СПОСОБ ВЫСОКОПРОИЗВОДИТЕЛЬНОГО ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК ИЗ ПРОРОСТКОВ СОИ Российский патент 2025 года по МПК C12N15/10 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области молекулярной биологии, в частности, к методам выделения ДНК из проростков сои. Может быть использовано в научно-исследовательской работе и в сельском хозяйстве, для легко выполнимого одновременного выделения ДНК из большого количества образцов.

Предшествующий уровень техники

Соя (Glycine max (L.) Merril) - важнейшая белково-маслиничная культура мирового земледелия. Она занимает первое место по производству растительного белка среди всех зернобобовых культур. На сегодняшний день производство сои является одним из самых рентабельных. Современные молекулярно-генетические методы вносят большой вклад в изучение и улучшение данной сельскохозяйственной культуры. Выделение ДНК необходимой концентрации и чистоты является первоочередным этапом для любого молекулярно-генетического метода. Исследователи стремятся максимально упростить и ускорить процедуру выделения ДНК, сохраняя при этом качественные показатели. Проростки сои доступный растительный материал для экстрагирования ДНК. На их прорастание затрачивается гораздо меньше времени, чем на получение растений с настоящими листьями. Однако, белки и сахара, которые содержатся в проростках сои, мешают процессу выделения ДНК, создавая повышенную вязкость и пенообразование. Поэтому необходимо подбирать концентрации и соотношения действующих реагентов для оптимизации процесса выделения ДНК.

Известен способ выделения ДНК, основанный на лизисе клеток с помощью анионного детергента додецилсульфата натрия (SDS) [1]. Растительную ткань быстро растирают в ступке с помощью пестика, порционно добавляя SDS- лизирующий буфер из расчета 300 мкл на 30 мг растительной ткани. Затем 300 мкл растительного экстракта переносят в пробирки типа Эппендорф (1,5 мл), добавляют 3 мкл фермента РНКазы и инкубируют смесь в термостате при 60°С в течение одного часа. Пробирки охлаждают, добавляют по 100 мкл 5 М ацетата аммония, перемешивают на вортексе и центрифугируют 5 минут при 13000 оборотах. В полученный супернатант добавляют 300 мкл изопропанола и центрифугируют 5 минут при 13000 оборотах. Верхнюю фракцию сливают, к осадку добавляют охлажденный 70%-ный этиловый спирт и смесь центрифугируют в течение 2-х минут при 13000 оборотах. Подсушивают пробирки с промытым осадком до полного испарения спирта. Осадок растворяют в 50 мкл ТЕ буфера.

Недостатками данного способа являются потери ДНК при многочисленных стадиях промывок, которые проводят для избавления от остатков SDS-лизирующего буфера, ингибирующего ПЦР. Недостатком является повышенная трудозатратность при выполнении множества промывок.

Известен способ выделения ДНК со стеклянным порошком [2]. Принцип метода заключается в лизисе клеток с помощью сильного хаотропного агента, который разрушает клеточные мембраны и инактивирует внутриклеточные РНКазы, с последующей сорбцией нуклеиновой кислоты на носителе (стеклянные шарики, бусы и др.) Боросиликатное стекло измельчают в ступке с помощью пестика до получения мелкого порошка. Затем в ступке с помощью пестика измельчают смесь из 0,1 г стеклянного порошка и 0,1 г растительного образца до гомогенного состояния. Далее добавляют 1 мл экстракционного буфера следующего состава: 100 мМ трис, 100 мМ ЭДТА, 1,5 М NaCl (рН 8) и 10 мг порошкообразного активированного угля. Все перемешивают, переносят в пробирку объемом 1,5-2 мл и инкубируют при 65°С в течение 10 минут. После чего центрифугируют при 12000 g в течение 5 минут. Переносят 500 мкл супернатанта в чистую пробирку объемом 1,5 мл, добавляют 100 мкл 3М CH3COONa и 400 мкл дистиллированной воды. В течение 20 минут выдерживают при -20°С. Размораживают пробирки и центрифугируют в течение 5 минут при 12000 g. Берут новую пробирку и переносят супернатант и осаждают ДНК равным объемом холодного изопропилового спирта. Центрифугируют 10 минут при 12000 g и однократно промывают 70% этиловым спиртом. Ресуспендируют в минимальном (50-100 мкл) количестве ТЕ буфера (10 мМ трис и 1 мМ ЭДТА (рН 8)).

