МУКОЗАЛЬНАЯ ВАКЦИНА Российский патент 2015 года по МПК A61K39/39 A61K47/42 A61P31/00 

Область изобретения

[0001] Данное изобретение относится к мукозальной вакцине, эффективно индуцирующей IgA слизистых оболочек и IgG крови.

Уровень техники

[0002] В патентных документах 1 и 2 сделано подробное описание недостатков обычных инактивированных вакцин или анатоксинов, а также текущее состояние в связи с развитием мукозальных вакцин и иммуноадъювантов.

[0003] Как описано в патентных документах 1 и 2, необходимость перехода от обычной вакцины, которую вводят подкожно или внутримышечно, к мукозальной вакцине, вызывающей продукцию антитела IgA в слизистой оболочке, которая является природным путем передачи вирусной инфекции, широко и глубоко признается. Тем более, что вакцина следующего поколения в 21-м веке, мукозальная вакцина, вызывающая продукцию антитела IgA, местный иммунитет или мукозальный иммунитет, предпочтительно должна быть разработана и введена в практическое применение во всем мире, но до сих пор она еще не была получена.

[0004] В ответ на эти проблемы авторы данного изобретения создали носитель антигена-лекарства (antigen-drug vehicle, AD-носитель), который представляет собой комплекс белка В легочного сурфактанта и/или белка С легочного сурфактанта и липида(ов), и мукозальную вакцину, состоящую из этого AD-носителя и антигена (патентный документ 1). Авторы данного изобретения также обнаружили, что путем изменения массового соотношения V/A количества AD-носителя (V) и количества антигена (А), можно изменить селективную продукцию антитела IgA и продукцию обоих антител IgA и IgG, и затем разработали мукозальную вакцину на основе такого механизма действия (патентный документ 2). Патентные документы 1 и 2 также раскрывают эффективность фрагментов (пептидов) белков В и С легочного сурфактанта.

[0005] Кроме того, в результате исследования различных вариантов фрагментов белков легочного сурфактанта в отношении их эффекта на повышение продукции антитела авторы данного изобретения создали AD-носитель, содержащий в качестве компонента синтетический пептид KnLm (где n составляет от 4 до 8, a m составляет от 11 до 20), который, несмотря на то, что он меньшего размера, чем частичные пептиды, описанные в патентных документах 1 и 2, имеет мощное влияние на индукцию и повышение продукции антитела, особенно для исключительной продукции секреторного антитела IgA, а также отличное и эффективное индукторное влияние на продукцию и секреторного иммуноглобулина IgA слизистой, и IgG крови, а также мукозальную вакцину, состоящую из этого AD-носителя и антигена (патентный документ 3).

[0006] В составе назальных капель, путь введения которых идентичен таковому для мукозальной вакцины, с целью повышения вязкости для поддержания эффективности против поллиноза или аллергии, широко используется карбоксивиниловый полимер (CVP) или гидроксипропилцеллюлоза (НРС), а также используется гелеобразующий загуститель, такой как альгинат натрия. Например, также известны НРС-содержащая мукозальная вакцина (патентный документ 4), состав CVP-содержащей мукозальной вакцины (патентный документ 5) и назальный спрей вакцины против гриппа (патентный документ 6). Патентный документ 7 также раскрывает мукозальную вакцину, состоящую из антигена, адъюванта [особенно поли(I:С)] и загустителя (альгината натрия и т.п.).

Патентный документ 1: WO 2005/097182

Патентный документ 2: WO 2007/018152

Патентный документ 3: WO 2009/123119

Патентный документ: JP-A-2008-231 343

Патентный документ 5: WO 01/017556

Патентный документ 6: JP-A-03-38529

Патентный документ 7: JP-A-2009-209086

Сущность изобретения

Проблемы, решаемые изобретением

[0007] Хотя мукозальная вакцина патентного документа 3 обладает мощной способностью продуцировать антитела, она имеет недостаток, общий с другими мукозальными вакцинами, который заключается в том что антиген требуется в большем количестве, чем необходимо для чрескожной инъекционной вакцины.

[0008] Для эффективного лечения вакцина необходима в количестве, достаточном для областей распространения инфекции, на которую она направлена, но с учетом текущего масштаба производства антигена трудно производить повышенное количество мукозальной вакцины. Соответственно, желательно придать мукозальной вакцине дальнейшую мощную способность продуцировать антитела.

[0009] Целью изобретения является создание улучшенной мукозальной вакцины, имеющей более мощную способность продуцировать антитело, чем у мукозальных вакцин, описанных в патентных документах 3, и, как результат, способной оказывать хороший эффект, сопоставимый с подкожной инъекционной вакциной, даже с очень малым количеством антигена.

Средства для решения проблем

[0010] Изобретатели в качестве средств для дальнейшего повышения способности мукозальных вакцин патентных документов 3 индуцировать антитела рассмотрели гелеобразующие агенты (CVP, HPC), используемые в носовых каплях или вакцинах для применения на слизистых оболочках, чтобы понять, могут ли они работать в AD-носителе, увеличивая количество антигена, доставленного антигенпредставляющим клеткам, удлиняя назальный клиренс и тем самым индуцируя иммунный IgA слизистой и иммунный IgG крови, и было подтверждено следующее.

(1) По сравнению с мукозальными вакцинами (антиген+синтетический пептид+липиды) в патентном документе 3 или мукозальными вакцинами (антиген+CVP) в патентных документах 5 и 6 мукозальная вакцина, содержащая «антиген+синтетический пептид+липид+CVP», имеет гораздо лучшую способность индуцировать антитела, и ее влияние выходит далеко за рамки, предсказанные исходя из простой комбинации патентного документа 3 (антиген+синтетический пептид+липиды) и патентных документов 5 и 6 (антиген+CVP).

(2) Эксципиент, HPC, широко известный как гелеобразующий агент для носовых капель или мукозальной вакцины, аналогично CVP не способен индуцировать антитела, и нельзя ожидать, что он будет оказывать эффект индукции IgA слизистой и IgG крови при использовании с антигеном, а также с антигеном и AD-носителем.

(3) Даже при уменьшении количества антигена до примерно 1/5 или меньше от количества, необходимого в мукозальной вакцине (антиген+синтетический пептид+липиды) в патентном документе 3, мукозальная вакцина «антиген+синтетический пептид+липиды+CVP» имеет гораздо более мощный эффект, индуцирующий антитела.

[0011] Изобретение было создано на основе новых сведений, описанных выше.

[0012] Соответственно, изобретение представляет собой мукозальную вакцину, продуцирующую антиген-специфические IgA слизистой и IgG крови на уровнях, способных оказывать эффективную иммунную индукцию и эффект предотвращения инфекции, которая включает:

(а) AD-носитель, состоящий из синтетического пептида и липида(ов), где синтетический пептид состоит из аминокислотной последовательности KnLm (где n составляет от 4 до 8, a m составляет от 11 до 20);

(б) карбоксивиниловый полимер; и

(в) антигенный белок в количестве, не способном продуцировать достаточно IgA слизистой и IgG крови для оказания эффективной иммунной индукции и эффекта предотвращения инфекции, если использовать его в одиночку.

[0013] В мукозальной вакцине данного изобретения белковый антиген (в) находится в количестве, которое даже в сочетании с AD-носителем (а) или в сочетании с карбоксивиниловым полимером (б) не способно продуцировать антиген-специфические IgA слизистой и IgG крови, достаточные для оказания эффективной иммунной индукции и эффекта предотвращения инфекции.

[0014] В одном аспекте этой мукозальной вакцины синтетический пептид состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID №1 или 2.

[0015] В другом аспекте этой мукозальной вакцины липид представляет собой по меньшей мере один среди фосфатидилхолина, дипальмитоилфосфатидилхолина, фосфатидилсерина, фосфатидилглицерина, фосфатидилинозита, фосфатидилэтаноламина, фосфатидной кислоты, лауриловой кислоты, миристиновой кислоты, пальмитиновой кислоты, стеариновой кислоты и олеиновой кислоты. Более конкретно, липиды представляют собой смесь дипальмитоилфосфатидилхолина, фосфатидилглицерина и пальмитиновой кислоты.

