СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ НОВООБРАЗОВАНИЙ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2015 года по МПК C12Q1/00 C12Q1/68 

Изобретение относится к области молекулярной биологии и медицины, в частности к онкологии, и предназначено для быстрого определения типа злокачественных новообразований щитовидной железы (ЩЖ) человека (папиллярный рак, медуллярный рак, фолликулярный рак, фолликулярная аденома) или типа доброкачественных новообразований.

Узловые патологии ЩЖ доминируют по распространенности среди патологий эндокринной системы и встречаются, по различным данным, у 5-10% населения. Из них примерно 5% являются злокачественными и требуют оперативного вмешательства. Во многих регионах мира отмечается отчетливая тенденция роста заболеваемости раком ЩЖ. Самым распространенным типом рака ЩЖ является папиллярный рак (80-85% всех случаев). Фолликулярный рак встречается в 5-15% случаев, медуллярный рак - в 5% случаев. Плоскоклеточный рак и анапластический рак достаточно редко встречаются - в 0.2-0.7% и 0.1-1% случаев всех карцином, соответственно.

Наличие мутации гена BRAF, как диагностического и прогностического маркера, у пациентов с папиллярным раком ЩЖ, встречающейся по различным данным в 29.4-92.1% случаев, свидетельствует о более злокачественном течении заболевания, однако отсутствие мутации не означает отсутствие папиллярного рака [1].

Точность дооперационной диагностики типа новообразования ЩЖ принципиально важна, поскольку именно диагноз определяет как объем оперативного вмешательства и последующего лечения, так и прогноз заболевания.

Наибольшие сложности связаны с дооперационной диагностикой фолликулярного рака ЩЖ, который в большинстве случаев не может быть дифференцирован от фолликулярной аденомы. Особенно сложно различить цитологически атипичную фолликулярную аденому от фолликулярной опухоли. Участки атипии в аденоме могут иметь различную степень выраженности и гетерогенности и по клеточной структуре такую фолликулярную аденому от фолликулярного рака отличить очень трудно. Окончательный диагноз в таких случаях ставится только после операции: диагностируют фолликулярный рак, если при гистологическом исследовании будет установлено прорастание опухоли в капсулу и сосудистая инвазия [2].

В настоящее время основным методом диагностики является дооперационное цитологическое исследование биоптата опухоли.

Известен стандартный способ дифференциальной диагностики опухолей ЩЖ, включающий забор материала опухоли пациента путем аспирационной биопсии или вырезания фрагментов ткани опухоли, удаленной во время операции, приготовление препаратов для морфологического анализа - стандартных гистологических срезов толщиной 5-6 мкм, их стандартную окраску для гистологического исследования и цитологическое исследование аномальных клеток опухоли ЩЖ [3].

Способ не точный, не количественный, достаточно субъективный и требует большого практического опыта врачей при визуальной оценке структур опухоли и раковых клеток.

В связи с необходимостью совершенствования подходов к дооперационному типированию патологий ЩЖ актуальной задачей является разработка способов диагностики новообразований ЩЖ с использованием биомаркеров.

В качестве таких маркеров могут выступать микроРНК, представляющие собой короткие (18-24 нуклеотида) не кодирующие белок молекулы РНК, регулирующие экспрессию множества генов на посттранскрипционном уровне. МикроРНК участвуют практически во всех базовых процессах от момента возникновения организма: эмбриональном развитии, пролиферации, дифференцировке, старении, иммунном и стрессорном ответах, геномном импринтинге, в ключевых процессах метаболизма. Исследования последних лет показали, что микроРНК сами могут выступать в роли онкогенов и супрессоров опухолевого роста, при развитии самых разнообразных опухолей, в том числе и новообразований ЩЖ, содержание многих микроРНК существенно изменяется.

