ЛЕЧЕНИЕ И ПРОФИЛАКТИКА АЛЛЕРГИИ НА КЛЕЩЕЙ ДОМАШНЕЙ ПЫЛИ Российский патент 2024 года по МПК C07K14/435 C07K14/02 C07K19/00 C12P21/02 A61K39/35 A61K47/64 A61P37/08 

Область техники, к которой относится изобретение

[0001] Настоящее изобретение относится к области иммунотерапии пациентов, страдающих аллергией, в частности аллергией на клещей домашней пыли.

Уровень техники

[0002] Более 25% населения промышленно развитых стран страдают IgE-опосредованной аллергией. Пациенты с аллергией характеризуются повышенной продукцией IgE-антител против безвредных как таковых антигенов (т.е. аллергенов). Непосредственные симптомы аллергии I типа (аллергический риноконъюнктивит, астма, дерматит, анафилактический шок) обусловлены индуцированным аллергеном перекрестным сшиванием связанных с тучными клетками IgE-антител и высвобождением биологически активных медиаторов (например, гистамина, лейкотриенов).

[0003] В WO 2012/168487 описано применение поверхностного полипептида вируса семейства hepadnaviridae (например, вируса гепатита B) в качестве белка-носителя для фрагментов аллергена.

[0004] В Banerjee S. et al. (J. Immunol., 192 (2014): 4867-4875) описаны белки, содержащие два или четыре идентичных фрагмента аллергена Der p 23, слитых с N- и C-концом PreS. Согласно данным Banerjee S. et al. слитый белок, содержащий два идентичных фрагмента Der p 23 на С-конце PreS и два других идентичных фрагмента Der p 23 на N-конце PreS, индуцировал образование Der p 23-специфических антител, демонстрирующих значительное ингибирование IgE по сравнению со слитыми белками содержащие одинаковые фрагменты Der p 23 на обоих концах PreS.

[0005] Curin М. et al. (Allergy, 73 (2018): 1653-1661) раскрывают фрагменты Der p 5 и Der p 21, которые можно использовать для дальнейшей разработки вакцин.

[0006] В ЕР 2727934 описаны результаты испытания фрагментов нескольких аллергенов Der p, не обладающих IgE-реактивностью и проявляющих Т-клеточную реактивность.

[0007] Huey-Jy H. et al. (J. Immunol., 196 (2016): Suppl 1 192, 5) описывают полипептиды, содержащие, среди прочего, фрагменты Der p 1, Der p 2, Der p 7 и Der p 8.

[0008] В Bussières L. et al. (Int. Arch. Allergy Immunol., 153 (2010): 141-151), а также в EP 1908776 описаны слитые белки, содержащие зрелые Der p 1 и Der p 2.

[0009] В WO 2009/118642 раскрыты слитые полипептиды, которые содержат фрагменты Der p 1 и Der p 2, имеющие длину по меньшей мере 50 аминокислотных остатков.

[0010] В Chen A. et al. (Mol. Immunol., 45 (2008): 2486-2498), Casset A. et al. (Int. Arch. Allergy Immunol., 159 (253-262), WO 2015/070925 и Chen K-W. et al. (Allergy, 67 (2012): 609-621) раскрыты фрагменты аллергена Der p. Некоторые из данных фрагментов могут быть связаны с белками-носителями.

[0011] Клещи домашней пыли (HDM) представляют собой один из наиболее заметных источников аллергенов во всем мире. Почти 10% населения и более 50% субъектов, страдающих аллергией, сенсибилизированы к аллергенам клещей. HDM Dermatophagoides pteronyssinus (Der p) и Dermatophagoides farina (Der f) широко распространены во всем мире. Аллергены Der p и Der f включают более 30 белков или гликопротеинов, большинство из которых на данный момент охарактеризовано. Аллергены группы 1, 2 и 23 (Der p 1, Der p 2 и Der p 23, а также Der f 1 и Der f 2 и Der f 23) представляют собой очень важные аллергены HDM, и именно на эти аллергены HDM сенсибилизировано более 80% пациентов. Однако недавно было показано, что другие аллергены HDM (например, Der p 5, Der p 7 и Der p 21, а также Der f 5, Der f 7 и Der f 21) представляют собой важные аллергены HDM и вызывают сенсибилизацию и аллергические симптомы у 15% до более чем 40% пациентов с аллергией на HDM (Posa et al., J. Allergy Clin. Immunol., 2017 Feb; 139 (2): 541-549.e8). В этом контексте было обнаружено, что современные вакцины против HDM на основе экстракта аллергенов не индуцируют достаточный титр защитных IgG-антител против Der p 5, Der p 7, Der p 21 и Der p 23, и не обеспечивают лечения многих пациентов с аллергией на HDM (Selection of house dust mite-allergic patients by molecular diagnosis may enhance success of specific immunotherapy. Chen K.W., Zieglmayer P., Zieglmayer R., Lemell P., Horak F., Bunu C.P., Valenta R., Vrtala S., J. Allergy Clin. Immunol., 2019 Mar;143(3):1248-1252.e12. doi: 10.1016/j.jaci.2018.10.048. Epub 2018 Nov 14). Следовательно, важной задачей является открытие и разработка вакцины для иммунотерапии аллергии на клещей домашней пыли, которая обеспечивает полную защиту пациентов с аллергией на HDM посредством индукции блокирующих антител к Der p 1, Der p 2, Der p 5, Der p 7, Der p 21 и Der p 23, а также к соответствующим аллергенам Der f.

Сущность изобретения

[0012] В настоящее время апробированные для применения иммунотерапевтические продукты для лечения аллергии на клещей домашней пыли основаны на экстрактах тел и фекальных частиц HDM. Эти продукты содержат различные концентрации Der p 1, Der p 2, Der f 1 и Der f 2. Они не содержат всех важных аллергенов HDM, и, в частности, концентрации Der p 23 и Der f 23 являются очень низкими. Следовательно, они обеспечивают только неполное решение вопроса лечения или профилактики аллергии на клещей домашней пыли у пациентов (Casset et al., Int. Arch. Allergy Immunol., 2013; 161 (3): 287-288). Например, сублингвальные таблетки производства компании ALK Abelló, обеспечивают лишь умеренное снижение симптомов аллергии на 18% по сравнению с плацебо (Demoly et al., J. Allergy Clin. Immunol., 2016; 137: 444-451). За счет относительно большого количества различных аллергенов клещей домашней пыли для потенциальной иммунотерапии требуется введение многих различных белков и полипептидов, чтобы охватить, по меньшей мере, наиболее важные аллергены клещей домашней пыли.

[0013] Таким образом, целью настоящего изобретения является получение вакцины и соответствующих компонентов, входящих в ее состав, которые можно использовать для лечения и/или профилактики аллергии на клещей домашней пыли, вызываемой всеми шестью основными аллергенами.

[0014] Эта цель решается с помощью одного или более слитых белков формулы (I).

X₁-Y-X₂ (I),

где X₁ и X₂ каждый содержит четыре-восемь фрагментов аллергенов или их вариантов, слитых друг с другом, где указанные фрагменты аллергенов получены по меньшей мере из двух аллергенов клещей рода Dermatophagoides, и где Y представляет белок-носитель.

[0015] Другой аспект настоящего изобретения относится к фармацевтическому препарату, содержащему по меньшей мере один слитый белок, описанный выше.

[0016] Еще один аспект настоящего изобретения относится к слитому белку или фармацевтическому препарату по настоящему изобретению для применения в лечении или профилактике аллергии, вызванной аллергеном клеща домашней пыли.

[0017] Еще один аспект настоящего изобретения относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок по настоящему изобретению.

[0018] Еще один аспект настоящего изобретения относится к вектору, содержащему молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению.

[0019] Еще один аспект настоящего изобретения относится к клетке-хозяину, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты или вектор по настоящему изобретению.

Краткое описание фигур

[0020] На фиг. 1 приведено схематическое представление конструкций Der p 1-2 C3 и Der p 5 7 21 23_P6 (большой). PreS обозначает поверхностный антиген PreS вируса гепатита B. «P» обозначает пептиды, полученные из аллергена клещей домашней пыли Der p 1, Der p 2, Der p 5, Der p 7, Der p 21 и Der p 23, как указано в таблице I.

[0021] На фиг. 2 показаны очищенные слитые белки PreS по данным анализа электрофореза SDS-PAGE.

[0022] На фиг. 3 приведены результаты анализа IgE-реактивности Der p 1-2 C3 и Der p 5 7 21 23_P6 (большой), определенной иммуноблоттингом.

[0023] На фиг. 4 приведены результаты теста активации базофилов, показывающие, что Der p 1-2 C3 не обладает аллергенной активностью.

[0024] На фиг. 5 приведены результаты теста активации базофилов, показывающие, что Der p 5 7 21 23_P6 не обладает аллергенной активностью.

[0025] На фиг. 6 показано ингибирование связывания IgE от пациентов с Der p 1 и Der p 2 с помощью антисывороток, специфичных для Der p 1-2 C3.

[0026] На фиг. 7 показано ингибирование связывания IgE от пациентов с Der p 5, Der p 7, Der p 21 и Der p 23 с помощью антисывороток, специфичных для Der p 5 7 21 23_P6.

[0027] На фиг. 8A-8F показаны сывороточные титры IgG, специфически связывающегося с аллергенами клещей домашней пыли Der p 1 (фиг. 8A), Der p 2 (фиг. 8B), Der p 5 (фиг. 8C), Der p 7 (фиг. 8D), Der p 21 (фиг. 8E) и Der p 23 (фиг. 8F), определенные с помощью ELISA из сыворотки кроликов, иммунизированных 20 мкг BM35 («BM35 20»), 40 мкг BM35 («BM35 40»), 80 мкг BM35 («BM35 80»), Tyro-SIT («Bencard»), Alutard SQ 503 («ALK D.pter»), Alutard SQ 510 («ALK Dp/Df»), ACAROID («Allergoph.»), PURETHAL Milbenmischung («HAL»), суспензией для инъекций CLUSTOID Milben («Roxal») и nDer p1, rDer p 2, rDer p 5, rDer p 7, rDer p 21 и rDer p 23. Образцы были получены на сутки 38 и 66 после первой инъекции.

[0028] На фиг. 9A-9F показаны сывороточные титры IgG, специфически связывающегося с аллергенами клещей домашней пыли Der p 1 (фиг. 9A), Der p 2 (фиг. 9B), Der p 5 (фиг. 9C), Der p 7 (фиг. 9D), Der p 21 (фиг.9E) и Der p 23 (фиг.9F), определенные с помощью ELISA из сыворотки кроликов, иммунизированных 20 мкг BM35 («BM35 20»), 40 мкг BM35 («BM35 40») и 80 мкг BM35 («BM35 80») сывороток, полученных до первой инъекции указанных иммуногенов и на сутки 38 и 66 после первой инъекции. В качестве контроля определяли сывороточные титры IgG на соответствующие аллергены в образцах сыворотки кроликов, вакцинированных аллергенами nDer p 1, rDer p 2, rDer p 5, rDer p 7, rDer p 21 и rDer p 23.

Описание вариантов осуществления

[0029] Настоящее изобретение относится к одному или более слитым белкам формулы (I):

X₁-Y-X₂ (I),

где X₁ и X₂ каждый содержит четыре-восемь фрагментов аллергенов или их вариантов, слитых друг с другом, где указанные фрагменты аллергенов получены по меньшей мере из двух аллергенов клещей рода Dermatophagoides, и где Y представляет собой белок-носитель.

[0030] Неожиданно оказалось, что слитый белок, имеющий «архитектуру», определенную формулой (I), индуцирует образование in vivo антител, направленных по меньшей мере на два аллергена клещей рода Dermatophagoides. В частности, наличие от четырех до восьми фрагментов аллергенов на C- и N-концах белка-носителя оказывает положительный эффект в отношении индукции антител, ингибирующих взаимодействие аллергенспецифических IgE с их соответствующим аллергеном. Образование таких антител позволяет уменьшить или даже предупредить аллергические реакции, приводящие к необходимости лечения аллергии, вызванной аллергенами клещей рода Dermatophagoides.

[0031] В рамках изобретения, термин «слитый белок» относится к белку или полипептиду, полученному соединением двух или более полипептидов и/или пептидов друг с другом. Слитые белки можно получить с помощью технологии рекомбинантных ДНК или посредством химической ковалентной конъюгации.

[0032] В рамках изобретения, термин «фрагмент аллергена» относится к участку пептида или полипептида, полученному из аллергена фрагментацией.

[0033] От четырех до восьми, предпочтительно от четырех до шести фрагментов аллергенов, которые слиты друг с другом, происходят по меньшей мере из двух, предпочтительно, по меньшей мере трех, более предпочтительно, по меньшей мере четырех, в частности, из одного, двух, трех или четырех аллергенов одного или более клещей домашней пыли рода Dermatophagoides. Эти фрагменты аллергенов состоят от 8 до 100, предпочтительно от 8 до 80, более предпочтительно от 8 до 60, более предпочтительно от 10 до 60, более предпочтительно от 10 до 50, более предпочтительно от 15 до 50, более предпочтительно от 20 до 50, более предпочтительно от 25 до 50, последовательных аминокислотных остатков указанного аллергена.

[0034] Слитый белок по настоящему изобретению может содержать более одного фрагмента, полученного из одного и того же аллергена. В этом случае фрагменты могут происходить из разных (т. е. несмежных) областей или из смежных областей одного и того же аллергена. В последнем случае порядок фрагментов может отличаться от порядка в аллергене, из которого эти фрагменты получены.

[0035] Слитый белок по настоящему изобретению также может содержать один или более фрагментов аллергенов, имеющих одинаковую или по существу одинаковую аминокислотную последовательность. В рамках изобретения, термин «по существу одинаковые» означает, что две или более последовательностей, происходящих из одного и того же аллергена, имеют по меньшей мере 80%, предпочтительно, по меньшей мере 85%, более предпочтительно, по меньшей мере 90%, более предпочтительно, по меньшей мере 95% идентичность последовательностей.

[0036] Степень идентичности первой аминокислотной последовательности со второй аминокислотной последовательностью можно определить прямым сравнением обеих аминокислотных последовательностей с использованием определенных алгоритмов. Такие алгоритмы, например, включены в различные компьютерные программы или веб-сайты (например, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) (например, «BLAST 2 SEQUENCES (blastp)» (Tatusova et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett., 174: 247-25; Corpet F., Nucl. Acids Res. (1988) 16: 10881-10890) со следующими параметрами: матрица BLOSUM62; штрафы за открытие гэпа 11 и штраф за удлинение гэпа 1; гэп х пропуск (x_dropoff50); ожидание 10,0; размер слова 3; фильтр: нет.

[0037] Слитый белок по настоящему изобретению может также включать варианты фрагментов аллергенов. Особо предпочтительные варианты фрагментов аллергенов содержат по меньшей мере один, предпочтительно, по меньшей мере два, более предпочтительно, по меньшей мере три аминокислотные замены по сравнению с фрагментом аллергенов. Особенно предпочтительной является замена по меньшей мере одного, предпочтительно, по меньшей мере двух, более предпочтительно, по меньшей мере трех, в частности, всех остатков цистеина, встречающихся в природе во фрагменте аллергена, на другие аминокислотные остатки, предпочтительно на остатки серина, треонина, глицина, аланина или лейцина. Таким образом, вариант фрагмента аллергена по настоящему изобретению предпочтительно не содержит остатков цистеина.