[0016] В другом аспекте этой мукозальной вакцины антиген представляет собой полученный из возбудителя инактивированный антиген, очищенный антиген, частично очищенный антиген, рекомбинантный антиген, обезвреженный токсин или аллерген, вызывающий аллергию.

[0017] Данное изобретение также представляет собой способ получения мукозальной вакцины, продуцирующей антиген-специфический IgA слизистой и IgG крови на уровнях, способных оказывать эффективную иммунную индукцию и эффект предотвращения инфекции, которая включает:

(а) AD-носитель, состоящий из синтетического пептида и липида(ов), где синтетический пептид состоит из аминокислотной последовательности KnLm (где n составляет от 4 до 8, а m составляет от 11 до 20);

(б) карбоксивиниловый полимер и

(в) антигенный белок в количестве, не способном продуцировать достаточно IgA слизистой и IgG крови для оказания эффективной иммунной индукции и эффекта предотвращения инфекции, если использовать его в одиночку, где указанный способ включает:

(1) суспендирование указанного (а) и (в) в воде;

(2) повторное нагревание и перемешивание один или более чем один раз;

(3) замораживание и лиофилизацию;

(4) суспендирование лиофилизированной формы в физиологическом растворе для доведения до заранее определенной концентрации; и

(5) добавление раствора указанного (б).

[0018] Используемое в данном документе выражение «количество IgA слизистых и IgG крови, способное оказывать эффективную иммунную индукцию» означает любое такое количество IgA и IgG, которое дает значения ингибирования гемагглютинации (HI) крови не ниже, чем международные критерии оценки.

[0019] В следующем описании композиция, состоящая из синтетического пептида и липидов, может быть определена как «AD-носитель», а композиция, состоящая из AD-носителя и антигена, может быть определена как «мукозальная вакцина». Эти «AD-носитель» и «мукозальная вакцина» по существу идентичны тем, которые раскрыты в патентном документе 3. Кроме того, композиция мукозальной вакцины в сочетании с CVP может быть определена как «мукозальная вакцина с добавлением CVP». В этом изобретении понятие «липиды» включает раскрытие патентных документов с 1 по 3, а понятия «синтетический пептид» и «AD-носитель» включают раскрытие патентного документа 3.

Эффекты изобретения

[0020] Мукозальная вакцина с добавлением CVP данного изобретения имеет чрезвычайно высокий вакцинный эффект индукции антиген-специфических антител IgA и IgG и мощный эффект торможения гемагглютинации (HI) индуцированного антитела, которые намного превышают международный защитный стандарт. Эти эффекты также особо отмечены в сравнении с мукозальными вакцинами, описанными в патентном документе 3, или «вакцинным антигеном+CVP» (патентные документы 5 и 6), а также представляют собой прекрасные эффекты, которые не могут быть предсказаны из эффекта мукозальной вакцины патентного документа 3 или эффекта CVP патентных документов 5 и 6.

[0021] Благодаря такой мощной способности индуцировать антитела необходимого профилактического эффекта можно достичь, даже если антиген содержится в количестве, меньшем, чем в обычной мукозальной вакцине. Таким образом, мукозальная вакцина с добавлением CVP изобретения может оказать мощный эффект индукции антитела, даже если используемое количество антигена уменьшено до 1/5 или менее от количества в обычной мукозальной вакцине (антиген+синтетический пептид+липиды). Например, как показано в эксперименте 2, мукозальная вакцина патентного документа 3, использующая антиген гриппа в качестве антигена, демонстрирует значение ингибирования гемагглютинации (HI) меньше HI=40, что является международным критерием оценки вакцин против гриппа, даже тогда, когда количество антигена составляет 0,2 мкг, в то время как мукозальная вакцина с добавлением CVP изобретения демонстрирует прекрасный защитный иммунный эффект, который отражается значением HI=100 или более, даже с количеством антигена 0,1 мкг, или 0,03 мкг.

[0022] Кроме того, сама композиция (AD-носитель, CVP) мукозальной вакцины с добавлением CVP изобретения не имеет никакого эффекта стимуляции антигенраспознающих клеток, и, соответственно, она имеет крайне низкую способность вызывать неожиданные побочные эффекты, такие как аутоиммунные заболевания или поствакцинное обострение аллергии к любым другим антигенам, отличным от вакцинного антигена.

[0023] Кроме того, в соответствии со способом получения мукозальной вакцины изобретения эта мукозальная вакцина обладает еще более сильной способностью продуцировать антиген-специфические IgA слизистой и IgG крови.

Краткое описание графических материалов

[0024]

[Фиг.1] Результаты эксперимента 1, которые показывают уровни IgA в смыве носовой полости (слева) и уровни IgG в сыворотке (справа), когда мышам назально вводили какую-либо из вакцин примера 1 и сравнительных примеров с 1 по 5 или НА-антиген.

[Фиг.2] Результаты эксперимента 1, которые показывают значения HI, демонстрируемые антителом против НА вируса гриппа, когда мышам назально вводили какую-либо из вакцин примера 1 и сравнительных примеров 1 и 5, НА-антиген или HA+AD-носитель в качестве референсного контроля.

[Фиг.3] Результаты эксперимента 2, которые показывают изменение уровней экспрессии маркерных молекул активации (МНС II, CD40, CD80 (В7-1) и CD86 (В7-2)) на клеточной мембране, когда антигенпредставляющие дендритные клетки стимулировали эндотоксином (ЛПС), поли(I:С) и SF-10 (CVP+AD-носитель), соответственно. Левый график показывает соотношение (%) положительных клеток от общего числа клеток, которое указывает на повышенную экспрессию каждой мембранной молекулы (клетки демонстрируют значение выше отрицательной границы отсечки, как указывает столбец вблизи центра, которая была определена на основании обработки физиологическим раствором в качестве контроля в точечных графиках справа). Правый график показывает результаты измерения с помощью проточной цитометрии, в котором визуализируется количество маркерных молекул активации на клеточной мембране.

[Фиг.4] Результаты эксперимента 4, которые указывают на взаимосвязь между количеством PFU (plaque-forming unit, бляшкообразующих единиц) инфекционого вируса гриппа и выживаемостью.

[Фиг.5] Результаты эксперимента 4, которые являются изменениями в % выживаемости, когда мышей (10 мышей в группе) иммунизировали интраназально любой из вакцин примера 1, примера 5, сравнительного примера 5 или сравнительного примера 6, а затем инфицировали 50 PFU вируса гриппа.

[Фиг.6] Результаты эксперимента 4, которые являются изменениями в % выживаемости, когда мышей (10 мышей в группе) иммунизировали интраназально любой из вакцин примера 1, примера 5, сравнительного примера 5 или сравнительного примера 6, а затем инфицировали 800 PFU вируса гриппа.

[Фиг.7] Изображение, полученное с помощью трансмиссионного электронного микроскопа, результаты эксперимента 6. (А) Мукозальная вакцина сравнительного примера 1, (В) мукозальная вакцина с добавлением CVP примера 1 и ее частично увеличенное изображение (на фиг. справа).

[Фиг.8] Результаты проточной цитометрии в эксперименте 7, которые показывают количество флуоресцентно меченого антигена, обнаруженного в дендритных клетках. При условии, что уровни флуоресценции, обнаруженные в дендритных клетках, обработанных только антигеном НА, составляют 1, во сколько раз увеличение количества флуоресценции было усилено в условиях каждого измерения, указано на ординате с «Кратность в зависимости от НА»=[MFI в каждом измерении образца]/[MFI в дендритной клетке, обработанной только НА]. MFI: средняя интенсивность флуоресценции **: р<0,01 против НА (n=3).

[Фиг.9] Результат эксперимента 8, в котором измеряли уровни экспрессии маркерной молекулы активации (CD86) на клеточной мембране, где антигенпредставляющие дендритные клетки стимулировали с помощью поли(I:С) и SF-10 (CVP+AD-носитель), соответственно. □ указывает на отсутствие антигенного белка НА, в то время как ■ указывает на наличие антигенного белка НА. MFI: средняя интенсивность флуоресценции, *: р<0,05 против адъюванта в одиночку (n=3).

