СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СООТВЕТСТВИЯ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ ПИКОВ, ПОЛУЧЕННЫХ НА КОЛОНКАХ С ПОЛЯРНОЙ И НЕПОЛЯРНОЙ ФАЗАМИ, ОДНОМУ И ТОМУ ЖЕ КОМПОНЕНТУ ПРОБЫ Российский патент 2015 года по МПК G01N30/02 

Изобретение относится к газохроматографическим методам анализа и может быть использовано для идентификации летучих компонентов различных лекарственных растений и фитопрепаратов в медицине, фармакологии, здравоохранении, пищевой и парфюмерной и других отраслях промышленности.

Известны способы определения соответствия хроматографических пиков одному и тому же веществу на колонках с последовательно изменяющейся полярностью и многоступенчатый метод с переключением колонок (см.: Вигдергауз М.С., Семенченко Л.В., Езрец В.А., Богословский Ю.Н. Качественный газохроматографический анализ. М.: Наука. 1978. С. 162-186).

Недостатками известных способов определения соответствия хроматографических пиков одному и тому же веществу на основе независимых хроматограмм смеси, отвечающим нескольким колонкам являются большая трудоемкость и сложность проведения эксперимента, а также отсутствие серийной хроматографической аппаратуры для получения многоэлементных спектров сорбатов.

Известен также способ определения соответствия пиков на хроматограммах с использованием дополнительной информации из одного цикла анализа от двух хроматографических детекторов - пламенно-ионизационного (ПИД) и детектора по теплопроводности (ДТП) (см.: Арутюнов Ю.И., Кудряшов С.Ю., Онучак Л.А., Платонов И.А. Газохроматографический анализ смесей, содержащих неизвестные компоненты. // Вестник СамГУ. Естественнонаучная серия. Изд-во «Самарский университет». 2005. №5 (39). С. 137-162).

Способ заключается в получении результатов анализа исследуемой пробы на каждой колонке с двумя детекторами на выходе в виде:

1). Расчетных концентраций

$$C_{рас{ч}_i}^{ДТП}=\frac{A_i^{ДТП}}{{\displaystyle \sum _1^N{A}_i^{ДТП}}}\cdot 100;C_{рас{ч}_i}^{ПИД}=\frac{A_i^{ПИД}}{{\displaystyle \sum _1^N{A}_i^{ПИД}}}\cdot 100\left(1\right)$$

2). Относительного коэффициента чувствительности двух детекторов

$$K_{от{н}_i}^{\raisebox{1ex}{$ДТП$}\!\left/ \!\raisebox{-1ex}{$ПИД$}\right.}=\frac{A_{st}^{ДТП}\cdot A_i^{ПИД}}{A_{st}^{ПИД}\cdot A_i^{ДТП}}\cdot \frac{K_{st}^{ДТП}}{K_{st}^{ПИД}},\left(2\right)$$

где $$A_i^{ДТП,ПИД}$$ и $$A_{st}^{ДТП,ПИД}$$ - соответственно площади хроматографических пиков i-го вещества и стандарта на хроматограммах ДТП и ПИД (в случае, когда в качестве стандарта используется бензол - множитель $$\frac{K_{st}^{ДТП}}{K_{st}^{ПИД}}=1$$ ); N - число пиков на хроматограммах ДТП и ПИД.

Равенство $$C_{рас{ч}_i}^{ДТП}$$ , $$C_{рас{ч}_i}^{ПИД}$$ и $$K_{от{н}_i}^{\raisebox{1ex}{$ДТП$}\!\left/ \!\raisebox{-1ex}{$ПИД$}\right.}$$ , измеренных на двух колонках, свидетельствует о соответствии пиков на хроматограммах этих колонок одному и тому же веществу.

Однако в известном способе используется детектор ДТП, который из-за большой инерционности не может работать с высокоэффективными капиллярными колонками, широко применяемыми для анализа многокомпонентных сложных смесей.

