Способ выделения ДНК из почвы Российский патент 2019 года по МПК C12N15/10 

Изобретение относится к биотехнологии и молекулярной биологии и предназначено для анализа генетического материала почвенных микроорганизмов с целью изучения их разнообразия и при конструировании генно-инженерных штаммов-продуцентов. Способ обеспечивает выход ДНК порядка 10000 нг на 0.2 г чернозема.

За последние два десятилетия во всех отраслях биологической науки, связанных с микробиологией, произошли революционные изменения - ученые пришли к выводу, что биоразнообразие микроорганизмов разительно превосходит сложившиеся за последние 100-150 лет представления. Выяснилось, что ранее изучали менее 1% всех существующих микроорганизмов, а приблизительно 99% не могут на настоящий момент культивироваться в лабораторных условиях и, соответственно, не подвергались какому-либо изучению. В настоящий момент развиваются методы, не связанные с получением культур, и позволяющие изучать микроорганизмы в пределах их природного местообитания. Такие методы получили название метагеномных. Метагеномика - раздел молекулярной генетики, изучающий «метагеном» - генетический материал, получаемый напрямую из образцов, взятых из окружающей среды. Традиционное секвенирование геномов полагается на культивируемые клоны культур, в то время как метагеномика работает с набором всех ДНК, находящихся в образце. Основным отличием при использовании метагеномного подхода является учет некультивируемых микроорганизмов, наряду с культивируемыми.

Выбор метода выделения ДНК - это один из важнейших этапов в проведении исследования, поскольку от качества и количества выделенной ДНК зависит успех дальнейших исследований. Существующие методы выделения почвенной метагеномной (тотальной) ДНК часто не позволяют получить достаточное для исследований (метагеномного секвенирования) количество ДНК необходимой чистоты. Необходимо отметить, что на первоначальных этапах выделения ДНК из почвы требуется получить максимально возможное количество нуклеиновых кислот, так как в процессе дальнейшей очистки потери ДНК могут быть значительными. Известные способы выделения ДНК из почвы, в основном, отличаются использованием различных поверхностно-активных веществ (ПАВ) с целью достижения наилучшего разрушения клеток, диссоциации биополимеров и их десорбции с почвенных частиц. Выход ДНК при использовании этих методов, как правило, невелик, что приводит к увеличению перерабатываемого объема почвы, повышению трудозатрат и расходу реактивов. В связи с этим исследователями постоянно предпринимаются попытки увеличить выход ДНК, предлагаются различные методы и наборы реактивов.

Известны коммерческие наборы реактивов для выделения метагеномной почвенной ДНК. Выделение ДНК в данном случае проводится в соответствии с протоколом производителей. Набор для выделения геномной ДНК из почв FastDNA Spin Kit For Soil (MP Biomedicals) (FastDNA Spin Kit For Soil, MP Biomedicals. Электронный ресурс: https://www.dia-m.ru/lab/gomogenizatory-fastprep/acs/17086/) [1] используется с гомогенизатором FastPrep или с альтернативным прибором. До 500 мг почвенной пробы помещают в 2 мл пробирки, содержащие лизирующую матрицу Е - смесь стеклянных (4 мм в диаметре), кварцевых (0.1 мм в диаметре) и керамических (1.4 мм в диаметре) шариков, способных разрушать все почвенные организмы. Гомогенизация происходит в присутствии МТ буфера и фосфата натрия. По завершению лизиса образцы центрифугируются. Полученную ДНК очищают с использованием технологии Geneclean, включающую применение силикагелевых фильтров SPIN и устранение гуминовых кислот и полифенолов.

Однако этот набор имеет высокую стоимость, которая составляет примерно 400 долларов на 50 выделений, выход ДНК низкий и составляет порядка 1-5 мкг из 500 мг почвы [1].

Известен также набор NucleoSpin® Soil (MACHEREY-NAGEL) (Genomic DNA from soil. User manual. NucleoSpin® Soil. November 2017 / Rev. 07. http://www.mnnet.com/Portals/8/attachments/Redakteure_Bio/Protocols/Genomic%20DNA/UM_gDNASoil.pdf) [2], который предназначен для выделения тотальной ДНК из почвы. Набор включает два альтернативных лизирующих буфера и добавку Enhancer SX, которую можно комбинировать с обоими лизирующими буферами. Для количественного связывания ДНК используются оптимизированные колонки с диоксидом кремния - NucleoSpin® Soil Columns. NucleoSpin® Bead Tubes, содержащие керамические бусины, которые позволяют наиболее эффективно лизировать микроорганизмы в образце. Для удобного удаления загрязняющих веществ в набор включены колонки для удаления ингибиторов NucleoSpin® Inhibitor Removal Columns. Вначале материал образца ресуспендируют в буфере для лизиса SL1 или SL2, дополненном Enhancer SX и механически разрушают с использованием керамических бусин. Белки и ингибиторы полимеразной цепной реакции (ПЦР) осаждаются буфером для лизиса SL3, а затем осаждают путем центрифугирования вместе с керамическими шариками и образцом материала. Супернатант (надосадочную жидкость) отбирают и очищают, пропуская его через NucleoSpin® Inhibitor Removal Column колонку для удаления ингибиторов. Связывание ДНК регулируется добавлением буфера SB и лизат загружают в колонку NucleoSpin® Soil Column. Остаточные гуминовые вещества, особенно гуминовые кислоты и другие ингибиторы ПЦР, удаляют путем эффективной промывки буфером SB и промывочными буферами SW1, а затем SW2. После стадии высушивания готовая к использованию ДНК может быть элюирована (смыта) буфером SE SEPLUS - 5 мМ Tris /HCl, рН 8.5.