[Фиг.10] Результаты эксперимента 9, в котором измеряли уровни экспрессии CD86 на мембране дендритных клеток, полученных из тканей носовой полости мышей. Мышей иммунизировали интраназально с адъювантом SF-10 (CVP+AD-носитель) в присутствии или в отсутствие антигена. MFI: средняя интенсивность флуоресценции.

[Фиг.11] Результаты эксперимента, в котором в качестве антигенного белка использовали антиген респираторно-синцитиального вируса (RSV). Первая диаграмма отражает результаты эксперимента с IgG, а вторая - с IgA.

[Фиг.12] Результаты эксперимента, в котором в качестве антигенного белка использовали овальбумин (OVA), типичный антиген пищевой аллергии. Мышам вводили интраназально физиологический раствор, один OVA, в комбинациях с SF-10 (CVP+AD-носитель) и с адъювантом поли(I:С).

Режим для осуществления изобретения

[0025] Мукозальная вакцина с добавлением CVP изобретения включает следующую композицию.

Синтетический пептид

Синтетический пептид состоит из аминокислотной последовательности KnLm (где n составляет от 4 до 8, a m составляет от 11 до 20). KnLm имеет n остатков K (Lys) на N-концевой части и m остатков L на С-концевой части. Такой синтетический пептид может быть любым из следующих пептидов. В скобках указана аббревиатура пептида. Аминокислотный остаток обозначается однобуквенным кодом.

SEQ ID №1 (K6L16) состоит из 6 остатков K(Lys) на N-концевой стороне и 16 остатков L на С-концевой стороне, a SEQ ID №2 (K6L11) состоит из 6 остатков K(Lys) на N-концевой стороне и 11 остатков L на С-концевой стороне. Эти синтетические пептиды, полученные в соответствии с известными способами химического синтеза, имеют чистоту 95% или выше.

Липид

Предпочтительно используется фосфолипид, содержащийся в легочном сурфактанте, такой как фосфатидилхолин, дипальмитоилфосфатидилхолин, фосфатидилсерин и фосфатидилглицерин. В противном случае также может быть использован фосфатидилинозит, фосфатидилэтаноламин, фосфатидная кислота, сфингомиелин и т.п. В качестве жирных кислот могут быть использованы лауриновая кислота, миристиновая кислота, пальмитиновая кислота, стеариновая кислота, пальмитоолеиновая кислота, олеиновая кислота и т.п. Кроме того, можно использовать липиды, полученные из водных животных, таких как киты и дельфины, у которых легкие раздуваются динамично.

Карбоксивиниловый полимер (СУР)

CVP представляет собой гидрофильный полимер, полученный путем полимеризации акриловой кислоты в качестве основного компонента, и коммерчески доступен; например, могут быть использованы Hivis Вако 103, Hivis Вако 104, Hivis Вако 105, продукты компании Sigma рАА130 (Sigma, Сент-Луис, Миссури, каталоговый №181293), рАА450 (Sigma, каталоговый №181285) и рАА1250 (Sigma, каталоговый №306215). Среди них предпочтительными являются Hivis Вако 104 и продукты компании Sigma рАА130 и рАА1250, которые широко используются в производстве косметических и фармацевтических гелей. После получения раствора CVP с 0,2 до 2,0% по весу в чистой воде или физиологическом растворе при ультразвуковой обработке для подведения pH до 5,0-10,5 может быть использован нейтрализующий раствор NaOH, так как предпочтительно использовать pH, который не влияет отрицательно на стабильность антигена вакцины. Например, антиген вакцины против вируса гриппа доводят до pH 6,8-8,0, предпочтительно до pH 7,0-7,2.

Антиген

Антиген включает молекулы антигена, например, бактериального антигена высокой степени чистоты для вакцинации, чистота которого составляет примерно 90% или более, вирусного антигена, белка, такого как анатоксин, гликопротеина, аллергена, полимерного сахарида и нуклеиновой кислоты. Например, предусмотрен антиген для вакцины против вируса ветряной оспы, вируса кори, вируса эпидемического паротита, полиомиелита, ротавируса, вируса гриппа, аденовируса, вируса герпеса, вируса атипичного острого респираторного синдрома (SARS), вируса Западного Нила, вируса Хантаан, вируса лихорадки денге, вируса японского энцефалита, вируса желтой лихорадки, вируса клещевого энцефалита, ВИЧ, вируса гепатита С, Bordetella pertussis, менингококка, вируса гриппа В, пневмовируса, холерного вибриона, плазмодия, возбудителя сонной болезни и т.п.

[0026] При использовании в одиночку или, особенно, в сочетании с AD-носителем (а) или в сочетании с карбоксивиниловым полимером (CVP) антиген применяют в количестве, которое подводят таким образом, что антиген - специфический IgA слизистой и IgG крови не производится в количестве, производящем эффективную иммунную индукцию.

[0027] Антигенный белок гриппа содержит белок М, нейраминазу, нуклеопротеид и т.п. в дополнение к антигенной молекуле НА. В последующем описании количество антигенного белка означает общее количество белка, в том числе антигенных молекул, перечисленных выше. Количество молекул антигена НА составляет примерно 50% от общего антигенного белка в случае часто используемой вакцины гриппа.

[0028] Ниже приведено описание способа получения AD-носителя и мукозальной вакцины с добавлением CVP из материалов, описанных выше.

Изготовление AD-носителя

Несколько липидов из перечисленных выше смешивают в подходящем соотношении и суспендируют в смеси хлороформ.метанол (2:1 (объем/объем)), например, с концентрацией липида 10 мг/мл, и используют в качестве липидного компонента. Синтетический пептид растворяют в этаноле, например, в концентрации 5,0 мг/мл. Затем эти липидный компонент и синтетический пептид смешивают. Соотношение смешивания включает от примерно 0,2 до примерно 12,0% сухой массы для синтетического пептида, и от примерно 88 до примерно 99,8% сухой массы для липида. Эту смесь выпаривают до сухости при температуре примерно 40°C с помощью роторного испарителя и повторно суспендируют в 10% этаноле до соответствующей концентрации, встряхивают и перемешивают в течение 15 минут на водяной бане при температуре примерно 45°C до получения однородной дисперсии, которую затем замораживают и высушивают. Это сухое вещество хранится при температуре примерно -30°C, и каждый раз в момент применения его суспендируют в чистой воде или физиологическом растворе, а затем подвергают воздействию ультразвуковой волны, гомогенизатора, мешалки, встряхивателя и т.п., чтобы сформировать однородную дисперсию.

Мукозальный вакцинный перпарат с добавлением CVP

Вышеупомянутый AD-носитель, CVP и антиген смешивают в подходящем соотношении. Таким образом, в случае вакцины против гриппа раствор AD-носителя смешивают со стоковым раствором вакцины, так что отношение количества AD-носителя (V) к антигенному белку (А) на основе сухого веса, т.е. V/A, приобретает необходимое значение. Сухой вес антигенного белка (А) для введения одной мыши составляет от примерно 0,01 до примерно 10 мкг/кг массы тела, предпочтительно составляет от примерно 0,03 до примерно 5,0 мкг/кг массы тела. Это количество антигенного белка составляет 1/5 или меньше от количества антигена (от примерно 0,1 до примерно 50 мкг/кг массы тела, предпочтительно от примерно 0,3 до примерно 30 мкг/кг массы тела) в мукозальной вакцине патентного документа 3 (антиген+AD-носитель).

[0029] В таком количестве антигена для индукции преимущественно и селективно продукции антитела IgA V/A предпочтительно составляет от примерно 0,1 до примерно 1,0. С другой стороны, V/A для индукции продукции обоих антител IgA и IgG составляет от примерно 1,0 до примерно 100, предпочтительно от примерно 5 до примерно 20. При описанном выше V/A примерно 60% или более антигена связано с AD-носителем, и полученная мукозальная иммунная вакцина способна эффективно индуцировать продукцию антитела IgA и/или продукцию антитела IgG.

