ШТАММ БАКТЕРИИ Komagataeibacter xylinus - ПРОДУЦЕНТ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ Российский патент 2015 года по МПК C12N1/20 C12P19/04 C12R1/00 

Изобретение относится к области биотехнологии, касается нового штамма - продуцента бактериальной целлюлозы Komagataeibacter xylinus и может быть использовано для восстановительной хирургии, реконструкции дефектов кожных покровов и закрытия кожных ран, а также для направленной тканевой регенерации в стоматологии, общей и челюстно-лицевой хирургии, для клеточной и тканевой инженерии в качестве опорных матриксов, с возможностью депонирования и доставки лекарственных препаратов. Материалы предназначены для длительного контакта с раневой поверхностью.

Целлюлоза синтезируется высшими и низшими фототрофными организмами, а также прокариотами родов Gluconacetobacter, Acetobacter, Komagataeibacter [Yamada Y., Yukphan P., Lan Vu H. Т., Muramatsu Y., Ochaikul D., Tanasupawat S., Nakagawa Y. Description of Komagataeibacter gen. nov., with proposals of new combinations (Acetobacteraceae) // J. Gen. Appl. Microbiol. - 2012. - 58, 397-404; Tanaka M, Murakami S, Shinke R, Aoki K. Genetic characteristics of cellulose-forming acetic acid bacteria identified phenotypically as Gluconacetobacter xylinus // Biosci Biotechnol Biochem. - 2000. - 64 (4). - P. 757-760].

Целлюлоза - внеклеточный полисахарид и, за исключением бактерий и оболочников, она является частью клеточной стенки у растений, водорослей и слизевиков (Dictyostelium) [Saxena I.М., Brown R.M. Cellulose biosynthesis: current views and evolving concepts // Annals of botany. - 2005. - T. 96. - №. 1. - C. 9-21].

Бактериальная целлюлоза предназначена для различных сфер применения, таких как: пищевая и бумажная промышленность, медицина и фармакология.

Бактериальная целлюлоза не токсична, обладает высокой биологической совместимостью, не вызывает аллергии и физического отторжения. Плоская гель-пленка бактериальной целлюлозы - это идеальная повязка при пересадке кожи, лечении ран, послеоперационных швов и язв, а в сочетании с лекарственными препаратами бактериальная целлюлоза эффективна для терапии гнойных воспалений, потертостей и пролежней и др.

Бактериальная целлюлоза предназначена для использования в реконструктивной медицине в качестве имплантатов [ЕР 2070557, МПК A61F 2/28, A61L 24/08, A61L 27/20, опубл. 17.06.2009; RU 2476187, МПК A61F 2/06, A61F 2/24, A61L 27/50, A61L 27/20, опубл. 27.02.2013]; раневых покрытий и искусственной кожи [RU 2462514, МПК С12Р 19/04, A61L 15/28, C12R 1/02, опубл. 27.09.2012; US 4.912.049, МПК A61L 26/00, A61L 27/00, A61L 27/20, A61L 27/60, A63B 51/02, B01D 71/10, С12Р 19/04, D06N 3/02, опубл. 27.03.1990; US 5.846.213, МПК A61F 13/00, A61L 15/28, B01D 39/18, опубл. 08.12.1998], носителя лекарственных препаратов [US 2011/0286948, МПК A61K 38/18, A61K 38/43, A61K 47/38, A61K 8/18, A61Q 3/00, С08В 1/00, С12Р 19/041, опубл. 24.11.2011]; гелей и гидрогелей [RU 2298022, МПК C08L 33/00, C08L 39/00, C08L 101/14, опубл. 27.04.2007], клеточной и тканевой инженерии [RU 2460785, МПК C12N 5/07, C08L 1/00, D01F 2/00, опубл. 10.09.2012], косметологии и др.

Расширение масштабов и областей применения бактериальной целлюлозы напрямую зависят от наличия продуктивных штаммов, обеспечивающих высокие выходы этого ценного биотехнологического продукта. С этой целью выделяются новые штаммы - продуценты бактериальной целлюлозы и совершенствуются способы их выращивания для эффективной продукции бактериальной целлюлозы.

