СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ Российский патент 2024 года по МПК G01N33/50 G01N33/574 C12Q1/6804 C12Q1/6886 

Изобретение относится к онкологии, а именно к диагностике злокачественных новообразований щитовидной железы с помощью тонкоигольной аспирационной биопсии (ТАБ).

Рак щитовидной железы по темпам годового прироста в последние годы опережает другие злокачественные образования. В Российской Федерации среднегодовой темп прироста РЩЖ за 10 лет с 2006 г. составил 2,54%, что в сумме увеличило показатель заболеваемости на 29,53%. В 2016 г. зарегистрировано 12194 новых случаев этой патологии (см. Каприн, А.Д., Старинский, В.В., Петрова, Г.В. Злокачественные новообразования в России в 2016 году. - М: МНИОИ им. П.А. Герцена филиал ФГБУ «НМИРЦ» Минздрава России, 2018. - 250 с.; см. Каприн, А.Д., Старинский, В.В., Петрова, Г.В. Состояние онкологической помощи населению России в 2016 году. - М., МНИОИ им. П.А. Герцена филиал ФГБУ «НМИРЦ» Минздрава России, 2017. - 236 с.). Все это делает проблему ранней диагностики чрезвычайно актуальной.

Во-первых, опухоли являются гормонозависимыми, что определяет характер патологического процесса. Известно, что рак щитовидной железы возникает на фоне гипотиреоза, вследствие врожденной или приобретенной патологии этого органа. Во-вторых, мультифокальность рака щитовидной железы требует тщательного дооперационного алгоритма обследования, что также затрудняет раннюю диагностику. Таким образом, у большинства больных речь может идти лишь о выявлении инвазивных локальных форм рака, а преинвазивные формы или микрокарциномы (до 10 мм) диагностируются в единичных наблюдениях на фоне другой патологии. Эти факторы обуславливает определенный подход к схеме клинико-морфологической дооперационной диагностике рака щитовидной железы (см. Шаталова Л.С., Козлова Ю.Г., Гафланова Д.М., Селютин С.А Бюллетень медицинских Интернет-конференций (ISSN 2224-6150) 2020. Том 10. №2. С. 61-63).

Дифференциальная диагностика разных по характеру узловых образований щитовидной железы (ЩЖ) далека от совершенства. Существующие методы современной диагностики позволяют установить локализацию узлового образования ЩЖ и не всегда уточнить характер заболевания. С целью морфологической верификации узловых образований ЩЖ чаще используют тонкоигольную аспирационную биопсию (ТАБ) под контролем УЗИ с последующим цитологическим исследованием полученного аспирата, эффективность которого остается невысокой (см. В.А. Белобородов, О.С. Олифирова, С.П. Шевченко, А.Т. Саая, В.А. Маньковский, О.В. Еселевич, Р.В. Модин. Морфологическая верификация рака щитовидной железы // Сибирский онкологический журнал. 2007. №2 (22). С. 69-72).

Точность и специфичность тонкоигольной биопсии при диагностике аутоиммунных заболеваний достигает 90%, а рака и других гиперплазий - 60-70%. соблюдение этапности диагностики морфологических изменений - дооперационная, интраоперационная и послеоперационная, и комплексность при применении различных методов исследования - цитологического, гистологического, иммуногистохимического, морфометрического позволили увеличить данные показатели до 80-90% (см. Г.А. Блувштейн, В.В. Греков Сложности морфологической диагностики заболеваний щитовидной железы // Новости хирургии 2012. Т. 20 №5. С. 18-23). По данным Г.А. Блувштейна и В.В. Грекова ложноположительные результаты цитологических заключений по раку ЩЖ имели место у 22 (2,3%) пациентов, ложноотрицательные результаты - у 29 (3,1%) пациентов, совпадение данных до- и интраоперационной диагностики с послеоперационным плановым гистологическим исследованием составили при раке щитовидной железы -91,1%, при узловом коллоидном зобе - 86,8%, при аутоиммунном тиреоидите - 54,2%. Основными причинами ошибок дооперационной диагностики тиреоидной патологии являются объективные трудности цитологической интерпретации при фолликулярном раке и редких формах рака ЩЖ. комплексное применение дооперационной ТАБ с последующим обязательным интраоперационным цитологическим исследованием способствует улучшению качества диагностики узлового зоба и позволяет выбрать оптимальный вид и объем операции.