[0030] Концентрация CVP в конечном растворе назальной вакцины, в который был добавлен CVP, составляет примерно от 0,1% до 1,0%, предпочтительно от 0,3% до 0,8%. AD-носитель, антиген и CVP можно смешать равномерно с помощью гомогенизатора, смесителя, мешалки, встряхивателя и т.п.

[0031] Как правило, как показано в Примере 1, описанном ниже, антигенный белок и AD-носитель смешивают, затем подвергают ультразвуковой обработке в течение 3 минут, затем встряхивают в течение 2 часов при комнатной температуре и, наконец, соединяют с равным объемом 1% раствора CVP в физиологическом растворе, таким образом получая мукозальную вакцину с добавлением CVP. Этот способ идентичен способу, описанному в патенте 3, за исключением добавления CVP. Тем не менее, этот способ является невыгодным, так как он может позволить вирусному антигену инактивироваться за счет тепла, выделяемого при ультразвуковой обработке, и процесс ультразвуковой обработки имеет затруднение в поддержании постоянных условий с учетом типа используемого прибора, размера осциллятора, состояния осциллятора и т.п.

[0032] Таким образом, предпочтительным является способ продукции, который приведен в Примере 7 и включает следующие этапы:

(1) суспендирование AD-носителя и антигенного белка в воде (чистой воде);

(2) повторное нагревание и перемешивание один или более чем один раз;

(3) замораживание и лиофилизацию;

(4) суспендирование лиофилизированных образцов в физиологическом растворе для доведения до заранее определенной концентрации; и

(5) добавление раствора CVP в физиологический раствор.

Он является прекрасным способом, который служит не только для решения вышеупомянутых проблем, связанных с ультразвуковой обработкой, но также позволяет далее увеличивать продукцию антиген-специфических IgA и IgG.

[0033] Мукозальная вакцина с добавлением CVP, изготовленная таким образом, может быть использована в однократной дозировке, но предпочтительно она используется в двух дозировках (начальная иммунизация и вторичная иммунизация) или трех дозировках (начальная иммунизация, вторичная иммунизация и третичная иммунизация). Такая повторная иммунизация позволяет заметно поднять титры антиген-специфических антител IgA и IgG. Две или три вакцинные дозировки вводят с интервалом от 1 недели до 3 недель, предпочтительно примерно 2 недели. Введение мукозальной вакцины с добавлением CVP изобретения может быть проведено в носовую полость, а также в ротовую полость или полость влагалища (см., например, Lubrizol Pharmaceutical Bulletin, Polymers for Pharmaceutical Applications, Lubrizol Advanced Materials, Inc. 2008).

[0034] Далее данное изобретение подробно описано в следующих примерах, но оно не ограничивается следующими примерами.

Пример 1

[0035] [Этапы производства, включающего ультразвуковую обработку]

AD-носитель получают, как описано ниже. Дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC), фосфатидилглицерин (PG) и пальмитиновую кислоту (РА) смешивают в соотношении 75:25:10 (вес/вес/вес) и суспендируют в смеси хлороформ:метанол (2:1 (объем/объем)) до концентрации фосфолипида 10 мг/мл, получая липидный компонент.Синтетический пептид K6L16 (KKKKKKLLLLLLLLLLLLLLLL) (продукт GenScript Inc.) с чистотой 95% или выше растворяют в метаноле в концентрации до 5,0 мг/мл. Раствор липидного компонента (DPPC:PG:PA=75:25:10, вес/вес/вес) и раствор пептида K6L16 смешивают в массовом соотношении фосфолипидный компонент: K6L16=100:2 и выпаривают до сухости при 40°C с помощью роторного испарителя. Их ресуспендируют в 10% этаноле до концентрации фосфолипида 4 мг/мл, встряхивают и перемешивают в течение 15 минут на водяной бане при температуре примерно 45°C до получения однородной дисперсии. Их замораживают и высушивают, а затем сохраняют в качестве AD-носителя при -30°C.

[0036] Затем вышеупомянутый AD-носитель используют для приготовления мукозальной вакцины с добавлением CVP, как описано ниже.

[0037] Лиофилизированный AD-носитель используют, суспендируя его в физиологическом растворе непосредственно перед применением. Используемым антигеном вакцины против вируса гриппа (НА) был A/NewCaledonia/20/99 (H1N1), предоставленный Фондом исследований микробных заболеваний Университета Осаки, с концентрацией 1,94 мг белка/мл (натрий-фосфатный буферный раствор, хлорид натрия, раствор тимеросала: содержащий на 1 мл 3,53 мг натрия фосфорнокислого двузамещенного одноводного, 0,54 мг дигидрофосфата натрия, 8,50 мг хлорида натрия и 0,008 мг тимеросала). Вакцину и AD-носитель смешивают в таком соотношении, что отношение количества белка в растворе антигена (А) к количеству фосфолипида в растворе AD-носителя (V), т.е. VA, составляет 10, подвергают ультразвуковой обработке с трехкратным включением и выключением с интервалом в 30 секунд, выполняя ультразвуковую обработку в течение 3 минут в общей сложности, в том числе с включением на 90 секунд и выключением на 90 секунд в общей сложности (модель S-250D, Branson Ultrasonics Danbury), затем встряхивают в течение 2 часов при комнатной температуре и растворяют в физиологическом растворе, а затем соединяют с нейтрализовованным 1% CVP (Hivis Вако 104) до конечной концентрации 0,5%. Таким образом, композиция, которая содержится в общей сложности в 4 мкл и которую вводят в обе носовые полости одной мыши, по 2 мкл в каждую ноздрю, содержит количество антигенного белка вакцины против гриппа (НА)/количество фосфолипида в растворе AD-носителя/масса CVP=0,2 мкг/2,0 мкг/20 мкг. pH этой мукозальной вакцины с добавлением CVP находится в пределах, которые позволяют поддерживать антигенность антигенного белка НА (от 7,0 до 7,2).

[0038] Здесь и далее мукозальная вакцина с добавлением CVP обозначается как «HA+SF-10». В то время как количество SF-10 представляет собой AD-носитель (2,0 мкг)+С\/Р (20 мкг)=22 мкг, как описано выше, следующее описание использует обозначение SF-10 (2,0 мкг) для представления количества фосфолипидов AD-носителя, который служит в качестве основы для влияния носителя адъюванта. Количества SF-10 в других примерах указаны как значения без учета количеств С VP.

Пример 2

[0039] В соответствии со способом в примере 1 была изготовлена мукозальная вакцина с добавлением CVP, в которой количество антигенного белка НА составило 0,1 мкг. Соотношение антигенного белка НА, AD-носителя и CVP было идентично таковому в примере 1 (т.е. содержание AD-носителя в количестве, в 10 раз превышающем количество антигенного белка, и CVP в конечной концентрации 0,5%).

Пример 3

[0040] В соответствии со способом в примере 1 была изготовлена мукозальная вакцина с добавлением CVP, в которой количество антигенного белка НА составило 0,03 мкг. Соотношение антигенного белка НА, AD-носителя и CVP было идентично таковому в примере 1 (т.е. содержание AD-носителя в количестве, в 10 раз превышающем количество антигенного белка, и CVP в конечной концентрации 0,5%).

Сравнительный Пример 1

[0041] Была изготовлена мукозальная вакцина патентного документа 3 (HA+AD-носитель). Антигенный белок НА и AD-носитель были идентичны таковым в Примере 1, и изготовление вакцины было проведено так же, как в примере 1. Количество антигенного белка НА составило 0,2 мкг, а количество AD-носителя составило 2,0 мкг.

Сравнительный пример 2

[0042] Была изготовлена мукозальная вакцина, описанная в патентных документах 5 и 6 (HA+CVP). Антигенный белок НА и CVP были идентичны таковым в Примере 1, и изготовление вакцины было проведено так же, как в примере 1. Количество антигенного белка НА составило 0,2 мкг, а конечная концентрация CVP составила 0,5%

Сравнительный пример 3

[0043] Была изготовлена мукозальная вакцина, описанная в патентном документе 4 (НА+НРС). Антигенный белок НА был идентичен таковому в Примере 1, а НРС был коммерчески полученным НРС 6.0-10.0 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd). Изготовление вакцины было проведено так же, как в примере 1. Количество антигенного белка НА составило 0,2 мкг, а количество НРС составило 20 мкг.