Известны питательные среды [патент РФ №2141530, МПК С12Р 19/02, C12N 1/20, опубл. 20.11.1999], содержащие в качестве источника углерода для получения бактериальной целлюлозы с использованием штамма Acetobacter xylinum отходы производства сахара ВКМ N В-880. Выход бактериальной целлюлозы после культивирования на жидкой питательной среде в течение 5-10 суток составляет 7-16 г.

В качестве продуцента бактериальной целлюлозы известен штамм бактерии Gluconacetobacter hansenii GH-1/2008 [RU 2464307, МПК C12N 1/20, C12P 19/04, C12R 1/01, опубл. 20.10.2012], который получен путем многоступенчатого скрининга из культуры «чайного кваса». Штамм депонирован в ВКПМ под номером В-10547. Штамм продуцирует бактериальную целлюлозу при культивировании на средах, содержащих в качестве источника углерода сахарозу или фруктозу. При культивировании в течение 7 суток на селективных средах выход бактериальной целлюлозы составляет 4,73-6,67 г/л.

Известен более эффективный состав питательной среды для получения бактериальной целлюлозы [RU 2189394, МПК С12Р 19/04, C12N 1/20, C12R 1:02, опубл. 20.09.2002], содержащий в качестве источника углерода гидролизаты древесины, торфа, сульфитный щелок целлюлозно-бумажного производства, нестандартное сырье плодово-ягодных производств. Выход бактериальной целлюлозы в культуре Acetobacter xylinum ВКМ N В-880 за 5-10 суток выращивания в 100 мл колбах на 60 мл среды составляет 9,8-11,3 г, что соответствует выходу бактериальной целлюлозы 163,3-188,3 г/л.

Недостатком вышеописанных изобретений является низкий выход бактериальной целлюлозы.

Целью изобретения является выявление нового продуктивного штамма, способного устойчиво продуцировать бактериальную целлюлозу с высокими выходами на средах, содержащих различные источники углерода.

Техническим результатом изобретения является новый штамм Komagataeibacter xylinus (ВКПМ В-12068) - продуцент бактериальной целлюлозы.

Изобретение поясняется чертежами. На фиг. 1 представлены микрофотографии Komagataeibacter xylinus В-12068 (×1000, окраска метиленовым синим). На фиг. 2 представлены колонии бактерий Komagataeibacter xylinus В-12068 на агаризованной Hestrin-Schramm среде. На фиг. 3 представлено фото поверхностной культуры Komagataeibacter xylinus В-12068 в статическом режиме в колбах на Hestrin-Schramm среде с различными источниками углерода: а - мальтоза; б - глюкоза; в - галактоза. На фиг. 4 представлено фото бактериальной целлюлозы при поверхностном (а) и глубинном (б и в) культивировании штамма Komagataeibacter xylinus В-12068 в колбах на Hestrin-Schramm среде с глюкозой. На фиг. 5 представлены РЭМ снимки бактериальной целлюлозы при поверхностном культивировании штамма Komagataeibacter xylinus В-12068 в статических условиях в кюветах на Hestrin-Schramm среде с глюкозой. На фиг. 6 дан элементный состав бактериальной целлюлозы, продуцируемой Komagataeibacter xylinus В-12068. На фиг. 7. представлены рентгенограммы образцов бактериальной целлюлозы, продуцируемой Komagataeibacter xylinus В-12068, полученной в статическом режиме: 1 и 2 (степень кристалличности 60 и 67%) и 3 - в динамическом режиме (степень кристалличности 30%).

Заявляемое техническое решения отличается тем, что в качестве продуцента используют новый штамм Komagataeibacter xylinus В-12068, способный утилизировать различные источники углерода и при культивировании глубинным динамическим и поверхностным статическим режимами обеспечивающий выходы получаемого продукта - бактериальной целлюлозы - от 200 до 350 г/л со степенью кристалличности соответственно 30 и 60-67%.

