Способ оценки риска наличия рака щитовидной железы у пациентов с синдромом узлового зоба Российский патент 2024 года по МПК G01N33/58 G01N33/574 C12Q1/686 C12Q1/6886 

Изобретение относится к области медицины, а именно к онкологии и эндокринологии, и предназначено для оценки вероятности наличия рака у пациентов с синдромом узлового зоба на основе панели генетических маркеров.

Выявляемость рака щитовидной железы (РЩЖ) значительно увеличилась за последние три десятилетия. Отмечается мировая тенденция к увеличению распространенности РЩЖ. Успех лечения зависит от точной стратификации риска РЩЖ при первичной диагностике синдрома узлового зоба. Наряду с ультразвуковым исследованием (УЗИ) одним из основных методов в диагностике злокачественных образований щитовидной железы (ЩЖ) является тонкоигольная аспирационная пункционная биопсия (ТАПБ) с последующим цитологическим исследованием пунктата. Однако около 25% результатов ТАПБ имеют «неопределенное» цитологическое заключение (Bethesda III, IV, V). Наиболее актуальной проблемой на сегодняшний день являются категории III, IV по Bethesda (атипия неопределенного значения и фолликулярная неоплазия/подозрение на фолликулярную неоплазию), где риск рака широко варьирует от 6 до 40% [Dimpi Desai et al., Thyroid neoplasia and cancer Thyroseq V3 GC for Bethesda III and IV: An Institutional Experience, 2020]. Данной когорте пациентов проводятся повторные ТАПБ, а в некоторых случаях -диагностические операции, что сопряжено, помимо экономических затрат, с риском серьезных послеоперационных осложнений (2-10%), а в большинстве случаев - с необходимостью пожизненной заместительной терапии левотироксином и, как следствие, снижением качества жизни [Haugen В. R., et al. 2015; Семкина Г. В., Абросимов А. Ю., Абдулхабирова Ф. М., Ванушко В. Э. 2014; Моргунова Т. Б., и др. 2010]. В связи с этим не вызывает сомнения необходимость улучшения диагностической ценности методик предоперационной диагностики у пациентов с узловым зобом, особенно в случае с «неопределенным» цитологическим диагнозом, с целью своевременного выявления злокачественных образований.

Известен способ, описанный в патенте RU 2705110 СТ, который позволяет произвести дифференциальную диагностику доброкачественных и злокачественных образований ЩЖ. При неопределенных цитологических заключениях выполняют молекулярно-генетическую диагностику (изменение уровня экспрессии гена HMGA2, соматические точечные замены в генах BRAF, изменение уровня экспрессии ряда микроРНК, а также соотношение митохондриальной и ядерной ДНК) из предварительно высушенных цитологических препаратов производят выделение ДНК и miRNA из цитологических препаратов тонкоигольной аспирационной пункционной биопсии (ТАПБ) новообразований ЩЖ с помощью наборов для выделения, производят детекцию и количественную оценку miRNA, основанный на методе ПЦР. При получении показателей HMGA2 более 0.09, miRNA 221 более 0,0105 и miRNA 375 более -12,1213 определяют фолликулярную опухоль с признаками злокачественности, при показателях miRNA- 146b более 0.1721 определяют папиллярный рак, при показателях miRNA -375 более 5.2514 определяют медуллярный рак, а показатель соотношения митохондриальной ДНК/ядерной ДНК равно или более 5716,3013 - В-клеточный рак, наличие мутации V600 в гене BRAF-папиллярный рак и является риском наличия высокой биологической агрессивности данного папиллярного рака и наличия у данного пациента распространенного процесса.