В качестве аналога нами выбран способ диагностики рака щитовидной железы (ЩЖ), заключающийся в выявлении наличия мутаций V600E гена BRAF в дооперационном материале при ТАБ. В исследование были включены 46 пациентов с узловыми образованиями щитовидной железы, которым была проведена ТАБ. ДНК выделялась сорбентным методом из материала ТАБ. Выявление мутации гена BRAF проводилось с помощью ПЦР с праймерами, характерными для дикого и мутантного типа гена. По результатам цитологического исследования все пациенты были разделены на 3 группы: 1 группа - больные с узловым коллоидным зобом (УКЗ) (n=9), 2 группа - больные папиллярным раком (ПР) (n=19) и 3 группа - пациенты с неопределенными результатами ТАБ (n=18). В группе пациентов с ПР все диагнозы были подтверждены гистологически, и мутация гена BRAF была выявлена у 15 (79%) пациентов. В группе с неопределенным цитологическим диагнозом только у одного пациента определена мутация гена BRAF и при гистологическом исследовании был диагностирован фолликулярный рак. У 16 пациентов с гистологическим диагнозом «фолликулярная аденома», у 9 пациентов с УКЗ и у 1 пациента с фолликулярным раком мутации BRAFV600E выявлено не было. Таким образом, были получены следующие критерии достоверности метода: чувствительность - 76%, специфичность - 100% и диагностическая точность - 89% (см. Д.Ю. Семенов, М.И. Зарайский, М.Е. Борискова и соавт. Значение выявления мутации гена BRAF в дооперационной диагностике рака щитовидной железы // Клиническая и экспериментальная тиреоидология, 2009, том 5, №4. С. 33-37). Однако, небольшая выборка пациентов (всего 46 случаев) ставит под сомнение полученный результат чувствительности, специфичности и диагностической точности метода.

Мутация BRAF V600E наиболее распространена в случае папиллярного рака щитовидной железы (ПРЩЖ), ее частота достигает 45% (см. Charles R.P., Iezza G., Amendola E., Dankort D., et al. Mutationally activated BRAF(V600E) elicits papillary thyroid cancer in the adult mouse. Cancer Res. 2011; 71 (11): 3863-71. 20. Xing M. BRAF mutation in thyroid cancer. Endocr Relat Cancer. 2005; 12 (2): 245-62.).

В исследовании Medici подтвердили связь мутации BRAF V600E с агрессивностью рака и неблагоприятным прогнозом (см. Medici М., Kwong N., Angell Т.Е., Marqusee Е., et al. The variable phenotype and low-risk nature of RAS-positive thyroid nodules. BMC Med. 2015; 13: 184). При оценке линии BRAF V600E трансгенных мышей отмечался рост агрессивного тиреоидного папиллярного рака (см. Lee S.J., Lee М.Н., Kim D.W., Lee S., et al. Cross-regulation between oncogenic BRAF (V600E) kinase and the MST1 pathway in papillary thyroid carcinoma. PLoS One. 2011; 6 (1): e16180). Проведенный крупный метаанализ подтверждает более агрессивное течение ПРЩЖ при наличии мутации BRAF V600E (см. Li С, Lee K.С., Schneider Е.В., Zeiger М.А. BRAF V600E mutation and its association with clinicopathological features of papillary thyroid cancer: a meta-analysis. J Clin Endocrinol Metab. 2012; 97 (12): 4559-70). По результатам исследований Хенке, мутация BRAF V600E не является предиктором развития агрессивного ПРЩЖ (см. Henke L.E., Pfeifer J.D., Ma С., Perkins S.M., et al. BRAF mutation is not predictive of long-term outcome in papillary thyroid carcinoma. Cancer Med. 2015; 4 (6): 791-9).

В работе сделаны выводы, что мутация BRAF V600E невыраженно коррелирует с клинико-патологическими признаками ПРЩЖ.