Сравнительный пример 4

[0044] Была изготовлена мукозальная вакцина (HA+AD-носитель+НРС) путем объединения HA+AD-носитель патентных документов 3 с НРС. HA+AD-носитель был идентичен таковому в сравнительном примере 1, а НРС был идентичен таковому в сравнительном примере 3, в то время как изготовление вакцины было проведено так же, как в примере 1. Количество антигенного белка НА составило 0,2 мкг, количество AD-носителя составило 2,0 мкг, а количество НРС составило 20 мкг.

Сравнительный пример 5

[0045] В соответствии со способом, описанным в публикации (Asahi-Ozaki Y et al., Microbes Infect 2006; 8:2706-2714, Ichinohe T, et al., J Virol 2005; 79(5): 2910-2919), была изготовлена мукозальная вакцина (НА+поли(I:С)), содержащая поли(I:С) (Alexis Corp.), который является лигандом Toll-подобных рецепторов (TLR) дендритных клеток и интенсивно стимулирует антигенпредставляющие клетки, усиливая продукцию антитела. Количество антигенного белка НА составило 0,2 мкг, количество поли(I:С) составило 2 мкг.

Сравнительный пример 6

[0046] Антиген НА разводили физиологическим раствором и использовали в качестве вакцины. Доза антигенного белка НА на одно животное составляла 0,2 мкг.

Эксперимент 1

[0047] Используя мышей, тестировали эффекты повышения продукции антитела, вызываемые назальными мукозальными вакцинами.

1. Мукозальная вакцина

- HA+SF-10 (пример 1)

- HA+AD-носитель (сравнительный пример 1)

- HA+CVP (сравнительный пример 2)

- НА+НРС (сравнительный пример 3)

- HA+AD-носитель+НРС (сравнительный пример 4)

- НА+поли (I:C) (сравнительный пример 5)

- НА в одиночку (сравнительный пример 6)

2. Животные

Использовали самок мышей BALB/c (6-8 недель), приобретенных у Japan SLC, Inc. (Сидзуока, Япония). Все эксперименты на животных проводили в здании для инфицированных животных (уровень Р2) в Институте экспериментов на животных, Университет Токушима, Школа медицины, в соответствии с руководящими принципами Комитета по экспериментам на животных Университета Токушима, Школа медицины.

3. Способ иммунизации

При введении вакцины через нос 2 мкл 5 мукозальных вакцин, описанных выше в разделе 1, соответственно вводили в каждую ноздрю, таким образом закапывая в общей сложности 4 мкл в обе носовые полости каждой мыши под анестезией с помощью препаратов Ketalar (62,6 мг/кг) и Selactar (12,4 мг/кг). В качестве контроля использовали группу, получившую физиологический раствор, и сравнительный пример 6 (антигенный белок НА в одиночку) в количестве, идентичном таковому в растворе вакцины. Каждая группа включала от 9 до 10 мышей.

[0048] Вторичную (бустирующую) иммунизацию проводили путем назального введения одинаковых доз вакцины через две недели после первой иммунизации. Через две недели после вторичной иммунизации аналогичным способом проводили третичную иммунизацию, и через две недели после последней иммунизации брали образцы. Хотя вакцину вводили в общей сложности три раза, вторичная иммунизация в качестве окончательной иммунизации может дать почти аналогичные результаты.

4. Получение от мышей смывов носовой полости и альвеолярных смывов Через две недели после третичной иммунизации получали смывы полости носа/альвеолярные смывы и сыворотки для измерения антиген-специфических IgA и IgG к вирусному НА. Процедуры были такими же, как описано в публикации (Mizuno D, Ide-Kurihara М, Ichinomiya Т, Kubo I, Kido H. Modified pulmonary surfactant is a potent adjuvant that stimulates the mucosal IgA production in response to the influenza virus antigen. J Immunol. 2006; 176:1122-30).

[0049] Мышей, которым вводили вакцину, анестезировали фенобарбиталом, чтобы провести тораколапаротомию, и надрезали трахею, чтобы вставить венозный катетер Atom 3 Fr с узлами (Atom Medical Corporation, Токио, Япония) в легкое, и через него затем вводили 1 мл физиологического раствора и забирали обратно. Эту процедуру повторяли три раза и полученные в общей сложности 3 мл использовали в качестве альвеолярного смыва. После сбора альвеолярного смыва венозный катетер Atom вставляли через надрезанную трахею в направлении носовой полости, вводили через него 1 мл физиологического раствора и собирали жидкость, выходящую из носа. Жидкость использовали в качестве смыва носовой полости. Кроме того, собирали кровь из сердца и центрифугировали ее в течение 10 минут со скоростью 5000 оборотов в минуту для получения сыворотки.

5. Количественная оценка противогриппозного антитела

Уровни специфических противогриппозных IgA и IgG в смывах носовой полости/альвеолярного смыва и сыворотке количественно оценивали с помощью анализа ELISA в соответствии с описанием в приведенной выше публикации (Mizuno D, et al. J Immunol. 2006;176:1122-30).

[0050] Анализ ELISA проводили в соответствии со способом, приведенным для набора для количественной оценки Mouse ELISA quantitation kit от BETHYL LABORATORIES, INC. (Техас, США). В каждую лунку 96-луночного иммунопланшета Nunc Immunoplate (Nalgen Nunc International, Нью-Йорк, США) вносили 1 мкг вакцины и 100 мкл 1 мг/мл раствора бычьего сывороточного альбумина (BSA, SIGMA, Миссури, США) в PBS и оставляли в течение ночи при 4°C для твердофазной реакции иммобилизации. После этого вакцинную жидкость удаляли путем трехкратного промывания промывочной жидкостью (50 мМ Tris, 0,14 М NaCl, 0,05% Твин-20, pH 8,0). В каждую лунку вносили 200 мкл 50 мМ буферного раствора Tris-HCl (pH 8,0), содержащего 0,15 М NaCl и 1% BSA, и проводили реакцию блокировки в течение 1 часа при комнатной температуре. После трехкратного промывания каждой лунки промывочной жидкостью вносили 100 мкл смывов носовой полости, легочных смывов или сывороток, которые были соответственно разведены буферным раствором, связывающим образец (50 мМ Tris, 0,15 М NaCl, 1% BSA, 0,05% Твин-20, pH 8,0), и проводили реакцию в течение 2 часов при комнатной температуре. Козлиные противомышиные IgA или IgG, меченые пероксидазой хрена (HRP) (Bethyl Laboratories, Inc), использовали в качестве вторичного антитела, и ТМВ Microwell Peroxidase Substrate System (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc., Мэриленд, США) использовали для проведения хромогенной реакции. Реакцию останавливали добавлением 100 мкл 2 М H₂SO₄ (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) в каждую лунку и измеряли абсорбцию при 450 нм с помощью SPECTRAmax PLUS 384. В качестве стандарта для количественной оценки использовали абсорбцию, полученную аналогично с использованием 10 нг противогриппозного IgA и IgG, очищенного из вышеупомянутых легочных смывов.

6. Результаты

Результаты индукции антитела против НА вируса гриппа показаны для IgA в смывах носовой полости (фиг. 1, слева) и IgG в крови (фиг. 1, справа). Соответствующие измеренные значения приведены в таблице 1. Фиг. 2 и Таблица 2 показывают титры HI соответствующих анализируемых групп.

(1) Группа, получавшая только антиген НА (сравнительный пример 6), демонстрировала уровень антиген-специфического IgA 24,77 нг/мл и уровень IgG 0,54 мкг/мл, в то время как группа, получавшая HA+SF-10 (пример 1), демонстрировала уровень антиген-специфического IgA 3307,60 нг/мл и уровень IgG 568,75 мкг/мл, показывая 132-кратное повышение для IgA в смывах носовой полости и 1137-кратное повышение для IgG в сыворотках крови. Было подтверждено, что мукозальная вакцина с добавлением CVP (HA+SF-10) данного изобретения имеет чрезвычайно мощный эффект индукции антитела (фиг.1, таблица 1).