К недостаткам данного способа можно отнести низкую сорбционную емкость сорбента, возможные потери ДНК вследствие необратимой сорбции на носителе.

Известен способ выделения ДНК из растительнгого материала с хелатирующей ионообменной смолой Chelex-100 [3]. Принцип метода заключается на взаимодействии между положительно заряженными группами смолы и отрицательно заряженными фосфатными группами молекулы ДНК. За счет большой суммарной площади поверхности смолы обеспечивается более крепкое соединение с нуклеиновой кислотой, при этом нуклеиновую кислоту легче отмыть и удалить примеси. Механически измельчают одно рисовое зерно массой 10-12 мг до крупного порошка. Далее 200 мкл 0,9% раствора NaCl и 100 мкл 20% Chelex-100 (С7901, Sigma) добавляют и встряхивают интенсивно в течение 10 с. Смесь нагревают на водяной бане в течение 10-20 минут при 95°С, еще 10 с перемешивают, после чего центрифугируют в течение 10 минут при 13000 оборотах. Супернатант переносят в свежую пробирку Эппендорфа, добавляют равный объем изопропанола и центрифугируют в течение 10 минут при 13000 оборотах. Полученный осадок промывают 70% этанолом и центрифугируют еще 10 минут при 13000 оборотов. К осадку добавляют 70 мкл воды, не содержащей нуклеазы, и выдерживают в холодильнике при температуре 4°С в течение 20-30 минут. Затем центрифугируют в течение 5 минут при 13000 оборотов. Собирают водную фазу, оставляя мягкий губчатый осадок.

Недостатками данного способа являются денатурация и получение одноцепочечной ДНК из-за щелочного рН и высокой температуры во время выделения, наличие остатков смолы в полученной НК, большие различия среди образцов по качеству и количеству выделенной ДНК.

Известен способ [4] выделения нуклеиновых кислот с использованием лизирующего буфера, последующей очисткой смесью хлороформа и изоамилового спирта и осаждением изопропанолом. Фрагмент растения в количестве 100 мг лизируют в 400 мкл буферного раствора (2% СТАВ, 1,4 NaCl, 20 мМ EDTA, 100 мМ TrisHCl), добавляют 10 мкл РНКазы и инкубируют при 65°С в течение 60 минут. Затем проводят двукратную промывку лизата 400 мкл смеси хлороформа и изоамилового спирта (92:8) с промежуточным центрифугированием. Переносят супернатант в чистую пробирку. После этого проводят осаждение ДНК в присутствии 350 мкл изопропанола, центрифугирование и удаление супернатанта. Полученный осадок ДНК промывают 400 мкл 70% этанола, сушат в течение 60 мин при комнатной температуре.

К недостаткам данного способа можно отнести повышенную вязкость образцов на этапе лизиса и затруднения во время перемешивания, большие расхождения по качеству и количеству ДНК при выделении из большого числа образцов. Недостатком является низкая производительность данного метода выделения ДНК.

Наиболее близким к заявленному способу изобретения, выбранному в качестве прототипа, является способ [5] выделения нуклеиновых кислот в пробирках со стрипами в 96-луночном планшете, с предварительной лиофилизацией растительного материала в течение 1-3 дней, последующей гомогенизацией, лизисом при помощи СТАВ буфера, очисткой смесью хлороформа и октанола и осаждением изопропанолом. Пробирки со стрипами объемом 1,2 мл устанавливают в 96-луночный планшет и помещают в них стеклянные шарики диаметром 1,7 - 2,5 мм, далее кладут фрагменты растительных образцов, после чего лиофилизируют от 1-го до 3-х дней, затем гомогенезируют, лизируют в 600 мкл буферного раствора СТАВ, инкубируют 30 минут при 58°С (после 15 минут инкубации перемешивают, переворачивая пробирки 10 раз). После этого дают образцам остыть в вытяжном шкафу в течение 10 минут. Промывают 300 мкл смеси хлороформа и октанола (24:1), переворачивая пробирки в течение 5 минут. Центрифугируют, отбирают 250 - 300 мкл верхнего слоя и переносят в лунки нового 96-луночного планшета с V-образным дном объемом 0,6 мл, наполненные 300 мкл изопропанола. Переворачивают 10 раз. Центрифугирут. Удаляют супернатант. Осадки промывают 50 мкл 70% этанола, сушат 10-15 минут и растворяют 50 - 100 мкл буфера ТЕ или Н₂О.