В качестве прототипа была выбрана панель Thyra MIR (Interpace Diagnostics Morris Corporate Center 1, Building A300 Interpace Parkway Parsippany, исследование экспрессии 10 микроРНК). Оценивалась микроРНК - малая некодируемая часть РНК. Экспрессия различных микроРНК была зафиксирована в различных тиреоидных неоплазиях (см. Cancer Genome Atlas Research Network. Integrated genomic characterization of papillary thyroid carcinoma. Cell. 2014; 159: 676-90). Thyra MIR оценивает различные микроРНК: miR-29-b-1-5p, miR-31-5p, miR-138-1-3p, miR-139-5p, miR-146b-5p, miR-155, miR-204-5p, miR-222-3р, miR-551b-3p. По результатам можно предположить, злокачественное образование или нет. Комбинация панелей Thyra MIR и TheGenX в отношении цитологии неопределенного генеза демонстрировала чувствительность 84% и специфичность 80% (см. Аметов А.С., Дэпюи Т.И., Позднякова Н.В., Чемекова А.Р., Филатова Г.А. Генетические маркеры в диагностике рака щитовидной железы // Журнал для непрерывного медицинского образования врачей. Эндокринология: новости, мнения, обучение. 2018. Т. 7, №1. С. 42-49; см. Wylie D., Beaudenon-Huibregtse S., Haynes B.C., Giordano T.J., et al. Molecular classification of thyroid lesions by combined testing for miRNA gene expression and somatic gene alterations. J Pathol Clin Res. 2016; 2: 93-103.). Однако, выше описанный прототип обладал существенными недостатками, поскольку основывался на анализе результатов исследования 10-ти микроРНК, что, несомненно, повышало стоимость и продолжительность исследования, также не предлагался математический алгоритм, позволявший по соотношению получаемых параметров точно вычислить коэффициент, который бы использовался в практическом здравоохранении.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является разработка способа, позволяющего более точно провести диагностику злокачественных новообразований щитовидной железы.

Технический результат достигается тем, что больным под контролем ультразвукового сканирования осуществляют тонкоигольную аспирационную биопсию для проведения цитологического исследования, при неопределенном результате исследования из оставшегося цитологического материала выделяют тотальную микроРНК и определяют в аспирате экспрессию миРНК-146b и миРНК-574-3р, затем по формуле рассчитывают диагностический коэффициент где К - диагностический коэффициент, Z=7,25*Х1-5,0*Х2-6,74, где X1 - экспрессия миРНК-146b в аспирате, полученном путем тонкоигольной аспирационной биопсии щитовидной железы, Х2 - экспрессия миРНК-574-3р в аспирате, полученном путем тонкоигольной аспирационной биопсии щитовидной железы, и при значении коэффициента К≥0,54 диагностируют злокачественное новообразование щитовидной железы.

Для лучшего понимания способа приводим фигуры.

На Фигуре 1 изображено автоматизированное окно расчета диагностического коэффициента К.

Способ осуществляется следующим образом.

У больных под контролем ультразвукового сканирования осуществляли ТАБ одноразовыми иглами 21G и 20G в зависимости от глубины залегания узла в щитовидной железе. Первую часть цитологического материала помещали на стекло, высушивали естественным образом и окрашивали по Майн-Грюнвальду-Гимзе, а далее исследовали с помощью световой микроскопии.

ТАБ выполняли 267 больным после выявления узлов ЩЖ при ультразвуковом сканировании. У 158 больных после цитологического исследования по классификация Bethesda system II (2017) была выявлена II категория (доброкачественный узел) и VI категория (злокачественное новообразование). У 109 больных результаты цитологического исследования были неопределенными (III-V категория по классификации Bethesda).

После повторной ТАБ у 26 пациентов в результате цитологического исследования диагноз был уточнен, а у 83 больных заключение по-прежнему было неопределенным.

У данной группы пациентов при повторной ТАБ после цитологического мазка на стекле из оставшегося цитологического материала выделяли тотальную микроРНК с помощью набора реагентов PureLink RNA Mini Kit (Thermo Scientific, США). Общую концентрацию и оценку качества выделенной РНК проводили на спектрофотометре NanoDrop 2000С (Thermo Scientific, США). Путем обратной транскрипции получали кДНК, используя набор компании «Альгимед-Техно» (Беларусь). Экспрессию миРНК-146b и миРНК-574-3р в аспирате узлов ЩЖ определяли методом dCt относительно референсной миРНК-7а (Let-7a) (dCt=2(Ct миРНК-Х - Ct миРНК-7а)).