Известен способ диагностики новообразований ЩЖ путем измерения уровня экспрессии микроРНК на основе микрочипа (технология microarray) по классификации фолликулярной неоплазии ЩЖ [4]. Способ заключается в измерении экспрессии 4-х групп микроРНК для улучшения дооперационной диагностики узелковых образований ЩЖ. Первая комбинация, состоящая из 14 и 2 микроРНК, позволяет, согласно двухстороннему классификатору с вероятностью от 0 до 1, получить ответ на один из поставленных вопросов: а) фолликулярная неоплазия (аденома или карцинома) или норма; б) фолликулярная аденома или норма и в) фолликулярная карцинома или норма. Вторая комбинация, состоящая из 2-х и нескольких дополнительных из 4-ой группы в 59 микроРНК, позволяет различить сильно агрессивную фолликулярную карциному, склонную к образованию метастазов, и минимально агрессивную фолликулярную карциному ЩЖ.

Недостатками известного способа являются сложность, громоздкость, дороговизна, ограниченные функциональные возможности, поскольку классификатор служит для распознавания в основном злокачественного и доброкачественного подтипов фолликулярного рака ЩЖ. Кроме того, диапазон количественных измерений при использовании микрочипов значительно уже, этот метод дает практически на порядок менее точные результаты, чем метод ПЦР в реальном времени.

Наиболее ближайшим к заявляемому способу - прототипом, является способ дифференциальной диагностики новообразований ЩЖ путем измерения уровня экспрессии микроРНК [5], заключающийся в следующем. Образцами для исследования служили замороженные или свежие образцы опухолевой ткани ЩЖ или клетки, фиксированные ткани или клетки железы, полученные при биопсии или при хирургической операции. Анализ микроРНК из образцов нормальной ткани ЩЖ и ткани опухолевого образования проводили с помощью микрочипов (технология microarray). Общее количество анализируемых микроРНК составляло 44, разделенных на 6 групп по 4, 18, 4, 6, 5 и 7 микроРНК в каждой, соответственно. За снижение или повышение экспрессии микроРНК считали 4-, 6-, 8-, 10-, 20- и 40-кратное изменение. Результат исследования образца ЩЖ пациента представляли в виде вероятностного значения от 0% до 100%, что пациент имеет злокачественное или доброкачественное новообразование ЩЖ. Образец считался злокачественным, если отмечали повышенную экспрессию одной или нескольких микроРНК из 1 группы (4 микроРНК) или снижение экспрессии одной или нескольких микроРНК из 2 группы (18 микроРНК); или образец также считался злокачественным, если отмечали повышенную экспрессию одной или нескольких микроРНК из 3 группы (4 микроРНК) или снижение экспрессии одной или нескольких микроРНК из 4 группы (6 микроРНК). Образец считался не злокачественным (фолликулярная аденома), если отмечали повышенную экспрессию одной или нескольких микроРНК из 5 группы (5 микроРНК) или снижение экспрессии одной или нескольких микроРНК из 6 группы (7 микроРНК).

Недостатками известного способа являются длительность, трудоемкость и ограниченные функциональные возможности, поскольку он не обеспечивает типирования опухолевых патологий ЩЖ, а только позволяет отличить злокачественное новообразование от доброкачественного вероятностным способом.

Задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, является упрощение способа, расширение функциональных возможностей способа за счет определения типа злокачественного или доброкачественного новообразования, а также сокращение длительности диагностики новообразований ЩЖ.

Технический результат: упрощение, расширение функциональных возможностей способа за счет определения типа злокачественного новообразования (папиллярный, медуллярный, фолликуллярный рак) или доброкачественного (опухолеподобные патологии (ОПП), фолликулярная аденома) и сокращение длительности способа.

Поставленная задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующем.

Забор образца опухолевой ткани ЩЖ человека и образца прилежащей неизмененной ткани железы в качестве контроля осуществляют при операции или с помощью тонкоигольной аспирационной пункционной биопсии (ТАПБ). Из полученных образцов выделяют суммарный пул РНК (в том числе содержащий и микроРНК) любым пригодным методом выделения нуклеиновых кислот, например [6].