Прототип имеет следующие недостатки, устраняемые заявляемым изобретением.

Необходимость выращивания растений до появления молодых листьев.

Затрачивание времени на проведение процесса лиофилизации растительных образцов в течение 1 - 3 дней.

Высокая вероятность перекрестной контаминации образцов в связи с повышенным пенообразованием и непроизвольным открытием пробирок во время гомогенизации и нагрева на водяной бане.

Таким образом, задачей настоящего изобретения является разработка высокопроизводительного способа выделения ДНК из проростков сои, лишенного недостатков известных способов выделения ДНК и позволяющего выделять не контаминированную ДНК необходимой чистоты и качества для дальнейших исследований. Решением данной задачи являются подобранные концентрации реагентов, используемых в предложенном способе выделения ДНК из проростков сои, и их соотношения между собой.

Сущность изобретения

Задача настоящего изобретения решается тем, что в способе выделения ДНК из проростков сои, в отличие от прототипа, ДНК выделяют не из листьев, а из проростков сои. Не проводят процесс лиофилизации образцов и поэтапно гомогенезируют не сухие образцы, а свежие проростки: сначала гомогенизируют сами образцы, затем с добавлением воды. В результате удается снизить вязкость и получить однородную массу мелко измельченных образцов. Затем 2% СТАВ буфер добавляют непосредственно перед термостатированием в уже гомогенизированные образцы в соотношении 270 мкл воды/370 мкл 2% СТАВ буфера. При такой концентрации буфера удается избежать повышенного пенообразования, раскрытия пробирок и перекрестной контаминации. Затем проводят промывку лизата, в каждую пробирку добавляют 400 мкл смеси хлороформа и изоамилового спирта (24:1). После центрифугирования отбирают 550 мкл верхнего слоя. Осаждают ДНК, добавляют в каждую пробирку по 630 мкл сильно охлажденного изопропанола. Удаляют супернатант, осадки ДНК промывают 70% этанолом, сушат и растворяют в воде. Именно при таких концентрациях и соотношениях реагентов, ДНК выделяется во всех пробирках планшета с необходимой концентрацией и чистотой.

Далее описание способа настоящего изобретения будет продолжено путем приведения конкретных примеров его осуществления.

Примеры

Сравнительный пример. Выделение ДНК известным СТАВ методом из 48 образцов проростков сои в двойной повторное™ в пробирках объемом 1,5 мл.

1. Навески проростков сои 100 мг растирали в фарфоровых ступках пестиками с добавлением 400 мкл буферного раствора (2% СТАВ, 1,4 NaCl, 20 мМ EDTA, 100 мМ TrisHCl), подогретого до 60°С. Гомогенные смеси переносили в пробирки объемом 1,5 мл. Добавляли 10 мкл РНКазы. Перемешивали (аккуратно переворачивая пробирки 2-3 раза).

2. Термостатировали при температуре 65°С и 100 оборотах в течение 60 минут на водяной бане с орбитальным шейкером и с функцией нагрева (Grant OLS26 Aqua Pro), дополнительно аккуратно перемешивали вручную каждые 15 -20 минут. Пробирки остужали под вытяжкой до комнатной температуры (около 20 минут).

3. Двукратно промывали смесью хлороформа и изоамилового спирта (24:1), промежуточно центрифугировали с помощью центрифуги (Eppendorf 581 OR с ротором A-2-DWP max.3700rpm) 45 минут при 3700 оборотах и температуре +4°С. Переносили супернатанты в чистые пробирки.

4. Добавляли 350 мкл охлажденного изопропилового спирта (для этого 1-2 часа держали в морозильной камере при температуре от -20°С до -24°С). Медленно вручную переворачивали пробирки несколько раз до появления «стекловидных нитей». Центрифугировали 45 минут при 3700 оборотах при температуре +4°С. Аккуратно, чтобы не уплыли осадки, сливали надосадочную жидкость, промокнув пробирки фильтровальной бумагой.