Признаки, отличающие заявляемое техническое решение, не выявлены в других технических решениях при изучении данной и смежной областей техники и, следовательно, обеспечивают заявляемому решению соответствие критериям «новизна» и «изобретательский уровень».

Заявляемый штамм выделен из природной ассоциации Medusomyces gisevii J. Lindau (чайный гриб) селекционным путем на стандартной среде Hestrin-Schramm, содержащей, (в %): глюкозы - 2,0, пептона - 0,5, дрожжевого экстракта - 0,5, Na₂HPO₄ - 0,27, лимонной кислоты - 0,115 [Hestrin S., Schramm М. Synthesis of cellulose by Acetobacter xylinum. 2. Preparation of freeze-dried cells capable of polymerizing glucose to cellulose. // Biochem. J. - 1954. - V. 58(2). - P. 345-352].

Заявляемый штамм Komagataeibacter xylinus депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ), коллекционный номер ВКПМ В-12068.

Идентификация штамма произведена на основании морфологических, биохимических, генетических и ростовых характеристик [Bergey′s Manual of Systematic Bacteriology. Second Edition. Volume 2: The Proteobacteria. Part C: The Alpha-, Beta-, Delta-, and Epsilonproteobacteria / Ed. George M. Garrity. - Springer, 2005. - p. 72-77].

Генетические характеристики:

Клонирован и охарактеризован ДНК фрагмент 1448 н.п. (депонирован в базе данных GenBank NCBI под номером KJ000081), включающий нуклеотидную последовательность гена, кодирующего 16S рРНК:

Культурально-морфологические характеристики:

Бактерии палочковидные, неподвижные, эндоспор не образуют (фиг. 1); окраска по Граму - отрицательная; расположение одиночное или парное; размеры: 0.4-0.6×1.0-1,5 µм. Границы физиологического действия pH в диапазоне 2.5-6.5, оптимальные значения 3,5-4,5. Штамм сохраняет способность к росту в диапазоне температур 20-37°С, оптимум роста 28-30°С.

Облигатный аэроб. Каталазоположительный, оксидазоотрицательный. Не обладает гидролитическими ферментами: желатину не разжижает, крахмал не гидролизует. Нитраты не восстанавливает; индол, сероводород - не образует. Хемоорганотроф. Нуждается в факторах роста (дрожжевой экстракт). На среде Hestrin-Schramm способен в качестве источника углерода использовать глюкозу, сахарозу, фруктозу, мальтозу. Рост на среде с галактозой и маннитолом - незначительный. Не растет на АЕ среде в присутствии 3% этанола и 6% уксусной кислоты. Не растет в присутствии 30% D-глюкозы. Чувствителен к NaCl выше 0,5% концентрации.

В жидкой питательной среде Hestrin-Schramm с глюкозой, сахарозой или мальтозой в статических условиях на поверхности культуральной жидкости образует плотную однородную гелеобразную пленку из микрофибрилл целлюлозы.

На среде Hestrin-Schramm с другими источниками углерода (галактоза, маннитол) образует слабо выраженную рыхлую пленку, распадающуюся на хлопья.

Колонии на плотной среде Hestrin-Schramm мелкие (1-3 мм), выпуклые, кремовато-серого цвета, непрозрачные, пленкообразные, с ровным или слегка волнистым краем (фиг. 2). Не пигментированные.

В составе жирных кислот штамма на питательной среде Hestrin-Schramm идентифицировано 36 жирных кислот; преобладают пальмитиновая (27,88%), цис-вакценовая (20,1%) и стеариновая (12.51%) кислоты.

Ростовые характеристики:

Культивирование бактерий проводят в стерильном режиме с использованием 0,5-1,0 литровых колб, плоских стеклянных или металлических кювет, заполненных средой Hestrin-Schramm на 30-50% по объему, в статических условиях в термостате и в динамических условиях на термостатируемой качалке при 29-30°С. В зависимости от условий культивирования получаемая бактериальная целлюлоза может быть в виде гель-пленки, сплетенных нитей, ворса, суспензии и др. (фиг. 3).