Далее проводят измерение уровней экспрессии 13 микроРНК, а именно микроРНК-21, -221, -222, -205, -146b, -31, -187, -181b, -375, -199b, -144, -200а, -200b (диагностируемые микроРНК) в опухолевых образцах, в сравнении с нормальными тканями, методом ОТ-ПЦР в реальном времени (qRT-PCR платформа) [7], позволяющим селективно выявлять зрелые микроРНК с высокой чувствительностью и специфичностью. Метод ОТ-ПЦР включает в себя обратную транскрипцию зрелой микроРНК с помощью длинного праймера со шпилькой, с последующей детекцией полученной к ДНК с помощью ПЦР в реальном времени. В качестве внутреннего контроля используют малую РНК U6, которая характеризуется стабильной экспрессией. Сочетание времени и температуры на каждом этапе протокола реакции подбирают специально для эффективной реакции с используемыми олигонуклеотидами.

Заключение о наличии и типе новообразования ЩЖ составляют на основании комплексного критерия, рассчитанного на основе медианных (средних) значений уровней экспрессии микроРНК в разных типах новообразований ЩЖ, представленного в классификаторе (таблица 1).

Комплексный критерий заключаются в том, что для каждого типа новообразования ЩЖ из 13 диагностируемых микроРНК экспериментально выбраны несколько микроРНК, представляющие специфический профиль экспрессии микроРНК, который характеризует именно конкретный тип опухоли ЩЖ. Комплексный критерий позволяет типировать новообразование ЩЖ на основании количественных критериев не отдельных уровней экспрессии определенных диагностических микроРНК, а их специфических профилей, т.е. группы в несколько микроРНК одновременно. Так, каждый тип новообразования ЩЖ характеризуется определенным специфическим профилем микроРНК, представляющим собой выборку из 13 исследованных микроРНК, т.е. 9, 10 или 12 микроРНК в различном сочетании.

В соответствии с таблицей 1 можно составить заключение, что:

- если в образце опухолевой ткани ЩЖ из специфического профиля 9-ти микроРНК-21, -221, -222, -205, -146b, -31, -187, -181b, -375 уровень микроРНК-146b или микроРНК-31 повышен, либо уровень трех любых из перечисленных 9 повышен, и при этом уровень микроРНК-31 не понижен, то имеется (можно констатировать) наличие папиллярного рака ЩЖ;

- если в образце опухолевой ткани ЩЖ из специфического профиля 10- ти микроРНК-21, -221, -222, -205, -187, -199b, -31, -144, -146b, -375 уровень микроРНК-146b не повышен, уровень двух любых из микроРНК-21, -221, -222, -187, -375 повышен, при этом уровень трех любых из микроРНК-205, -31, -199b, -144 понижен, то можно констатировать наличие медуллярного рака ЩЖ;

- если в образце опухолевой ткани ЩЖ из специфического профиля 10-ти микроРНК-21, -221, -222, -205, -199b, -31, -144, -187, -146b, -375 уровень микроРНК-221 или микроРНК-222, или микроРНК-187 повышен, уровень микроРНК-199b понижен, уровни микроРНК-21, -146b, -205, -375 не повышены, при этом уровень хотя бы одной из микроРНК-205, -31,-144, -375 понижен, то можно констатировать наличие фолликулярного рака ЩЖ;

- если в образце опухолевой ткани ЩЖ из специфического профиля 12-ти микроРНК-21, -221, -222, -205, -200а, -200b, -31, -199b, -181b, -187, -144, -375 уровни микроРНК-21, -221, -222, -200b не повышены, из микроРНК-181b, -187, -375 повышен уровень не более чем одной, уровни двух любых из микроРНК-205, -200а, -200b, -31, -199b, -144, -375 понижены, то можно констатировать наличие фолликулярной аденомы ЩЖ;

- если в образце опухолевой ткани ЩЖ из специфического профиля 9 микроРНК-21, -221, -222, -205, -200а, -200b, -31, -199b, -144 уровни микроРНК-21, -221, -222, -205, -200а, -200b, -31 не повышены, а уровни микроРНК -199b, -144 понижены, то можно констатировать наличие ОПП ЩЖ.