Данное изобретение позволяет не только выявлять злокачественный процесс, но и определять тип опухоли, образцы разделялись на следующие группы: доброкачественные образования (ДО), фолликулярные опухоли без маркеров злокачественности (ФОБМЗ), фолликулярные опухоли с маркерами злокачественности (ФОМЗ), В-клеточные фолликулярные опухоли с маркерами злокачественности (В-ФОМЗ), папиллярный и медуллярный раки. Если проводить параллели с гистологической классификацией, то группа ФОБМЗ состоит в основном из фолликулярных аденом с некоторым количеством фолликулярных раков, для которых не было обнаружено молекулярных маркеров злокачественности. Группа ФОМЗ состоит из фолликулярных раков, части фолликулярных вариантов папиллярного рака и небольшого количества фолликулярных аденом, для которых были выявлены молекулярные маркеры злокачественности. В группу включены пациенты с показателями HMGA2 более 0,0918, miRNA -375 более -12,1213, miRNA -221 более 0,0105. А при показателях микроРНК-375 более 5.2514 определяют медуллярный рак. Группа -ФОМЗ соответствует В-клеточным фолликулярные раки. Средняя диагностическая точность молекулярно-генетического исследования - 90.1%, а цитологического исследования - 58.2%.

Недостатками известных способов является большее количество включенных биомаркеров, что ограничивает широкое применение в клинической практике, отсутствие возможности оценить прогноз рака щитовидной железы, значения не удобны для интерпретации практическими врачами.

Известен способ диагностики опухолей щитовидной железы у больных узловыми образованиями щитовидной железы (патент RU 2548773 C1), согласно которому проводят забор образца опухолевой ткани ЩЖ и образца прилежащей неизмененной ткани железы в качестве контроля осуществляемый при операции или с помощью ТАПБ, выделяют miRNA из образцов любым из известных способов. Для получения копии кДНК проводят реакцию обратной транскрипции с соответствующими праймерами (амплификация), полученную кДНК сразу используют в качестве матрицы для проведения ПЦР. Далее проводят измерение уровня miRNA -21, -221, -222, -155, -205 в опухолевых клетках в сравнении с нормальными тканями методом ПЦР в реальном времени. В качестве внутреннего контроля используют малую РНК U6, которая характеризуется стабильной экспрессией. В том случае, если изменение уровня экспрессии диагностических miRNA -21, -221, -222, -155, -205 не превышает 4-кратного значения как в сторону повышения, так и в сторону понижения экспрессии, т.е. находится в диапазоне [-4;+4], делают заключение о доброкачественном новообразовании, а если уровни экспрессии вышеназванных miRNA в опухоли при сравнении с нормальной тканью органа отличаются более чем в 4 раза, то делают заключение о злокачественном новообразовании. Данный способ требует забора материала участка незатронутой ткани, наряду с опухолевой тканью, что усложняет диагностический процесс, включает большее количество miRNA и не обладает прогностической способностью.

Технической проблемой является создание простого и эффективного способа, обеспечивающего улучшение диагностики РЩЖ у пациентов с синдромом узлового зоба на дооперационном этапе при подозрении на злокачественный процесс.

Раскрытие сущности изобретения

Техническим результатом предложенного изобретения является повышение эффективности диагностики рака у пациентов с узловыми образованиями щитовидной железы. Как следствие, снижение количества необоснованных хирургических вмешательств, выбора оптимального объема оперативного лечения.

Технический результат достигается при реализации способа оценки вероятности риска наличия рака щитовидной железы у пациента с узловыми образованиями щитовидной железы, включающего проведение молекулярно-генетического исследования цитологических образцов щитовидной железы, по итогам которого определяют уровень экспрессии miR145 и miR7 в условных единицах.

Далее рассчитывают значение Р1 по формуле:

где е - число Эйлера, и в случае рассчитанного значения Р1<0,5 делают вывод о низкой вероятности наличия рака щитовидной железы, при Р1≥0,5 делают вывод о высокой вероятности наличия рака щитовидной железы.

Краткое описание чертежей

Изобретение поясняется графиком, где на фиг.1 - ROC-анализ диагностической значимости определения экспрессии miRNA.

Осуществление изобретения

При разработке способа оценки вероятности на первом этапе было ретроспективно изучены данные 140 пациентов с узловым зобом, прооперированных в одном центре за 2018 г. с подозрением на РЩЖ. Проведена оценка результатов клинических, ультразвуковых, лабораторных исследований на основании клинико-морфологического сопоставления (анализ историй болезни и протоколов цитологичекого и гистологического исследований), отобраны материалы, удовлетворяющие качеством для проведения молекулярно-генетического исследования.

