 клк в ростовых пробирках на безгормональной среде MS.

В лабораторных экспериментальных исследованиях методом люминисцентной микроскопии, показана высокая способность клеток Exiguobacterium mexicanum шт. S4/2 колонизировать корни и листья растений. Через 7 дней после прорастания семян мы наблюдали усиление ризогенеза, удлинение стебля и большее разветвление корневой системы у колонизированных растений в сравнении с контрольными. Растения рапса в фитосимбиозе с Exiguobacterium mexicanum через 30 дней имели показатели роста примерно в 2 раза превышающие аналогичные показатели контрольных вариантов (Фигура 2 и Фигура 3).

Пример 4. Exiguobacterium mexicanum S4/2 ВКМ B-3549D способен к деструкции нефти и нефтепродуктов. Данный пример демонстрирует эффективность применения штамма S4/2 в отношении деструкции нефтепродуктов. Клетки выращивали в минеральной среде следующего состава: (на 1 литр дистиллированной воды): 8.71 г К₂НРО₄, 1 мл of 5 М NH₄Cl, 1 мл 0.1 М Na₂SO₄, 1 мл 62 мМ MgCl₂, 1 мл 1 мМ CaCl₂, 1 мл 5 μМ (NH₄)₆Mo₇O₂₄⋅4H₂O; 1 мл раствора микроэлементов, рН 7.0. Раствор микроэлементов содержал (в 1% HCl): 0.41 г/л ZnO; 5.4 г/л FeCl₂⋅6H₂O; 2.0 г/л MnCl₂⋅4H₂O; 0.17 г/л CuCl₂⋅2H₂O; 0.48 г/л CoCl₂⋅6H₂O; 0.06 г/л H₃BO₃. В качестве ростового субстрата использовали раствор сырой нефти в концентрации 2%. Выросшие клетки отмывали от ростовой среды и инокулировали в минеральную среду, содержащую 2% сырой нефти. Условия проведения эксперимента: относительная влажность 45%; температура - 22-25°С; количество обработок клетками бактерий - однократно; длительность проведения эксперимента 45 суток. Содержание нефтепродуктов определялось на аппарате КН-2М (Россия). Остаточное количество нефти определяли по разнице показателей в начальный и конечный момент времени. Убыль содержания нефтепродуктов составила 68%.

Штамм бактерий Exiguobacterium mexicanum S4/2 ВКМ B-3549D отличается от известных штаммов-бактерий, являющихся деструкторами нефти. Это следует из примеров 1-3 и литературных данных. Предлагаемый штамм бактерий Exiguobacterium mexicanum S4/2 ВКМ B-3549D обеспечивает прорастание и ускоренное развитие семян свеклы, крестоцветных культур, что не известно из уровня техники.

При проведении патентного поиска в Российской базе данных по запросу «Exiguobacterium mexicanum» и «стимуляция роста растений» не дает результата. Таким образом, нет данных по патентам на штамм Exiguobacterium mexicanum S4/2 ВКМ B-3549D как стимулятор роста растений.

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой штамм Exiguobacterium mexicanum S4/2 - перспективный стимулятор роста растений. Штамм бактерий Exiguobacterium mexicanum S4/2, задепонированный во Всероссийской коллекции культур микроорганизмов под номером ВКМ B-3549D. На богатой среде образует колонии бледно-розового цвета. Штамм Exiguobacterium mexicanum S4/2 оказывал стимулирующее действие на прорастание семян таких растений, как свекла, овес и крестоцветные. Штамм выделен с поверхности кожного покрова водной лягушки-когтеносца Беттгера Hymenochirus boettgeri. Штамм может быть использован для получения биопрепаратов для замачивания семян и стимулирования прорастания семян и роста и развития растений. 3 ил., 2 табл., 4 пр.

Штамм бактерий Exiguobacterium mexicanum S4/2, ВКМ В-3549D во Всероссийской коллекции микроорганизмов, для стимуляции роста растений.