[0038] Фрагменты аллергенов в составе слитого белка по настоящему изобретению могут быть непосредственно слиты друг с другом или могут быть разделены одним аминокислотным остатком или линкерным пептидом, состоящим от 2 до 30, предпочтительно от 2 до 20, более предпочтительно от 2 до 10, более предпочтительно от 2 до 5 аминокислотных остатков. Также X₁/X₂ и белок-носитель Y могут быть разделены одним аминокислотным остатком или линкерным пептидом, как определено выше.

[0039] Слитый белок по настоящему изобретению можно получить рекомбинантно в любой экспрессионной системе, известной в данной области. Особенно предпочтительные экспрессионные системы включают бактерии (например, E. coli), дрожжевые клетки (например, Pichia pastoris) или клетки насекомых, такие как клетки S2 из Drosophila melanogaster, клетки Sf9 или Sf21 из Spodoptera frugiperda или клетки TNi из Trichoplusia ni.

[0040] Фрагменты аллергенов слитого белка по настоящему изобретению могут быть получены из любого клеща домашней пыли. Однако особенно предпочтительно использовать аллергены клещей домашней пыли, которые вызывают аллергические реакции у большинства людей. Следовательно, предпочтительно, чтобы фрагменты аллергена происходили из аллергенов клещей Dermatophagoides pteronyssinus и/или Dermatophagoides farinae.

[0041] Согласно другому предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, по меньшей мере два аллергена происходят из клещей Dermatophagoides pteronyssinus и выбраны из группы, состоящей из Der p 1, Der p 2, Der p 5, Der p 7, Der p 21 и Der p. 23.

[0042] Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, по меньшей мере два аллергена происходят из клещей Dermatophagoides farinae и выбраны из группы, состоящей из Der f 1, Der f 2, Der f 5, Der f 7, Der f 21 и Der f 23.

[0043] Люди с аллергией по-разному реагируют на аллергены, происходящие из одного и того же источника. Люди, страдающие аллергией на клещей домашней пыли, вызванной Dermatophagoides pteronyssinus и/или Dermatophagoides farinae, реагируют на аллергены Der p 1 и Der p 2, а также на Der p 5, Der p 7, Der p 21 и Der p 23 и на аллергены Der f 1 и Der f 2, а также Der f 5, Der f 7, Der f 21 и Der f 23 соответственно. Следовательно, особенно предпочтительно обеспечить слитый белок, содержащий фрагменты аллергенов одного или более из данных аллергенов.

[0044] Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, аллергенные фрагменты по меньшей мере двух аллергенов состоят из от 25 до 50 аминокислотных остатков, предпочтительно от 28 до 48 аминокислотных остатков, более предпочтительно от 30 до 45 аминокислотных остатков.

[0045] Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, по меньшей мере один, предпочтительно, по меньшей мере два, более предпочтительно, по меньшей мере три, в частности, все остатки цистеина фрагментов аллергенов заменены серином, треонином, глицином, аланином или лейцином.

[0046] Некоторые или все остатки цистеина фрагментов аллергенов, используемых в слитом белке по настоящему изобретению, могут быть заменены другими аминокислотными остатками. Замена одного или более остатков цистеина может уменьшить количество дисульфидных связей, потенциально образующихся во время рекомбинантной экспрессии слитых белков по настоящему изобретению или во время его обработки (например, очистки слитого белка из телец включения, производства вакцинного состава). Кроме того, замена остатков цистеина во фрагментах аллергенов приводит к уменьшению или полному удалению свободных серусодержащих групп в слитом белке, тем самым предупреждая взаимодействие таких групп с другими соединениями.

[0047] Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, фрагмент аллергена Der p 1 состоит из аминокислотной последовательности, которая является по меньшей мере на 90%, предпочтительно, по меньшей мере на 92%, более предпочтительно, по меньшей мере на 95%, более предпочтительно, по меньшей мере на 97%, в частности, на 100% идентичной аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из: TNACSINGNAPAEIDLRQMRTVTPIRMQGGCGSCWAFSGVA (SEQ ID NO: 1), ATESAYLAYRNQSLDLAEQELVDCASQHGCHGDTIPRGIEYIQ (SEQ ID NO: 2), HNGVVQESYYRYVAREQSCRRPNAQRFGISN (SEQ ID NO: 3), VRNSWDTNWGDNGYGYFAANIDLMMIEEYPYVVIL (SEQ ID NO: 4), TNASSINGNAPAEIDLRQMRTVTPIRMQGGSGSSWAFSGVA (SEQ ID NO: 5), ATESAYLAYRNQSLDLAEQELVDSASQHGSHGDTIPRGIEYIQ (SEQ ID NO: 6) и HNGVVQESYYRYVAREQSSRRPNAQRFGISN (SEQ ID NO: 7).

[0048] Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения фрагмент аллергена Der p 2 состоит из аминокислотной последовательности, которая является по меньшей мере на 90%, предпочтительно, по меньшей мере на 92%, более предпочтительно, по меньшей мере на 95%, более предпочтительно, по меньшей мере на 97%, в частности, на 100% идентичной аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из: CHGSEPCIIHRGKPFQLEAVFEANQNSKTAK (SEQ ID NO: 8, EVDVPGIDPNACHYMKCPLVKGQQYDIKYTWIVPKIAPKSEN (SEQ ID NO: 9), HGSEPSIIHRGKPFQLEAVFEANQNSKTAK (SEQ ID NO: 10) и EVDVPGIDPNASHYMKSPLVKGQQYDIKYTWIVPKIAPKSEN (SEQ ID NO: 11).

[0049] Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения фрагмент аллергена Der p 5 состоит из аминокислотной последовательности, которая является по меньшей мере на 90%, предпочтительно, по меньшей мере на 92%, более предпочтительно, по меньшей мере на 95%, более предпочтительно, по меньшей мере на 97%, в частности, на 100% идентичной аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из: DYQNEFDFLLMERIHEQIKKGELALFYLQ (SEQ ID NO: 12) и EQYNLEMAKKSGDILERDLKKEEARVKKIEV (SEQ ID NO: 13).

[0050] Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения фрагмент аллергена Der p 7 состоит из аминокислотной последовательности, которая является по меньшей мере на 90%, предпочтительно, по меньшей мере на 92%, более предпочтительно, по меньшей мере на 95%, более предпочтительно, по меньшей мере на 97%, в частности, на 100% идентичной аминокислотной последовательности DPIHYDKITEEINKAVDEAVAAIEKSETFD (SEQ ID NO: 14).

[0051] Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения фрагмент аллергена Der p 21 состоит из аминокислотной последовательности, которая является по меньшей мере на 90%, предпочтительно, по меньшей мере на 92%, более предпочтительно, по меньшей мере на 95%, более предпочтительно, по меньшей мере на 97%, в частности, на 100% идентичной аминокислотной последовательности YNYEFALESIKLLIKKLDELAKKVKAVNPDEYY (SEQ ID NO: 15).

[0052] Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения фрагмент аллергена Der p 23 состоит из аминокислотной последовательности, которая является по меньшей мере на 90%, предпочтительно, по меньшей мере на 92%, более предпочтительно, по меньшей мере на 95%, более предпочтительно, по меньшей мере на 97%, в частности, на 100% идентичной аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из: GYFADPKDPHKFYICSNWEAVHKDCPGNTRWNEDEETCT (SEQ ID NO: 16) и GYFADPKDPHKFYISSNWEAVHKDSPGNTRWNEDEETST (SEQ ID NO: 17).

[0053] Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения фрагмент аллергена Der f 1 состоит из аминокислотной последовательности, которая является по меньшей мере на 90%, предпочтительно, по меньшей мере на 92%, более предпочтительно, по меньшей мере на 95%, более предпочтительно, по меньшей мере на 97%, в частности, на 100% идентичной аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из: TSACRINSVNVPSELDLRSLRTVTPIRMQGGCGSCWAFSGVA (SEQ ID NO: 38), ATESAYLAYRNTSLDLSEQELVDCASQHGCHGDTIPRGIEYIQ (SEQ ID NO: 39), QNGVVEERSYPYVAREQQCRRPNSQHYGISN (SEQ ID NO: 40) и VRNSWDTTWGDSGYGYFQAGNNLMMIEQYPYVVIM (SEQ ID NO: 41).

[0054] Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения фрагмент аллергена Der f 2 состоит из аминокислотной последовательности, которая является по меньшей мере на 90%, предпочтительно, по меньшей мере на 92%, более предпочтительно, по меньшей мере на 95%, более предпочтительно, по меньшей мере на 97%, в частности, на 100% идентичной аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из: HGSDPCIIHRGKPFNLEAIFDANQNTKTAK (SEQ ID NO: 42) и EVDVPGIDTNACHYIKCPLVKGQQYDAKYTWNVPKIAPKSEN (SEQ ID NO: 43).

[0055] Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения фрагмент аллергена Der f 5 состоит из аминокислотной последовательности, которая является по меньшей мере на 90%, предпочтительно, по меньшей мере на 92%, более предпочтительно, по меньшей мере на 95%, более предпочтительно, по меньшей мере на 97%, в частности, на 100% идентичной аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из: DYQNEFDFLLMQRIHEQMRKGEEALLHLQ (SEQ ID NO: 44) и ERYNVEIALKSNEILERDLKKEEQRVKKIEV (SEQ ID NO: 45).

[0056] Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения фрагмент аллергена Der f 7 состоит из аминокислотной последовательности, которая является по меньшей мере на 90%, предпочтительно, по меньшей мере на 92%, более предпочтительно, по меньшей мере на 95%, более предпочтительно, по меньшей мере на 97%, в частности, на 100% идентичной аминокислотной последовательности DPIHYDKITEEINKAIDDAIAAIEQSETID (SEQ ID NO: 46).

[0057] Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения фрагмент аллергена Der f 21 состоит из аминокислотной последовательности, которая является по меньшей мере на 90%, предпочтительно, по меньшей мере на 92%, более предпочтительно, по меньшей мере на 95%, более предпочтительно, по меньшей мере на 97%, в частности, на 100% идентичной аминокислотной последовательности YNFETAVSTIEILVKDLAELAKKVKAVKSDD (SEQ ID NO: 47).

[0058] Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения фрагмент аллергена Der f 23 состоит из аминокислотной последовательности, которая является по меньшей мере на 90%, предпочтительно, по меньшей мере на 92%, более предпочтительно, по меньшей мере на 95%, более предпочтительно, по меньшей мере на 97%, в частности, на 100% идентичной аминокислотной последовательности GYFADPKDPCKFYICSNWEAIHKSCPGNTRWNEKELTCT (SEQ ID NO: 48).

[0059] Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения X₁ содержит четыре фрагмента аллергена Der p 1 и два фрагмента Der p 2 или три фрагмента Der p 21 и три фрагмента Der p23.

[0060] Неожиданно оказалось, что X₁, содержащий или состоящий из данных фрагментов аллергенов в любом порядке, слитый с N-концом белка-носителя, приводит к образованию антител, способных ингибировать связывание соответствующего природного аллергена с аллергенспецифическим IgE. Это позволяет использовать такой слитый белок в качестве вакцины для лечения или профилактики аллергических реакций, вызванных соответствующими аллергенами.

[0061] Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, X₂ содержит от двух до четырех фрагментов аллергена Der p 1 и два фрагмента Der p 2 или четыре фрагмента Der p 5, два фрагмента Der p 7.

[0062] Х₂, слитый с С-концом белка-носителя, может включать или состоять из вышеуказанных фрагментов аллергенов в любом порядке. Оказалось, что такие фрагменты аллергенов на С-конце белка-носителя приводят к образованию слитого белка, индуцирующего образование антител, способных ингибировать связывание соответствующего природного аллергена с аллергенспецифическим IgE. Это позволяет использовать такой слитый белок в качестве вакцины для лечения или профилактики аллергических реакций, вызванных соответствующими аллергенами.

[0063] Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения слитый белок содержит по меньшей мере один полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 и/или SEQ ID NO: 25.

[0064] Полипептиды, состоящие из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 18 и 19, содержат фрагменты аллергенов Der p 1 и Der p 2:

[0065] SEQ ID NO: 18:

VRNSWDTNWGDNGYGYFAANIDLMMIEEYPYVVILHNGVVQESYYRYVAREQSSRRPNAQRFGISNHGSEPSIIHRGKPFQLEAVFEANQNSKTAKHGSEPSIIHRGKPFQLEAVFEANQNSKTAKVRNSWDTNWGDNGYGYFAANIDLMMIEEYPYVVILHNGVVQESYYRYVAREQSSRRPNAQRFGISN

[0066] SEQ ID NO: 19:

EVDVPGIDPNASHYMKSPLVKGQQYDIKYTWIVPKIAPKSENEVDVPGIDPNASHYMKSPLVKGQQYDIKYTWIVPKIAPKSENATESAYLAYRNQSLDLAEQELVDSASQHGSHGDTIPRGIEYIQTNASSINGNAPAEIDLRQMRTVTPIRMQGGSGSSWAFSGVAATESAYLAYRNQSLDLAEQELVDSASQHGSHGDTIPRGIEYIQTNASSINGNAPAEIDLRQMRTVTPIRMQGGSGSSWAFSG

[0067] Полипептид, состоящий из SEQ ID NO: 18, может представлять X₁ или X₂ в формуле (I), где в наиболее предпочтительном варианте настоящего изобретения указанный полипептид представляет собой X₁ в формуле (I).

[0068] Полипептид, состоящий из SEQ ID NO: 19, может представлять X₁ или X₂ в формуле (I), где в наиболее предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанный полипептид представляет собой X₂ в формуле (I).

[0069] Полипептиды, состоящие из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 20 и 21, содержат фрагменты аллергенов Der p 5, Der p 7, Der p 21 и Der p 23:

[0070] SEQ ID NO: 20:

YNYEFALESIKLLIKKLDELAKKVKAVNPDEYYYNYEFALESIKLLIKKLDELAKKVKAVNPDEYYYNYEFALESIKLLIKKLDELAKKVKAVNPDEYYGYFADPKDPHKFYISSNWEAVHKDSPGNTRWNEDEETSTGYFADPKDPHKFYISSNWEAVHKDSPGNTRWNEDEETSTGYFADPKDPHKFYISSNWEAVHKDSPGNTRWNEDEETST

[0071] SEQ ID NO: 21:

DYQNEFDFLLMERIHEQIKKGELALFYLQDYQNEFDFLLMERIHEQIKKGELALFYLQDPIHYDKITEEINKAVDEAVAAIEKSETFDDPIHYDKITEEINKAVDEAVAAIEKSETFDEQYNLEMAKKSGDILERDLKKEEARVKKIEVEQYNLEMAKKSGDILERDLKKEEARVKKIEV

[0072] Полипептид, состоящий из SEQ ID NO: 20, может представлять собой X₁ или X₂ в формуле (I), где в наиболее предпочтительном варианте настоящего изобретения указанный полипептид представляет собой X₁ в формуле (I).

[0073] Полипептид, состоящий из SEQ ID NO: 21, может представлять собой X₁ или X₂ в формуле (I), где в наиболее предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанный полипептид представляет собой X₂ в формуле (I).

