СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ЭТИОЛОГИИ ХРОНИЧЕСКОЙ СЕРДЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ Российский патент 2015 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, и может быть использовано в дифференциальной диагностике хронической сердечной недостаточности (ХСН) и хронической сердечной недостаточности на фоне воспалительной кардиомиопатии.

Несмотря на достигнутые успехи в изучении патогенеза и лечения хронической сердечной недостаточности прогноз при данном состоянии остается неблагоприятным и сопоставимым с таковым при различных злокачественных новообразованиях. Это связано с тем, что в последние годы не выявлены новые патогенетические схемы заболевания, являющиеся потенциальными терапевтическими мишенями.

Известен способ диагностики хронической сердечной недостаточности, включающий исследование образцов сыворотки или плазмы человека и приведения в контакт биологического образца с антителом к проBNP(1-108), детектирование проBNP(1-108) в образце и корреляцию между количеством обнаруженных комплексов антиген-антитело с клиническим состоянием субъекта.

(Патент РФ №2315773, МПК C07K 16/26, опубл. 27.01.2008 г.).

Недостатки данного способа связаны с тем, что имеется ряд других состояний, при которых повышается содержание данного вещества. Сюда относятся беременность, хроническая почечная недостаточность, тромбоэмболические осложнения. Соответственно, проведение точной дифференциальной диагностики в связи с этим затруднено. Кроме того, у ряда категорий больных - в частности у пожилых, пациентов с избыточной массой тела, содержание проBNP не увеличивается даже в случае клинически значимой хронической сердечной недостаточности.

Задачей изобретения является создание достоверного способа дифференциальной диагностики этиологии хронической сердечной недостаточности, позволяющего с высокой точностью устанавливать этиологию заболевания для дальнейшего проведения контроля эффективности лечения.

Технический результат заключается в повышении достоверности и точности способа, в том числе на ранних стадиях заболевания.

Это достигается тем, что в заявляемом способе дифференциальной диагностики этиологии хронической сердечной недостаточности, включающем исследование крови человека, согласно изобретению, в крови методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации определяют циркулирующие уровни микроРНК и при одновременном определении концентрации микроРНК-423-5р более 35500 копий/мкл и микроРНК-34а-5р более 4538 копий/мкл устанавливают хроническую сердечную недостаточность, а при одновременном определении концентрации микроРНК-423-5р более 35500 копий/мкл и концентрации микроРНК-21-5р более 711755 копий/мкл устанавливают хроническую сердечную недостаточность на фоне воспалительной кардиомиопатии.

В последние годы активно изучается возможность воздействия на основные процессы регуляции внутриклеточной транскрипции, проявляющиеся в изменении процессов метаболизма и фиброза. Эти процессы закономерно меняются в процессе формирования хронической сердечной недостаточности и зависят как от стадии, так и от этиологии.

Несмотря на то, что эти процессы являются сложными, комплексными и мультимодальными, имеется возможность разновекторного влияния на них, модулируя эпигенетическую активность. Это связано с наличием систем, регулирующих данные внутриклеточные процессы на верхнем (корневом) уровне. К числу таких систем относятся микроРНК.

МикроРНК представляют собой большое количество различных видов одноцепочечных молекул РНК, вовлеченных в процессы эпигенетической регуляции синтеза большого количества различных белков, ферментов, структурных и регуляторных молекул, а также посттранскрипционного подавления активности генов.

Перспективы использования микроРНК в диагностике сердечно-сосудистых заболеваний прежде всего связаны с недавним обнаружением нового класса РНК - циркулирующих микроРНК. Хотя до недавнего времени считалось, что время жизни молекул РНК вне клеток очень коротко, введение новых более чувствительных методов позволило обнаружить постоянно присутствующий в крови и физиологических жидкостях класс микроРНК. Устойчивость микроРНК к эндонуклеазам объясняется формированием надмолекулярных комплексов с белковыми молекулами, а также инкапсуляцией микроРНК в липидный слой с образованием наноструктурных комплексов, называемых экзосомами.

Осуществление способа.