Наиболее близким к заявленному изобретению по совокупности существенных признаков является хроматораспределительный метод с использованием коэффициентов распределения компонентов пробы в системе ограниченно смешиваемых растворителей «гексан-ацетонитрил», определяемых на капиллярной колонке с пламенно-ионизационным детектором при линейном программировании температуры колонки (см.: Арутюнов Ю.И., Онучак Л.А., Платонов И.А., Никитченко Н.В. Применение хроматораспределительного метода для определения молекулярной массы и температуры кипения неизвестных компонентов смеси. // Сорбционные и хроматографические процессы. 2011. Т. 11. №4. С. 502-510.).

Коэффициенты распределения $$K_{C_i}$$ летучих компонентов пробы определяются из хроматограмм гексанового и ацетонитрильного экстрактов на каждой колонке по уравнению:

$$K_{C_i}^{\left(\mathrm{1,2}\right)}=\frac{A_{i\left(г\right)}\cdot {\displaystyle \sum _{}^N{A}_{i\left(а\right)}}}{{\displaystyle \sum _{}^N{A}_{i\left(г\right)}\cdot A_{i\left(а\right)}}},\left(3\right)$$

где $$\frac{A_{i\left(г\right)}}{{\displaystyle \sum _{}^N{A}_{i\left(г\right)}}}$$ и $$\frac{A_{i\left(а\right)}}{{\displaystyle \sum _{}^N{A}_{i\left(а\right)}}}$$ - концентрации i-го компонента в гексановом и ацетонитрильном слое соответственно; N - число пиков на хроматограммах.

Равенство $$K_{C_i}$$ , полученных на двух колонках, наряду с равенством $$C_{рас{ч}_i}^{ПИД}$$ (уравнение (1)) свидетельствует о том, что хроматографические пики принадлежат одному и тому же веществу.

Недостатками известного способа является уменьшение общего количества определяемых компонентов пробы за счет наложения больших пиков гексана и ацетонитрила на хроматографические пики исследуемых летучих компонентов и увеличивающаяся погрешность определения $$K_{C_i}$$ по уравнению (3) для малых количеств i-го компонента в пробе.

Задачей изобретения является увеличение количества определяемых летучих компонентов пробы и повышение сходимости определения концентрации летучих компонентов пробы.

Эта задача решается за счет того, что в способе определения соответствия хроматографических пиков, полученных на колонках с полярной и неполярной фазами, одному и тому же компоненту пробы, при котором исследуемую пробу помещают в герметичный сосуд, выдерживают 40 минут при температуре 100°C, летучие компоненты равновесной паровой фазы барботируют через небольшой объем жидких растворителей, полученный экстракт дозируют в хроматограф с неполярной и полярной колонками, а соответствие пиков на двух хроматограммах одному и тому же летучему компоненту пробы определяют по соотношению их концентраций, при этом дополнительно проводят анализ на неполярной и полярной колонках равновесной паровой фазы пробы и соответствие пиков одному и тому же летучему компоненту пробы проводят по соотношениям концентраций этого компонента как при анализе жидкого экстракта, так и равновесной паровой фазы.

Соответствие пиков на хроматограммах неполярной и полярной колонок одному и тому же летучему компоненту пробы определяется в предлагаемом способе по равенству концентраций i-го компонента:

1) в жидком экстракте $$C_{рас{ч}_{i\left(ж\right)}}^{\left(1\right)}=C_{рас{ч}_{i\left(ж\right)}}^{\left(2\right)}$$ по уравнению (1) детектор ПИД для неполярной колонки, верхний индекс (1), и полярной колонки, верхний индекс (2);

2) в равновесной паровой фазе пробы $$C_{рас{ч}_{i\left(п\right)}}^{\left(1\right)}=C_{рас{ч}_{i\left(п\right)}}^{\left(2\right)}$$ .

В качестве третьего критерия используется равенство разностей полученных концентраций по п.п. 1) и 2): $${\delta }_C^{\left(1\right)}={\delta }_C^{\left(2\right)}$$ , где $${\delta }_C^{\left(1\right)}=C_{рас{ч}_{i\left(ж\right)}}^{\left(1\right)}-C_{рас{ч}_{i\left(п\right)}}^{\left(1\right)}$$ и $${\delta }_C^{\left(2\right)}=C_{рас{ч}_{i\left(ж\right)}}^{\left(2\right)}-C_{рас{ч}_{i\left(п\right)}}^{\left(2\right)}$$ .