Данный набор имеет высокую стоимость, которая составляет примерно 370 долларов на 50 выделений и невысокий выход ДНК порядка 2-10 мкг из 0.5 г почвы [2, С. 7].

Известен набор для выделения ДНК (RU 2650865, МПК C12N 15/10, опубл. 17.04.2018) [3], включающий лизирующий, промывочные и элюирующий буферные растворы. Лизирующий буферный раствор содержит гуанидин тиоцианат, трис гидрохлорид, тритон и сорбент в виде суспензии из магнитных микросфер в солевом растворе. Промывочный буфер №1 содержит гуанидин тиоцианат, трис гидрохлорид и этиловый спирт. Промывочный буфер №2 содержит трис гидрохлорид, хлорид натрия и этиловый спирт. Элюирующий раствор представляет собой деионизированную воду. Известный набор реактивов для выделения ДНК имеет небольшой выход ДНК - от 200 до 500-1000 нг из 5 г исходного материала [3, С. 3].

Для облегчения выхода ДНК из клеток, кроме определенных реагентов, используются способы с применением физических факторов воздействия.

Например, в способе выделения ДНК из почвы (Bintrim S.B., Donohue T.J., Handelsman J., Roberts G.P., Goodman R.M. Molecular phylogeny of Archaea from soil // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1997. - V. 94 (1). - P. 277-282. https://doi.org/10.1073/pnas.94.L277) [4, C. 277-278] для облегчения выхода ДНК из клеток использован ультразвук. 500 миллиграммов почвы ресуспендируют в 500 мкл раствора А, содержащего 250 мМ NaCl и 100 мМ Na₂EDTA (двунатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты), и обрабатывают ультразвуком в ультразвуковой ванночке Branson 2200 в течение 3 минут. Затем добавляют лизоцим до концентрации 0,5 мг/мл и смесь инкубируют при 37°C в течение 30 мин с периодическим перемешиванием. Далее добавляют протеиназу K до конечной концентрации 2.0 мг/мл и смесь инкубируют еще 30 мин. После инкубации добавляют 500 мкл раствора В, который содержит 250 мМ NaCl, 100 мМ Na₂EDTA, 4% (вес/об.) додецилсульфата натрия (sodium dodecyl sulphate, SDS), и 75 мкл 5 М гуанидин изотиоцианата и смесь осторожно перемешивают. Смесь инкубируют при 68°C в течение 1 часа при периодическом перемешивании. После инкубации образец смешивают в соотношении 1:1 с гранулами диоксида циркония/кремнезема диаметром 0,1 мм и гомогенизируют в Mini-Beadbeater (тип ВХ-4, Biospec Products, США) при 3000 об/мин в течение 45 секунд. Образцы центрифугируют, чтобы удалить гранулы, и отбирают надосадочную жидкость, в которую добавляют 150 микролитров раствора цетилтриметиламмоний бромида (cetyltrimetylammonium bromide, СТАВ), который содержит 2% (вес./об.) СТАВ, 100 мМ Трис⋅HCl рН 8.0, 20 мМ Na₂EDTA, 1.4 М NaCl, и перемешивают. Смесь инкубируют при 65°C в течение 15 мин с периодическим перемешиванием и затем последовательно экстрагируют равными объемами смеси хлороформ : изоамиловый спирт (24:1), фенол : хлороформ : изоамиловый спирт (24:24:1) и хлороформ : изоамиловый спирт (24:1). Равный объем изопропанола добавляется в супернатант, и тотальная ДНК извлекается центрифугированием. ДНК ресуспендируется в 500 мкл 10 мМ Tris⋅HCl (рН 8.0) и для амплификации ПЦР очищается 4-кратной ультрафильтрацией с использованием микроконцентраторов Microcon-100 (Amicon).

Недостатком известного способа является трудоемкость, а использование ультразвука может вызвать повреждение структуры ДНК (Grokhovsky S.L. Specificity of DNA cleavage by ultrasound // Molecular Biology. - 2006. - V. 40 (2). - P. 276-283; Нечипуренко Ю.Д, Головкин M.B., Нечипуренко Д.Ю., Ильичева И.А., Панченко Л.А., Полозов Р.В., Гроховский С.Л. Характерные особенности расщепления ДНК ультразвуком // Журнал структурной химии. - 2009. - Т. 50, №5. - С. 1045-1052) [5, Р. 277; 6, С. 1050-1051].