Среди пациентов преобладали женщины, с соотношением мужчины и женщины 1: 3,6. Средний возраст включенных пациентов составил 49 [19; 79] лет. Анализ возрастного состава больных свидетельствовал о значительной доле пациентов молодого возраста (18-44 года) - 40%. На долю пациентов средней возрастной группы (45-59 лет) приходилось 35,8%. Доля пациентов в возрасте 60-74 лет составила 17,1%, старше 75 лет - 7,1%. Таким образом большая часть - это пациенты трудоспособного возраста, что говорит о социальной значимости изучаемой проблемы. Большинство пациентов имели узлы более 1 см. Обращает на себя внимание, что 19,2% прооперированных имели узел менее 1 см. Оценка тиреоидного статуса показала, что 120 пациентов находились в эутиреозе без терапии со средним уровнем ТТГ 1,8±1,1 мкМЕ/мл, 6 пациентов - с гипофункцией ЩЖ и 20 пациентов - с гиперфункцией ЩЖ. Средний объем ЩЖ составил 33,0±27,2 мл.

На втором этапе было проведено молекулярно-генетическое исследование 112 пациентам на следующие параметры (уровней экспрессии гена HMGA2, 12 miRNA, miR144, miR145, miR146, miR155, miR183, miR199, miR221, miR31, miR551, miR375, miR451, miR7; мутации V600E в гене BRAF). Включенные в исследование послеоперационные гистологические образцы, которым было выполнено молекулярно-генетическое исследование, были разделены на 2 группы: I группа представлена злокачественными образованиями ЩЖ (n=54): папиллярный РЩЖ (n=47), фолликулярный РЩЖ (n=3), медуллярный РЩЖ (n=2), анапластический РЩЖ (n=2). Во II группу (группа контроля) вошли доброкачественные образования ЩЖ (n=58): фолликулярная аденома (n=30), коллоидный зоб - (n=28).

При подозрении на узловое образование ЩЖ первым этапом проводилась ультразвуковая диагностика. При размере узловых образований 1 см и более, а также при наличие подозрительных признаков на злокачественность в узлах менее 1 см проводится ТАПБ. При получении неоднозначных цитологических диагнозов (Bethesda III, IV или V), а также при получении расхождений по данным ультразвуковых, цитологических и гистологических результатов обследования, при неоднократном получении неинфомативных пунктатов (Bethesda I). Далее проводили молекулярно-генетическое исследование: предварительно высушенный цитологический препарат с цитологических стекол смывали в пробирку тремя порциями лизирующего буфера по 200 мкл каждая, затем проводили детекцию и количественную оценку диагностически значимых miRNA с помощью стандартных методов, например, ОТ-ПЦР-РВ с помощью термоциклера CFX96 (Bio-Rad Laboratories, США). Для каждой miRNA отдельно проводили реакцию обратной транскрипции с последующей ПЦР-РВ. Для каждого образца анализ проводили в одном повторе.

На последнем этапе работы в ходе многомерного анализа для выбора порогового уровня показателей (cut-off) и расчета чувствительности и специфичности был проведен ROC-анализ, в результате чего получены диагностические и прогностические модели. В результате проведенного анализа в диагностическую модель были включены уровни экспрессии 2 miRNA: miR145 и miR7 и следующая формула для расчета:

где е - число Эйлера, miR145 и miR7- уровни экспрессии соответствующих miRNA в условных единицах.

Критерием выбора значения cut-off принято требование максимально суммарной чувствительности и специфичности.

Площадь под ROC кривой для диагностической модели составила 0,99 (0,96-1,00) (р=0,006), коэффициент Наделькеркеса - 87,5%, что свидетельствует о высокой диагностической ценности полученной модели (фиг.1).

