СПОСОБ ОЧИСТКИ ВИРУСНЫХ ПОЛИЭДРОВ Российский патент 2015 года по МПК C12N7/02 C12R1/92 

Способ очистки вирусных полиэдров.

Изобретение относится к области вирусологии и может быть использовано в технологиях производства инсектицидных препаратов на основе вирусов в качестве промежуточного этапа при выделении вирусов из погибших насекомых.

Большую роль при выделении вирусов играет степень очистки вирусных полиэдров от тканей насекомых. Использование недостаточно очищенных вирусных полиэдров может снизить уровень достоверности в молекулярно-генетических исследованиях, создавать ошибки в конечном результате.

Известен способ очистки вирусных полиэдров [1], в котором инфицированных вирусом трупы личинок растирали в воде и очищали с помощью низкоскоростного центрифугирования. Раствор с полиэдрами разбавляли введением равного объема 0,1% M Na₂CO₃ с последующей очисткой в водном градиенте сахарозы (от 30 до 65% (вес/вес) при 90000 g (g - ускорение свободного падения) в течение 2 часов. Вирусные фракции собирали и осаждали из сахарозы. Полиэдры ресуспендировали в воде и хранили при +4°C.

Недостатками этого метода являются низкая скорость процесса очистки.

Известен способ очистки вирусных полиэдров, использующийся при получении штамма вируса ядерного полиэдроза хлопковой совки [2], в котором для очистки вируса к биомассе из погибших гусениц добавляют дистиллированную воду и размельчают с помощью гомогенизатора, полученный гомогенат фильтруют через 2 слоя капроновой ткани с ячейками 0,1 мм, затем фильтрат осаждают центрифугированием, осадок высушивают на лиофильной установке. В качестве наполнителя используют цеолит или кремниевую кислоту.

Описанный способ обладает низким уровнем очистки полиэдров, так как через слой капроновой ткани с ячейками 0,1 мм проходит много посторонних веществ, и такой диаметр пор ткани как минимум в 50 раз превышает среднестатистический размер вирусных полиэдров насекомых.

В основу изобретения поставлена задача усовершенствования способа очистки вирусных полиэдров, улучшение качества очистки и ускорение процесса.

Поставленная задача решается таким образом, что в способе очистки вирусных полиэдров, включающем гомогенизацию биомассы из погибших насекомых, в заявляемом способе неоднократно проводят центрифугирование при 12000-13000 об/мин, при этом в надосадочную жидкость с полиэдрами добавляют трехмолярный раствор гуанидина тиоцианата и после удаления надосадочной жидкости в пробирку и добавления воды ресуспендируют на центрифуге типа Vortex, при этом полиэдры остаются приклеенными к стенкам пробирки, а осадок, содержащий ткани насекомого, переходит в надосадочную жидкость, которую удаляют, далее полиэдры промывают водой в объеме 200 мкл и удаляют надосадочную жидкость, а к осадку из полиэдров добавляют ТЕ-буфер в соотношении 1:50 (осадок/буфер) по объему, выдерживают 180 сек при температуре +25°C и центрифугируют при 5000 об/мин в течение 60 сек.

Причинно-следственная связь между отличительными признаками изобретения и достигаемым техническим результатом - улучшением качества очистки и ускорением процесса - заключается в следующем. Трехмолярный раствор гуанидина тиоцианата при комнатной температуре хорошо растворяет осадок из тканей насекомого, который потом легко удалить, а осадок из полиэдров слипается и остается на месте. Процедура очищения полиэдров занимает меньше времени по сравнению с прототипом и улучшает качество очистки.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентам и научно-техническим источникам информации, и выявление источников, содержащих сведения об аналогах заявляемого решения, позволил установить, что заявителем не обнаружены аналоги, характеризующиеся признаками, идентичными всем существующим признакам заявляемого изобретения.

Предложенный прототип позволил выявить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков, изложенных в формуле изобретения. Следовательно, заявляемое изобретение соответствует критерию «новизна».

Для проверки соответствия заявляемого изобретения требованию изобретательского уровня был проведен дополнительный поиск по выявлению известных способов очистки вирусных полиэдров с целью выявления признаков, совпадающих с отличительными от прототипа признаками заявляемого изобретения. Результаты проверки показывают, что заявляемое изобретение не следует для специалиста явным образом из известного уровня техники по разработке способа, в частности заявляемым изобретением не предусматривается известное преобразование.