5. Добавляли 400 мкл 70% этанола, охлажденного до +4°С. Переворачивали пробирки два раза. Центрифугировали 5 минут при 3700 оборотах при температуре +10°С. Аккуратно сливали жидкость, промокнув пробирки.

6. Пробирки с осадками инкубировали 60 минут при комнатной температуре.

7. Добавляли 200 мкл дистиллированной автоклавированной воды. На сутки оставляли в холодильнике при температуре +4°С для растворения ДНК. Далее хранили в морозильной камере на - 20°С.

Показатели качества ДНК, выделенной данным способом, приводятся ниже в Таблице 1.

Пример. Выделение ДНК способом настоящего изобретения из 48 образцов проростков сои в двойной повторности в 96-луночном планшете.

1. Среднюю часть проростка мелко нарезали и заполняли пробирки со стрипами объемом 1,2 мл 96-луночного планшета, постукивая их для более равномерного распределения растительного материала. Было отмечено, что определить единую оптимальную длину проростка для закладки весьма затруднительно, так как проростки различных сортов и линий сильно отличаются по толщине. Пробирки заполняли не более чем на 1,5 - 1,7 см, так как заполнение пробирок более чем на 1,7 см в дальнейшем приводит к повышенной вязкости растительного материала в буферном растворе, затруднениям в перемешивании при термостатировании и самопроизвольному открыванию крышек.

2. Далее в каждую пробирку с образцами помещали стерильные металлические шарики диаметром 3-4 мм. Плотно закрывали крышками. Растирали на электрическом гомогенизаторе (Qiagen TissueLyser II) 2 раза по 30 секунд при 28 оборотах в секунду с 1 минутным перерывом. Центрифугировали с помощью центрифуги (Eppendorf 581 OR с ротором A-2-DWP max.3700rpm) 1 минуту при 3700 оборотах при температуре 20 - 22°С. Открывали крышки, добавляли 270 мкл дистиллированной автоклавированной воды. Закрывали крышки. Растирали на гомогенизаторе 3 раза по 30 секунд при 28 оборотах в секунду с 1 минутным перерывом. Центрифугировали 1 минуту при 3700 оборотах при температуре 22° - 25°С. Добавляли 370 мкл 2% СТАВ буфера (2% СТАВ, 1,4 М NaCl, 20 мМ EDTA (0,5 М рН-8), 100 мМ Tris-HCl (1 М рН-8)) буфера подогретого до 65°С. Перемешивали, для этого вручную несколько раз аккуратно переворачивали планшет с пробирками.

3. Термостатировали при температуре 65°С и 100 оборотах в течение 60 минут на водяной бане с орбитальным шейкером и с функцией нагрева (Grant OLS26 Aqua Pro), дополнительно аккуратно перемешивали вручную каждые 15 -20 минут. Давали пробиркам остыть под вытяжкой до комнатной температуры (около 20 минут).

4. Добавляли 400 мкл смеси хлороформа и изоамилового спирта (24:1). Пробирки со стрипами закрывали новыми крышками и вручную медленно переворачивали в течение 5 минут. Затем центрифугировали 45 минут при 3700 оборотах при температуре +4°С.

5. Далее отбирали 550 мкл верхнего слоя в новые пробирки со стрипами. Добавляли 630 мкл сильно охлажденного изопропилового спирта (для этого 1-2 часа держали в морозильной камере при температуре от -20°С до -24°С). Закрывали новыми крышками. Медленно вручную переворачивали пробирки несколько раз до появления «стекловидных нитей». Центрифугировали 45 минут при 3700 оборотах при температуре +4°С. Аккуратно, чтобы не уплыли осадки, сливали надосадочную жидкость, промокнув пробирки фильтровальной бумагой.

6. Добавляли 300 мкл 70% этанола, охлажденного до +4°С. Переворачивали пробирки два раза. Центрифугировали 5 минут при 3700 оборотах при температуре +10°С. Аккуратно сливали жидкость, промокнув пробирки фильтровальной бумагой.

7. На электрическом концентраторе (Eppendorf Concentrator plus 5305) устанавливали программу D-AL и инкубировали пробирки с осадками 5 минут при температуре +45°С.