Известен способ выделения ДНК, в котором образец почвы после смешивания с лизирующим раствором, содержащим NaCl, SDS, инкубируют при температуре 72°C в течение 45 мин для лизиса бактериальных клеток (Sagar K., Singh S., Goutam K.K., Konwar В.K. Assessment of five soil DNA extraction methods and a rapid laboratory-developed method for quality soil DNA extraction for 16S rDNA-based amplification and library construction. // J Microbiol. Methods. - 2014. - V. 97. - P. 68-73. doi: 10.1016/j.mimet.2013.11.008) [7]. Далее образец центрифугируют при ускорении 13000 g в течение 5 мин при 4°C и супернатант переносят в 2-мл центрифужную пробирку. 100 мкл 6 М ацетата калия и 400 мкл 50% полиэтиленгликоля (ПЭГ) вносят в надосадочную жидкость и смесь оставляют для осаждения на 20 мин при -20°C и затем центрифугируют при 4°C в течение 5 мин. Супернатант удаляют и осадок высушивают на воздухе. Далее его растворяют в 500 мкл ТЕ-буфера (трис-ЭДТА буфер) рН 8.0, добавляют 500 мкл хлороформа и центрифугируют с ускорением 13000 g при 4°C в течение 5 мин. Экстракцию хлороформом повторяют дважды и в супернатант добавляют 500 мкл изопропанола. Затем оставляют для осаждения водной фракции ДНК на 5 мин при 4°C и снова центрифугируют при ускорении 13000 g в течение 5 мин. Осадок ДНК суспендируют в 100 мкл 1 × ТЕ (10 mMTris-HCl, 1 мМ ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота)).

Недостатком метода является невысокий выход ДНК, который составляет 3.8 мкг/г почвы [7, С. 70], что может быть обусловлено неэффективной процедурой клеточного лизиса.

В другом способе выделения ДНК из почвы для клеточного лизиса используется порошок из стекла (Devi S.G., Fathima A.A., Radha S., Arunraj R., Curtis W.R., Ramya M. Rapid and economical method for efficient DNA extraction from diversesoils suitable for metagenomic applications // PLoS One. - 2015. - V. 10 (7):e0132441. doi: 10.1371/journal.pone.0132441) [8]. Для выделения ДНК 1 г образца почвы и 1 г стерильного порошка из измельченного лабораторного стекла помещают в стерильную ступку и растирают примерно в течение 5 мин. Для экстракции ДНК добавляют 1 мл буфера 100 мМ Трис, 100 мМ ЭДТА, 1.5 М NaCl (рН 8.0) и 10 мг порошкообразного активированного угля и перемешивают несколько раз посредством пипетирования. Переносят смесь в 2-миллилитровую пробирку. Инкубируют пробирку при 65°C в течение 10 минут на водяной бане, а затем центрифугируют при ускорении 12000 g в течение 5 минут при 4°C. Переносят 500 мкл супернатанта в новую микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл. В полученную надосадочную жидкость добавляют 100 мкл ацетата натрия, рН 5.2, и 400 мкл 30% ПЭГ (MW-8000). Дают смеси остыть при -20°C в течение 20 минут в морозильной камере. Медленно оттаивают пробирки, а затем центрифугируют при 12000 g, в течение 5 минут при 4°C. Удаляют надосадочную жидкость и снова суспендируют осадок с 500 мкл ТЕ-буфера 10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА рН 8.0. Добавляют равный объем (500 мкл) смеси хлороформ : изоамиловый спирт, приготовленной в соотношении 24:1. Центрифугируют при 12000 g в течение 5 минут при 4°C. Переносят водную фазу в новую пробирку и добавляют 500 мкл ледяного изопропанола. Проводят осаждение в течение 5 мин при 4°C и центрифугируют при ускорении 12000 g в течение 10 мин при 4°C. Удаляют супернатант и промывают осадок 70% этанолом. Центрифугируют при 12000 g в течение 2 минут при 4°C. Удаляют супернатант, высушивают на воздухе осадок и растворяют в 100 мкл буфера ТЕ (рН 8.0).

Недостатком метода также является невысокий выход ДНК, равный 5.48 мкг/г почвы [8, С. 9].