Следовательно, заявляемое изобретение соответствует требованию «изобретательский уровень»

Пример конкретного осуществления способа.

В полипропиленовую пробирку объемом 1,5 мл заливают 1 мл препарата, предварительно взбалтывают. Для избавления от тяжелых фракций центрифугируют препарат в пробирке в течение 10-15 секунд при 12000-13000 об/мин до появления белой фракции полиэдров вируса над осадком тканей насекомого, удаляют надосадочную жидкость с полиэдрами в новую пробирку и добавляют в нее 100 мкл раствора трехмолярного гуанидина тиоцианата на 30-40 мкл осадка. Повторно центрифугируют при 12000-13000 об/мин в течение 60 сек. Удаляют надосадочную жидкость, добавляют в пробирку 200 мкл воды и ресуспендируют на центрифуге типа «Vortex». При этом полиэдры остаются прикрепленными к стенкам пробирки, а осадок, содержащий ткани насекомого, переходит в надосадочную жидкость, которую удаляют, далее полиэдры промывают в объеме 200 мкл воды и опять удаляют надосадочную жидкость.

Далее к осадку из полиэдров добавляют обычный ТЕ-буфер, в соотношении 1:50 (осадок /буфер) по объему. Выдерживают 180 сек при температуре +25 градусов Цельсия, затем центрифугируют при 5000 об/мин в течение 60 сек. После этого удаляют надосадочную жидкость и в осадке остаются очищенные вирусные полиэдров.

Источники информации

1 HarrietM. et. all, The DNA Contained by Nuclear Polyhedrosis Viruses Isolated from Four Spodoptera spp., J. Gen. Virol.(1977), 37,135-143

2 Патент РФ №2359031, МПК C12N 7/00 (2006.01) «Штамм вируса ядерного полиэдроза Хлопковой совки Heliothis armigera Hbn„ используемый для получения инсектицидного препарата».

Способ относится к области вирусологии и касается способа очистки вирусных полиэдров. Изобретение включает гомогенизацию биомассы из погибших насекомых, центрифугирование и выделение осадка. При этом суспензию полиэдров вируса предварительно взбалтывают и центрифугируют до появления белой фракции полиэдров вируса над осадком тканей насекомого. Удаляют надосадочную жидкость с полиэдрами в новую пробирку и добавляют в нее раствор трехмолярного гуанидина тиоцианата, повторно центрифугируют, удаляют надосадочную жидкость, добавляют в пробирку воду и ресуспендируют на центрифуге. Далее к осадку из полиэдров добавляют ТЕ-буфер, выдерживают 180 сек при температуре +25 градусов Цельсия, и затем центрифугируют, удаляют надосадочную жидкость, и в осадке остаются очищенные вирусы полиэдров. Изобретение может быть использовано в технологии производства инсектицидных препаратов на основе энтомопатогенных вирусов в качестве промежуточного этапа при выделении вирусов из погибших насекомых. 1 пр.

Способ очистки вирусных полиэдров, включающий гомогенизацию биомассы из погибших насекомых, центрифугирование и выделение осадка, отличающийся тем, что в полипропиленовую пробирку объемом 1,5 мл заливают 1 мл суспензии полиэдров вируса, предварительно взбалтывают и центрифугируют при 12000-13000 об/мин в течение 10-15 сек до появления белой фракции полиэдров вируса над осадком тканей насекомого, удаляют надосадочную жидкость с полиэдрами в новую пробирку и добавляют в нее 100 мкл раствора трехмолярного гуанидина тиоцианата на 30-40 мкл осадка, повторно центрифугируют при 12000-13000 об/мин в течение 60 сек, удаляют надосадочную жидкость, добавляют в пробирку 200 мкл воды и ресуспендируют на центрифуге типа "Vortex", при этом полиэдры остаются приклеенными к стенкам пробирки, а осадок, содержащий ткани насекомого, переходит в надосадочную жидкость, которую удаляют, далее полиэдры промывают водой в объеме 200 мкл и удаляют надосадочную жидкость, а к осадку из полиэдров добавляют ТЕ-буфер в соотношении 1:50 (осадок/буфер) по объему, выдерживают 180 сек при температуре +25 градусов Цельсия и затем центрифугируют при 5000 об/мин в течение 60 сек, удаляют надосадочную жидкость, и в осадке остаются очищенные вирусы полиэдров.