При культивировании на жидкой среде Hestrin-Schramm в течение 7 суток в конических колбах на 250 мл с объемом питательной среды 100 мл (начальная рН=6.0, температура инкубирования 30°С) в статических условиях образуется целлюлозная плотная пленка: на глюкозе 105,8 г/л; на сахарозе 101,2 г/л; на мальтозе 72,6 г/л (фиг. 4).

При поверхностном культивировании на жидкой среде Hestrin-Schramm на глюкозе от 3 до 7 суток в плоских кюветах при высоте налива среды - 1,0-1,5 см (начальная рН=6.0, температура инкубирования 30°С) в статических условиях образуется целлюлозная плотная гель-пленка массой от 200 до 350 г/л.

При культивировании в глубинной культуре с перемешиванием (динамический режим) в стеклянных колбах с коэффициентом заполнения 0,3-0,5 на термостатируемой качалке (120 об./мин) из целлюлозы образуются сферические, нитевидные, жгутовидные структуры с выходами бактериальной целлюлозы до 133,5 г/л.

Для реализации режима синтеза бактериальной целлюлозы штамм Komagataeibacter xylinus В-12068 выращивают в периодическом режиме выращивания (статическом поверхностном или глубинном динамическом) на среде с источником углерода - сахарами.

Для культивирования штамма применимы среды следующего состава:

Среда 1: для получения бактериальной целлюлозы включает: источники углерода - глюкозу, азота - пептон, витаминов - дрожжевой экстракт, минеральных добавок - Na₂HPO₄, дополнительный источник углерода - моногидрат лимонной кислоты и воду при следующем соотношении ингредиентов, вес.%:

глюкоза - 2,0;

пептон - 0,5;

дрожжевой экстракт - 0,5;

Na₂HPO₄ - 0,27;

моногидрат лимонной кислоты - 0,115;

вода - остальное.

Среда 2: содержит глюкозу, пептон, дрожжевой экстракт, безводный K₂HPO₄ и воду при следующем соотношении ингредиентов, вес.%:

глюкоза - 0,5;

пептон - 0,5;

дрожжевой экстракт - 0,5;

K₂HPO₄ (безводный) - 0,1;

вода - остальное.

Среда 3: содержит 100 г сахарозы и 500 мл экстракта черного чая, полученного мацерацией 2 г чайного листа при температуре 70-90°С в течение 15 мин, после полного растворения сахарозы объем доводят до 1 л.

Культивирование проводят в течение 7 суток при температуре 30°С, начальное значение рН=6.0, в статических условиях поверхностным способом и в динамических условиях в глубинной культуре с перемешиванием с использованием шейкера «Incubator Shaker Series Innova 44».

В зависимости от условий выращивания штамма полученный продукт (бактериальная целлюлоза) представляет собой гель-пленку. Полученную бактериальную целлюлозу снимают с поверхности или извлекают из среды.

Для очистки пленку бактериальной целлюлозы помещают в 0,5% раствор NaOH на 24 ч при температуре 25-27°С, и периодически перемешивают.

После промывки в дистиллированной воде, пленку помещают в 0,5% раствор соляной или уксусной кислоты на 24 ч, после чего промывают дистиллированной водой до получения реакции промывочных вод pH 6-7, и высушивают на воздухе при комнатной температуре до постоянной массы.

Стерилизуют полученные пленки в автоклаве при 1 атм. (121°С) в течение 15 минут. До стерилизации добавляют дистиллированную воду в отношении 1:10 (1 г сырой пленки: 10 мл дистиллированной воды).

Стерильные сырые пленки хранят в дистиллированной воде в закрытых емкостях. При высушивании бактериальной целлюлозы до постоянной массы хранение осуществляют при средней комнатной температуре 15-25°С и влажности не более 60%.