При решении поставленной задачи создается технический результат, заключающийся в том, что вместо двух ограниченно смешиваемых жидких растворителей - гексан и ацетонитрил - в предлагаемом способе используют один жидкий растворитель, который выбирают для анализируемой пробы так, чтобы его хроматографический пик перекрывал как можно меньше пиков летучих компонентов пробы на хроматограммах, полученных как с полярной, так и неполярной колонок. В результате чего значительно увеличивается количество определяемых летучих компонентов пробы.

Устройство для определения соответствия хроматографических пиков, полученных на колонках с полярной и неполярной фазами, одному и тому же компоненту пробы содержит два герметичных сосуда. Первый сосуд служит для получения равновесной паровой фазы летучих компонентов пробы лекарственных растений или фитопрепаратов. Второй сосуд служит для жидкофазной экстракции компонентов равновесной паровой фазы путем барботажного контакта.

Эксперимент проводили на газовом хроматографе «Кристалл 5000.2» ЗАО СКБ «Хроматэк» с пламенно-ионизационным детектором. Использовали две капиллярные кварцевые колонки. Первая колонка VF-1 фирмы Varian (30 м × 0,32 мм × 0,5 мкм) с полидиметилсилоксановой неполярной фазой. Вторая колонка INNOWAX фирмы Agilent Technologies (30 м × 0,32 мм × 0,5 мкм) с полярной неподвижной фазой ПЭГ-20М.

Хроматографирование проводили в режиме линейного программирования температуры колонки. При работе на колонке с неполярной фазой начальная температура составляла 40°C, линейное программирование - 5°C/мин, конечная температура - 240°C. Температура испарителя 250°C, температура детектора 250°C. При работе на колонке с полярной фазой начальная температура составляла 40°C, линейное программирование - 4°C/мин, конечная температура - 200°C. Время анализа 40 минут в обоих случаях. Обработка результатов проводилась с использованием программного обеспечения «Хроматэк - Аналитик 2.5».

Порядок проведения эксперимента

1. Известный способ

Первый герметичный сосуд с исследуемой пробой выдерживали 40 минут при температуре 100°C (см.: Арутюнов Ю.И., Онучак Л.Α., Куркин В.А. и др. Способ оценки подлинности лекарственного сырья и устройство для его осуществления. Патент РФ №2452944 // Бюл. изобр. №16 от 10062012).

Второй герметичный сосуд заполнили жидкими растворителями - 1,0 см³ гексана и 1,0 см³ ацетонитрила. В полученную двухфазную систему барботировали 20 см³ равновесной паровой фазы из первого сосуда. Полученную смесь встряхивали в течение нескольких минут при комнатной температуре (20°C). После расслоения из каждого слоя отбирали пробы для газохроматографического анализа. Объем вводимой в испаритель хроматографа пробы составлял не более 0,5 мкл.

По результатам газохроматографического анализа определяли:

- Константы распределения компонентов равновесной паровой фазы в системе ограниченно смешиваемых растворителей «гексан-ацетонитрил» на колонке с неполярной неподвижной фазой ( $$K_{C_i}^{\left(1\right)}$$ ) и на колонке с полярной фазой ( $$K_{C_i}^{\left(2\right)}$$ ) по уравнению (3).

- Индексы удерживания Ван-ден-Доола и Кратца $$I_i^T$$ на каждой колонке для исследуемых компонентов:

$$I_i^{T\left(1\right),\left(2\right)}=100\left(\frac{t_{Ri}-t_{Rz}}{t_{Rz+1}-t_{Rz}}+z\right),\left(4\right)$$

где $$t_{Rz}$$ и $$t_{Rz+1}$$ - время удерживания соседних гомологов н-алканов с числом углеродных атомов в молекулах z и z+1, соответственно;

$$t_{Ri}$$ - время удерживания i-го компонента равновесной паровой фазы.