После гемитиреоидэктомии при гистологическом исследовании операционных образцов ткани у 17 пациентов была диагностирована папиллярная карцинома ЩЖ, 9 - фолликулярный вариант папиллярной карциномы ЩЖ, 5 - фолликулярная карцинома ЩЖ и у 52 пациентов -доброкачественные образования ЩЖ (у 50 пациентов фолликулярная аденома и у 2 - оксифильная аденома). В результате 31 больной составил группу со злокачественными образованиями ЩЖ и 52 пациента с доброкачественными узлами ЩЖ.

Гистологическое исследование операционных образцов расценивали как золотой стандарт диагностики, с которым сравнивали результаты оценки экспрессии миРНК в цитологическом материале до операции. То есть для разработки модели проводили ретроспективный анализ результатов молекулярных исследований после получения гистологического заключения относительно операционных образцов ткани. При этом больные со злокачественными опухолями получали ранг 1, а пациенты с доброкачественными опухолями ранг 0.

С помощью ROC-анализа определяли разделительную точку cut-off с целью дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных опухолей ЩЖ по показателю экспрессии миРНК в цитологическом материале, полученном при ТАБ. Для миРНК-146b точка cut-off составила 1,17, а для миРНК-574-3р - 0,26.

Превышение экспрессии миРНК-146b уровня 1,17 с диагностической чувствительностью 87,5% и специфичностью 94,1% позволяло сформировать заключение о злокачественном процессе в ЩЖ. Площадь под кривой ROC составила 0,876±0,0474 (доверительный интервал 95% от 0,785 до 0,938, р<0,0001).

При снижении уровня экспрессии миРНК-574-3р ниже 0,26 риск злокачественного процесса в узловых образованиях ЩЖ повышался в 5,3 раза (р<0,001) с диагностической чувствительностью 74,2% и специфичностью 84,6%. Площадь под кривой ROC (AUC) составила 0,776±0,054 (доверительный интервал 95% от 0,671 до 0,860, р<0,001).

При разработке модели учитывали одновременное изменение экспрессии миРНК-146b и миРНК-574-3р. Модель разрабатывали методом логистической регрессии, учитывая заключение по результатам гистологического заключения операционных образцов о злокачественном (ранг 1) или доброкачественном (ранг 0) процессе. В качестве зависимых переменных рассматривали показатели экспрессии миРНК-146b и миРНК-574-3р у 83 больных.

Полученное математическое выражение имело вид:

где К - диагностический коэффициент,

Z=7,25*X1-5,0*X2-6,74,

X1 - экспрессия миРНК-146b в аспирате, полученном при ТАБ ЩЖ,

Х2 - экспрессия миРНК-574-3р в аспирате, полученном при ТАБ ЩЖ.

Коэффициенты перед переменными X1 и Х2, а также постоянная константа -6,74 рассчитаны методом логистической регрессии при статистическом анализе результатов исследования 83 пациентов.

Разработанная модель имела высокую статистическую значимость, о чем свидетельствовали критерий Хи квадрат 30, 27 и р<0,001.

Для каждого из 83 пациентов был рассчитан диагностический коэффициент К. Далее методом ROC анализа определен дифференциально разделительный уровень, при превышении которого риск злокачественного поражения ЩЖ возрастал. Такой уровень соответствовал 0,54.

При превышении коэффициента К уровня 0,54 с диагностической чувствительностью 93,75% и специфичностью 93,33%) формировали заключение о злокачественном процессе в ЩЖ (р<0,001).

Для автоматизированного расчета в табличном процессоре Excel разработанную формулу использовали для расчета диагностического коэффициента К после введения данных пациента (см. Фиг. 1).

Приводим примеры применения способа.

Клинический пример 1.

Пациентка Б. 64 лет обратилась в ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России после поликлинического приема в общей лечебной сети и планового ежегодного обследования. Жалоб нет.

При ультразвуковом исследовании в щитовидной железе выявлен узел.

В НМИЦ онкологии при выполнении ТАБ под контролем ультразвукового сканирования после цитологического исследования получено неопределенное заключение. Для уточнения результатов ТАБ повторно выполнена пункция, часть материала направлена на цитологическое исследование, ответ прежний, другая - на молекулярно-генетическое исследование. Выделена тотальная микроРНК с помощью набора реагентов PureLink RNA Mini Kit (Thermo Scientific, США). Общую концентрацию и оценку качества выделенной РНК проводили на спектрофотометре NanoDrop 2000С (Thermo Scientific, США). Путем обратной транскрипции получали кДНК, используя набор компании «Альгимед-Техно» (Беларусь). Экспрессию миРНК-146b и миРНК-574-3р в аспирате узлов ЩЖ определяли методом dCt относительно референсной миРНК-7а (Let-7a) (dCt=2(Ct миРНК-Х - Ct миРНК-7а)).