Определение выхода бактериальной целлюлозы проводят следующим образом: отмытые пленки помещают на фильтровальную бумагу для удаления излишней влаги и далее взвешивают. Содержание сухого вещества в образце целлюлозы - отношение массы испытуемого образца после сушки до постоянной массы при температуре (105±2)°С в определенных условиях к его массе до высушивания. Содержание сухого вещества выражается в процентах.

Структуру поверхности бактериальной целлюлозы анализируют растровой электронной микроскопией (Phillips SEM 525 М). Рентгеноструктурный анализ и измерение степени кристалличности сухих образцов бактериальной целлюлозы выполнены на рентгеноспектрометре D8 ADVANCE "Bruker" (Германия) (графитовый монохроматор на отраженном пучке).

Пример 1.

Культивирование штамма Komagataeibacter xylinus В-12068 проводят в статическом режиме в колбах емкостью 250 мл, содержащих 100 мл питательной среды Hestrin-Schramm с мальтозой в следующем соотношении, вес.%:

мальтоза - 2,0;

пептон - 0,5;

дрожжевой экстракт - 0,5;

Na₂HPO₄ - 0,27;

моногидрат лимонной кислоты - 0,115;

вода - остальное.

Посевную культуру вносят в количестве 1 мл. Инкубируют при 30°С, через 7 суток пленку бактериальной целлюлозы извлекают из среды и помещают для очистки в 0,5% раствор NaOH на 24 ч при температуре 25-27°С, при периодическом перемешивании. Затем пленку промывают дистиллированной водой, нейтрализуют 0,5% раствором уксусной кислоты, и снова промывают дистиллированной водой до получения реакции промывочных вод pH 6-7. Выход пленки составляет 7,26 г.

Пример 2.

В условиях примера 1 питательная среда содержит глюкозу в количестве 2,0 вес.%. Выход пленки составляет 10,58 г.

Пример 3.

Культивирование штамма Komagataeibacter xylinus В-12068 проводят в статическом режиме в плоских кюветах емкостью 1000 мл, содержащих 500 мл питательной среды Hestrin-Schramm с глюкозой в следующем соотношении, вес.%:

глюкоза - 2,0;

пептон - 0,5;

дрожжевой экстракт - 0,5;

Na₂HPO₄ - 0,27;

моногидрат лимонной кислоты - 0,115;

вода - остальное.

Высота слоя питательной среды 1,0-1,2 см. Посевную культуру вносят в количестве 5 мл. Инкубируют при 30°С, через 7 суток пленку бактериальной целлюлозы извлекают из среды и очищают, как описано в примере 1. Выход пленки составляет 171,24 г.

Пример 4.

Культивирование штамма Komagataeibacter xylinus В-12068 проводят в динамическом режиме в колбах емкостью 500 мл, содержащих 200 мл питательной среды Hestrin-Schramm с глюкозой в следующем соотношении, вес.%:

глюкоза - 2,0;

пептон - 0,5;

дрожжевой экстракт - 0,5;

Na₂HPO₄ - 0,27;

моногидрат лимонной кислоты - 0,115;

вода - остальное.

Посевную культуру вносят в количестве 2 мл. Инкубируют при 30°С на термостатируемой качалке (120 об./мин.), через 7 суток пленку бактериальной целлюлозы отделяют от среды и очищают, как описано в примере 1. Выход пленки составляет 58,31 г.

Использование штамма Komagataeibacter xylinus ВКПМ В-12068 позволяет получать бактериальную целлюлозу с высокими выходами до 200-350 г/л, при поверхностном и глубинном культивировании на жидкой питательной среде, с использованием в качестве источника углерода - глюкозы.

Изобретение относится к области биотехнологии. Штамм Komagataeibacter xylinus депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под регистрационным номером ВКПМ В-12068. Бактериальная целлюлоза может быть использована для восстановительной хирургии, тканевой регенерации и восстановления кожных покровов. Изобретение позволяет повысить выход бактериальной целлюлозы. 7 ил., 4 пр.

Штамм бактерий Komagataeibacter xylinus ВКПМ В-12068 - продуцент бактериальной целлюлозы.