Для определения $$t_{Rz}$$ и $$t_{Rz+1}$$ дополнительно хроматографировали на каждой колонке смесь н-алканов от пентана до октадекана включительно. Объем вводимой пробы не превышал 1,0 мкл.

- Соответствие хроматографических пиков, полученных на колонках с полярной и неполярной неподвижными фазами, одному и тому же компоненту пробы определяли по равенству констант распределения $$K_{C_i}^{\left(1\right)}=K_{C_i}^{\left(2\right)}$$ и по равенству расчетных концентраций $$C_{рас{ч}_i}^{ПИД\left(1\right)}=C_{рас{ч}_i}^{ПИД\left(2\right)}$$ по уравнению (1).

2. Предлагаемый способ

Подготовительные операции с первым герметичным сосудом аналогичны известному способу.

Второй герметичный сосуд заполняли 1,0 см³ жидкого тетрадекана, через который барботировали 20 см³ равновесной паровой фазы из первого сосуда при комнатной температуре (20°C). Жидкий экстракт объемом не более 0,5 мкм вводили в испаритель хроматографа для анализа.

Тетрадекан в качестве жидкого растворителя выбран потому, что его пик как на колонке с неполярной, так и на колонке с полярной неподвижными фазами перекрывает наименьшее количество хроматографических пиков компонентов равновесной паровой фазы исследуемых проб.

По результатам газохроматографического анализа определяли:

- Индексы удерживания Ван-дер-Доола и Кратца $$I_i^T$$ на каждой колонке для компонентов равновесной паровой фазы из первого герметичного сосуда по уравнению (4). Объем вводимой пробы 2 см³.

- Соответствие хроматографических пиков, полученных на колонках с полярной и неполярной неподвижными фазами, одному и тому же компоненту исследуемой пробы определяли по равенству следующих измеряемых характеристик:

1. Равенству расчетных концентраций i-го компонента равновесной паровой фазы в жидком экстракте $$C_{рас{ч}_{i\left(ж\right)}}^{ПИД\left(1\right)}=C_{рас{ч}_{i\left(ж\right)}}^{ПИД\left(2\right)}$$ по уравнению (1) для двух колонок. Верхний индекс (1) - неполярная неподвижная фаза, верхний индекс (2) - полярная фаза.

2. Равенство расчетных концентраций i-го компонента в равновесной паровой фазе исследуемой пробы по уравнению (1) $$C_{рас{ч}_{i\left(п\right)}}^{ПИД\left(1\right)}=C_{рас{ч}_{i\left(п\right)}}^{ПИД\left(2\right)}$$ .

3. Равенство разностей полученных концентраций по п.п. 1) и 2): $${\delta }_{C_i}^{\left(1\right)}={\delta }_{C_i}^{\left(2\right)}$$ , где $${\delta }_{C_i}^{\left(1\right)}=C_{рас{ч}_{i\left(ж\right)}}^{ПИД\left(1\right)}-C_{рас{ч}_{i\left(п\right)}}^{ПИД\left(1\right)}$$ ; $${\delta }_{C_i}^{\left(2\right)}=C_{рас{ч}_{i\left(ж\right)}}^{ПИД\left(2\right)}-C_{рас{ч}_{i\left(п\right)}}^{ПИД\left(2\right)}$$ .

Сравнение известного и предлагаемого способов определения соответствия хроматографических пиков, полученных на колонках с полярной и неполярной фазами, одному и тому же летучему компоненту пробы проводили по результатам анализа следующих лекарственных растений: трава зверобоя, лаванда колосовая, листья мяты перечной и плоды расторопши пятнистой.