Известен способ выделения ДНК из биологических объектов на предметных носителях - марле, бумаге, синтетических тканях, в котором в качестве поверностно-активного вещества для разрушения клеток и диссоциации биополимеров используется N-лаурилсаркозинат Na, а для предотвращения деградации нуклеиновых кислот - динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) (RU 2485178, МПК C12N 15/10, В82В 1/00. опубл. 20.06.2013) [9]. Согласно известному способу биологический объект измельчают и помещают в пробирку с лизирующим буферным раствором состава: 0.1 М Трис-HCl, 0.1 М ЭДТА, 0.1 М NaCl, 0.5% N-лаурилсаркозил Na и протеиназы К, рН 6-7. Получают клеточный лизат, к которому добавляют сорбент магнитных наночастиц, модифицированных хитозаном, перемешивают и инкубируют в течение 25-35 мин. Пробирку помещают на магнитный штатив, разделяют смесь на фракции - сорбент, связанный с ДНК, и надосадочную жидкость. Надосадочную жидкость удаляют, а к осадку приливают элюирующий буферный раствор 10 мМ трис-HCl, рН 7.4, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, инкубируют, пробирки помещают на магнитный штатив, разделяют смесь на фракции сорбент - осадок и надосадок - ДНК, растворенная в элюирующем буферном растворе. Осадок удаляют, в надосадочной жидкости остается ДНК. Выход продукта составляет до 200 нг ДНК из 5 г костного порошка. Способ позволяет выделить ДНК из биологических материалов, например, мышечной ткани, рогов, шерсти животных, ногтевых пластин.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому изобретению является способ выделения ДНК из образцов почвы (Выделение ДНК из образцов почвы: Методические указания. Российская академия сельскохозяйственных наук. Всероссийский научно исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии. - СПб., 2011. - 27 с.) [10, С. 15-17], в котором в качестве основного детергента для выделения ДНК используется додецилсульфат натрия. К навеске 0.2 г замороженной почвы, помещенной в пробирку, добавляют количество стеклянных бусин, по объему примерно равное почве, и вносят раствор гуанидина - гуанидина изотиоцианат 240 mM, натрий-фосфатный буфер 200 mM, рН 7.0, и 350 мкл 1% раствора SDS - TrisHCl 500 mM, SDS 1% (вес/об.), рН 7.9, а также 400 мкл смеси фенол-хлороформ. Пробирку помещают во встряхиватель и гомогенизируют образец в течение 1-15 мин, в зависимости от мощности прибора (FastPrep 24-1 мин при максимальной мощности, Vortex Genie® 2-15 мин при максимальной скорости). Затем центрифугируют при ускорении 10-15 × 10³ g при максимальной скорости в течение 5 мин. Водную фазу отбирают, добавляют 400 мкл хлороформа, центрифугируют также, как и на предыдущей стадии, и отбирают водную фазу. К неочищенному экстракту ДНК добавляют равный объем изопропилового спирта, центрифугируют на максимальной скорости в течение 5 мин, промывают 70% (об./об.) этанолом, слегка подсушивают на воздухе и растворяют осадок при 65°C в течение 5-10 мин в 100 мкл воды.

В методических указаниях не представлен выход ДНК. В связи с этим авторами заявляемого изобретения был реализован способ-прототип и получен выход ДНК, равный 1750 нг из 0.2 г образца чернозема (Таблица 2), что недостаточно для метагеномных исследований, например, для NGS-секвенирования (секвенирование следующего поколения).

Задачей заявляемого изобретения является увеличение выхода метагеномной ДНК из почвы за счет повышения эффективности процессов разрушения клеток и десорбции биополимеров.

Указанный технический результат достигается тем, что способ выделения ДНК из почвы включает гомогенизацию образца почвы путем вибрации в присутствии мелющих тел в растворе, содержащем гуанидин HCl, натрий-фосфатный буфер, TrisHCl, додецилсульфат натрия (SDS), смесь фенол-хлороформ с последующим центрифугированием и осаждением ДНК изопропанолом.

Согласно изобретению раствор для гомогенизации почвы дополнительно содержит детергент лаурилсаркозинат натрия при следующем соотношении исходных компонентов, вес. %:

лаурилсаркозинат натрия - 2-6

додецилсульфат натрия - 1-4

В предпочтительном исполнении:

- гомогенизацию образца почвы осуществляют при помощи вибромельницы в диапазоне частот 25-35 Гц;

- в качестве мелющих тел используют смесь стеклянных бусин диаметром 0.5 мм и 1.0 мм и керамических бусин 2.0 мм в весовом соотношении 3:1:1, соответственно.

Лаурилсаркозинат натрия C₁₅H₂₈NNaO₃ и додецилсульфат натрия являются поверхностно-активными веществами, которые применяются в качестве детергентов в промышленности, фармакологии, косметологии (Лаурилсаркозинат натрия. Электронный ресурс: https://dic.academic.ru/dic.nsf/ruwiki/1541358 (дата обращения: 03.08.2018); Лаурилсульфат натрия. Электронный ресурс: http://moepravo.guru/vozvrat-i-obmen/obsshaya-informatsiya/sostav/laurilsulfat-natriya (дата обращения: 03.08.2018)) [11, 12].