Определяющими отличиями заявляемого способа, по сравнению с прототипом, являются:

1) В образцах опухолевой ткани, в сравнении с условно нормальными образцами ткани ЩЖ, измеряют уровни экспрессии экспериментально подобранных 13-ти микроРНК (микроРНК-21, -221, -222, -205, -146b, -31, -187, -181b, -375, -199b, -144, -200а, -200b), что позволяет упростить способ в сравнении с прототипом вследствие подбора минимально значимого количества диагностируемых микроРНК, ускорить проведение диагностики (5-6 часов или один рабочий день, вместо как минимум трех рабочих дней по прототипу), а также обеспечить возможность типирования новообразований ЩЖ, используя специфические изменения уровней экспрессии (профили) диагностируемых микроРНК;

2) Измерение уровня экспрессии 13 микроРНК в образцах опухолевой ткани в сравнении с условно нормальными образцами ткани проводят методом ОТ-ПЦР в реальном времени (qRT-PCR платформа), что позволяет расширить диапазон количественных характеристик экспрессии определенных генов по сравнению с методом microarray (прототип). Кроме этого, метод microarray имеет более низкую специфичность, чем qRT-PCR, поэтому неприемлем для получения абсолютных количественных характеристик и для быстрого анализа образцов в клинической практической онкологии;

3) Заключение о наличие и типе новообразования ЩЖ составляют на основании комплексного критерия, рассчитанного на основе медианных значений уровней экспрессии микроРНК в разных типах новообразований ЩЖ, представленного в классификаторе (таблица 1), что позволяет расширить функциональные возможности способа за счет обеспечения возможности типирования злокачественных новообразований ЩЖ человека (папиллярный рак, фолликулярный рак, медуллярный рак) и доброкачественных новообразований (фолликулярная аденома, ОПП).

Выбранные для анализа микроРНК являются онкогенными или онкосупрессорными или имеющими непосредственное отношение к процессу метастазирования (по эпителиально-мезенхимной трансформации, способности стимулировать образование метастазов), или отличающимися по степени участия в процессах апоптоза, ангиогенеза и инвазивности. Данные 13 микроРНК являются оптимальными и достаточными для определения типов новообразований ЩЖ.

Предварительно, для определения и обоснования диагностических значений микроРНК, был проведен сравнительный анализ уровней экспрессии 13 человеческих микроРНК: микроРНК-21, микроРНК-221, микроРНК-222, микроРНК-146b, микроРНК-205, микроРНК -31, микроРНК-187, микроРНК-181b, микроРНК-375, микроРНК-199b, микроРНК-144, микроРНК-200а, микроРНК-200b в 208 образцах операционного материала с различными гистопатологическими типами опухолей, различающихся по степени злокачественности. Согласно данным гистологического заключения образцы распределились следующим образом: 108 случаев - папиллярный рак, 16 случаев - фолликулярный рак, 4 - медуллярный рак, 41 - фолликулярная аденома и в 39 случаях - опухолеподобные патологии (ОПП, к которым относятся зоб и аутоиммунный тиреоидит).

Оценку изменения уровня экспрессии диагностируемых микроРНК в опытном образце по отношению к контрольному (т.е. опухолевой и нормальной ткани ЩЖ) вычисляли по стандартной формуле [8]:

где Е - эффективность реакции амплификации микроРНК (E_miR) или внутреннего контроля U6(E_U6), Ct - пороговый цикл реакции. Все значения Ct определяют как для опухоли (оп), так и для нормы (норм).

При проведении сравнительного анализа уровней экспрессии 13 онкогенных и онкосупрессорных микроРНК в разных типах опухолей ЩЖ человека - доброкачественных (фолликулярная аденома, ОПП) и злокачественных (папиллярный рак, фолликулярный рак и медуллярный рак) новообразованиях, были определены характерные для каждого вида новообразования специфические профили экспрессии микроРНК и сведены в классификатор (таблица 1).

Предлагаемый способ отличается высокой диагностической специфичностью, чувствительностью, а также высокой предсказательной ценностью положительного и отрицательного результатов для всех типов опухолей (практически все выше 90%).

Предлагаемый способ позволяет просто, быстро и точно идентифицировать и различать типы злокачественных новообразований ЩЖ человека (папиллярный рак, фолликулярный рак, медуллярный рак) и доброкачественные новообразования - фолликулярную аденому, ОПП.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения способа.