Чувствительность (Se) полученной модели составила 98,1% (89,9-100%), специфичность (Sp) - 96,6% (88,1-99,6%). Предсказательная ценность положительного (PPV) и отрицательного (NPV) результатов составили 98,2% (90,6-100%) и 96,3% (87,3-99,5%) соответственно. Диагностическая точность модели (De) составила 97,3% (92,3-99,4%).

Изобретение поясняется конкретными примерами выполнения, демонстрирующими возможность достижения требуемого технического результата.

Клинический случай № 1.

Пациент А., 59 лет. Больным считает себя с момента, когда отметил появление увеличенных лимфатических узлов шеи. При проведении биопсии лимфатического узла шеи выявлен метастаз папиллярного рака щитовидной железы. Далее, при обращении в отделение УКБ №1 по результатам цитологического исследования подтвердился диагноз папиллярный рак щитовидной (Bethesda VI) железы с метастатических поражением лимфатических узлов шеи с обеих сторон.

При исследовании цитологического материала уровень экспрессии miR145 составил 7,29 усл. ед., miR7m2 - 460,36 усл. ед. При вычислении дискриминантной функции получено значение;

После логит-преобразования получена высокая вероятность злокачественного образования

07.06.2018 пациенту проведено хирургическое лечение в объеме расширенная тиреоидэктомия с резекцией возвратных гортанных нервов с обеих сторон. Расширенная лимфаденэктомия на шее справа с удалением клетчатки задней поверхности шеи. Удаление клетчатки пре- и паратрахеальных областей с обеих сторон и передне-верхнего средостения. Пластика операционного дефекта перемещенными кожно-жировыми лоскутами. Трахеостомия. По результатам гистологии множественные узлы представлены очагами папиллярно рака щитовидной железы, с участками фолликулярного строения, опухоль прорастает капсулу щитовидной железы. 18.07.18 проведен курс радиойдтерапии активностью 3,7 ГБк. В августе 2018 г выявлен увеличенный яремный лимфатический узел, по результатам биопсии - метастаз папиллярно рака. Проведена повторная операция на лимфатических путях шеи справа. Пациент находится на супрессивной терапии под наблюдением онколога и эндокринолога.

Клинический случай № 2.

Пациентка С., 30 лет. В анамнезе правосторонний эутиреоидный зоб. По результатам цитологии - Bethesda IV. При исследовании цитологичексого материала уровень экспрессии miR145 составил 2,12 усл. ед., miR7m2 - 21,64 усл. ед. При вычислении дискриминантной функции получено значение:

После логит-преобразования получена низкая вероятность злокачественного образования

Выполнено оперативное лечение в объеме правосторонней гемитиреоидэктомии. По результатам гистологии - фолликулярная аденома на фоне многоузлового зоба.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии и эндокринологии, и может быть использовано для оценки риска наличия рака щитовидной железы у пациента с узловыми образованиями щитовидной железы. Проводят молекулярно-генетическое исследование цитологических образцов щитовидной железы, по итогам которого определяют уровень экспрессии miR145 и miR7. Рассчитывают значение вероятности наличия рака щитовидной железы Р1. В случае Р1<0,5 делают вывод о низкой вероятности наличия рака щитовидной железы. При Р1≥0,5 делают вывод о высокой вероятности наличия рака щитовидной железы. Способ обеспечивает повышение эффективности диагностики рака у пациентов с узловыми образованиями щитовидной железы за счет определения уровня экспрессии miR145 и miR7 в образце щитовидной железы. 1 ил., 2 пр.

Способ оценки риска наличия рака щитовидной железы у пациента с узловыми образованиями щитовидной железы, включающий проведение молекулярно-генетического исследования цитологических образцов щитовидной железы, по итогам которого определяют уровень экспрессии miR145 и miR7 в условных единицах, рассчитывают значение Р1 по формуле:

Р1=1/(1+е^-1,596*^miR145-0,041*^miR7-5,370),

где е - число Эйлера, и в случае рассчитанного значения Р1<0,5 делают вывод о низкой вероятности наличия рака щитовидной железы, при Р1≥0,5 делают вывод о высокой вероятности наличия рака щитовидной железы.