Сочетание известных детергентов в заявляемых концентрациях приводит к повышению эффективности процессов разрушения клеток и десорбции биополимеров благодаря синергетическому эффекту - и, как следствие, высокому выходу ДНК из почвы порядка 10000 нг, что не достигалось в прототипе и известных аналогах.

Способ осуществляется следующим образом.

В пробирку объемом 2 мл с завинчивающейся крышкой помещают навеску 0.2 г замороженной почвы, к которой добавляют стеклянные диаметром 0.5 мм и 1.0 мм и керамические диаметром 2.0 мм бусины. Затем в пробирку вносят 350 мкл раствора гуанидина - гуанидин HCl 240 mM, натрий-фосфатный буфер 200 mM, рН 7.0; 350 мкл раствора SDS - TrisHCl 500 mM, SDS 1-4%, вес. %, рН 7.9; 350 мкл раствора лаурилсаркозината натрия 2-6%, вес. %, а также 400 мкл смеси фенол-хлороформ. Смесь встряхивают на мельнице Mixer Mills ММ400 (Retsch, Германия) в течение 15 минут при частоте 30 Гц, затем центрифугируют на центрифуге MiniSpin Plus Eppendorf в течение 7 минут при ускорении 14000 g. Отбирают водную фазу и добавляют к ней 400 мкл хлороформа. Затем интенсивно встряхивают и центрифугируют в течение 7 минут при ускорении 14000 g, затем отбирают 500 мкл водной фазы и добавляют к ней 500 мкл изопропилового спирта. Выдерживают в холодильнике в течение 15 минут. Далее центрифугируют в течение 7 минут при ускорении 14000 g. Осадок 2 раза промывают 70% этанолом (об./об.) и растворяют в 1X буфере ТЕ. Степень чистоты всех реактивов, использованных в экспериментах - "ч.д.а.". Концентрацию ДНК определяли флуориметрическим способом при помощи флуориметра Quibit 3.0 (Termo Fisher Scientific).

В таблице 1 приведено количество ДНК в нг, выделенной из образца почвы весом 0.2 г с применением додецилсульфата натрия и лаурилсаркозината натрия в заявляемых концентрациях и за их пределами.

В таблице 2 приведено количество ДНК, нг, выделенной из образца почвы весом 0.2 г, полученное согласно заявляемому способу и способу-прототипу.

Пример 1. Выделение ДНК с помощью 0.5% SDS совместно с раствором гуанидин хлорида. Провели выделение ДНК согласно способу-прототипу [10], отличающееся тем, что концентрацию SDS уменьшили до 0.5%.

Пример 2. Выделение ДНК согласно способу-прототипу [10].

В пробирку объемом 2 мл с завинчивающейся крышкой помещали навеску 0.2 г замороженной почвы. Добавляли количество матрикса - стеклянных бусин, по объему примерно равное почве, после чего в каждый эппендорф вносили 350 мкл раствора гуанидина - гуанидина изотиоцианат 240 mM, натрий-фосфатный буфер 200 mM, рН 7.0, и 350 мкл 1% раствора SDS - TrisHCl 500 mM, SDS 1% (вес/об.), рН 7.9, а также 400 мкл смеси фенол-хлороформ. Пробирку помещали во встряхиватель и разрушали образец в течение 1-15 мин, в зависимости от мощности прибора (FastPrep 24 - 1 мин при максимальной мощности). Затем центрифугировали при ускорении 10-15 × 10³ g (максимальная скорость, стандартный ротор для 1,5 мл пробирок типа эппендорф) в течение 5 мин. Водную фазу аккуратно отбирали, добавляли 400 мкл хлороформа, интенсивно встряхивали в течение 1-3 мин, центрифугировали при ускорении 10-15 × 10³ g, аккуратно отбирали водную фазу. К неочищенному экстракту ДНК добавляли один объем изопропилового спирта, интенсивно встряхивали, центрифугировали (максимальная скорость, 5 мин), промывали 70% (об./об.) этанолом, слегка подсушивали на воздухе и растворяли осадок при 65°C в течение 5-10 мин в 100 мкл воды. Концентрацию ДНК определяли флуориметрическим способом при помощи флуориметра Quibit 3.0 (Termo Fisher Scientific).

Пример 3. Выделение ДНК с помощью с помощью 2% SDS. Провели выделение ДНК согласно примеру 2, отличающееся тем, что концентрацию SDS увеличили до 2%.

Пример 4. Выделение ДНК с помощью 4% SDS совместно с раствором гуанидин хлорида. Выделение ДНК проводили согласно примеру 2, отличающееся тем, что концентрацию SDS увеличили до 4%.

Пример 5. Выделение ДНК с помощью 6% SDS совместно с раствором гуанидин хлорида. Выделение ДНК проводили согласно примеру 2, отличающееся тем, что концентрацию SDS увеличили до 6%.

Пример 6. Выделение ДНК с помощью 1% лаурилсаркозината натрия вместо гуанидин хлорида и SDS.

Выделение ДНК проводили согласно следующей процедуре.