Пример 1

У пациента №170 во время операции были взяты образцы ткани опухоли щитовидной железы и прилежащей неизмененной ткани железы для контроля и продиагностированы заявляемым способом.

Выделение РНК. Выделение суммарного пула РНК, содержащего также и микроРНК, из образцов ткани проводили с помощью набора «РеалБест экстракция 100» (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск) в соответствии с инструкцией производителя. К 50 мг ткани добавляли 500 мкл лизирующего гуанидинового буфера, содержащего 4 М гуанидин изотиоцианат, 25 мМ цитрат натрия, 0,3% саркозил, 3% дитиотреитол. Ткань в растворе интенсивно перемешивали и оставляли в термошейкере при 65°С на 15 мин. Раствор центрифугировали 2 мин на 10000 об/мин, переносили супернатант в новые пробирки и добавляли к нему равный объем изопропанола, перемешивали и оставляли при комнатной температуре на 5 мин. Центрифугировали 10 мин при 13000 об/мин, супернатант сливали, а осадок промывали с помощью 500 мкл 70% этанола, затем 300 мкл ацетона. РНК растворяли в 200 мкл деионизованной воды.

Реакция обратной транскрипции. Реакцию обратной транскрипции для получения копии кДНК проводили в объеме 50 мкл. Использовали готовые реакционные смеси «РеалБест Мастер микс ОТ» (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск). Реакция обратной транскрипции содержала: 3 мкл выделенной РНК, 16.2 мкл 40% раствора трегалозы, 3 мкл 10х буфера для обратной транскрипции, 3 мкл 4 мМ раствора дезоксинуклеозидтрифосфатов, 3 мкл 10% раствора бычьего сывороточного альбумина (BSA), 100 e.a.M-MLV обратной транскриптазы, 1.5 мкл 10 мкМ раствора соответствующего праймера для обратной транскрипции. Использованные праймеры приведены в таблице 2.

Реакцию проводили в течение 30 мин при 42°С, после чего реакционную смесь инкубировали 2 мин при 95°С для инактивации обратной транскриптазы. Полученную реакционную смесь, содержащую кДНК, в объеме 3 мкл сразу использовали в качестве матрицы для проведения ПЦР.

ПЦР в реальном времени. Измерение уровней экспрессии 13-ти микроРНК-21, -221, -222, -205, -146b, -31, -187, -181b, -375, -199b, -144, -200а, -200b проводили методом ПЦР в реальном времени на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad Laboratories, США). В качестве контроля использовали малую РНК U6. Использовали праймеры и зонды, приведенные в таблице 2. Реакцию проводили в объеме 30 мкл: 3 мкл полученной кДНК, 14 мкл H₂O, 3 мкл 10х буфера для ПЦР (ЗАО «Вектор-Бест»), 3 мкл 4 мМ раствора дезоксинуклеозидтрифосфатов, 3 мкл 10% раствора BSA, 1 е.а. Taq-полимеразы (ЗАО «Вектор-Бест») в комплексе с моноклональными антителами к ее активному центру (Clontech, США), 3 мкл раствора прямого и обратного праймеров (5 мкМ) и зонда (2.5 мкМ).

Протокол реакции ПЦР: предварительный прогрев при 94°С - 2 мин, 50 основных циклов: денатурация при 94°С - 10 сек, отжиг и элонгация: 60°С - 20 сек.

Изменение уровня экспрессии каждой микроРНК в опытном образце (fold change) по отношению к контрольному (во сколько раз) с учетом эффективности амплификации вычисляли по стандартной формуле [8].

Для каждого пациента измерения проводили в 3 образцах нормальной ткани и 3 образцах опухолевой ткани ЩЖ, для расчетов использовали средние значения. Учитывая случайную ошибку методики анализа, достоверным считали регистрируемое отличие содержания микроРНК в опытном образце (опухолевая ткань ЩЖ) в 5 и более раз (в большую или меньшую сторону) по отношению к контролю (нормальная ткань ЩЖ).