Оценку сходимости определения расчетных концентраций в жидких экстрактах проводили на примере равновесной паровой фазы травы зверобоя из выборки n=5 измерений в виде относительного среднего квадратичного отклонения (S_r) результата измерения $$C_{рас{ч}_{i\left(ж\right)}}^{ПИД\left(1\right)}$$ для компонента, имеющего индексы удерживания на неполярной и полярной колонках $$I_i^{T\left(1\right)}=788\pm 3$$ и $$I_i^{T\left(2\right)}=1024\pm 12$$ соответственно:

$$S_r=\frac{1}{C_{рас{ч}_{i\left(ж\right)}}^{ПИД}}\sqrt{\frac{{\displaystyle \sum _1^n{\left(C_{рас{ч}_{i\left(ж\right)}}^{ПИД}-{\overline{C}}_{рас{ч}_{i\left(ж\right)}}^{ПИД}\right)}^2}}{n-1}}\cdot 100.\left(5\right)$$

Результаты экспериментов сведены в таблицу «Сравнительные данные экспериментальной проверки известного и предлагаемого способов».

Сравнительные данные экспериментальной проверки известного и предлагаемого способов № п/п Наименование Известный способ Предлагаемый способ неполярная колонка полярная колонка неполярная колонка полярная колонка 1 2 3 4 5 6 1. Сходимость, S_r, % 11,3 11,8 3,5 4,1 2. Индексы удерживания $$I_i^{T\left(1\right)}$$ и $$I_i^{T\left(2\right)}$$ соответствующие одному и тому же летучему компоненту         2.1. Трава зверобоя 552±5 865±12 552±5 865±12 Общее количество хроматографических пиков при анализе равновесной паровой фазы: 556±5 878±12 556±5 878±12     602±5 907±12     629±5 938±12 642±5 883±12 642±5 883±12 659±5 1141±12 659±5 1141±12 - неполярная колонка 30     669±5 951±12 - полярная колонка 32     679±5 980±12 788±3 1024±12 788±3 1024±12 865±3 1114±12 865±3 1114±12 897±3 1161±12 897±3 1161±12 934±3 1085±12 934±3 1085±12 967±3 1256±8 967±3 1256±8     995±3 1187±12 1009±2 1190±12 1009±2 1190±2 1021±2 1228±8 1021±2 1228±8     1058±2 1345±8 1091±2 1287±8 1091±2 1287±8 2.2. Лаванда колосовая     552±5 972±12   Общее количество хроматографических пиков при анализе равновесной паровой фазы:     568±5 590±12     577±5 838±12     584±5 767±12 760±3 1020±12 760±3 1020±12 931±2 1085±12 931±2 1085±12 - неполярная колонка 37 942±2 1039±12 942±2 1039±12 - полярная колонка 43 948±2 1458±8 948±1 1458±8 978±2 1156±12 978±2 1156±12 1006±2 1302±8 1006±2 1302±8 1012±2 1271±8 1012±2 1271±8 1019±2 1228±8 1019±2 1228±8 1021±2 1206±8 1021±2 1206±8     1046±2 1251±8     1055±2 1585±8 1069±2 1286±8 1069±2 1286±8     1077±2 1305±8 2.3. Листья мяты перечной     572±5 590±12 Общее количество хроматографических     588±5 649±12     607±5 896±12

  пиков при анализе равновесной паровой фазы:     620±5 877±12 669±5 913±12 669±5 913±12     705±3 970±12 - неполярная колонка 41 764±5 1000±12 764±5 1000±12 - полярная колонка 39 788±3 1072±12 788±3 1072±12 837±3 1049±12 837±3 1049±12 886±3 1018±12 886±3 1018±12 923±3 1234±8 923±3 1234±8 931±3 1134±12 931±3 1134±12 942±3 1039±12 942±3 1039±12 964±3 1130±12 964±3 1130±12 970±3 1124±12 970±3 1124±12     995±3 1260±8     1006±2 1177±12 1009±2 1190±12 1009±2 1190±12 2.4. Плоды расторопши пятнистой     568±5 590±12     580±5 838±12 Общее количество хроматографических пиков при анализе равновесной паровой фазы:     589±5 649±12     616±5 957±12     622±5 877±12 656±5 1141±12 656±5 1141±12 722±3 1183±12 722±3 1183±12 - неполярная колонка 27 799±3 1263±12 799±3 1263±12 - полярная колонка 15 861±3 1028±12 861±3 1028±12 884±3 1124±12 884±3 1124±12