[0074] Полипептиды, состоящие из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 22 и 23, содержат фрагменты аллергенов Der f 1 и Der f 2:

[0075] SEQ ID NO: 22:

VRNSWDTTWGDSGYGYFQAGNNLMMIEQYPYVVIMQNGVVEERSYPYVAREQQCRRPNSQHYGISNHGSDPCIIHRGKPFNLEAIFDANQNTKTAKHGSDPCIIHRGKPFNLEAIFDANQNTKTAKVRNSWDTTWGDSGYGYFQAGNNLMMIEQYPYVVIMQNGVVEERSYPYVAREQQCRRPNSQHYGISN

[0076] SEQ ID NO: 23:

EVDVPGIDTNACHYIKCPLVKGQQYDAKYTWNVPKIAPKSENEVDVPGIDTNACHYIKCPLVKGQQYDAKYTWNVPKIAPKSENATESAYLAYRNTSLDLSEQELVDCASQHGCHGDTIPRGIEYIQTSACRINSVNVPSELDLRSLRTVTPIRMQGGCGSCWAFSGVAATESAYLAYRNTSLDLSEQELVDCASQHGCHGDTIPRGIEYIQTSACRINSVNVPSELDLRSLRTVTPIRMQGGCGSCWAFSGVA

[0077] Полипептид, состоящий из SEQ ID NO: 22, может представлять собой X₁ или X₂ в формуле (I), где в наиболее предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанный полипептид представляет собой X₁ в формуле (I).

[0078] Полипептид, состоящий из SEQ ID NO: 23, может представлять собой X₁ или X₂ в формуле (I), где в наиболее предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанный полипептид представляет собой X₂ в формуле (I).

[0079] Полипептиды, состоящие из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 24 и 25, содержат фрагменты аллергенов Der p 5, Der p 7, Der p 21 и Der p 23:

[0080] SEQ ID NO: 24:

YNFETAVSTIEILVKDLAELAKKVKAVKSDDYNFETAVSTIEILVKDLAELAKKVKAVKSDDYNFETAVSTIEILVKDLAELAKKVKAVKSDDGYFADPKDPCKFYICSNWEAIHKSCPGNTRWNEKELTCTGYFADPKDPCKFYICSNWEAIHKSCPGNTRWNEKELTCTGYFADPKDPCKFYICSNWEAIHKSCPGNTRWNEKELTCT

[0081] SEQ ID NO: 25:

DYQNEFDFLLMQRIHEQMRKGEEALLHLQDYQNEFDFLLMQRIHEQMRKGEEALLHLQDPIHYDKITEEINKAIDDAIAAIEQSETIDDPIHYDKITEEINKAIDDAIAAIEQSETIDERYNVEIALKSNEILERDLKKEEQRVKKIEVERYNVEIALKSNEILERDLKKEEQRVKKIEV

[0082] Полипептид, состоящий из SEQ ID NO: 24, может представлять собой X₁ или X₂ в формуле (I), где в наиболее предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанный полипептид представляет собой X₁ в формуле (I).

[0083] Полипептид, состоящий из SEQ ID NO: 25, может представлять собой X₁ или X₂ в формуле (I), где в наиболее предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанный полипептид представляет собой X₂ в формуле (I).

[0084] Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения белок-носитель представляет собой поверхностный полипептид вируса семейства hepadnaviridae или фрагмент поверхностного полипептида.

[0085] Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения вирус семейства hepadnaviridae представляет собой вирус гепатита B.

[0086] Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения поверхностный полипептид вируса семейства hepadnaviridae представляет собой PreS.

[0087] Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения фрагмент поверхностного полипептида представляет собой PreS1 вируса гепатита B или PreS2 вируса гепатита B.

[0088] Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения белок-носитель содержит аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 90%, предпочтительно, по меньшей мере на 92%, более предпочтительно, по меньшей мере на 95%, более предпочтительно, по меньшей мере на 97%, в частности, на 100% идентичной последовательности SEQ ID NO: 26.

[0089] Белок-носитель, используемый в настоящем изобретении, может содержать или состоять из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 26 (GenBank идентификационный номер AAT28678.1):

GGWSSKPRKGMGTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNPIKDHWPAANQVGVGAFGPGLTPPHGGILGWSPQAQGILTTVSTIPPPASTNRQSGRQPTPISPPLRDSHPQAMQWNSTAFHQALQDPRVRGLYFPAGGSSSGTVNPAPNIASHISSISARTGDPVTN

[0090] Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения слитый белок содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая является по меньшей мере на 90%, предпочтительно, по меньшей мере на 92%, более предпочтительно, по меньшей мере на 95%, более предпочтительно, по меньшей мере на 97%, в частности, на 100% идентичной последовательностям SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 или SEQ ID NO: 33.

[0091] Слитые белки по настоящему изобретению могут содержать PreS в качестве белка-носителя Y и фрагменты различных аллергенов, образующих два полипептида X₁ и X₂, соответственно, которые расположены смежно с белком-носителем (см. формулу (I)). Особенно предпочтительные слитые белки содержат фрагменты аллергенов Der p 1, Der p 2, Der p 5, Der p 7, Der p 21 и Der p 23. Такие слитые белки могут состоять из следующих аминокислотных последовательностей.

[0092] SEQ ID NO: 27 («Der p 1-2 C3»):

VRNSWDTNWGDNGYGYFAANIDLMMIEEYPYVVILHNGVVQESYYRYVAREQSSRRPNAQRFGISNHGSEPSIIHRGKPFQLEAVFEANQNSKTAKHGSEPSIIHRGKPFQLEAVFEANQNSKTAKVRNSWDTNWGDNGYGYFAANIDLMMIEEYPYVVILHNGVVQESYYRYVAREQSSRRPNAQRFGISNGGWSSKPRKGMGTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNPIKDHWPAANQVGVGAFGPGLTPPHGGILGWSPQAQGILTTVSTIPPPASTNRQSGRQPTPISPPLRDSHPQAMQWNSTAFHQALQDPRVRGLYFPAGGSSSGTVNPAPNIASHISSISARTGDPVTNEVDVPGIDPNASHYMKSPLVKGQQYDIKYTWIVPKIAPKSENEVDVPGIDPNASHYMKSPLVKGQQYDIKYTWIVPKIAPKSENATESAYLAYRNQSLDLAEQELVDSASQHGSHGDTIPRGIEYIQTNASSINGNAPAEIDLRQMRTVTPIRMQGGSGSSWAFSGVAATESAYLAYRNQSLDLAEQELVDSASQHGSHGDTIPRGIEYIQTNASSINGNAPAEIDLRQMRTVTPIRMQGGSGSSWAFSG

[0093] SEQ ID NO: 28 (“Der p 572123_P6 (большой)”)

YNYEFALESIKLLIKKLDELAKKVKAVNPDEYYYNYEFALESIKLLIKKLDELAKKVKAVNPDEYYYNYEFALESIKLLIKKLDELAKKVKAVNPDEYYGYFADPKDPHKFYISSNWEAVHKDSPGNTRWNEDEETSTGYFADPKDPHKFYISSNWEAVHKDSPGNTRWNEDEETSTGYFADPKDPHKFYISSNWEAVHKDSPGNTRWNEDEETSTGGWSSKPRKGMGTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNPIKDHWPAANQVGVGAFGPGLTPPHGGILGWSPQAQGILTTVSTIPPPASTNRQSGRQPTPISPPLRDSHPQAMQWNSTAFHQALQDPRVRGLYFPAGGSSSGTVNPAPNIASHISSISARTGDPVTNDYQNEFDFLLMERIHEQIKKGELALFYLQDYQNEFDFLLMERIHEQIKKGELALFYLQDPIHYDKITEEINKAVDEAVAAIEKSETFDDPIHYDKITEEINKAVDEAVAAIEKSETFDEQYNLEMAKKSGDILERDLKKEEARVKKIEVEQYNLEMAKKSGDILERDLKKEEARVKKIEV

[0094] SEQ ID NO: 29 (“Der p 1-2 C1”)

VRNSWDTNWGDNGYGYFAANIDLMMIEEYPYVVILHNGVVQESYYRYVAREQSSRRPNAQRFGISNVRNSWDTNWGDNGYGYFAANIDLMMIEEYPYVVILHNGVVQESYYRYVAREQSSRRPNAQRFGISNHGSEPSIIHRGKPFQLEAVFEANQNSKTAKHGSEPSIIHRGKPFQLEAVFEANQNSKTAKGGWSSKPRKGMGTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNPIKDHWPAANQVGVGAFGPGLTPPHGGILGWSPQAQGILTTVSTIPPPASTNRQSGRQPTPISPPLRDSHPQAMQWNSTAFHQALQDPRVRGLYFPAGGSSSGTVNPAPNIASHISSISARTGDPVTNEVDVPGIDPNASHYMKSPLVKGQQYDIKYTWIVPKIAPKSENEVDVPGIDPNASHYMKSPLVKGQQYDIKYTWIVPKIAPKSENATESAYLAYRNQSLDLAEQELVDSASQHGSHGDTIPRGIEYIQTNASSINGNAPAEIDLRQMRTVTPIRMQGGSGSSWAFSGVAATESAYLAYRNQSLDLAEQELVDSASQHGSHGDTIPRGIEYIQTNASSINGNAPAEIDLRQMRTVTPIRMQGGSGSSWAFSG

[0095] SEQ ID NO: 30 (“Der p 1-2 C2”)

VRNSWDTNWGDNGYGYFAANIDLMMIEEYPYVVILHNGVVQESYYRYVAREQSSRRPNAQRFGISNVRNSWDTNWGDNGYGYFAANIDLMMIEEYPYVVILHNGVVQESYYRYVAREQSSRRPNAQRFGISNHGSEPSIIHRGKPFQLEAVFEANQNSKTAKHGSEPSIIHRGKPFQLEAVFEANQNSKTAKGGWSSKPRKGMGTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNPIKDHWPAANQVGVGAFGPGLTPPHGGILGWSPQAQGILTTVSTIPPPASTNRQSGRQPTPISPPLRDSHPQAMQWNSTAFHQALQDPRVRGLYFPAGGSSSGTVNPAPNIASHISSISARTGDPVTNATESAYLAYRNQSLDLAEQELVDSASQHGSHGDTIPRGIEYIQTNASSINGNAPAEIDLRQMRTVTPIRMQGGSGSSWAFSGVAEVDVPGIDPNASHYMKSPLVKGQQYDIKYTWIVPKIAPKSENEVDVPGIDPNASHYMKSPLVKGQQYDIKYTWIVPKIAPKSENATESAYLAYRNQSLDLAEQELVDSASQHGSHGDTIPRGIEYIQTNASSINGNAPAEIDLRQMRTVTPIRMQGGSGSSWAFSG

[0096] SEQ ID NO: 31 (“Der p 5.7.21.23_P4P5”)

YNYEFALESIKLLIKKLDELAKKVKAVNPDEYYYNYEFALESIKLLIKKLDELAKKVKAVNPDEYYYNYEFALESIKLLIKKLDELAKKVKAVNPDEYYGYFADPKDPHKFYICSNWEAVHKDCPGNTGYFADPKDPHKFYICSNWEAVHKDCPGNTGGWSSKPRKGMGTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNPIKDHWPAANQVGVGAFGPGLTPPHGGILGWSPQAQGILTTVSTIPPPASTNRQSGRQPTPISPPLRDSHPQAMQWNSTAFHQALQDPRVRGLYFPAGGSSSGTVNPAPNIASHISSISARTGDPVTNKFYICSNWEAVHKDCPGNTRWNEDEETCTKFYICSNWEAVHKDCPGNTRWNEDEETCTDYQNEFDFLLMERIHEQIKKGELALFYLQDYQNEFDFLLMERIHEQIKKGELALFYLQDPIHYDKITEEINKAVDEAVAAIEKSETFDDPIHYDKITEEINKAVDEAVAAIEKSETFDEQYNLEMAKKSGDILERDLKKEEARVKKIEVEQYNLEMAKKSGDILERDLKKEEARVKKIEV

[0097] SEQ ID NO: 32 (“Der p 5_7_21 C1”)

YNYEFALESIKLLIKKLDELAKKVKAVNPDEYYYNYEFALESIKLLIKKLDELAKKVKAVNPDEYYYNYEFALESIKLLIKKLDELAKKVKAVNPDEYYYNYEFALESIKLLIKKLDELAKKVKAVNPDEYYDPIHYDKITEEINKAVDEAVAAIEKSETFDDPIHYDKITEEINKAVDEAVAAIEKSETFDGGWSSKPRKGMGTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNPIKDHWPAANQVGVGAFGPGLTPPHGGILGWSPQAQGILTTVSTIPPPASTNRQSGRQPTPISPPLRDSHPQAMQWNSTAFHQALQDPRVRGLYFPAGGSSSGTVNPAPNIASHISSISARTGDPVTNDYQNEFDFLLMERIHEQIKKGELALFYLQDYQNEFDFLLMERIHEQIKKGELALFYLQDPIHYDKITEEINKAVDEAVAAIEKSETFDDPIHYDKITEEINKAVDEAVAAIEKSETFDEQYNLEMAKKSGDILERDLKKEEARVKKIEVEQYNLEMAKKSGDILERDLKKEEARVKKIEV

[0098] SEQ ID NO: 33 (“Der p 5_7_21 C2”)

YNYEFALESIKLLIKKLDELAKKVKAVNPDEYYYNYEFALESIKLLIKKLDELAKKVKAVNPDEYYYNYEFALESIKLLIKKLDELAKKVKAVNPDEYYYNYEFALESIKLLIKKLDELAKKVKAVNPDEYYDYQNEFDFLLMERIHEQIKKGELALFYLQDYQNEFDFLLMERIHEQIKKGELALFYLQGGWSSKPRKGMGTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNPIKDHWPAANQVGVGAFGPGLTPPHGGILGWSPQAQGILTTVSTIPPPASTNRQSGRQPTPISPPLRDSHPQAMQWNSTAFHQALQDPRVRGLYFPAGGSSSGTVNPAPNIASHISSISARTGDPVTNDPIHYDKITEEINKAVDEAVAAIEKSETFDDPIHYDKITEEINKAVDEAVAAIEKSETFDDPIHYDKITEEINKAVDEAVAAIEKSETFDDPIHYDKITEEINKAVDEAVAAIEKSETFDEQYNLEMAKKSGDILERDLKKEEARVKKIEVEQYNLEMAKKSGDILERDLKKEEARVKKIEV

[0099] SEQ ID NO: 36 (“Der f 1/2 C3”)

VRNSWDTTWGDSGYGYFQAGNNLMMIEQYPYVVIMQNGVVEERSYPYVAREQQSRRPNSQHYGISNHGSDPSIIHRGKPFNLEAIFDANQNTKTAKHGSDPSIIHRGKPFNLEAIFDANQNTKTAKVRNSWDTTWGDSGYGYFQAGNNLMMIEQYPYVVIMQNGVVEERSYPYVAREQQSRRPNSQHYGISNGGWSSKPRKGMGTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNPIKDHWPAANQVGVGAFGPGLTPPHGGILGWSPQAQGILTTVSTIPPPASTNRQSGRQPTPISPPLRDSHPQAMQWNSTAFHQALQDPRVRGLYFPAGGSSSGTVNPAPNIASHISSISARTGDPVTNEVDVPGIDTNASHYIKSPLVKGQQYDAKYTWNVPKIAPKSENEVDVPGIDTNASHYIKSPLVKGQQYDAKYTWNVPKIAPKSENATESAYLAYRNTSLDLSEQELVDSASQHGSHGDTIPRGIEYIQTSASRINSVNVPSELDLRSLRTVTPIRMQGGSGSSWAFSGVAATESAYLAYRNTSLDLSEQELVDSASQHGSHGDTIPRGIEYIQTSASRINSVNVPSELDLRSLRTVTPIRMQGGSGSSWAFSG

[0100] SEQ ID NO: 37 (“Der f 5 7 21 23_P6”)

YNFETAVSTIEILVKDLAELAKKVKAVKSDDYNFETAVSTIEILVKDLAELAKKVKAVKSDDYNFETAVSTIEILVKDLAELAKKVKAVKSDDGYFADPKDPSKFYISSNWEAIHKSSPGNTRWNEKELTSTGYFADPKDPSKFYISSNWEAIHKSSPGNTRWNEKELTSTGYFADPKDPSKFYISSNWEAIHKSSPGNTRWNEKELTSTGGWSSKPRKGMGTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNPIKDHWPAANQVGVGAFGPGLTPPHGGILGWSPQAQGILTTVSTIPPPASTNRQSGRQPTPISPPLRDSHPQAMQWNSTAFHQALQDPRVRGLYFPAGGSSSGTVNPAPNIASHISSISARTGDPVTNDYQNEFDFLLMQRIHEQMRKGEEALLHLQDYQNEFDFLLMQRIHEQMRKGEEALLHLQDPIHYDKITEEINKAIDDAIAAIEQSETIDDPIHYDKITEEINKAIDDAIAAIEQSETIDERYNVEIALKSNEILERDLKKEEQRVKKIEVERYNVEIALKSNEILERDLKKEEQRVKKIEV

[0101] Другой аспект настоящего изобретения относится к фармацевтическому препарату (т. е. вакцинному составу), содержащему, по меньшей мере один слитый белок по настоящему изобретению.