Для сравнения полученных результатов дополнительно была проведена детекция мутации в гене BRAF (V600E) с помощью аллель-специфичной ПЦР с гидролизуемым зондом, использованные праймеры и зонды приведены в таблице 3. Протокол ПЦР: предварительный прогрев при 95°С - 2 мин, 50 основных циклов: денатурация при 94°С - 10 сек, отжиг и элонгация: 60°С - 15 сек.

Результаты, полученные при измерении уровней экспрессии микроРНК образцов пациента №170, представлены в таблице 4. Жирным шрифтом указаны значимые, более чем в 5 раз, изменения уровней экспрессии микроРНК, из составляющих специфический профиль экспрессии микроРНК данного пациента. Из таблицы 4 видно, что уровень экспрессии микроРНК-146b повышен, при этом уровни экспрессии микроРНК-221, -222 и -375 тоже повышены, а уровень экспрессии микроРНК-31 не понижен, поэтому в соответствии с классификатором (таблица 1) можно сделать заключение о наличии у пациента папиллярного рака ЩЖ.

Дооперационный диагноз по ТАПБ пациента №170 - папиллярный рак; гистологический на операционном материале - фолликулярный рак T1N0M0; диагноз по наличию мутации BRAF - папиллярный рак.

Таким образом, заявляемый способ дифференциальной диагностики новообразований ЩЖ человека является более точным и надежным, чем гистологический и цитологический, что позволяет избежать ошибок в диагностике опухолевых патологий ЩЖ.

Пример 2

У пациента №28 во время операции были взяты образцы ткани опухоли щитовидной железы и прилежащей неизмененной ткани железы для контроля. Способ диагностики новообразования ЩЖ пациента осуществляли аналогично примеру 1. Результаты, полученные при измерении уровней экспрессии микроРНК образцов пациента №28, представлены в таблице 5. Из таблицы 5 видно, что уровень экспрессии микроРНК-146b повышен, при этом уровни экспрессии микроРНК-21, -221, -222 повышены, а уровень экспрессии микроРНК-31 не понижен, поэтому в соответствии с классификатором (таблица 1) можно сделать заключение о наличии у пациента папиллярного рака ЩЖ.

Дооперационный диагноз пациента №28 по ТАПБ - фолликулярная опухоль; гистологически на операционном материале - аденома эмбрионально-фетального типа; диагноз по наличию мутации BRAF - папиллярный рак.

Диагноз патоморфолога после вторичной независимой экспертизы, проведенной для всех случаев с несовпадением цитологических, гистологических и молекулярно-генетических результатов обследования - фолликулярный вариант папиллярного рака. Фолликулярный вариант папиллярного рака - это второй по частоте подтип папиллярной карциномы ЩЖ, который встречается в 23-41% случаев [9]. Вывод: наличие мутации BRAF и результаты вторичной независимой экспертизы подтверждают результаты, полученные заявляемым способом, а именно о наличии у пациента №28 злокачественной опухолевой патологии - папиллярного рака.

Пример 3

У пациента №97 во время операции были взяты образцы ткани опухоли щитовидной железы и прилежащей неизмененной ткани железы для контроля. Способ диагностики новообразования ЩЖ пациента осуществляли аналогично примеру 1.

Дооперационный диагноз пациента №97 по ТАПБ - микрофолликулярная аденома; гистологически на операционном материале - микрофолликулярная аденома. Результаты, полученные при измерении уровней экспрессии микроРНК образцов пациента №97, представлены в таблице 6. Из таблицы 6 видно, что уровень экспрессии микроРНК-146b повышен, при этом уровни экспрессии микроРНК-221, -222, -187 и -375 повышены, а уровень экспрессии микроРНК-31 не понижен, поэтому в соответствии с классификатором (таблица 1) можно сделать заключение о наличии у пациента папиллярного рака ЩЖ.

Диагноз по уровням экспрессии специфических для данного типа рака микроРНК и наличию мутации BRAF - папиллярный рак или фолликулярный вариант папиллярного рака. Диагноз после вторичной независимой экспертизы - фолликулярный вариант папиллярного рака.