(2) Продукция антитела в группе, получавшей HA+SF-10 (пример 1), была выше в 15,6 раз для антиген-специфического IgA и в 150 раз для IgG по сравнению с HA+AD-носитель (сравнительный пример 1) и выше в 10,7 раз для антиген-специфического IgA и в 115,4 раз для IgG по сравнению с HA+CVP (сравнительный пример 2) (фиг. 1, таблица 1). Такие необыкновенно хорошие эффекты индукции антитела, вызванные HA+SF-10, выходят далеко за рамки, предсказанные исходя из простой комбинации известной мукозальной вакцины (HA+AD-носитель) патентного документа и известного CVP патентных документов 5 и 6.

(3) Продукция антитела в группе, получавшей НА+НРС (сравнительный пример 3), была аналогична или меньше, чем в группе, получавшей только НА (сравнительный пример 6). Продукция антитела в группе, получавшей HA+AD-носитель+НРС (сравнительный пример 4), была ниже, чем в группе, получавшей HA+AD-носитель (сравнительный пример 1) (фиг. 1, таблица 1). Основываясь на этих результатах, было подтверждено, что НРС, который широко известен как гелеобразующий агент в составе носовых капель или как добавка в мукозальной вакцине, аналогичная CVP, не обладает эффектом повышения иммунной индукции при использовании в сочетании с антигеном и AD-носителем. Соответственно, считается, что усиление адъювантного эффекта AD-носителя с помощью добавления CVP связано с природой AD-носителя, а не просто с эффектом увеличения вязкости вакцины.

(4) Продукция антител в группе, получавшей HA+SF-10 (пример 1), была выше в 11,4 раз для IgA в смывах носовой полости и в 2,3 раза для IgG в сыворотках крови по сравнению с НА+поли(I:С) (сравнительный пример 5) (фиг. 1, таблица 1). На основании этих результатов было подтверждено, что мукозальная вакцина с добавлением CVP (HA+SF-10) изобретения имеет более мощный иммунный эффект индукции, чем поли(I:С), мощно стимулируя антигенпредставляющие клетки и усиливая продукцию антигена.

[0051] [Таблица 1]

Титр антител

[0052]

(5) В то время как в соответствии с международными критериями оценки вакцин против гриппа для защитного иммунитета, по которым вакцина, титр торможения гемагглютинации (HI) которой превышает 40, оценивается как эффективная, только у 50% образцов с HA+AD-носитель (сравнительный пример 1) HI превысил 40 со средним значением HI=39. Напротив, HA+SF-10 (пример 1) показал HI>40 во всех образцах, а среднее значение было таким высоким как HI=213,3, и демонстрировал мощный противовирусный защитный эффект, который составлял 1,56 от такового с НА+поли(I:С) (сравнительный пример 5), который продемонстрировал HI=137,0 (фиг. 2, таблица 2).

[0053] [Таблица 2]

Титр HI

Эксперимент 2

[0054] Антигенпредставляющие дендритные клетки, полученные способом из публикации (Mizuno D et al., J Immunol 2006; 176:1122-1130), стимулировали эндотоксином (ЛПС: 100 нг/1×10⁵ клеток) (Grauer О, et al., Histochem Cell Biol 2002; 117:351-362), поли(I:С) (10 мкг/1×10⁵ клеток) и SF-10 (AD-носитель с добавлением CVP 10 мкг/1×10⁵ клеток) и измеряли уровни экспрессии маркерных молекул активации на клеточных мембранах (МНС II, CD40, CD80 (В7-1) и CD86 (В7-2)).

[0055] Результаты показаны на фиг. 3. ЛПС и поли(1:С) заметно повышали экспрессию CD40 и CD86 и число активированных антигенпредставляющих дендритных клеток, в то время как SF-10 сам по себе не увеличивал экспрессию МНС II, CD40, CD80 и CD86 на антигенпредставляющих дендритных клетках, показывая уровень экспрессии, почти равный уровню в контроле (необработанных клетках).

[0056] На основании этих результатов было принято, что SF-10 прямо не стимулирует антигенпредставляющие дендритные клетки без антигена, т.е. SF-10 эффективно стимулирует доставку антигена к антигенпредставляющим дендритным клеткам, тем самым вызывая продукцию антитела.

Эксперимент 3

[0057] Каждую мукозальную вакцину с добавлением CVP из примера 1 (количество антигенного белка НА: 0,2 мкг), примера 2 (количество антигенного белка НА: 0,1 мкг) и примера 3 (количество антигенного белка НА: 0,03 мкг) вводили мышам (10 животных в каждой группе) аналогично эксперименту 1 и измеряли антиген-специфические IgA в смывах носовой полости и IgG в крови аналогично эксперименту 1.

[0058] Результаты представлены в таблице 3. Пример 1 (количество антигенного белка НА: 0,2 мкг) и пример 2 (количество антигенного белка НА: 0,1 мкг) демонстрировали почти равный эффект индукции антител. Кроме того, пример 3 (количество антигенного белка НА: 0,03 мкг), где количество антигенного белка составляло 1/6 или менее от такового в примере 1, также демонстрировал намного более мощный эффект индукции антитела по сравнению со сравнительным примером 2: HA+AD-носитель (количество антигенного белка НА: 0,2 мкг) и сравнительным примером 3: HA+CVP (количество антигенного белка НА: 0,2 мкг) в эксперименте 1 (таб. 1). Таким образом, экспериментальная группа из примера 3 демонстрировала уровень антиген-специфического IgA в 11,7 раза выше, чем в сравнительном примере 2, и в 8,0 раз выше, чем в сравнительном примере 3, и количество IgG в 77,2 раза выше, чем в сравнительном примере 2, и в 60,1 выше, чем в сравнительном примере 3.

[0059] На основании этих результатов было подтверждено, что мукозальная вакцина с добавлением CVP изобретения способна продуцировать достаточное количество антитела с гораздо меньшим количеством антигена, чем в мукозальных вакцинах патентного документа 3 (HA+AD-носитель) и патентных документов 5 и 6 (HA+CVP). Кроме того, в отношении эффекта торможения гемагглютинации (HI-эффекта) мукозальная вакцина с добавлением CVP демонстрировала достаточный защитный эффект, реализуемый HI=198,0, даже с количеством антигенного белка НА 0,03 мкг.

[0060] [Таблица 3]

Пример 4

[0061] В соответствии со способом в примере 1 получали мукозальную вакцину с добавлением CVP с количеством AD-носителя 0,3 мкг и количеством антигенного белка НА 0,03 мкг. Соотношение антигенного белка НА, AD-носителя и CVP было идентично таковому в примере 1 (т.е. содержание AD-носителя в количестве, в 10 раз превышающем количество антигенного белка, и CVP в конечной концентрации 0,5%).

Эксперимент 4

[0062] Каждую мукозальную вакцину с добавлением CVP из примера 1 (AD-носитель: 2,0 мкг, количество антигенного белка НА: 0,2 мкг) и примера 4 (AD-носитель: 0,3 мкг, количество антигенного белка НА: 0,03 мкг) аналогично эксперименту 1 вводили мышам (10 животных в каждой группе), которых затем инфицировали на 14 день после второй вакцинации (в общей сложности трехкратная иммунизация) 50 PFU и 800 PFU вируса гриппа (A/PR8 (N1H1)/мкл).

[0063] Как показано на фиг. 4, инфицирующее количество вируса, способное обеспечить 50% летальную дозу (LD50), составляло PFU<5, а без введения вакцины все мыши умирали в течение 9 дней при 50 PFU и в течение 8 дней при 100 PFU или более после заражения.

[0064] Влияние вакцинации на выживаемость показано на фиг. 5 и фиг. 6. И в контроле (с физиологическим раствором), и в сравнительном примере 6 (только антигенный белок НА) все животные погибли через 7-9 дней после инфицирования 50 PFU вируса и через 7 дней после инфицирования 800 PFU вируса. В сравнительном примере 5 (НА+поли(I:С)) 9 из 10 животных погибли в течение 9 дней после инфицирования 800 PFU вируса.