Образцы цельной крови собирают в пробирки, содержащие ЭДТА, и центрифугируют при 3000 g в течение 5 минут. Выделение общей РНК (длина цепи менее 1000 н.п.) производят методом адсорбционной колоночной хроматографии на смоле из 200 мкл плазмы крови. Затем осуществляют реакцию обратной транскрипции и синтеза первой цепи кДНК. Для определения уровней исследуемых индивидуальных микроРНК используют химические модификации LNA специфических праймеров и анализируют методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации «в режиме реального времени». Данные по экспрессии микроРНК нормализуют на исходный объем цельной крови.

При одновременном определении концентрации микроРНК-423-5р более 35500 копий/мкл и микроРНК-34а-5р более 4538 копий/мкл устанавливают хроническую сердечную недостаточность.

При одновременном определении концентрации микроРНК-423-5р более 35500 копий/мкл и концентрации микроРНК-21-5р более 711755 копий/мкл устанавливают хроническую сердечную недостаточность на фоне воспалительной кардиомиопатии.

Пример 1.

Пациент 49 лет с жалобами на одышку, отеки нижних конечностей. В анамнезе длительно текущая нелеченная артериальная гипертония и перенесенный миокардит. Для назначения специфической терапии требуется определение возможной этиологии сердечной недостаточности - воспалительная или нет.

С этой целью в соответствии с заявляемым способом были определены циркулирующие микроРНК. Концентрация микроРНК-423-5р составила 84000 копий/мкл и концентрация микроРНК-21-5р составила 823568 копий/мкл. В связи с этим определяющим является воспалительная этиология ХСН. Назначено специфическое лечение со значимым клиническим улучшением.

Пример 2.

Пациент 38 лет с жалобами на одышку, отеки голеней и стоп, плохую переносимость физической нагрузки. В анамнезе перенесенный миокардит и долговременное злоупотребление алкоголем. Для решения вопроса о возможной воспалительной причине сердечной недостаточности и необходимости специфической терапии определены циркулирующие уровни микро РНК по заявляемому способу. Концентрация микроРНК-423-5р составила 57345 копий/мкл и концентрация микроРНК-21-5р составила 11214 копий/мкл. Это показывает на то, что причиной сердечной недостаточности является алкогольная кардиомиопатия. На фоне воздержания от алкоголя и отсутствия противовоспалительной терапии наблюдается значимое улучшение клинической симптоматики.

По заявляемому способу проведено исследование 100 человек, из которых 56 больных с клинически и инструментально подтвержденной ХСН и 44 составили контрольную группу, среди которых 15 (34%) имели ранее установленное сердечно-сосудистое заболевание (ССЗ) без сердечной недостаточности (СН) и 29 (66%) - практически здоровые добровольцы.

Таким образом, исследование активности различных микроРНК у пациентов с хронической сердечной недостаточностью дают возможность проведения дифференциальной диагностики этиологии хронической сердечной недостаточности, что позволит провести дифференциальную диагностику ХСН, в том числе и на ранних этапах, а также контроль эффективности лечения.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу диагностики хронической сердечной недостаточности (ХСН). Способ включает исследование крови человека методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации. Определяют циркулирующие уровни микроРНК и при одновременном определении концентрации микроРНК-423-5р более 35500 копий/мкл и микроРНК-34а-5р более 4538 копий/мкл устанавливают хроническую сердечную недостаточность, а при одновременном определении концентрации микроРНК-423-5р более 35500 копий/мкл и концентрации микроРНК-21-5р более 711755 копий/мкл устанавливают хроническую сердечную недостаточность на фоне воспалительной кардиомиопатии. Предложенное изобретение позволяет с повышенной достоверностью проводить диагностику ХСН на ранних стадиях заболевания. 2 пр.

Способ дифференциальной диагностики этиологии хронической сердечной недостаточности, включающий исследование крови человека, отличающийся тем, что в крови методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации определяют циркулирующие уровни микроРНК и при одновременном определении концентрации микроРНК-423-5р более 35500 копий/мкл и микроРНК-34а-5р более 4538 копий/мкл устанавливают хроническую сердечную недостаточность, а при одновременном определении концентрации микроРНК-423-5р более 35500 копий/мкл и концентрации микроРНК-21-5р более 711755 копий/мкл устанавливают хроническую сердечную недостаточность на фоне воспалительной кардиомиопатии.