В аспирате узлов ЩЖ экспрессия миРНК-146b составила 1,84, экспрессия миРНК-574-3р - 0,2. Подставляем показатели экспрессии миРНК в разработанную модель:

Поскольку рассчитанное значение К составило 0,996 и превышало разделительный уровень 0,54, то формировали заключение о злокачественном процессе.

После выполнения гемитиреоидэктомии при гистологическом исследовании операционного образца опухолевой ткани была верифицирована папиллярная карцинома.

Клинический пример 2.

Пациент К., 65 лет, обратился в ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России после поликлинического приема в общей лечебной сети и планового ежегодного обследования. Жалоб нет. При ультразвуковом исследовании в ЩЖ выявлен узел.

При выполнении ТАБ под контролем ультразвукового сканирования после цитологического исследования получено неопределенное заключение.

Для уточнения результатов ТАБ повторно была выполнена пункция, часть материала направлена на цитологическое исследование, ответ прежний, другая - на молекулярно-генетическое исследование.

Выделена тотальная микроРНК с помощью набора реагентов PureLink RNA Mini Kit (Thermo Scientific, CHIA). Общую концентрацию и оценку качества выделенной РНК проводили на спектрофотометре NanoDrop 2000С (Thermo Scientific, США). Путем обратной транскрипции получали кДНК, используя набор компании «Альгимед-Техно» (Беларусь). Экспрессию миРНК-146b и миРНК-574-3р в аспирате узлов ЩЖ определяли методом dCt относительно референсной миРНК-7а (Let-7a) (dCt=2(Ct миРНК-Х - Ct миРНК-7а)).

В аспирате узлов ЩЖ экспрессия миРНК-146b составила 0,67, экспрессия миРНК-574-3р - 0,55.

Подставляем показатели экспрессии миРНК в разработанную модель:

Поскольку рассчитанное значение К составило 0,01 и не превышало разделительный уровень 0,54, то сформировали заключение о доброкачественном процессе.

После выполнения гемитиреоидэктомии при гистологическом исследовании операционного образца опухолевой ткани была верифицирована фолликулярная аденома.

Данным способом был поставлен диагноз 37 пациентам.

Технико-экономическая эффективность способа заключается в том, что его применение позволяет более точно провести диагностику злокачественных новообразований щитовидной железы.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для диагностики злокачественных новообразований щитовидной железы. Больным под контролем ультразвукового сканирования осуществляют тонкоигольную аспирационную биопсию для проведения цитологического исследования. При неопределенном результате исследования из оставшегося аспирата выделяют тотальную микроРНК и определяют экспрессию миРНК-146b и миРНК-574-3р. Полученные значения подставляют в формулу расчета диагностического коэффициента K. При значении K, равном или более 0,54, диагностируют злокачественное новообразование щитовидной железы. Способ позволяет более точно провести диагностику злокачественных новообразований щитовидной железы за счет определения экспрессии миРНК-146b и миРНК-574-3р. 1 ил., 2 пр.

Способ диагностики злокачественных новообразований щитовидной железы, заключающийся в том, что больным под контролем ультразвукового сканирования осуществляют тонкоигольную аспирационную биопсию для проведения цитологического исследования, при неопределенном результате исследования из оставшегося цитологического материала выделяют тотальную микроРНК и определяют в аспирате экспрессию миРНК-146b и миРНК-574-3р, затем по формуле рассчитывают диагностический коэффициент где K - диагностический коэффициент, Z=7,25*Х1-5,0*Х2-6,74, где X1 - экспрессия миРНК-146b в аспирате, полученном путем тонкоигольной аспирационной биопсии щитовидной железы, Х2 - экспрессия миРНК-574-3р в аспирате, полученном путем тонкоигольной аспирационной биопсии щитовидной железы, и при значении коэффициента K, равном или более 0,54, диагностируют злокачественное новообразование щитовидной железы.