В пробирку объемом 2 мл с завинчивающейся крышкой брали навеску 0.2 г замороженной почвы. Добавляли количество матрикса - стеклянных бусин, по объему примерно равное почве, после чего в каждый эппендорф вносили 350 мкл 200 mM натрий-фосфатного буфера и 350 мкл 1% раствора лаурилсаркозината натрия - TrisHCl 500 mM, лаурилсаркозинат натрия 1% (вес/об.), рН 7.9, а также 400 мкл смеси фенол-хлороформ. Смесь встряхивали на мельнице Mixer Mills ММ400 («Retsch», Германия) в течение 15 минут при частоте 30 Гц, затем центрифугировали 7 минут при ускорении 14000 g. Отбирали водную фазу, добавляли к ней 400 мкл хлороформа, интенсивно встряхивали в течение 2 минут. Центрифугировали так же, как и на предыдущей стадии, затем отбирали 500 мкл водной фазы и добавляли к ней 500 мкл изопропилового спирта. Выдерживали в холодильнике в течение ~15 минут, после чего центрифугировали 7 минут при ускорении 14000 g. Осадок дважды промывали 70% этанолом и растворяли в деионизированной воде. Концентрацию ДНК определяли флуориметрическим способом при помощи флуориметра Quibit 3.0 (Termo Fisher Scientific).

Пример 7. Выделение ДНК с помощью 2% лаурилсаркозината натрия.

Выделение ДНК проводили согласно примеру 6, отличающееся тем, что концентрацию лаурилсаркозината натрия увеличили до 2%.

Пример 8. Выделение ДНК с помощью 4% лаурилсаркозината натрия

Выделение ДНК проводили согласно примеру 6, отличающееся тем, что концентрацию лаурилсаркозината натрия увеличили до 4%.

Пример 9. Выделение ДНК с помощью 6% лаурилсаркозината натрия

Выделение ДНК проводили согласно примеру 6, отличающееся тем, что концентрацию лаурилсаркозината натрия увеличили до 6%.

Пример 10. Выделение ДНК с помощью 8% лаурилсаркозината натрия

Выделение ДНК проводили согласно примеру 6, отличающееся тем, что концентрацию лаурилсаркозината натрия увеличили до 8%.

Пример 11. Выделение ДНК с помощью 4% лаурилсаркозината натрия совместно с 0.5% SDS и раствором гуанидин хлорида.

В пробирку объемом 2 мл с завинчивающейся крышкой брали навеску 0.2 г замороженной почвы. Добавляли количество матрикса - стеклянных бусин, по объему примерно равное почве, после чего в каждый эппендорф вносили 350 мкл раствора гуанидина - гуанидин HCl 240 mM, натрий-фосфатный буфер 200 mM, рН 7.0, и 350 мкл раствора 0.5% SDS с 4% лаурилсаркозинатом натрия - TrisHCl 500 mM, SDS 1% (вес/об.), лаурилсаркозинат натрия 4% (вес/об.), рН 7.9, а также 400 мкл смеси фенол-хлороформ.

Смесь встряхивали на мельнице Mixer Mills ММ400 («Retsch», Германия) в течение 15 минут при частоте 30 Гц, затем центрифугировали 7 минут при 14000 g. Отбирали водную фазу, добавляли к ней 400 мкл хлороформа, интенсивно встряхивали в течение 2 минут. Центрифугировали так же, как и на предыдущей стадии, затем отбирали водную фазу и добавляли к ней 500 мкл изопропилового спирта. Выдерживали в холодильнике в течение ~15 минут, после чего центрифугировали 7 минут при 14000 g. Осадок дважды промывали 70% этанолом и растворяли в деионизированной воде. Концентрацию ДНК определяли флуориметрическим способом при помощи флуориметра Quibit 3.0 (Тепло Fisher Scientific).

Пример 12. Выделение ДНК с помощью 4% лаурилсаркозината натрия совместно с 1% SDS и раствором гуанидин хлорида.

Выделение ДНК проводили согласно примеру 11, отличающееся тем, что концентрацию SDS увеличили до 2%.

Пример 13. Выделение ДНК с помощью 4% лаурилсаркозината натрия совместно с 2% SDS и раствором гуанидин хлорида.

Выделение ДНК проводили согласно примеру 11, отличающееся тем, что концентрацию SDS увеличили до 2%.

Пример 14. Выделение ДНК с помощью 4% лаурилсаркозината натрия совместно с 4% SDS и раствором гуанидин хлорида.

Выделение ДНК проводили согласно примеру 11, отличающееся тем, что концентрацию SDS увеличили до 4%.

Пример 15. Выделение ДНК с помощью 4% лаурилсаркозината натрия совместно с 6% SDS и раствором гуанидин хлорида.

Выделение ДНК проводили согласно примеру 11, отличающееся тем, что концентрацию SDS увеличили до 6%.