Из приведенных в таблице данных видно, что:

1. Количество хроматографических пиков на полярной и неполярной колонках, соответствующих одному и тому же компоненту пробы, определенное как известным, так и предлагаемым способами, значительно меньше общего количества хроматографических пиков при анализе равновесной паровой фазы исследуемых растений, так как она представляет собой сложную многокомпонентную смесь различных веществ, при хроматографическом анализе которых в одном хроматографическом пике могут присутствовать несколько неподеленных компонентов. Об этом свидетельствует также то, что общее количество хроматографических пиков при анализе равновесной паровой фазы различно для неполярной и полярой колонок. Например, для плодов расторопши пятнистой на неполярной колонке зарегистрировано почти в два раза больше хроматографических пиков, чем на полярной колонке.

2. Предложенный способ обеспечивает определение значительно большего количества хроматографических пиков, соответствующих одному и тому же компоненту исследуемой пробы, чем известный. Так, для травы зверобоя количество определяемых пиков в 1,3 раза больше, а для плодов расторопши пятнистой в 2,0 раза больше известного способа.

3. Предложенный способ обеспечивает значительно большую сходимость измерения концентрации анализируемых компонентов в жидких экстрактах. Погрешность измерения S_r уменьшилась практически в три раза. Связано это с тем, что в известном способе пробу на анализ отбирают из гетерогенной системы ограниченно смешиваемых жидкостей (гексан-ацетонитрил) и на результаты измерения влияют значительно большее количество внешних факторов, чем в предлагаемом способе.

Использование предлагаемого способа определения соответствия хроматографических пиков, полученных на колонках с полярной и неполярной фазами, одному и тому же компоненту пробы позволяет:

1. Проводить с использованием справочных данных об индексах удерживания групповую и индивидуальную идентификацию некоторых летучих компонентов лекарственных растений, фитопрепаратов и биологически активных добавок, изготовленных на их основе, для стандартизации и оценки подлинности на предприятиях при их изготовлении и реализации.

2. Проводить экспресс-анализ качества лекарственного растительного сырья и фитопрепаратов на имеющемся в лабораториях доступном оборудовании вместо дорогостоящего и сложного в эксплуатации хроматомасс-спектрометра.

Изобретение относится к газохроматографическим методам анализа и может быть использовано для идентификации летучих компонентов различных лекарственных растений и фитопрепаратов в медицине, фармакологии, здравоохранении, пищевой, парфюмерной и других отраслях промышленности. Способ определения соответствия хроматографических пиков, полученных на колонках с полярной и неполярной фазами, одному и тому же компоненту пробы заключается в том, что исследуемую пробу помещают в герметичный сосуд, выдерживают 40 минут при температуре 100°C, компоненты равновесной паровой фазы барботируют через небольшой объем жидкого растворителя. Затем полученные экстракт и равновесную паровую фазу хроматографируют на полярной и неполярных колонках, а соответствие хроматографических пиков одному и тому же компоненту пробы определяют по соотношению полученных концентраций этого компонента как при анализе жидкого экстракта, так и равновесной паровой фазы. Техническим результатом является увеличение количества определяемых летучих компонентов пробы и повышение сходимости определения концентрации летучих компонентов пробы. 1 табл.

Способ определения соответствия хроматографических пиков, полученных на колонках с полярной и неполярной фазами, одному и тому же компоненту пробы, при котором исследуемую пробу помещают в герметичный сосуд, выдерживают 40 минут при температуре 100°C, компоненты равновесной паровой фазы барботируют через небольшой объем жидких растворителей, полученный экстракт дозируют в хроматограф с неполярной и полярной колонками, а соответствие пиков на двух хроматограммах одному и тому же летучему компоненту пробы определяют по соответствию их концентраций, отличающийся тем, что дополнительно проводят газохроматографический анализ равновесной паровой фазы исследуемой пробы на колонках с полярной и неполярной фазами, а соответствие пиков одному и тому же компоненту пробы проводят по соотношению полученных концентраций этого компонента как при анализе жидкого экстракта, так и равновесной фазы.