Пример 4

У пациента №123 во время операции были взяты образцы ткани опухоли ЩЖ и прилежащей неизмененной ткани железы для контроля. Способ диагностики новообразования ЩЖ пациента осуществляли аналогично примеру 1. Дооперационный диагноз пациента №123 по ТАПБ - диффузный токсический зоб; гистологически на операционном материале - токсический зоб; диагноз по наличию мутации BRAF - папиллярный рак; диагноз по измерению уровня экспрессии микроРНК заявляемым способом - папиллярный рак.

Диагноз, поставленный патоморфологом после вторичной независимой экспертизы, - ОПП.

Результаты, полученные заявляемым способом путем измерения уровней экспрессии микроРНК в образцах опухолевой ткани пациента №123, представлены в таблице 7. Из таблицы 7 видно, что уровень экспрессии микроРНК-146b повышен, при этом уровни экспрессии микроРНК-21, -221, -222, -205, -187 повышены, а уровень экспрессии микроРНК-31 не понижен, поэтому в соответствии с классификатором (таблица 1) можно сделать заключение о наличии у пациента папиллярного рака ЩЖ.

Поскольку мутация BRAF - это бесспорное подтверждение наличия папиллярного рака, то диагностика заявляемым способом позволила разобраться в сложном и спорном случае, поставить верный диагноз и провести вовремя необходимое оперативное лечение. В противном случае пациент был бы обречен на позднее проведение оперативного лечения при раке и ухудшение прогноза.

Заявляемый способ позволит просто, быстро и точно диагностировать тип новообразования ЩЖ до операции, используя ткань опухоли, полученную с помощью ТАПБ или сразу после операции, чтобы подтвердить или скорректировать результаты, полученные при гистологическом и цитологическом исследовании, выбрать правильную тактику последующего лечения пациента.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Tang К.Т., Lee С.Н. BRAF mutation in papillary thyroid carcinoma: pathogenic role and clinical implications. J. Chin. Med. Assoc. - 2010. -V. 73.-№3.-P. 113-128.

2. Шкурупий В.А., Полоз Т.Л. Цитоморфология фолликулярных опухолей щитовидной железы. Дифференциальная диагностика методом компьютерного анализа изображений и нейросетевых технологий. /Новосибирск: Наука, 2009. - 190 с.

3. Богин Ю.Н. Комплексная экспресс-диагностика заболеваний щитовидной железы/ Ю.Н. Богин и др.// Методические рекомендации. - М., 1992. - 175 с.

4. Nielsen F.С., Rossing М., Bennedbaek F.N. Microrna classification of thyroid follicular neoplasia. - Patent WO 2011154008A1, Pub. 25.12.2011.

5. Beaudenon-Huibregtse S., Choudhary A. MiRNA as biomarkers for distinguishing benign from malignant thyroid neoplasms. - Patent 20120157334, Pub. 2012.

6. Tan S.C., Yiap B.C. DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present. J Biomed Biotechnol. - V. 2009 (2009). - Article ID 574398, 10 pages. - doi: 10.1155/2009/574398.

7. Chen C., Ridzon D.A., Broomer A.J., Zhou Z., Lee D.H., Nguyen J.T., Barbisin M., Xu N.L., Mahuvakar V.R., Andersen M.R., Lao K.Q., Livak K.J., Guegler K.J. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Research. - 2005. - V. 33. - №20. - e179, doi:10.1093/nar/gni178.

8. Pfaffl M.W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR //Nucleic Acids Res. - 2001. - V. 29. - №9. - e45.

9. Passler C., Prager G., Scheuba C., Niederle B.E., Kaserer K., Zetting G., Niederle B.Follicular variant of papillary thyroid carcinoma: a long-term follow-up. Arch Surq. - 2003. - V. 138. - №12. - P. 1362-1366.