[0102] Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения препарат включает слитый белок, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, и слитый белок, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28.

[0103] Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения указанный препарат содержит от 10 нг до 1 г, предпочтительно от 100 нг до 10 мг, в частности, от 0,5 мкг до 200 мкг слитого белка по настоящему изобретению или молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный слитый белок, или вектор, содержащий указанную молекулу нуклеиновой кислоты.

[0104] Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения слитый белок по настоящему изобретению вводят субъекту по меньшей мере один раз в количестве от 0,01 пг/кг массы тела до 5 мг/кг массы тела, предпочтительно 0,1 пг/кг массы тела до 2 мг/кг массы тела.

[0105] Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения слитый белок вводят пациенту в количестве от 5 до 100 мкг, предпочтительно от 10 до 80 мкг, более предпочтительно от 10 до 40 мкг, независимо от массы тела (т.е. доза может составлять 15, 20, 25, 30 или 80 мкг) или на кг массы тела.

[0106] Количество слитого белка, которое может быть объединено с эксципиентами для получения разовой лекарственной формы, будет варьировать в зависимости от пациента, которого лечат, и конкретного способа введения. Доза полипептидной конструкции может варьировать в зависимости от таких факторов, как болезненное состояние, возраст, пол и масса тела субъекта, а также способности индуцировать желаемую ответную выработку антител у субъекта. Схема дозирования может быть скорректирована для обеспечения оптимального терапевтического ответа. Например, можно вводить несколько разделенных доз ежедневно, или доза может быть пропорционально уменьшена в зависимости от необходимости терапевтической ситуации. Доза полипептидной конструкции также может варьироваться для обеспечения оптимального профилактического ответа на дозу в зависимости от обстоятельств. Например, слитый белок по настоящему изобретению можно вводить субъекту с интервалами в несколько суток, одну, две недели или даже месяцы, всегда в зависимости от уровня индукции аллергенспецифического IgG.

[0107] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения слитый белок и фармацевтический препарат по настоящему изобретению применяют от 2 до 10, предпочтительно от 2 до 7, еще более предпочтительно до 5 раз. В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения однократное применение бустер-дозы назначают в период между 3 месяцами и 5 годами после первой схемы дозирования. Такое применение бустер-дозы можно повторять от 2 до 10 раз, предпочтительно от 2 до 5 раз и наиболее предпочтительно 2 или 3 раза. В особенно предпочтительном варианте осуществления временной интервал между последующими вакцинациями выбирается от 2 недель до 5 лет, предпочтительно от 3 недель до 3 лет, более предпочтительно от 3 недель до 1 года. Повторное введение слитого белка по настоящему изобретению может обеспечить максимальный конечный эффект лечения.

[0108] В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения слитый белок и/или фармацевтический препарат по настоящему изобретению можно применять с использованием от 3 до 6, предпочтительно 5, ежемесячных инъекций с последующими бустер-инъекциями, как указано выше, один раз в 1-6 месяцев, предпочтительно 3-4 месяцев, по меньшей мере в 1, предпочтительно, по меньшей мере 2, более предпочтительно 2-6, более предпочтительно 3-5 лет.

[0109] Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения указанный препарат дополнительно содержит по меньшей мере один адъювант, фармацевтически приемлемый эксципиент и/или консервант.

[0110] Слитый белок и фармацевтический препарат по настоящему изобретению можно вводить подкожно, внутримышечно, внутривенно, трансмукозально и т.д. В зависимости от лекарственной формы и пути введения полипептидная конструкция по настоящему изобретению может быть объединена с эксципиентами, разбавителями, адъювантами и/или носителями. Предпочтительным адъювантом является гидроксид алюминия. Подходящие протоколы приготовления вакцинных составов известны специалистам в данной области, и их можно найти, например, в руководстве «Vaccine Protocols» (A. Robinson, M. P. Cranage, M. Hudson; Humana Press Inc., U.S.; 2nd edition 2003).

[0111] Слитый белок по настоящему изобретению может быть составлен также с другими адъювантами, постоянно используемыми в вакцинах. Например, подходящими адъювантами могут быть MF59, фосфат алюминия, фосфат кальция, цитокины (например, IL-2, IL-12, GM-CSF), сапонины (например, QS21), производные MDP, CpG- олигонуклеотиды, LPS, MPL, полифосфазены, эмульсии (например, адъювант Фрейнда, SAF), липосомы, виросомы, искомы, кохлеаты, микрочастицы PLG, частицы полоксамера, вирусоподобные частицы, термолабильный энтеротоксин (LT), холерный токсин (CT), мутантные токсины (например, LTK63 и LTR72), микрочастицы и/или полимеризованные липосомы. Подходящие адъюванты являются коммерчески доступными, например, такие как ASO1B (MPL и QS21 в липосомном составе), ASO2A, AS15, AS-2, AS-03 и их производные (GlaxoSmithKline, США); CWS (каркас клеточной стенки), TDM (трегалоза-6,6'-димиколат), LeIF (фактор инициации элонгации Leishmania), соли алюминия, такие как гель гидроксида алюминия (квасцы) или фосфат алюминия; соли кальция, железа или цинка; нерастворимая суспензия ацилированного тирозина; ацилированные сахара; катионные или анионные производные полисахаридов; полифосфазены; биоразлагаемые микросферы; монофосфориллипид A и квил A. Цитокины, такие как GM-CSF или интерлейкин-2, -7 или -12, также могут быть использованы в качестве адъювантов. Предпочтительные адъюванты для использования в индукции ответа преимущественно Th1-типа включают, например, комбинацию монофосфориллипида A, предпочтительно 3-0-деацилированного монофосфориллипида A (3D-MPL), необязательно с солью алюминия. Водные составы, содержащие монофосфориллипид А и поверхностно-активное вещество, описаны в WO 98/43670.

[0112] Еще одним предпочтительным адъювантом является сапонин или миметик сапонина или его производные, предпочтительно QS21 (Aquila Biopharmaceuticals Inc.), которые можно использовать отдельно или в комбинации с другими адъювантами. Например, улучшенная система включает комбинацию монофосфориллипида A и производного сапонина, такая как комбинация QS21 и 3D-MPL. Другие предпочтительные составы включают эмульсию «масло-в-воде» и токоферол. Особенно эффективный адъювант представляет собой QS21, 3D-MPL и токоферол в эмульсии «масло-в-воде». Дополнительные адъюванты на основе сапонина для применения в настоящем изобретении включают QS7 (описанный в WO 96/33739 и WO 96/11711) и QS17 (описанный в патенте США № 5057540 и EP 0362279 B1).

[0113] Фармацевтический препарат по настоящему изобретению наиболее предпочтительно включает гидроксид алюминия в качестве адъюванта.

[0114] Еще один аспект настоящего изобретения относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок по настоящему изобретению. Молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению может представлять собой молекулу РНК или ДНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть частью вектора (например, вектора экспрессии белка, вектора интеграции, вектора клонирования), который может быть трансфектирован или введен в любой вид биологической клетки. Предпочтительные клетки включают бактериальные клетки, такие как Escherichia coli, дрожжевые клетки, такие как Pichia pastoris или Saccharomyces cerevisiae, клетки растений, клетки млекопитающих и клетки насекомых. Средства и способы получения таких молекул нуклеиновых кислот, векторов и клеток хорошо известны специалистам в данной области.

[0115] Молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую слитый белок по настоящему изобретению, также можно использовать непосредственно для вакцинации субъектов, нуждающихся в этом. Эти молекулы нуклеиновой кислоты могут быть молекулами РНК и/или ДНК.

[0116] Еще один аспект настоящего изобретения относится к вектору, содержащему молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению.

[0117] Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, указанный вектор представляет экспрессионный вектор или клонирующий вектор. Вектор может быть вектором из бактерий, грибов, насекомых, вирусов или млекопитающих.

[0118] Вектор по настоящему изобретению предпочтительно может использоваться для целей клонирования и экспрессии в различных хозяевах, таких как бактерии, дрожжи, нитчатые грибы, клетки млекопитающих, клетки насекомых, клетки растений или любые другие прокариотические или эукариотические клетки. Следовательно, указанный вектор включает помимо нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок по настоящему изобретению, специфические регуляторные последовательности хозяина.

[0119] Еще один аспект настоящего изобретения относится к клетке-хозяину, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты или вектор по настоящему изобретению.

[0120] Еще один аспект настоящего изобретения относится к слитому белку или фармацевтическому препарату по настоящему изобретению для применения в лечении или профилактике аллергии, вызванной аллергеном клеща домашней пыли, в частности, вызванной Der p 1, Der p 2, Der p 5, Der p 7, Der p 21 или Der p 23.

[0121] Термины «профилактика» и «предупреждение» в контексте настоящего изобретения относятся к профилактике или подавлению рецидива, начала и развития аллергии или ее симптома у субъекта в результате введения слитого белка или фармацевтического препарата по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления «профилактика» и «предупреждение» относятся к снижению риска развития аллергии на конкретные аллергены. Термин «профилактика» охватывает меры не только по предупреждению возникновения аллергии, но также по остановке ее развития и уменьшению ее последствий после выявления.

[0122] Термины «лечение» и «проводить лечение» в контексте настоящего изобретения относятся к уменьшению или подавлению прогрессирования и продолжительности аллергии, уменьшению или облегчению тяжести аллергии и облегчению одного или более ее симптомов. «Лечение» также включает ослабление и/или устранение симптомов аллергии или аллергических реакций. Слитый белок, который вызывает ослабление любого параметра, ассоциированного с аллергией, может быть идентифицирован как терапевтический слитый белок или конъюгат. Термин «лечение» относится как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим мерам. Например, субъекты, кому может быть полезно лечение композициями и способами по настоящему изобретению, включают субъектов, которые уже страдают аллергией, а также субъектов, у которых аллергию следует профилактировать.

[0123] Настоящее изобретение дополнительно иллюстрируется следующими примерами, но без ограничения ими.

Примеры

[0124] Пример 1: конструирование фрагментов аллергенов для применения в слитых белках по настоящему изобретению

[0125] Пептиды, охватывающие последовательность аллергена, представляющего интерес, были идентифицированы на основе прогноза поверхностного обнажения аминокислот, определенного с помощью инструмента биоинформатики ProtScale с сервера ExPASY (http://web.expasy.org/protscale/). Если пептиды не содержали остатков цистеина в своей последовательности, то цистеины добавляли к их N- или C-концу для обеспечения возможности соединения с гемоцианином лимфы улитки (KLH). Пептиды синтезировали с использованием пептидного синтезатора Applied Biosystems Model 433A (Foster City, США), и затем очищали препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографией (HPLC) (Dionex, Thermofischer Scientific, США) (Focke et al., FASEB J., 2001; 15 (11): 2042-4). Размер и идентичность пептидов подтверждали масс-спектрометрией (Bruker, Австрия).

[0126] В таблице I приведены фрагменты аллергенов, полученные из аллергенов клещей домашней пыли:

Der p 1

(TNACSINGNAPAEIDLRQMRTVTPIRMQGGCGSCWAFSGVAATESAYLAYRNQSLDLAEQELVDCASQHGCHGDTIPRGIEYIQHNGVVQESYYRYVAREQSCRRPNAQRFGISNYCQIYPPNVNKIREALAQTHSAIAVIIGIKDLDAFRHYDGRTIIQRDNGYQPNYHAVNIVGYSNAQGVDYWIVRNSWDTNWGDNGYGYFAANIDLMMIEEYPYVVIL; SEQ ID NO: 34),

Der p 2

(DQVDVKDCANHEIKKVLVPGCHGSEPCIIHRGKPFQLEAVFEANQNSKTAKIEIKASIEGLEVDVPGIDPNACHYMKCPLVKGQQYDIKYTWIVPKIAPKSENVVVTVKVMetGDNGVLACAIATHAKIRD; SEQ ID NO: 35), Der p 5 (GenBank идентификационный номер: X17699), Der p 7 (GenBank идентификационный номер: U37044), Der p 21 (GenBank идентификационный номер: DQ354124) и Der p 23 (GenBank идентификационный номер: EU414751.1), которые тестировали в отношении IgE-реактивности, активации базофилов, иммуногенности и блокирования аллергенспецифических молекул IgE.