[0065] С другой стороны, все мыши, получавшие мукозальные вакцины с добавлением CVP из примера 1 и примера 4, выживали в течение 15 дней после инфицирования 50 PFU вируса. Инфицирование 800 PFU вируса убило 1 из 10 животных, получавших вакцину из примера 1 (через 8 дней или позднее), и 5 из 10 животных, получавших вакцину из примера 4 (через 10 дней или позднее).

[0066] На основании этих результатов было подтверждено, что мукозальная вакцина с добавлением CVP изобретения обладает отличным эффектом предотвращения инфекции.

Пример 5

[0067] [Производственный процесс В без ультразвуковой обработки]

Порошок лиофилизированного AD-носителя растворяли в чистой воде и добавляли к жидкости с антигенным белком НА, как в Примере 1, а затем этот раствор объединяли с равным количеством 1,0% CVP, растворенного в чистой воде, получая суспензию. Эту суспензию нагревали без ультразвуковой обработки при 42°C в течение 10 минут, используя водяную баню, и на третьей и седьмой минутах нагревания раствор перемешивали с помощью миксера в течение 10 секунд для достижения однородности. После нагревания суспензию замораживали на ночь при температуре от -30°C до -75°C и лиофилизировали, получая сухой порошок. Лиофилизированный порошок хранили при температуре -30°C.

Непосредственно перед применением лиофилизированный порошок суспендировали в физиологическом растворе, получая мукозальную вакцину с добавлением CVP. Раствор вакцины так разводили, чтобы вводить в общей сложности 4 мкл в обе носовые полости мышей, в каждую ноздрю по 2 мкл раствора, содержащего 0,5% CVP, 0,2 мкг антигенного белка НА и 2,0 мкг фосфолипидов AD-носителя. Далее эта мукозальная вакцина с добавлением CVP обозначается как HA+SF-10-B.

Пример 6

[0068] [Производственный процесс С без ультразвуковой обработки] Порошок лиофилизированного AD-носителя, растворенный в чистой воде, смешивали с жидкостью с антигенным белком НА, как в Примере 1. Эту суспензию нагревали при 42°C в течение 10 минут, используя водяную баню, и на третьей и седьмой минутах нагревания раствор перемешивали с помощью миксера в течение 10 секунд для достижения однородности. После нагревания суспензию замораживали на ночь при температуре от -30°C до -75°C и лиофилизировали, получая сухой порошок. Лиофилизированный порошок хранили при температуре -30°C. Непосредственно перед применением лиофилизированный порошок осторожно перемешивали с 0,5% раствором CVP, предварительно растворенного в физиологическом растворе, избегая любого вспенивания, и таким образом получали мукозальную вакцину с добавлением CVP. В общей сложности вводили 4 мкл в обе носовые полости мышей, в каждую ноздрю по 2 мкл раствора, содержащего 0,2 мкг антигенного белка НА и 2,0 мкг фосфолипидов AD-носителя. Далее эта мукозальная вакцина с добавлением CVP обозначается как HA+SF-10-C.

Эксперимент 5

[0069] Каждую из мукозальных вакцин с добавлением CVP из примера 1 (далее именуемую «HA+SF-10-А»), примера 5 (HA+SF-10-B) и примера 6 (HA+SF-10-С) инокулировали мышам (10 животным в каждой группе) аналогично эксперименту 1 (три раза с интервалом в 2 недели) и измеряли противогриппозные антитела IgA и IgG аналогично эксперименту 1.

[0070] Результаты представлены в таблице 4. Пример 6 (HA+SF-10-C) демонстрировал эффект индукции антитела примерно в 2-4 раза выше для уровня IgA и примерно в 2 раза выше для уровня IgG по сравнению с примером 1 (HA+SF-10-А) и примером 5 (HA+SF-10-B). Таким образом, предполагалось, что способ примера 6 (производственный процесс С) приводит к отличному эффекту индукции антитела из-за того, что отсутствовал этап ультразвуковой обработки и раствор CVP добавляли в заключительном этапе.

[0071] [Таблица 4]

Сравнение эффектов индукции антитела при различии процесса производства вакцины

Эксперимент 6

[0072] Форму каждого компонента мукозальной вакцины с добавлением CVP изобретения (антигенного белка НА, AD-носителя и CVP) анализировали с помощью электронного микроскопа. Как показано на фиг. 7, CVP играл роль в существенном повышении связывания антигена и AD-носителя.

[0073] CVP использовали в качестве загустителя (патентные документы 5 и 6), который является одним из загустителей-полимеров для улучшения нахождения активного ингридиента в полости носа, так же, как и гидроксипропилцеллюлоза (патентный документ 4), альгинат натрия (патентный документ 7) и другие эксципиенты. Тем не менее, как показали результаты эксперимента 6, в данном изобретении было обнаружено, что CVP в сочетании с AD-носителем повышает связывание антигена и AD-носителя, а также увеличивает количество антигена, включенного в антигенпредставляющие клетки, тем самым усиливая эффект AD-носителя.

Эксперимент 7

[0074] SF-10 (AD-носитель+CVP) (20 мкг) примера 1 и антигенный белок НА (2 мкг) примера 1, которые были помечены флуоресцентным красителем АТТО 488, смешивали и затем добавляли к мышиным дендритным клеткам костного мозга (2×10⁵ клеток), и через 1 час инкубации измеряли с помощью проточной цитометрии интенсивность флуоресценции дендритных клеток, помеченных антигенным белком НА, меченым флуоресцентным красителем. Также смешивали поли(I:С) (10 мкг) сравнительного примера 5 и флуоресцентно-меченый антигенный белок НА (2 мкг) и аналогично измеряли интенсивность флуоресценции дендритных клеток. Флуоресценция, демонстрируемая дендритными клетками, отражала связывание и включение меченого флуоресцентной краской антигенного белка НА в клетки.

[0075] Результаты показаны на фиг. 8. В то время как поли(I:С) не способствовал связыванию и включению меченого флуоресцентной краской антигенного белка НА в дендритные клетки, SF-10 демонстрировал значительный стимулирующий эффект.

[0076] На основании этих результатов было подтверждено, что мукозальная вакцина изобретения SF-10 способствует связыванию и включению антигенного белка в антигенпредставляющие клетки, таким образом увеличивая продукцию антитела и давая отличную возможность предотвратить инфекцию.

Эксперимент 8

[0077] Следующие компоненты добавляли к культивируемым мышиным дендритным клеткам костного мозга (2×10⁵ клеток) в 1 мл среды cRPMI, и через 1 час измеряли с помощью проточной цитометрии активацию дендритных клеток, используя в качестве индекса увеличение экспрессии CD86, который является одним из маркеров активации дендритных клеток. Для измерения использовали цитометр FACSCalibur (BD Biosciences, Массачусетс, США), а для обработки данных использовали программное обеспечение CellQuest (BD Biosciences, Массачусетс, США), чтобы определить экспрессию CD86.

- Физиологический раствор

- Физиологический раствор+антигенный белок НА

- SF-10

- SF-10+антигенный белок НА

- поли(I:С)

- поли(I:С)+антигенный белок НА

Антигенный белок НА (2 мкг) и SF-10 (20 мкг) были такими, как описано в примере 1, в то время как поли(I:С) (10 мкг) был идентичен таковому в сравнительном примере 5.

[0078] Результаты показаны на фиг. 9. В то время как поли(I:С) сам по себе увеличивал экспрессию CD86 (маркер активации дендритных клеток) аналогично эксперименту 2, экспрессия CD86 не увеличивалась далее при добавлении антигена. Напротив, SF-10 сам по себе не активировал дендритные клетки, но экспрессия CD86 в присутствии антигена увеличивалась примерно в 2 раза.

[0079] На основании этих результатов предполагается, что мукозальный адъювант с добавлением CVP изобретения, т.е. SF-10, эффективно доставлял антиген антигенпредставляющим дендритным клеткам, активируя их и, тем самым, вызывая продукцию антитела.