8. Добавляли 200 мкл дистиллированной автоклавированной воды. Закрывали новыми крышками. На сутки оставляли в холодильнике при температуре +4°С для растворения ДНК. Далее хранили в морозильной камере на - 20°С.

Показатели качества ДНК, выделенной способом настоящего изобретения, приводятся ниже в Таблице.

Из данных Таблицы видно, что при выделении ДНК способом настоящего изобретения, более выражена однородность полученных концентраций ДНК по образцам, в отличие от концентраций ДНК выделенных известным способом.

Кроме того, ДНК выделенная способом настоящего изобретения более чистая по показателю чистоты ДНК (λ_260-280). Следовательно, ДНК, выделенная способом настоящего изобретения, не только не уступает по качеству ДНК выделенной известным способом, но и превосходит ее. Учитывая, что предлагаемый способ выполняется в 96-луночном планшете, очевидна его высокая производительность и экономичность трудозатрат и времени выполнения.

Финансирование работ по созданию настоящего изобретения проводилось из средств Государственного задания № FGUM-2023-0005 «Разработка молекулярно-генетических технологий в целях ускорения селекционного процесса в рамках федерального проекта «Аграрная наука - шаг в будущее развитие АПК».

Список литературы

1. Клименко И. А. и др. Эффективный способ выделения ДНК для ПЦР-анализа из «балк-образцов» проростков //Адаптивное кормопроизводство. -2021.-№. 3.-С.29.

2. Попова А. С., Старухина А. О., Зайцев В. Г. Сравнительный анализ методов ускоренного выделения ДНК из растительного материала //Научно-агрономический журнал. - 2021. - №. 2 (113). - С.28-33.

3. Sajib A. A., Bhuiya М. A. I., Huque R. A simple, efficient and rapid method for good quality DNA extraction from rice grains //Rice Science. - 2017. - T. 24. -№. 2. - C. 119-122.

4. Doyle J. J., Doyle J. L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue //Phytochemical bulletin. - 1987.

5. Hsia A. P. et al. DNA extraction from freeze-dried plant tissue with СТАВ in a 96-well format //Cold Spring Harbor Protocols. - 2010. - T. 2010. - №. 11.-C. pdb. prot5516-pdb. prot5516.

Изобретение относится к области биологии, а именно к способу высокопроизводительного выделения ДНК из проростков сои в 96-луночном планшете. Все этапы выделения проводят в пробирках со стрипами в 96-луночном планшете. Гомогенизацию образцов проводят без добавления лизирующего буфера в несколько подходов, сначала без воды, затем с водой (270 мкл на один образец). Лизирующий 2% СТАВ буфер добавляют непосредственно перед термостатированием (370 мкл на один образец). Далее термостатируют 45-60 минут. Очищают смесью хлороформа и изоамилового спирта (24:1) в количестве 400 мкл на один образец. Центрифугируют. Отбирают 550 мкл верхнего слоя. Осаждают ДНК изопропиловым спиртом в количестве 630 мкл на один образец. Центрифугируют, сливают надосадочную жидкость. Осадок ДНК однократно промывают 70% этанолом, сушат и растворяют водой. Изобретение позволяет повысить производительность выделения ДНК необходимой чистоты и концентрации для дальнейших молекулярно-генетических манипуляций таких, как, например, ПЦР, и значительно снизить вероятность перекрестной контаминации образцов. 1 табл., 1 пр.

Способ высокопроизводительного выделения ДНК из проростков сои без процедуры лиофилизации, включающий следующие этапы:

среднюю часть проростка мелко нарезали и заполняли пробирки со стрипами объемом 1,2 мл 96-луночного планшета, постукивая их для более равномерного распределения растительного материала, при этом пробирки заполняли не более чем на 1,5-1,7 см,

гомогенизация проростков сои без воды,

добавление к гомогенизированным проросткам воды в количестве 270 мкл на один образец,

лизис с использованием 370 мкл 2% СТАВ буфера на один образец, очистка смесью хлороформа и изоамилового спирта (400 мкл на один образец),

отбор 550 мкл верхнего слоя,

осаждение ДНК из отобранного верхнего слоя путем добавления 630 мкл изопропилового спирта на один образец,

промывание осадков ДНК 70% этанолом,

высушивание осадков ДНК и

растворение высушенных осадков ДНК в воде.