Таблица I
Фрагменты аллергенов пептиды Положение в аллергене SEQ ID No. Аминокислотная последовательность Der p 1 Der p 1 P1 1-41 1 TNACSINGNAPAEIDLRQMRTVTPIRMQGGCGSCWAFSGVA Der p 1 P1 1-41 5 TNASSINGNAPAEIDLRQMRTVTPIRMQGGSGSSWAFSGVA Der p 1 P2 42-84 2 ATESAYLAYRNQSLDLAEQELVDCASQHGCHGDTIPRGIEYIQ Der p 1 P2 42-84 6 ATESAYLAYRNQSLDLAEQELVDSASQHGSHGDTIPRGIEYIQ Der p 1 P3 85-115 3 HNGVVQESYYRYVAREQSCRRPNAQRFGISN Der p 1 P3 85-115 7 HNGVVQESYYRYVAREQSSRRPNAQRFGISN Der p 1 P4 99-135 49 REQSCRRPNAQRFGISNYCQIYPPNVNKIREALAQTH Der p 1 P5 145-175 50 KDLDAFRHYDGRTIIQRDNGYQPNYHAVNIV Der p 1 P6 155-187 51 GRTIIQRDNGYQPNYHAVNIVGYSNAQGVDYWI Der p 1 P7 175-208 52 VGYSNAQGVDYWIVRNSWDTNWGDNGYGYFAANI Der p 1 P8 188-222 4 VRNSWDTNWGDNGYGYFAANIDLMMIEEYPYVVIL Der p 2 Der p 2 P1 1-33 53 DQVDVKDCANHEIKKVLVPGCHGSEPCIIHRGK Der p 2 P2 21-51 8 CHGSEPCIIHRGKPFQLEAVFEANQNSKTAK Der p 2 P2a 22-51 10 HGSEPSIIHRGKPFQLEAVFEANQNSKTAK Der p 2 P3 42-73 54 EANQNSKTAKIEIKASIEGLEVDVPGIDPNAC Der p 2 P4 62-103 9 EVDVPGIDPNACHYMKCPLVKGQQYDIKYTWIVPKIAPKSEN Der p 2 P4a 62-103 11 EVDVPGIDPNASHYMKSPLVKGQQYDIKYTWIVPKIAPKSEN Der p 2 P5 98-129 55 APKSENVVVTVKVMGDNGVLACAIATHAKIRD Der p 5 Der p 5 P1 1-34 56 EDKKHDYQNEFDFLLMERIHEQIKKGELALFYLQ Der p 5 P2 24-59 57 KKGELALFYLQEQINHFEEKPTKEMKDKIVAEMDTI Der p 5 P3 64-94 58 DGVRGVLDRLMQRKDLDIFEQYNLEMAKKSG Der p 5 P4 78-113 59 DLDIFEQYNLEMAKKSGDILERDLKKEEARVKKIEV Der p 5 P1-1 1-29 60 EDKKHDYQNEFDFLLMERIHEQIKKGELA Der p 5 P1-2 6-34 12 DYQNEFDFLLMERIHEQIKKGELALFYLQ Der p 5 P4-1 78-108 61 DLDIFEQYNLEMAKKSGDILERDLKKEEARV Der p 5 P4-2 83-113 13 EQYNLEMAKKSGDILERDLKKEEARVKKIEV Der p 21 Der p 21 P1 1-34 62 FIVGDKKEDEWRMAFDRLMMEELETKIDQVEKGL Der p 21 P2 35-71 63 LHLSEQYKELEKTKSKELKEQILRELTIGENFMKGAL Der p 21 P3 67-95 64 MKGALKFFEMEAKRTDLNMFERYNYEFAL Der p 21 P4 89-121 15 YNYEFALESIKLLIKKLDELAKKVKAVNPDEYY Der p 7 Der p 7 P1 1-30 14 DPIHYDKITEEINKAVDEAVAAIEKSETFD Der p 7 P2 20-50 65 VAAIEKSETFDPMKVPDHSDKFERHIGIIDL Der p 7 P3 50-80 66 LKGELDMRNIQVRGLKQMKRVGDANVKSEDG Der p 7 P4 90-125 67 VHDDVVSMEYDLAYKLGDLHPNTHVISDIQDFVVEL Der p 7 P5 123-148 68 VELSLEVSEEGNMTLTSFEVRQFANV Der p 7 P6 149-176 69 VNHIGGLSILDPIFAVLSDVLTAIFQDT Der p 7 P7 170-198 70 TAIFQDTVRAEMTKVLAPAFKKELERNNQ Der p 23 Der p 23 P1 1-32 71 MANDNDDDPTTTVHPTTTEQPDDKFECPSRFG Der p 23 P2 15-48 72 PTTTEQPDDKFECPSRFGYFADPKDPHKFYICSN Der p 23 P3 32-70 16 GYFADPKDPHKFYICSNWEAVHKDCPGNTRWNEDEETCT Der p 23 P3a 32-70 73 GYFADPKDPHKFAICSNWAAVHKACPGNTRWNAAAATCT Der p 23 P3b 32-37 74 GYFADPKDPHAFYICSNWEAVAADCPGNTRWNEDEETCT Der p 23 P4 32-60 75 GYFADPKDPHKFYICSNWEAVHKDCPGNT Der p 23 P4a 32-60 76 GYFADPKDPHKFYISSNWEAVHKDSPGNT Der p 23 P5 42-70 77 KFYICSNWEAVHKDCPGNTRWNEDEETCT Der p 23 P5a 42-70 78 KFYISSNWEAVHKDSPGNTRWNEDEETST Der p 23 P5b 47-70 79 SNWEAVHKDCPGNTRWNEDEETCT Der p 23 P6 32-70 17 GYFADPKDPHKFYISSNWEAVHKDSPGNTRWNEDEETST Der p 23 P7 32-64 80 GYFADPKDPHKFYICSNWEAVHKDCPGNTRWNE Der p 23 P8 32-68 81 GYFADPKDPHKFYICSNWEAVHKDCPGNTRWNEDEET Der f 1 Der f 1 P1 38 TSACRINSVNVPSELDLRSLRTVTPIRMQGGCGSCWAFSGVA Der f 1 P2 39 ATESAYLAYRNTSLDLSEQELVDCASQHGCHGDTIPRGIEYIQ Der f 1 P3 40 QNGVVEERSYPYVAREQQCRRPNSQHYGISN Der f 1 P8 41 VRNSWDTTWGDSGYGYFQAGNNLMMIEQYPYVVIM Der f 2 Der f 2 P2a 42 HGSDPCIIHRGKPFNLEAIFDANQNTKTAK Der f 2 P4a 43 EVDVPGIDTNACHYIKCPLVKGQQYDAKYTWNVPKIAPKSEN Der f 5 Der f 5 P1-2 44 DYQNEFDFLLMQRIHEQMRKGEEALLHLQ Der f 5 P4-2 45 ERYNVEIALKSNEILERDLKKEEQRVKKIEV Der f 7 Der f 7 P1 46 DPIHYDKITEEINKAIDDAIAAIEQSETID Der f 21 Der f 21 P4 47 YNFETAVSTIEILVKDLAELAKKVKAVKSDD Der f 23 Der f 23 P6 48 GYFADPKDPCKFYICSNWEAIHKSCPGNTRWNEKELTCT

[0127] IgE-реактивность пептидов определяли с помощью дот-блоттинга. Для этого аликвотные порции по 0,5 мкг каждого пептида соответствующего аллергена и сывороточного альбумина человека (HSA), который использовали в качестве контроля, наносили в виде точек на нитроцеллюлозную мембрану Whatman Protran (GE healthcare, Little Chalfont, UK). После трехкратного блокирования в течение 20 мин буфером gold (50 мМ фосфат натрия [pH 7,4], 0,5% [об./ об.] Твина-20, 0,5% [мас./об.] BSA и 0,05% [мас./об.] азида натрия), мембраны инкубировали с сывороткой пациентов с аллергией на HDM (разведение 1:10 в буфере gold) или с сывороткой субъекта, не страдающего аллергией (в разведении 1:10 в буфере gold), в течение ночи при 4°C. Связанные IgE-антитела детектировали с помощью I¹²⁵-меченных Ab против человеческого IgE в разведении 1:10 (Demeditec Diagnostics, Киль, Германия) и визуализировали с использованием авторадиографии (пленка Kodak XOMAT).

[0128] Для определения иммуногенности пептидов кроликов иммунизировали три раза (первая бустер-инъекция через 4 недели и вторая бустер-инъекция через 7 недель) каждым из пептидов, конъюгированных с KLH (200 мкг/инъекцию), и в качестве контроля соответствующим аллергеном (200 мкг/инъекцию) с использованием один раз полного адъюванта Фрейнда и дважды неполного адъюванта Фрейнда (Charles River, Chatillon sur Chalaronnne, Франция) и/или Al(OH)₃ (Serva). Иммунные ответные реакции кроликов анализировали титрованием с помощью ELISA. Для измерения специфических кроличьих IgG-антител планшеты для ELISA покрывали в течение ночи соответствующим аллергеном. После блокирования планшеты инкубировали в течение ночи с серийными разведениями соответствующей кроличьей антисыворотки или сыворотки от неиммунизированного кролика (1:500, 1:2000, 1:10000 и 1:20000). Связанные кроличьи IgG-антитела детектировали с помощью меченной пероксидазой хрена ослиной антисыворотки против кроличьего IgG в разведении 1:1000 (Amersham Biosciences, Little Chalfont, UK).

[0129] Для определения блокирующей способности пептидов IgG планшеты для ELISA (Nunc, Roskilde, Дания), покрытые в течение ночи 1 мкг/мл соответствующего аллергена, предварительно инкубировали в течение 24 ч с каждой из антисывороток против пептида, антисывороток против аллергена или сывороткой от неиммунизированного кролика, которую использовали в качестве контроля (все в разведении 1:50), и затем промывали. После инкубации в течение ночи с сывороткой от пациентов с аллергией на HDM (разведение 1:10) связанные IgE-антитела детектировали с помощью меченных пероксидазой хрена козьих антител против IgE человека (KPL, Gaithersburg, MD). Процент снижения связывания IgE, достигаемый предварительной инкубацией с кроличьей антисывороткой, рассчитывали следующим образом: 100-(ODI/ODP) × 100). Показатели ODI и ODP представляют значения оптической плотности после предварительной инкубации с кроличьей иммунной сывороткой или нормальной кроличьей сывороткой соответственно.

[0130] Для тестирования аллергенной активности пептидов, клетки базофильного лейкоза крыс (RBL), экспрессирующие высокоаффинный рецептор IgE человека FcεRI (1×10⁵ на лунку), в течение ночи нагружали сыворотку от пациентов с аллергией на HDM и сыворотку от одного субъекта без аллергии, которую использовали в качестве контроля, в разведении 1:10. Клетки трижды промывали буфером Тироде (Sigma, Австрия) и подвергали взаимодействию с серийными разведениями аллергена и пептидами в течение 1 ч. Супернатанты анализировали на β-гексозаминидазную активность, как описано ранее. Эксперименты проводили в трех повторностях, и результаты представлены в виде средних процентных значений от общей β-гексозаминидазы, высвобожденной после добавления 1% Тритона X-100 в виде +/- SE среднего значения (SEM).

Таблица II пептиды IgE реактивность
(дот-блот) активация базофилов иммуногенность блокирование IgE Der p 1 Der p 1 P1 - - да 52% CFA Der p 1 P2 - - да 51% CFA Der p 1 P3 - - да 19% CFA Der p 1 P4 - - да 25% CFA Der p 1 P5 - - да 18% CFA Der p 1 P6 - - да 4% CFA Der p 1 P7 - - да 35% CFA Der p 1 P8 - - да 45% CFA Der p 2 Der p 2 P1 - - да 41% CFA Der p 2 P2 - - да 70% CFA Der p 2 P3 - - да 78% CFA Der p 2 P4 - - да 73% CFA Der p 2 P5 - - слабая 3% CFA Der p 5 Der p 5 P1 + не делали да 35% AlOH, 53% CFA Der p 5 P2 - - да 23% AlOH, 37% CFA Der p 5 P3 + - да 31% AlOH, 69% CFA Der p 5 P4 + не делали да 42% AlOH, 83% CFA Der p 5 P1-1 + не делали не делали не делали Der p 5 P1-2 - - да 45% AlOH, 69% CFA Der p 5 P4-1 + не делали не делали не делали Der p 5 P4-2 - не делали да 45% AlOH, 78% CFA Der p 21 Der p 21 P1 + - да 54% AlOH, 55% CFA Der p 21 P2 + - да 14% AlOH, 39% CFA Der p 21 P3 + - слабая <10% Der p 21 P4 - - да 64% AlOH, 81% CFA Der p 7 Der p 7 P1 - - да 66% AlOH, 65% CFA Der p 7 P2 - - да 26% AlOH, 62% CFA Der p 7 P3 - - да 26% AlOH, 33% CFA Der p 7 P4 - - да 15% AlOH, 46% CFA Der p 7 P5 - - слабая 0% AlOH, 0% CFA Der p 7 P6 - - слабая 5% AlOH, 9% CFA Der p 7 P7 - - да 22% AlOH, 52% CFA Der p 23 Der p 23 P1 - - слабая не делали Der p 23 P2 - - да 19% Der p 23 P3 + не делали да не делали Der p 23 P3a + не делали слабая не делали Der p 23 P3b + не делали нет не делали Der p 23 P4 - - да 33% Der p 23 P4a * * * * Der p 23 P5 + - да 39% Der p 23 P5a * * * * Der p 23 P5b * * * * Der p 23 P6 - не делали да 70% Der p 23 P7 - не делали да 5% Der p 23 P8 - не делали да 6% nd: не делали; выделенные жирным шрифтом и подчеркнутые буквы: остатки цистеина, замененные остатками серина и аланина; + указывает на наличие IgE-реактивности; - указывает на отсутствие IgE-реактивности или активации базофилов

[0131] Пример 2: рекомбинантное получение белков

[0132] Синтезировали гены (кодон-оптимизированные для экспрессии в Escherichia coli), кодирующие слитые белки Der p 1-2 C3 и Der p 5 7 21 23_P6 (большой) (ATG: biosynthetics, Merzhausen, Германия и GenScript, Piscataway, США) и вставляли в сайты NdeI/XhoI pET-27b (Novagen, Германия). Рекомбинантные белки экспрессировали в штамме E.coli BL21-Gold (DE3). Экспрессию Der p 1-2 C3 (см. фиг. 1; SEQ ID NO: 27) индуцировали при OD600=0,4 добавлением 0,5 мМ IPTG к бактериальным культурам и инкубированием в течение 3 ч при 37°C. Der p 5 7 21 23_P6 (большой) (см. фиг. 1; SEQ ID NO: 28) индуцировали при OD600=0,6 добавлением 1 мМ IPTG и инкубированием культур в течение 2,5 ч при 37°C.

[0133] После сбора и добавления ингибиторов протеаз проводили подготовку телец включения для удаления растворимых бактериальных белков. Осадки, содержащие частично очищенные белки Der p 1-2 C3, растворяли в 6 М мочевине, 10 мМ Трис pH 8, 4% и изопропаноле, и очистку продолжали анионообменной хроматографией с использованием колонки HiTrap DEAE Sepharose FF (GE healthcare). Элюирование белка с колонки достигалось при линейном увеличении концентрации NaCl. Элюированные фракции высокой чистоты объединяли, и проводили ступенчатый диализ для удаления мочевины и солей, и для обеспечения возможности рефолдинга белков без агрегации. Затем белок Der p 1-2 C3 инкубировали в течение минимум 4-5 ч при 4°C в следующих растворах: 1) 6 М мочевины, 154 мМ NaCl, 10 мМ Трис pH 8, 4% изопропанола, 2) 4 М мочевины, 103 мМ NaCl, 2 мМ Hepes, pH 8, 3) 2 мМ мочевины, 50,2 мМ NaCl, 2 мМ Hepes, pH 8, 4) 1 M мочевины, 25 мМ NaCl, 2 мМ Hepes, pH 8, 5) 0,5 М мочевины, 12,5 мМ NaCl, 2 мМ Hepes, pH 8, 6) 2 мМ Hepes, pH 8.

[0134] Клеточный лизат, содержащий Der p 5 7 21 23_P6 (большой), растворяли в растворе из 6 М мочевины, 10 мМ Трис pH 7,5, 4% изопропанола, наносили на колонку HiTrap DEAE Sepharose FF (GE healthcare) и элюирование белка с колонки достигалось при линейном увеличении концентрации NaCl. Чистые фракции объединяли и подвергали диализу следующим образом. Условия ступенчатого диализа Der p 5 7 21 23_P6 (большой): инкубирование белка в течение минимум 4-5 ч при 4°C, затем в следующих растворах: 1) 6 M мочевины, 100 мМ NaCl, 10 мМ Трис pH 7,5, 4% изопропанола, 2) 4 M мочевины, 100 мМ NaCl, 2 мМ Hepes, pH 7,5, 3) 2 мМ мочевины, 100 мМ NaCl, 2 мМ Hepes, pH 7,5, 4) 1 М мочевины, 100 мМ NaCl, 2 мМ Hepes, pH 7,5, 5) 0,5 М мочевины, 100 мМ NaCl, 2 мМ Hepes, pH 7,5, 6) 100 мМ NaCl, 2 мМ Hepes, pH 7,5, 7) 50 мМ NaCl, 2 мМ Hepes, pH 7,5, 8) 25 мМ NaCl, 2 мМ Hepes, pH 7,5, 9) 12,5 мМ NaCl, 2 мМ Hepes, pH 7,5, 10) 2 мм Hepes, pH 7,5.