[0080] Аналогичные результаты были получены при использовании CD40, который также является одним из маркеров активации дендритных клеток.

Эксперимент 9

[0081] Для того, чтобы изучить активацию дендритных клеток при повышенной доставке антигена с помощью SF-10, которая была подтверждена in vitro в эксперименте 8, отдельным мышам {in vivo) вводили в носовую полость следующие компоненты, идентичные таковым в эксперименте 8.

- Физиологический раствор

- Физиологический раствор+антигенный белок НА

- SF-10

- SF-10+антигенный белок НА

Эксперимент на животных проводили по пути эксперимента 1. Антигенный белок НА (0,2 мкг) и SF-10 (2 мкг) были такими же, как в примере 1, в то время как поли(I:С) (2 мкг) был идентичен таковому в сравнительном примере 5.

[0082] Мышей декапитировали через 48 часов после назальной инокуляции, собирали ткани полости носа и обрабатывали коллагеназой (1 мг/мл, встряхивая при 37°C в течение 30 минут). После фильтрации через сетку с последующим центрифугированием (4°C, 10 минут, 200×g) из извлеченных клеток получали дендритные клетки с помощью VarioMACS (Miltenyl Biotech, Бергиш-Гладбах, Германия) с использованием анти-CD11c (N-418)-конъюгированных магнитных шариков (Miltenyl Biotech, Бергиш-Гладбах, Германия) и LS-колонки в соответствии с инструкцией изготовителя. Затем измеряли повышение экспрессии CD86 способом, аналогичным таковому в эксперименте 8.

[0083] Результаты показаны на фиг. 10. Активация дендритных клеток в связи с повышением доставки антигена с помощью SF-10 была подтверждена также в носовой полости мыши.

Эксперимент 10

[0084] Исследовали CVP на предмет его предпочтительной концентрации. За исключением применения рАА130, производимого Sigma Corporation, в качестве CVP с концентрацией 0,1%, 0,25%, 0,5%, 0,75%, или на 1,0%, мукозальную вакцину с добавлением CVP получали способом из примера 6, и способом из эксперимента 1 измеряли количество антиген-специфического IgA в смыве носовой полости и IgG в сыворотке крови мыши.

[0085] Результаты представлены в таблице 5, которая указывает, что уровни и IgA, и IgG были повышены в ответ на увеличение количества CVP до концентрации рАА130 CVP 0,5%. После достижения пика CVP на уровне 0,5% более высокая концентрация CVP, как правило, имела тенденцию уменьшать эффект индукции антитела.

[0086] [Таблица 5]

Эксперимент 11

Исследовали влияние комбинации AD-носителя и CVP на иммуногенный эффект антигена респираторно-синцитиального вируса (RSV). Способом из эксперимента 1 измеряли количество антиген-специфического IgA в смыве носовой полости и IgG в сыворотке крови мыши. Результаты представлены на Фиг. 11, где комбинация AD-носителя и CVP обозначена как "SF-10F" при получении вакцины с использованием лиофилизированного AD-носителя и антигена, смешиваемых с CVP, либо как "SF-10" при получении вакцины с использованием нелиофилизированной смеси. Первая диаграмма на Фиг. 11 отражает результаты эксперимента с IgG, а вторая - с IgA.

Результаты свидетельствуют, что как SF-10F, так и SF-10 в комбинации с антигеном RSV вызывают усиленную продукцию IgG и IgA по сравнению с одним RSV, с комбинацией RSV+CVP и с комбинацией RSV+AD-носитель.

Эксперимент 12

Исследовали эффективность комбинации SF-10 (AD-носитель и CVP) с овальбумином (OVA), типичным антигеном пищевой аллергии, в сравнении с одним OVA и комбинацией OVA+поли(I:С).

Эксперимент проводили на самках мышей BL/6 7-недельного возраста.

Экспериментальные группы: физиологический раствор, OVA, OVA+поли(I:С), OVA+SF-10.

Дозы интраназального введения: 10 мкг OVA/10 мкг поли(I:С) или 100 мкг SF-10/мышь.

График введения: три раза каждые две недели.

На 7-й день после последней вакцинации выделяли лимфоциты из слизистой оболочки носа.

FACS-анализ: лимфоциты окрашивали антителом к T-Select МНС тетрамеру (H-2Kb OVA Tetramer-SINFEKL, РЕ) (MBL) и меченым FITC антимышиным CD8a (BD) и затем проводили FACS-анализ.

Результаты представлены на Фиг. 12.

При интраназальном введении OVA+SF-10 наблюдается значительно более выраженный иммунный ответ по сравнению с введением одного OVA, который сопоставим с ответом, наблюдаемым с поли(I:С), известным мощным мукозальным адъювантом.

Группа изобретений относится к медицине и касается мукозальной вакцины, продуцирующей антиген-специфический IgA слизистой оболочки и IgG крови на уровнях, способных вызывать эффективную иммунную индукцию и эффект предотвращения инфекции, которая включает: (а) AD-носитель, состоящий из синтетического пептида и смеси дипальмитоилфосфатидилхолина, фосфатидилглицерина и пальмитиновой кислоты; (б) карбоксивиниловый полимер; и (в) антигенный белок. Группа изобретений также касается способа получения указанной мукозальной вакцины. Группа изобретений обеспечивает более мощную способность продуцировать антитела, чем у мукозальных вакцин данного уровня техники, и в результате отличный эффект даже при очень небольшом количестве антигена. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 12 ил., 5 табл., 6 пр.

1. Мукозальная вакцина, продуцирующая антиген-специфический IgA слизистой оболочки и IgG крови на уровнях, способных вызывать эффективную иммунную индукцию и эффект предотвращения инфекции, которая включает:
(а) AD-носитель, состоящий из синтетического пептида и смеси дипальмитоилфосфатидилхолина, фосфатидилглицерина и пальмитиновой кислоты, где синтетический пептид состоит из аминокислотной последовательности KnLm (где n составляет от 4 до 8, a m составляет от 11 до 20);
(б) карбоксивиниловый полимер; и
(в) антигенный белок в количестве, не способном продуцировать достаточно IgA слизистой оболочки и IgG крови для оказания эффективной иммунной индукции и эффекта предотвращения инфекции, если использовать его в одиночку.

2. Мукозальная вакцина по п. 1, в которой белковый антиген (в) присутствует в количестве, которое даже в сочетании с AD-носителем (а) или в сочетании с карбоксивиниловым полимером (б) не способно продуцировать антиген-специфические IgA слизистой оболочки и IgG крови в количествах, способных оказывать эффективную иммунную индукцию и эффект предотвращения инфекции.

3. Мукозальная вакцина по п. 1, где указанный синтетический пептид состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID №1 или 2.

4. Мукозальная вакцина по п. 1, где указанный антигенный белок представляет собой полученный из патогена инактивированный антиген, очищенный антиген, частично очищенный антиген, рекомбинантный антиген, обезвреженный токсин или аллерген, вызывающий аллергию.

5. Способ получения мукозальной вакцины, производящей уровни антиген-специфических IgA слизистой оболочки и IgG крови, способные оказывать эффективную иммунную индукцию и эффект предотвращения инфекции, которая включает:
(а) AD-носитель, состоящий из синтетического пептида и смеси дипальмитоилфосфатидилхолина, фосфатидилглицерина и пальмитиновой кислоты, где синтетический пептид состоит из аминокислотной последовательности KnLm (где n составляет от 4 до 8, a m составляет от 11 до 20);
(б) карбоксивиниловый полимер; и
(в) антигенный белок в количестве, не способном продуцировать достаточно IgA слизистой оболочки и IgG крови для оказания эффективной иммунной индукции и эффекта предотвращения инфекции, если использовать его в одиночку, где указанный способ включает:
(1) суспендирование указанного (а) и (в) в воде;
(2) повторное нагревание и перемешивание один или более чем один раз;
(3) замораживание и лиофилизацию;
(4) суспендирование лиофилизированной формы в физиологическом растворе для доведения до заранее определенной концентрации; и
(5) добавление раствора указанного (б).