Пример 16. Выделение ДНК с помощью 1% лаурилсаркозината натрия совместно с 2% SDS и раствором гуанидин хлорида.

В пробирку объемом 2 мл с завинчивающейся крышкой брали навеску 0.2 г замороженной почвы. Добавляли количество матрикса - стеклянных бусин, по объему примерно равное почве, после чего в каждый эппендорф вносили 350 мкл раствора гуанидина - гуанидин HCl 240 mM, натрий-фосфатный буфер 200 mM, рН 7.0, и 350 мкл раствора 2% SDS с 1% лаурилсаркозинатом натрия - TrisHCl 500 mM, SDS 2% (вес/об.), лаурилсаркозинат натрия 1% (вес/об.), рН 7.9, а также 400 мкл смеси фенол-хлороформ.

Смесь встряхивали на мельнице Mixer Mills ММ400 («Retsch», Германия) в течение 15 минут при частоте 30 Гц, затем центрифугировали 7 минут при 14000 g. Отбирали водную фазу, добавляли к ней 400 мкл хлороформа, интенсивно встряхивали в течение 2 минут. Центрифугировали так же, как и на предыдущей стадии, затем отбирали водную фазу и добавляли к ней 500 мкл изопропилового спирта. Выдерживали в холодильнике в течение ~15 минут, после чего центрифугировали 7 минут при 14000 g. Осадок дважды промывали 70% этанолом и растворяли в деионизированной воде. Концентрацию ДНК определяли флуориметрическим способом при помощи флуориметра Quibit 3.0 (Termo Fisher Scientific).

Пример 17. Выделение ДНК с помощью 2% лаурилсаркозината натрия совместно с 2% SDS и раствором гуанидин хлорида.

Выделение ДНК проводили согласно примеру 16, отличающееся тем, что концентрацию лаурилсаркозината натрия увеличили до 2%.

Пример 18. Выделение ДНК с помощью 6% лаурилсаркозината натрия совместно с 2% SDS и раствором гуанидин хлорида.

Выделение ДНК проводили согласно примеру 16, отличающееся тем, что концентрацию лаурилсаркозината натрия увеличили до 6%.

Пример 19. Выделение ДНК с помощью 8% лаурилсаркозината натрия совместно с 2% SDS и раствором гуанидин хлорида.

Выделение ДНК проводили согласно примеру 16, отличающееся тем, что концентрацию лаурилсаркозината натрия увеличили до 8%.

Концентрация ДНК регистрировалась при помощи флуориметра Qubit 3.0 (Termo Fisher Scientific).

Как видно из данных, приведенных в таблице 1, количество ДНК, выделенной из образца почвы весом 0.2 г с помощью коммерческого набора NucleoSpin® Soil (MACHEREY-NAGEL), составило 580 нг. Это минимальный выход ДНК, который был получен при ее выделении способами, приведенными в примерах 1-19 (таблица 1).

При выделении ДНК из почвы с использованием в качестве детергента только додецилсульфата натрия (примеры 1-5), наилучший результат был достигнут при концентрации SDS 2%. Выход ДНК составил 2010 нг / 0.2 г модельной почвы.

Если в качестве единственного детергента применялся лаурилсаркозинат натрия (примеры 6-10), наилучший результат был зарегистрирован, когда его концентрация составила 4%. При данной концентрации лаурилсаркозината натрия удалось выделить 3030 нг ДНК из 0.2 г модельной почвы.

При анализе данных, полученных в результате осуществления примеров 11-19, стал очевиден синергетический эффект действия двух детергентов одновременно. При совместном действии додецилсульфата натрия и лаурилсаркозината натрия минимальное количество выделенной из 0.2 г модельной почвы ДНК составило 4830 нг, что в 1,59 раз превышает максимальный эффект одиночного применения анализируемых детергентов. Сочетание концентраций детергентов 4% лаурилсаркозината натрия и 2% додецилсульфата натрия позволило выделить из 0.2 г модельной почвы 15300 нг ДНК. Это более чем в 5 раз выше, чем количество ДНК, полученное при помощи любого из детергентов по отдельности.

Таким образом, данные, приведенные в таблице 1, позволили сделать вывод о значительном синергетическом эффекте совместного применения лаурилсаркозината натрия и додецилсульфата натрия. Смесь этих детергентов при выделении ДНК из почвы более эффективно лизировала биологические объекты, находящиеся в почве, предотвращала сорбцию нуклеиновых кислот на почвенных частицах и агрегацию биополимеров.

В таблице 2 приведены данные по сравнению количества ДНК, выделенной из 0.2 г модельной почвы при помощи способа-прототипа и заявляемого способа. Из данных таблицы 2 видно, что при использовании заявленных концентраций лаурилсаркозината натрия и додецилсульфата натрия выход ДНК превысил количество ДНК, выделенное при помощи способа-прототипа от 4.5 до 8.7 раз.