[0135] Чистоту белков определяли электрофорезом SDS-PAGE и окрашиванием Кумаси (см. фиг. 2). Эксклюзионную хроматографию использовали для подтверждения отсутствия олигомеризации подвергшихся рефолдингу белков.

[0136] Пример 3: определение IgE-реактивности

[0137] IgE-реактивность конструкций из примера 2 определяли иммуноблоттингом (Curin M. et al., Sci Rep., 22 (2017): 12135). Аликвотные порции, содержащие 0,5 мкг очищенного nDer p 1 (природный изолят; идентификационный номер: PDB: 3RVW_A; ссылка на методы: Hales B.J. et al., Clin. Exp. Allergy., 30 (2000): 934-943), rDer p 2 (рекомбинантно полученный Der p 2; последовательность опубликована в работе Chen K.W. et al., Allergy, 67 (2012): 609-21; ссылка на методы: Chen K. et al., Mol. Immunol., 45 (2008): 2486-2498), rDer p 5 (GeneBank: X17699; эталонные методы: Weghofer M. et al., Int. Arch. Allergy Immunol., 147 (2008): 101-9), rDer p 7 (GeneBank идентификационный номер: U37044; ссылка на методы: Resch Y. et al., Clin. Exp. Allergy, 41 (2011): 1468-77), rDer p 21 (GeneBank идентификационный номер: DQ354124; эталонные методы: Weghofer M. et al., Allergy, 63 (2008): 758-67), rDer p 23 (GeneBank идентификационный номер: EU414751.1; эталонные методы: Weghofer M. et al., J. Immunol., 190 (2013): 3059-67), Der p 1-2 C3 (см. пример 2), Der p 5 7 21 23_P6 (большой) (см. пример 2), и для контроля BSA наносили в виде точек на нитроцеллюлозные мембраны (Schleicher & Schuell, Германия). Мембраны блокировали буфером gold (50 мМ фосфата натрия [pH 7,4], 0,5% [об./об.] Твина-20, 0,5% [мас./об.] BSA и 0,05% [мас./об.] азида натрия) трижды в течение 20 мин, и затем инкубировали с сывороткой пациентов с аллергией на клещей домашней пыли (разведенной 1:10 в буфере gold) и с сывороткой от субъекта, не страдающего аллергией (1:10 в буфере gold), в течение ночи при 4°C. Связанный IgE детектировали с использованием ¹²⁵I-меченных Ab против человеческого IgE в разведении 1:10 (Demeditec Diagnostics, Киль, Германия) и визуализировали с использованием авторадиографии (пленка Kodak XOMAT), как описано ранее (Curin et al., Sci. Rep., 22 (2017): 12135).

[0138] IgE-реактивность Der p 1-2 C3 сравнивали с данным показателем Der p 1 и Der p 2 у 20 сенсибилизированных к HDM пациентов с помощью дот-блоттинга (фиг. 3A). В то время как пациенты с аллергией реагировали с Der p 1 и Der p 2, ни один из пациентов не показал соответствующей IgE-реактивности с Der p 1-2 C3. Какой-либо реактивности не наблюдали с сывороткой от субъекта без аллергии (NA), и контрольный белок BSA также не проявил IgE-реактивности (фиг. 3A). В следующих экспериментах IgE-реактивность Der p 5 7 21 23_P6 (большой) сравнивали с IgE-реактивностью для Der p 5, Der p 7, Der p21 и Der p 23. 18 HDM-сенсибилизированных пациентов давали реакцию с Der p 5, Der p 7, Der p 21 и Der p 23 в зависимости от пациента, но ни один из тестированных пациентов не реагировал в варианте с Der p 5 7 21 23_P6 (большой) или с контрольным белком BSA (фиг. 3B).

[0139] Пример 4: конкурентный анализ IgE

[0140] Информация о способности пептидов индуцировать блокирующие антитела важна, поскольку было показано, что блокирующие антитела играют существенную роль в иммунотерапии аллергии.

[0141] Для исследования способности иммуноглобулинов (в частности, IgG), индуцированных введением млекопитающим Der p 1-2 C3 и Der p 5 7 21 23_P6 (большой), ингибировать связывание IgE от пациентов с аллергией на клещей домашней пыли на аллергены клещей домашней пыли проводили конкурентным анализом ELISA.

[0142] Конкурентный анализ IgE ELISA проводили для оценки ингибирования связывания человеческого IgE с nDer p 1, rDer p 2, rDer p 5, rDer p 7, rDer p 21, rDer p 23 под действием анти-Der p 1-2 C3 и анти-Der p 5 7 21 23_P6 (большой) кроличьего IgG. Вкратце, планшеты для ELISA (Nunc, Дания), покрытые в течение ночи 1 мкг/мл соответствующего аллергена, предварительно инкубировали в течение 24 ч с антисывороткой против Der p 1-2 C3, против Der p 5 7 21 23_P6 (большой), соответствующей антисывороткой против аллергенов для сравнения (антисыворотка: против nDer p 1, против rDer p 2, против rDer p 5, против rDer p 7, против rDer p 21 или против rDer p 23) или для контроля использовали сыворотку от неиммунизированного кролика (все в разведении 1:3), и затем планшеты промывали. После инкубации в течение ночи с сывороткой от пациентов с аллергией на HDM (разведение 1:10) связанные IgE-антитела детектировали с использованием меченных пероксидазой хрена козьих антител против человеческого IgE (KPL, Gaithersburg, MD). Процентное снижение связывания IgE, достигаемое предварительной инкубацией с кроличьей антисывороткой, рассчитывали следующим образом: 100 - (ODI/ODP) × 100) (см. фиг. 6 и 7). Показатели ODI и ODP представляют значения оптической плотности после предварительной инкубации с кроличьей иммунной сывороткой или нормальной кроличьей сывороткой соответственно (см. Curin M. et al., Sci. Rep., 22 (2017): 12135).

[0143] Анти-Der p 1-2 C3 и анти-Der p 5 7 21 23_P6 (большой)-специфический кроличий IgG, использованный в данном примере, получали следующим образом. Кроликов (Charles River, Франция) иммунизировали трижды (первая бустер-инъекция через 4 недели и вторая бустер-инъекция через 7 недель) с использованием Der p 1-2 C3 или Der p 5 7 21 23_P6 (большой) (200 мкг/инъекцию). Al(OH)₃ (Serva) использовали в качестве адъюванта. Иммунизировали по 2 кроликов на каждый белок. Иммунные ответы кроликов анализировали титрованием с помощью ELISA.

[0144] Ингибирование связывания IgE от пациентов с nDer p 1, достигнутое с помощью анти-Der p 1-2 C3-антител, было несколько ниже, но близким (53% и 58% среднее ингибирование) по сравнению с ингибированием анти-nDer p 1-антителами (78% среднее ингибирование). Ингибирование связывания IgE с rDer p 2, достигнутое с помощью кроличьих антител против Der p 1-2 C3 (среднее значение 89% и 85%), было сравнимо с ингибированием, полученным с кроличьими антителами против Der p 2 (среднее значение 84%) (фиг. 6). Ингибирование связывания IgE от пациентов с Der p 5, достигнутое с помощью анти-Der p 5 7 21 23_P6 (большой) (среднее ингибирование 76% и 85%), было сравнимо с ингибированием с помощью анти-Der p 5 (среднее ингибирование 88%), тогда как ингибирование связывания с Der p 21 было несколько ниже для Der p 5 7 21 23_P6 (большой) (среднее ингибирование 58% и 58%), чем для анти-Der p 21 (среднее ингибирование 87%). Ингибирование связывания с Der p 7 и Der p 23 было выше у Der p 5 7 21 23_P6 (большой) (74% для обоих кроликов для Der p 7 и 47% и 42% для Der p 23), чем для анти-Der p 7 (58%) и анти-Der p 23 (7%) (фиг. 7).

[0145] Пример 5: аллергенная активность, определенная с помощью теста активации базофилов

[0146] Для тестирования аллергенной активности конструкций по настоящему изобретению, в частности Der p 1-2 C3 и Der p 5 7 21 23_P6 (большой), клетки базофильного лейкоза крыс (RBL), экспрессирующие высокоаффинный рецептор IgE человека FcεRI (1 × 10⁵ на лунку) в течение ночи нагружали сывороткой от пациентов с аллергией на клещей домашней пыли в разведении 1:10. Клетки трижды промывали буфером Тироде (Sigma, Австрия) и подвергали взаимодействию с серийным разведениям аллергена (100 нг/мл, 10 нг/мл и 1 нг/мл nDer p 1, rDer p 2, rDer p 5, rDer p 7, rDer p 21, rDer p 23, Der p 1-2 C3 и Der p 5 7 21 23_P6 (большой) соответственно) в течение 1 ч. Сыворотку без аллергена или аллерген без сыворотки использовали в качестве отрицательного контроля. Супернатанты анализировали на β-гексозаминидазную активность, как описано ранее (Hartl et al., Allergy 59 (2004): 65-73). Опыты проводили в трех повторностях, и результаты представлены в виде средних процентов от общей β-гексозаминидазы, высвобожденной после добавления 1% Тритона Х-100 в виде +/- SE среднего (SEM) (см. фиг. 4 и 5).

[0147] Было обнаружено, что Der p 1 и Der p 2 индуцировали высвобождение β-гексозаминидазы из базофилов, нагруженных сывороточным IgE от пациентов с аллергией на HDM, тогда как Der p 1-2 C3 не активировал базофилы (фиг. 4). Результаты следующей серии экспериментов показали, что Der p 5, Der p 7, Der p 21 и Der p 23 индуцировали высвобождение β-гексозаминидазы из базофилов, нагруженных сывороточным IgE, зависимым от пациента образом, тогда как Der p 5 7 21 23_P6 (большой) не индуцировал высвобождения базофилов с сыворотками от тех же пациентов (фиг. 5). Полученные данные указывают на то, что конструкции Der p 1-2 C3 и Der p 5 7 21 23_P6 (большой) не проявляют аллергенной активности.

[0148] Пример 6: образование аллергенспецифического IgG, индуцированного BM35, по сравнению с коммерческими вакцинами против HDM

[0149] Группы из двух новозеландских белых кроликов иммунизировали подкожно различными дозами BM35 (препарат, включающий слитые белки, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 27 и 28 в массовом соотношении 1: 1), и коммерческими препаратами согласно указаниям производителя (см. таблицу III). Контрольных кроликов иммунизировали аллергенами nDer p1, rDer p 2, rDer p 5, rDer p 7, rDer p 21 и rDer p 23.

Таблица III Продукт Компания Схема введения Tyro-SIT Bencard Allergie GmbH неделя 1:0,1 мл
неделя 2:0,3 мл
неделя 3:0,5 мл
неделя 4:0,1 мл
неделя 5:0,3 мл
неделя 6:0,5 мл
неделя 9:0,5 мл
неделя 13:0,5 мл
неделя 17:0,5 мл Alutard SQ 503 и 510 ALK-Abelló неделя 1:0,2 мл
неделя 2:0,4 мл
неделя 3:0,8 мл
неделя 4:0,2 мл
неделя 5:0,4 мл
неделя 6:0,8 мл
неделя 7:0,2 мл
неделя 8:0,4 мл
неделя 9: 0,8 мл
неделя 10:0,2 мл
неделя 11:0,4 мл
неделя 12:0,6 мл
неделя 13:0,8 мл
неделя 14:1 мл
неделя 18:1 мл ACAROID Allergopharma неделя 1:0,1 мл
неделя 2:0,2 мл
неделя 3:0,4 мл
неделя 4:0,6 мл
неделя 5:0,1 мл
неделя 6:0,2 мл
неделя 7: 0,4 мл
неделя 8:0,6 мл
неделя 10:0,6 мл
неделя 13:0,6 мл
неделя 17:0,6 мл PURETHAL Milbenmischung HAL Allergy неделя 1:0,05 мл
неделя 2:0,1 мл
неделя 3:0,2 мл
неделя 4:0,3 мл
неделя 5:0,4 мл
неделя 6:0,5 мл
неделя 8:0,5 мл
неделя 10:0,5 мл
неделя 12:0,5 мл
неделя 15:0,5 мл
неделя 19:0,5 мл CLUSTOID Milben суспензия для инъекций Roxall Medizin GmbH неделя 1:0,2 мл (через 15 мин 0,5 мл)
неделя 4:0,5 мл
неделя 8:0,5 мл
неделя 12:0,5 мл
неделя 16:0,5 мл

[0150] У кроликов отбирали образцы крови и готовили сыворотки в день первой иммунизации и на сутки 38 и 66 после первой иммунизации для мониторинга образования IgG, специфически связывающегося с аллергенами клещей домашней пыли nDer p 1, rDer p 2, rDer p 5, rDer p 7, rDer p 21 и rDer p 23, для определения аллергенспецифической ответной продукции антител на аллергены клещей домашней пыли. Аллергенспецифическую ответную продукцию IgG у кроликов измеряли разведением сывороток 1:500 и с использованием ELISA. Связанный кроличий IgG детектировали с помощью конъюгированных с пероксидазой хрена ослиных антител против кроличьего IgG в разведении 1:2000 (NA 934; GE Healthcare UK Limited, Chalfont St Giles, United Kingdom). Развитие окраски проводили с помощью 2,2’-азино-бис (3-этилбензотиазолин-6-сульфоновой кислоты). Сыворотки, полученные после иммунизации аллергенами клещей домашней пыли дикого типа, служили в качестве положительного контроля.

[0151] Результаты, приведенные на фиг. 8 и 9, четко показывают, что BM35 способен индуцировать образование существенно более высокого титра аллергенспецифических IgG-антител по сравнению с коммерческими продуктами. Особенно удивительно то, что BM35 индуцировал образование антител, направленных против всех 6 аллергенов клещей домашней пыли, тогда как коммерческие продукты приводили к существенно более низкому титру аллергенспецифического IgG и только к отдельным аллергенам. Таким образом, все коммерческие продукты показали более слабую индукцию IgG-антител, специфически связывающихся с очень ограниченным числом аллергенов, по сравнению с BM35.