Изобретение касается способа дифференциальной диагностики новообразований щитовидной железы (ЩЖ) человека. Способ включает выделение из образца опухолевой ткани ЩЖ человека и образца прилежащей неизмененной ткани железы (в качестве контроля) суммарного пула РНК (в том числе содержащий и микроРНК) любым из известных способов. Далее проводят измерение уровней экспрессии 13 микроРНК, а именно микроРНК-21, -221, -222, -205, -146b, -31, -187, -181b, -375, -199b, -144, -200а, -200b (диагностируемые микроРНК) в опухолевых образцах в сравнении с нормальными тканями методом ОТ-ПЦР в реальном времени. Заключение о наличии и типе новообразования ЩЖ составляют на основании комплексного критерия, рассчитанного на основе средних значений уровней экспрессии микроРНК в разных типах новообразований ЩЖ. Изобретение позволяет упростить возможность определения типа злокачественного новообразования (папиллярный, медуллярный, фолликуллярный рак) или доброкачественного (опухолеподобные патологии (ОПП), фолликулярная аденома) и сократить его длительность. 1 з.п. ф-лы, 7 табл., 4 пр.

1. Способ дифференциальной диагностики новообразований щитовидной железы человека, включающий взятие образца ткани опухоли щитовидной железы (ЩЖ) и прилежащей неизмененной ткани железы в качестве контроля, выделение суммарного пула РНК из образцов, измерение уровня экспрессии диагностируемых микроРНК с последующим сравнительным анализом изменения уровня экспрессии диагностируемых микроРНК в норме и при опухолевых образованиях ЩЖ и составлением заключения о наличии и типе злокачественного новообразования, отличающийся тем, что измеряют уровень экспрессии 13 микроРНК, а именно микроРНК-21, -221, -222, -205, -146b, -31, -187, -181b, -375, -199b, -144, -200а, -200b методом ОТ-ПЦР в реальном времени, а заключение о наличии и типе новообразования ЩЖ составляют на основании комплексного критерия, рассчитанного на основе средних значений уровней экспрессии микроРНК в разных типах новообразований ЩЖ, характеризующихся специфическим профилем микроРНК, при этом:
- если в образце опухолевой ткани ЩЖ из специфического профиля 9-ти микроРНК-21, -221, -222, -205, -146b, -31, -187, -181b, -375 уровень микроРНК- 146b или микроРНК-31 повышен, либо уровень трех любых из перечисленных микроРНК повышен, и при этом уровень микроРНК-31 не понижен, то делают заключение о наличии у пациента папиллярного рака ЩЖ;
- если в образце опухолевой ткани ЩЖ из специфического профиля 10-ти микроРНК-21, -221, -222, -205, -187, -199b, -31, -144, -146b, -375 уровень микроРНК-146b не повышен, уровень двух любых из микроРНК-21, -221, -222, -187, -375 повышен, при этом уровень трех любых из микроРНК-205, -31, -199b, -144 понижен, то делают заключение о наличии медуллярного рака ЩЖ;
- если в образце опухолевой ткани ЩЖ из специфического профиля 10-ти микроРНК-21, -221, -222, -205, -199b, -31, -144, -187, -146b, -375 уровень микроРНК-221 или микроРНК-222, или микроРНК-187 повышен, уровень микроРНК-199b понижен, уровни микроРНК-21, -146b, -205, -375 не повышены, при этом уровень хотя бы одной из микроРНК-205, -31, -144, -375 понижен, то делают заключение о наличии фолликулярного рака ЩЖ;
- если в образце опухолевой ткани ЩЖ из специфического профиля 12-ти микроРНК-21, -221, -222, -205, -200а, -200b, -31, -199b, -181b, -187, -144, -375 уровни микроРНК-21, -221, -222, -200b не повышены, из микроРНК-181b, -187, -375 повышен уровень не более чем одной, уровни двух любых из микроРНК-205, -200а, -200b, -31, -199b, -144, -375 понижены, то делают заключение о наличии фолликулярной аденомы ЩЖ;
- если в образце опухолевой ткани ЩЖ из специфического профиля 9 микроРНК-21, -221, -222, -205, -200а, -200b, -31, -199b, -144 уровни микроРНК-21, -221, -222, -205, -200а, -200b, -31 не повышены, а уровни микроРНК -199b, -144 понижены, то делают заключение о наличии доброкачественного новообразования ЩЖ.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что реакцию ОТ-ПЦР проводят на амплификаторе CFX96.