Найденные в результате экспериментов концентрации и соотношения детергентов позволили получить максимальный выход ДНК порядка 10000 нг, что не достигалось известными аналогами и прототипом.

Источники информации:

1. Набор для выделения геномной ДНК из почв / FastDNA Spin Kit For Soil, MP Biomedicals. Электронный ресурс: https://www.dia-m.ru/lab/gomogenizatory-fastprep/acs/17086/ (дата обращения: 3.08.2018).

2. Genomic DNA from soil. User manual. NucleoSpin® Soil. November 2017 / Rev. 07. http://www.mn-net.com/Portals/8/attachments/Redakteure_Bio/Protocols/Genomic%20DNA/UM_gDNASoil.pdf (дата обращения: 3.08.2018).

3. Патент 2650865. Российская Федерация, МПК C12N 15/10. Набор реактивов для выделения ДНК / Викторов Д.А., Никитин А.Г., Пименов С.В., Тороповский А.Н. - 2016146882, заявл. 29.11.2016, опубл. 17.04.2018, Бюл. №11. - С. 3.

4. Bintrim S.B., Donohue T.J., Handelsman J., Roberts G.P., Goodman R.M. Molecular phylogeny of Archaea from soil // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1997. - V. 94 (1). - P. 277-282. https://doi.org/10.1073/pnas.94.1.277

5. Grokhovsky S.L. Specificity of DNA cleavage by ultrasound // Molecular Biology. - 2006. - V. 40 (2). - P. 276-283.

6. Нечипуренко Ю.Д, Головкин M.B., Нечипуренко Д.Ю., Ильичева И.А., Панченко Л.А., Полозов Р.В., Гроховский С.Л. Характерные особенности расщепления ДНК ультразвуком // Журнал структурной химии. - 2009. - Т. 50, №5. - С. 1045-1052.

7. Sagar K., Singh S., Goutam K.K., Konwar В.K. Assessment of five soil DNA extraction methods and a rapid laboratory-developed method for quality soil DNA extraction for 16S rDNA-based amplification and library construction. // J Microbiol. Methods. - 2014. - V. 97. - P. 68-73. doi: 10.1016/j.mimet.2013.11.008.

8. Devi S.G., Fathima A.A., Radha S., Arunraj R., Curtis W.R., Ramya M. A rapid and economical method for efficient DNA extraction from diverse soils suitable for metagenomic applications // PLoS One. - 2015. - V. 10 (7):e0132441. doi: 10.1371/journal.pone.0132441.

9. RU 2485178, МПК C12N 15/10, B82B 1/00. опубл. 20.06.2013,

10. Выделение ДНК из образцов почвы: Методические указания. Российская академия сельскохозяйственных наук. Всероссийский научно исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии. - СПб., 2011. - 27 с. - прототип.

11. Лаурилсаркозинат натрия. Электронный ресурс: https://dic.academic.ru/dic.nsf/ruwiki/1541358 (дата обращения: 03.08.2018).

12. Лаурилсульфат натрия. Электронный ресурс: http://moepravo.guru/vozvrat-i-obmen/obsshaya-informatsiya/sostav/laurilsulfat-natriya (дата обращения: 03.08.2018).

Изобретение относится к биотехнологии и молекулярной биологии и предназначено для анализа генетического материала почвенных микроорганизмов с целью изучения их разнообразия и при конструировании генно-инженерных штаммов-продуцентов. Техническим результатом является увеличение выхода метагеномной ДНК из почвы за счет повышения эффективности процессов разрушения клеток и десорбции биополимеров. Для этого осуществляют гомогенизацию образца почвы путем вибрации в присутствии мелющих тел в растворе, содержащем гуанидин HCl, натрий-фосфатный буфер, TrisHCl, додецилсульфат натрия в количестве 1-4 вес.%, лаурилсаркозинат натрия в количестве 2-6 вес.%, смесь фенол-хлороформ с последующим центрифугированием и осаждением ДНК изопропанолом. Способ обеспечивает выход ДНК порядка 10000 нг на 0.2 г чернозема. 2 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Способ выделения ДНК из почвы, включающий гомогенизацию образца почвы путем вибрации в присутствии мелющих тел в растворе, содержащем гуанидин НCl, натрий-фосфатный буфер, TrisHCl, додецилсульфат натрия (SDS), смесь фенол-хлороформ, с последующим центрифугированием и осаждением ДНК изопропанолом, отличающийся тем, что раствор для гомогенизации почвы дополнительно содержит детергент лаурилсаркозинат натрия при следующем соотношении исходных компонентов, вес.%:

лаурилсаркозинат натрия - 2-6,

додецилсульфат натрия - 1-4.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что гомогенизацию образца почвы осуществляют при помощи вибромельницы в диапазоне частот 25-35 Гц.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве мелющих тел используют смесь стеклянных бусин диаметром 0.5 мм и 1.0 мм и керамических бусин диаметром 2.0 мм в весовом соотношении 3:1:1 соответственно.