--->

Список последовательностей

<110> Biomay AG

<120> ЛЕЧЕНИЕ И ПРОФИЛАКТИКА АЛЛЕРГИИ НА КЛЕЩЕЙ ДОМАШНЕЙ ПЫЛИ

<130> 25108-WO

<150> EP 18173258.7

<151> 2018-05-18

<160> 81

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 41

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 1

Thr Asn Ala Cys Ser Ile Asn Gly Asn Ala Pro Ala Glu Ile Asp Leu

1 5 10 15

Arg Gln Met Arg Thr Val Thr Pro Ile Arg Met Gln Gly Gly Cys Gly

20 25 30

Ser Cys Trp Ala Phe Ser Gly Val Ala

35 40

<210> 2

<211> 43

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 2

Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala Tyr Arg Asn Gln Ser Leu Asp Leu

1 5 10 15

Ala Glu Gln Glu Leu Val Asp Cys Ala Ser Gln His Gly Cys His Gly

20 25 30

Asp Thr Ile Pro Arg Gly Ile Glu Tyr Ile Gln

35 40

<210> 3

<211> 31

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 3

His Asn Gly Val Val Gln Glu Ser Tyr Tyr Arg Tyr Val Ala Arg Glu

1 5 10 15

Gln Ser Cys Arg Arg Pro Asn Ala Gln Arg Phe Gly Ile Ser Asn

20 25 30

<210> 4

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 4

Val Arg Asn Ser Trp Asp Thr Asn Trp Gly Asp Asn Gly Tyr Gly Tyr

1 5 10 15

Phe Ala Ala Asn Ile Asp Leu Met Met Ile Glu Glu Tyr Pro Tyr Val

20 25 30

Val Ile Leu

35

<210> 5

<211> 41

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 5

Thr Asn Ala Ser Ser Ile Asn Gly Asn Ala Pro Ala Glu Ile Asp Leu

1 5 10 15

Arg Gln Met Arg Thr Val Thr Pro Ile Arg Met Gln Gly Gly Ser Gly

20 25 30

Ser Ser Trp Ala Phe Ser Gly Val Ala

35 40

<210> 6

<211> 43

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 6

Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala Tyr Arg Asn Gln Ser Leu Asp Leu

1 5 10 15

Ala Glu Gln Glu Leu Val Asp Ser Ala Ser Gln His Gly Ser His Gly

20 25 30

Asp Thr Ile Pro Arg Gly Ile Glu Tyr Ile Gln

35 40

<210> 7

<211> 31

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 7

His Asn Gly Val Val Gln Glu Ser Tyr Tyr Arg Tyr Val Ala Arg Glu

1 5 10 15

Gln Ser Ser Arg Arg Pro Asn Ala Gln Arg Phe Gly Ile Ser Asn

20 25 30

<210> 8

<211> 31

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 8

Cys His Gly Ser Glu Pro Cys Ile Ile His Arg Gly Lys Pro Phe Gln

1 5 10 15

Leu Glu Ala Val Phe Glu Ala Asn Gln Asn Ser Lys Thr Ala Lys

20 25 30

<210> 9

<211> 42

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 9

Glu Val Asp Val Pro Gly Ile Asp Pro Asn Ala Cys His Tyr Met Lys

1 5 10 15

Cys Pro Leu Val Lys Gly Gln Gln Tyr Asp Ile Lys Tyr Thr Trp Ile

20 25 30

Val Pro Lys Ile Ala Pro Lys Ser Glu Asn

35 40

<210> 10

<211> 30

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 10

His Gly Ser Glu Pro Ser Ile Ile His Arg Gly Lys Pro Phe Gln Leu

1 5 10 15

Glu Ala Val Phe Glu Ala Asn Gln Asn Ser Lys Thr Ala Lys

20 25 30

<210> 11

<211> 42

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 11

Glu Val Asp Val Pro Gly Ile Asp Pro Asn Ala Ser His Tyr Met Lys

1 5 10 15

Ser Pro Leu Val Lys Gly Gln Gln Tyr Asp Ile Lys Tyr Thr Trp Ile

20 25 30

Val Pro Lys Ile Ala Pro Lys Ser Glu Asn

35 40

<210> 12

<211> 29

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 12

Asp Tyr Gln Asn Glu Phe Asp Phe Leu Leu Met Glu Arg Ile His Glu

1 5 10 15

Gln Ile Lys Lys Gly Glu Leu Ala Leu Phe Tyr Leu Gln

20 25

<210> 13

<211> 31

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 13

Glu Gln Tyr Asn Leu Glu Met Ala Lys Lys Ser Gly Asp Ile Leu Glu

1 5 10 15

Arg Asp Leu Lys Lys Glu Glu Ala Arg Val Lys Lys Ile Glu Val

20 25 30

<210> 14

<211> 30

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 14

Asp Pro Ile His Tyr Asp Lys Ile Thr Glu Glu Ile Asn Lys Ala Val

1 5 10 15

Asp Glu Ala Val Ala Ala Ile Glu Lys Ser Glu Thr Phe Asp

20 25 30

<210> 15

<211> 33

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 15

Tyr Asn Tyr Glu Phe Ala Leu Glu Ser Ile Lys Leu Leu Ile Lys Lys

1 5 10 15

Leu Asp Glu Leu Ala Lys Lys Val Lys Ala Val Asn Pro Asp Glu Tyr

20 25 30

Tyr

<210> 16

<211> 39

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 16

Gly Tyr Phe Ala Asp Pro Lys Asp Pro His Lys Phe Tyr Ile Cys Ser

1 5 10 15

Asn Trp Glu Ala Val His Lys Asp Cys Pro Gly Asn Thr Arg Trp Asn

20 25 30

Glu Asp Glu Glu Thr Cys Thr

35

<210> 17

<211> 39

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 17

Gly Tyr Phe Ala Asp Pro Lys Asp Pro His Lys Phe Tyr Ile Ser Ser

1 5 10 15

Asn Trp Glu Ala Val His Lys Asp Ser Pro Gly Asn Thr Arg Trp Asn

20 25 30

Glu Asp Glu Glu Thr Ser Thr

35

<210> 18

<211> 192

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> слитый белок

<400> 18

Val Arg Asn Ser Trp Asp Thr Asn Trp Gly Asp Asn Gly Tyr Gly Tyr

1 5 10 15

Phe Ala Ala Asn Ile Asp Leu Met Met Ile Glu Glu Tyr Pro Tyr Val

20 25 30

Val Ile Leu His Asn Gly Val Val Gln Glu Ser Tyr Tyr Arg Tyr Val

35 40 45

Ala Arg Glu Gln Ser Ser Arg Arg Pro Asn Ala Gln Arg Phe Gly Ile

50 55 60

Ser Asn His Gly Ser Glu Pro Ser Ile Ile His Arg Gly Lys Pro Phe

65 70 75 80

Gln Leu Glu Ala Val Phe Glu Ala Asn Gln Asn Ser Lys Thr Ala Lys

85 90 95

His Gly Ser Glu Pro Ser Ile Ile His Arg Gly Lys Pro Phe Gln Leu

100 105 110

Glu Ala Val Phe Glu Ala Asn Gln Asn Ser Lys Thr Ala Lys Val Arg

115 120 125

Asn Ser Trp Asp Thr Asn Trp Gly Asp Asn Gly Tyr Gly Tyr Phe Ala

130 135 140

Ala Asn Ile Asp Leu Met Met Ile Glu Glu Tyr Pro Tyr Val Val Ile

145 150 155 160

Leu His Asn Gly Val Val Gln Glu Ser Tyr Tyr Arg Tyr Val Ala Arg

165 170 175

Glu Gln Ser Ser Arg Arg Pro Asn Ala Gln Arg Phe Gly Ile Ser Asn

180 185 190

<210> 19

<211> 250

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> слитый белок

<400> 19

Glu Val Asp Val Pro Gly Ile Asp Pro Asn Ala Ser His Tyr Met Lys

1 5 10 15

Ser Pro Leu Val Lys Gly Gln Gln Tyr Asp Ile Lys Tyr Thr Trp Ile

20 25 30

Val Pro Lys Ile Ala Pro Lys Ser Glu Asn Glu Val Asp Val Pro Gly

35 40 45

Ile Asp Pro Asn Ala Ser His Tyr Met Lys Ser Pro Leu Val Lys Gly

50 55 60

Gln Gln Tyr Asp Ile Lys Tyr Thr Trp Ile Val Pro Lys Ile Ala Pro

65 70 75 80

Lys Ser Glu Asn Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala Tyr Arg Asn Gln

85 90 95

Ser Leu Asp Leu Ala Glu Gln Glu Leu Val Asp Ser Ala Ser Gln His

100 105 110

Gly Ser His Gly Asp Thr Ile Pro Arg Gly Ile Glu Tyr Ile Gln Thr

115 120 125

Asn Ala Ser Ser Ile Asn Gly Asn Ala Pro Ala Glu Ile Asp Leu Arg

130 135 140

Gln Met Arg Thr Val Thr Pro Ile Arg Met Gln Gly Gly Ser Gly Ser

145 150 155 160

Ser Trp Ala Phe Ser Gly Val Ala Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala

165 170 175

Tyr Arg Asn Gln Ser Leu Asp Leu Ala Glu Gln Glu Leu Val Asp Ser

180 185 190

Ala Ser Gln His Gly Ser His Gly Asp Thr Ile Pro Arg Gly Ile Glu

195 200 205

Tyr Ile Gln Thr Asn Ala Ser Ser Ile Asn Gly Asn Ala Pro Ala Glu

210 215 220

Ile Asp Leu Arg Gln Met Arg Thr Val Thr Pro Ile Arg Met Gln Gly

225 230 235 240

Gly Ser Gly Ser Ser Trp Ala Phe Ser Gly

245 250

<210> 20

<211> 216

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> слитый белок

<400> 20

Tyr Asn Tyr Glu Phe Ala Leu Glu Ser Ile Lys Leu Leu Ile Lys Lys

1 5 10 15

Leu Asp Glu Leu Ala Lys Lys Val Lys Ala Val Asn Pro Asp Glu Tyr

20 25 30

Tyr Tyr Asn Tyr Glu Phe Ala Leu Glu Ser Ile Lys Leu Leu Ile Lys

35 40 45

Lys Leu Asp Glu Leu Ala Lys Lys Val Lys Ala Val Asn Pro Asp Glu

50 55 60

Tyr Tyr Tyr Asn Tyr Glu Phe Ala Leu Glu Ser Ile Lys Leu Leu Ile

65 70 75 80

Lys Lys Leu Asp Glu Leu Ala Lys Lys Val Lys Ala Val Asn Pro Asp

85 90 95

Glu Tyr Tyr Gly Tyr Phe Ala Asp Pro Lys Asp Pro His Lys Phe Tyr

100 105 110

Ile Ser Ser Asn Trp Glu Ala Val His Lys Asp Ser Pro Gly Asn Thr

115 120 125

Arg Trp Asn Glu Asp Glu Glu Thr Ser Thr Gly Tyr Phe Ala Asp Pro

130 135 140

Lys Asp Pro His Lys Phe Tyr Ile Ser Ser Asn Trp Glu Ala Val His

145 150 155 160

Lys Asp Ser Pro Gly Asn Thr Arg Trp Asn Glu Asp Glu Glu Thr Ser

165 170 175

Thr Gly Tyr Phe Ala Asp Pro Lys Asp Pro His Lys Phe Tyr Ile Ser

180 185 190

Ser Asn Trp Glu Ala Val His Lys Asp Ser Pro Gly Asn Thr Arg Trp

195 200 205

Asn Glu Asp Glu Glu Thr Ser Thr

210 215

<210> 21

<211> 180

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> слитый белок

<400> 21

Asp Tyr Gln Asn Glu Phe Asp Phe Leu Leu Met Glu Arg Ile His Glu

1 5 10 15

Gln Ile Lys Lys Gly Glu Leu Ala Leu Phe Tyr Leu Gln Asp Tyr Gln

20 25 30

Asn Glu Phe Asp Phe Leu Leu Met Glu Arg Ile His Glu Gln Ile Lys

35 40 45

Lys Gly Glu Leu Ala Leu Phe Tyr Leu Gln Asp Pro Ile His Tyr Asp

50 55 60

Lys Ile Thr Glu Glu Ile Asn Lys Ala Val Asp Glu Ala Val Ala Ala

65 70 75 80

Ile Glu Lys Ser Glu Thr Phe Asp Asp Pro Ile His Tyr Asp Lys Ile

85 90 95

Thr Glu Glu Ile Asn Lys Ala Val Asp Glu Ala Val Ala Ala Ile Glu

100 105 110

Lys Ser Glu Thr Phe Asp Glu Gln Tyr Asn Leu Glu Met Ala Lys Lys

115 120 125

Ser Gly Asp Ile Leu Glu Arg Asp Leu Lys Lys Glu Glu Ala Arg Val

130 135 140

Lys Lys Ile Glu Val Glu Gln Tyr Asn Leu Glu Met Ala Lys Lys Ser

145 150 155 160

Gly Asp Ile Leu Glu Arg Asp Leu Lys Lys Glu Glu Ala Arg Val Lys

165 170 175

Lys Ile Glu Val

180

<210> 22

<211> 192

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> слитый белок

<400> 22

Val Arg Asn Ser Trp Asp Thr Thr Trp Gly Asp Ser Gly Tyr Gly Tyr

1 5 10 15

Phe Gln Ala Gly Asn Asn Leu Met Met Ile Glu Gln Tyr Pro Tyr Val

20 25 30

Val Ile Met Gln Asn Gly Val Val Glu Glu Arg Ser Tyr Pro Tyr Val

35 40 45

Ala Arg Glu Gln Gln Cys Arg Arg Pro Asn Ser Gln His Tyr Gly Ile

50 55 60

Ser Asn His Gly Ser Asp Pro Cys Ile Ile His Arg Gly Lys Pro Phe

65 70 75 80

Asn Leu Glu Ala Ile Phe Asp Ala Asn Gln Asn Thr Lys Thr Ala Lys

85 90 95

His Gly Ser Asp Pro Cys Ile Ile His Arg Gly Lys Pro Phe Asn Leu

100 105 110

Glu Ala Ile Phe Asp Ala Asn Gln Asn Thr Lys Thr Ala Lys Val Arg

115 120 125

Asn Ser Trp Asp Thr Thr Trp Gly Asp Ser Gly Tyr Gly Tyr Phe Gln

130 135 140

Ala Gly Asn Asn Leu Met Met Ile Glu Gln Tyr Pro Tyr Val Val Ile

145 150 155 160

Met Gln Asn Gly Val Val Glu Glu Arg Ser Tyr Pro Tyr Val Ala Arg

165 170 175

Glu Gln Gln Cys Arg Arg Pro Asn Ser Gln His Tyr Gly Ile Ser Asn

180 185 190

<210> 23

<211> 254

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> слитый белок

<400> 23

Glu Val Asp Val Pro Gly Ile Asp Thr Asn Ala Cys His Tyr Ile Lys

1 5 10 15

Cys Pro Leu Val Lys Gly Gln Gln Tyr Asp Ala Lys Tyr Thr Trp Asn

20 25 30

Val Pro Lys Ile Ala Pro Lys Ser Glu Asn Glu Val Asp Val Pro Gly

35 40 45

Ile Asp Thr Asn Ala Cys His Tyr Ile Lys Cys Pro Leu Val Lys Gly

50 55 60

Gln Gln Tyr Asp Ala Lys Tyr Thr Trp Asn Val Pro Lys Ile Ala Pro

65 70 75 80

Lys Ser Glu Asn Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala Tyr Arg Asn Thr

85 90 95

Ser Leu Asp Leu Ser Glu Gln Glu Leu Val Asp Cys Ala Ser Gln His

100 105 110

Gly Cys His Gly Asp Thr Ile Pro Arg Gly Ile Glu Tyr Ile Gln Thr

115 120 125

Ser Ala Cys Arg Ile Asn Ser Val Asn Val Pro Ser Glu Leu Asp Leu

130 135 140

Arg Ser Leu Arg Thr Val Thr Pro Ile Arg Met Gln Gly Gly Cys Gly

145 150 155 160

Ser Cys Trp Ala Phe Ser Gly Val Ala Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu

165 170 175

Ala Tyr Arg Asn Thr Ser Leu Asp Leu Ser Glu Gln Glu Leu Val Asp

180 185 190

Cys Ala Ser Gln His Gly Cys His Gly Asp Thr Ile Pro Arg Gly Ile

195 200 205

Glu Tyr Ile Gln Thr Ser Ala Cys Arg Ile Asn Ser Val Asn Val Pro

210 215 220

Ser Glu Leu Asp Leu Arg Ser Leu Arg Thr Val Thr Pro Ile Arg Met

225 230 235 240

Gln Gly Gly Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Gly Val Ala

245 250

<210> 24

<211> 210

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> слитый белок

<400> 24

Tyr Asn Phe Glu Thr Ala Val Ser Thr Ile Glu Ile Leu Val Lys Asp

1 5 10 15

Leu Ala Glu Leu Ala Lys Lys Val Lys Ala Val Lys Ser Asp Asp Tyr

20 25 30

Asn Phe Glu Thr Ala Val Ser Thr Ile Glu Ile Leu Val Lys Asp Leu

35 40 45

Ala Glu Leu Ala Lys Lys Val Lys Ala Val Lys Ser Asp Asp Tyr Asn

50 55 60

Phe Glu Thr Ala Val Ser Thr Ile Glu Ile Leu Val Lys Asp Leu Ala

65 70 75 80

Glu Leu Ala Lys Lys Val Lys Ala Val Lys Ser Asp Asp Gly Tyr Phe

85 90 95

Ala Asp Pro Lys Asp Pro Cys Lys Phe Tyr Ile Cys Ser Asn Trp Glu

100 105 110

Ala Ile His Lys Ser Cys Pro Gly Asn Thr Arg Trp Asn Glu Lys Glu

115 120 125

Leu Thr Cys Thr Gly Tyr Phe Ala Asp Pro Lys Asp Pro Cys Lys Phe

130 135 140

Tyr Ile Cys Ser Asn Trp Glu Ala Ile His Lys Ser Cys Pro Gly Asn

145 150 155 160

Thr Arg Trp Asn Glu Lys Glu Leu Thr Cys Thr Gly Tyr Phe Ala Asp

165 170 175

Pro Lys Asp Pro Cys Lys Phe Tyr Ile Cys Ser Asn Trp Glu Ala Ile

180 185 190

His Lys Ser Cys Pro Gly Asn Thr Arg Trp Asn Glu Lys Glu Leu Thr

195 200 205

Cys Thr

210

<210> 25

<211> 180

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> слитый белок

<400> 25

Asp Tyr Gln Asn Glu Phe Asp Phe Leu Leu Met Gln Arg Ile His Glu

1 5 10 15

Gln Met Arg Lys Gly Glu Glu Ala Leu Leu His Leu Gln Asp Tyr Gln

20 25 30

Asn Glu Phe Asp Phe Leu Leu Met Gln Arg Ile His Glu Gln Met Arg

35 40 45

Lys Gly Glu Glu Ala Leu Leu His Leu Gln Asp Pro Ile His Tyr Asp

50 55 60

Lys Ile Thr Glu Glu Ile Asn Lys Ala Ile Asp Asp Ala Ile Ala Ala

65 70 75 80

Ile Glu Gln Ser Glu Thr Ile Asp Asp Pro Ile His Tyr Asp Lys Ile

85 90 95

Thr Glu Glu Ile Asn Lys Ala Ile Asp Asp Ala Ile Ala Ala Ile Glu

100 105 110

Gln Ser Glu Thr Ile Asp Glu Arg Tyr Asn Val Glu Ile Ala Leu Lys

115 120 125

Ser Asn Glu Ile Leu Glu Arg Asp Leu Lys Lys Glu Glu Gln Arg Val

130 135 140

Lys Lys Ile Glu Val Glu Arg Tyr Asn Val Glu Ile Ala Leu Lys Ser

145 150 155 160

Asn Glu Ile Leu Glu Arg Asp Leu Lys Lys Glu Glu Gln Arg Val Lys

165 170 175

Lys Ile Glu Val

180

<210> 26

<211> 173

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> белок-носитель PreS

<400> 26

Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser

1 5 10 15

Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala

20 25 30

Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Ile Lys

35 40 45

Asp His Trp Pro Ala Ala Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Pro

50 55 60

Gly Leu Thr Pro Pro His Gly Gly Ile Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala

65 70 75 80

Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Ser Thr Ile Pro Pro Pro Ala Ser Thr

85 90 95

Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg

100 105 110

Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Ala Phe His Gln

115 120 125

Ala Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly

130 135 140

Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Ala Pro Asn Ile Ala Ser His Ile

145 150 155 160

Ser Ser Ile Ser Ala Arg Thr Gly Asp Pro Val Thr Asn

165 170

<210> 27

<211> 615

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> слитый белок

<400> 27

Val Arg Asn Ser Trp Asp Thr Asn Trp Gly Asp Asn Gly Tyr Gly Tyr

1 5 10 15

Phe Ala Ala Asn Ile Asp Leu Met Met Ile Glu Glu Tyr Pro Tyr Val

20 25 30

Val Ile Leu His Asn Gly Val Val Gln Glu Ser Tyr Tyr Arg Tyr Val

35 40 45

Ala Arg Glu Gln Ser Ser Arg Arg Pro Asn Ala Gln Arg Phe Gly Ile

50 55 60

Ser Asn His Gly Ser Glu Pro Ser Ile Ile His Arg Gly Lys Pro Phe

65 70 75 80

Gln Leu Glu Ala Val Phe Glu Ala Asn Gln Asn Ser Lys Thr Ala Lys

85 90 95

His Gly Ser Glu Pro Ser Ile Ile His Arg Gly Lys Pro Phe Gln Leu

100 105 110

Glu Ala Val Phe Glu Ala Asn Gln Asn Ser Lys Thr Ala Lys Val Arg

115 120 125

Asn Ser Trp Asp Thr Asn Trp Gly Asp Asn Gly Tyr Gly Tyr Phe Ala

130 135 140

Ala Asn Ile Asp Leu Met Met Ile Glu Glu Tyr Pro Tyr Val Val Ile

145 150 155 160

Leu His Asn Gly Val Val Gln Glu Ser Tyr Tyr Arg Tyr Val Ala Arg

165 170 175

Glu Gln Ser Ser Arg Arg Pro Asn Ala Gln Arg Phe Gly Ile Ser Asn

180 185 190

Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser

195 200 205

Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala

210 215 220

Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Ile Lys

225 230 235 240

Asp His Trp Pro Ala Ala Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Pro

245 250 255

Gly Leu Thr Pro Pro His Gly Gly Ile Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala

260 265 270

Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Ser Thr Ile Pro Pro Pro Ala Ser Thr

275 280 285

Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg

290 295 300

Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Ala Phe His Gln

305 310 315 320

Ala Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly

325 330 335

Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Ala Pro Asn Ile Ala Ser His Ile

340 345 350

Ser Ser Ile Ser Ala Arg Thr Gly Asp Pro Val Thr Asn Glu Val Asp

355 360 365

Val Pro Gly Ile Asp Pro Asn Ala Ser His Tyr Met Lys Ser Pro Leu

370 375 380

Val Lys Gly Gln Gln Tyr Asp Ile Lys Tyr Thr Trp Ile Val Pro Lys

385 390 395 400

Ile Ala Pro Lys Ser Glu Asn Glu Val Asp Val Pro Gly Ile Asp Pro

405 410 415

Asn Ala Ser His Tyr Met Lys Ser Pro Leu Val Lys Gly Gln Gln Tyr

420 425 430

Asp Ile Lys Tyr Thr Trp Ile Val Pro Lys Ile Ala Pro Lys Ser Glu

435 440 445

Asn Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala Tyr Arg Asn Gln Ser Leu Asp

450 455 460

Leu Ala Glu Gln Glu Leu Val Asp Ser Ala Ser Gln His Gly Ser His

465 470 475 480

Gly Asp Thr Ile Pro Arg Gly Ile Glu Tyr Ile Gln Thr Asn Ala Ser

485 490 495

Ser Ile Asn Gly Asn Ala Pro Ala Glu Ile Asp Leu Arg Gln Met Arg

500 505 510

Thr Val Thr Pro Ile Arg Met Gln Gly Gly Ser Gly Ser Ser Trp Ala

515 520 525

Phe Ser Gly Val Ala Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala Tyr Arg Asn

530 535 540

Gln Ser Leu Asp Leu Ala Glu Gln Glu Leu Val Asp Ser Ala Ser Gln

545 550 555 560

His Gly Ser His Gly Asp Thr Ile Pro Arg Gly Ile Glu Tyr Ile Gln

565 570 575

Thr Asn Ala Ser Ser Ile Asn Gly Asn Ala Pro Ala Glu Ile Asp Leu

580 585 590

Arg Gln Met Arg Thr Val Thr Pro Ile Arg Met Gln Gly Gly Ser Gly

595 600 605

Ser Ser Trp Ala Phe Ser Gly

610 615

<210> 28

<211> 569

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> слитый белок

<400> 28

Tyr Asn Tyr Glu Phe Ala Leu Glu Ser Ile Lys Leu Leu Ile Lys Lys

1 5 10 15

Leu Asp Glu Leu Ala Lys Lys Val Lys Ala Val Asn Pro Asp Glu Tyr

20 25 30

Tyr Tyr Asn Tyr Glu Phe Ala Leu Glu Ser Ile Lys Leu Leu Ile Lys

35 40 45

Lys Leu Asp Glu Leu Ala Lys Lys Val Lys Ala Val Asn Pro Asp Glu

50 55 60

Tyr Tyr Tyr Asn Tyr Glu Phe Ala Leu Glu Ser Ile Lys Leu Leu Ile

65 70 75 80

Lys Lys Leu Asp Glu Leu Ala Lys Lys Val Lys Ala Val Asn Pro Asp

85 90 95

Glu Tyr Tyr Gly Tyr Phe Ala Asp Pro Lys Asp Pro His Lys Phe Tyr

100 105 110

Ile Ser Ser Asn Trp Glu Ala Val His Lys Asp Ser Pro Gly Asn Thr

115 120 125

Arg Trp Asn Glu Asp Glu Glu Thr Ser Thr Gly Tyr Phe Ala Asp Pro

130 135 140

Lys Asp Pro His Lys Phe Tyr Ile Ser Ser Asn Trp Glu Ala Val His

145 150 155 160

Lys Asp Ser Pro Gly Asn Thr Arg Trp Asn Glu Asp Glu Glu Thr Ser

165 170 175

Thr Gly Tyr Phe Ala Asp Pro Lys Asp Pro His Lys Phe Tyr Ile Ser

180 185 190

Ser Asn Trp Glu Ala Val His Lys Asp Ser Pro Gly Asn Thr Arg Trp

195 200 205

Asn Glu Asp Glu Glu Thr Ser Thr Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg

210 215 220

Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe

225 230 235 240

Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro

245 250 255

Asp Trp Asp Phe Asn Pro Ile Lys Asp His Trp Pro Ala Ala Asn Gln

260 265 270

Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Pro Gly Leu Thr Pro Pro His Gly Gly

275 280 285

Ile Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Ser

290 295 300

Thr Ile Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro

305 310 315 320

Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln

325 330 335

Trp Asn Ser Thr Ala Phe His Gln Ala Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg

340 345 350

Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro

355 360 365

Ala Pro Asn Ile Ala Ser His Ile Ser Ser Ile Ser Ala Arg Thr Gly

370 375 380

Asp Pro Val Thr Asn Asp Tyr Gln Asn Glu Phe Asp Phe Leu Leu Met

385 390 395 400

Glu Arg Ile His Glu Gln Ile Lys Lys Gly Glu Leu Ala Leu Phe Tyr

405 410 415

Leu Gln Asp Tyr Gln Asn Glu Phe Asp Phe Leu Leu Met Glu Arg Ile

420 425 430

His Glu Gln Ile Lys Lys Gly Glu Leu Ala Leu Phe Tyr Leu Gln Asp

435 440 445

Pro Ile His Tyr Asp Lys Ile Thr Glu Glu Ile Asn Lys Ala Val Asp

450 455 460

Glu Ala Val Ala Ala Ile Glu Lys Ser Glu Thr Phe Asp Asp Pro Ile

465 470 475 480

His Tyr Asp Lys Ile Thr Glu Glu Ile Asn Lys Ala Val Asp Glu Ala

485 490 495

Val Ala Ala Ile Glu Lys Ser Glu Thr Phe Asp Glu Gln Tyr Asn Leu

500 505 510

Glu Met Ala Lys Lys Ser Gly Asp Ile Leu Glu Arg Asp Leu Lys Lys

515 520 525

Glu Glu Ala Arg Val Lys Lys Ile Glu Val Glu Gln Tyr Asn Leu Glu

530 535 540

Met Ala Lys Lys Ser Gly Asp Ile Leu Glu Arg Asp Leu Lys Lys Glu

545 550 555 560

Glu Ala Arg Val Lys Lys Ile Glu Val

565

<210> 29

<211> 615

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> слитый белок

<400> 29

Val Arg Asn Ser Trp Asp Thr Asn Trp Gly Asp Asn Gly Tyr Gly Tyr

1 5 10 15

Phe Ala Ala Asn Ile Asp Leu Met Met Ile Glu Glu Tyr Pro Tyr Val

20 25 30

Val Ile Leu His Asn Gly Val Val Gln Glu Ser Tyr Tyr Arg Tyr Val

35 40 45

Ala Arg Glu Gln Ser Ser Arg Arg Pro Asn Ala Gln Arg Phe Gly Ile

50 55 60

Ser Asn Val Arg Asn Ser Trp Asp Thr Asn Trp Gly Asp Asn Gly Tyr

65 70 75 80

Gly Tyr Phe Ala Ala Asn Ile Asp Leu Met Met Ile Glu Glu Tyr Pro

85 90 95

Tyr Val Val Ile Leu His Asn Gly Val Val Gln Glu Ser Tyr Tyr Arg

100 105 110

Tyr Val Ala Arg Glu Gln Ser Ser Arg Arg Pro Asn Ala Gln Arg Phe

115 120 125

Gly Ile Ser Asn His Gly Ser Glu Pro Ser Ile Ile His Arg Gly Lys

130 135 140

Pro Phe Gln Leu Glu Ala Val Phe Glu Ala Asn Gln Asn Ser Lys Thr

145 150 155 160

Ala Lys His Gly Ser Glu Pro Ser Ile Ile His Arg Gly Lys Pro Phe

165 170 175

Gln Leu Glu Ala Val Phe Glu Ala Asn Gln Asn Ser Lys Thr Ala Lys

180 185 190

Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser

195 200 205

Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala

210 215 220

Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Ile Lys

225 230 235 240

Asp His Trp Pro Ala Ala Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Pro

245 250 255

Gly Leu Thr Pro Pro His Gly Gly Ile Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala

260 265 270

Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Ser Thr Ile Pro Pro Pro Ala Ser Thr

275 280 285

Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg

290 295 300

Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Ala Phe His Gln

305 310 315 320

Ala Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly

325 330 335

Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Ala Pro Asn Ile Ala Ser His Ile

340 345 350

Ser Ser Ile Ser Ala Arg Thr Gly Asp Pro Val Thr Asn Glu Val Asp

355 360 365

Val Pro Gly Ile Asp Pro Asn Ala Ser His Tyr Met Lys Ser Pro Leu

370 375 380

Val Lys Gly Gln Gln Tyr Asp Ile Lys Tyr Thr Trp Ile Val Pro Lys

385 390 395 400

Ile Ala Pro Lys Ser Glu Asn Glu Val Asp Val Pro Gly Ile Asp Pro

405 410 415

Asn Ala Ser His Tyr Met Lys Ser Pro Leu Val Lys Gly Gln Gln Tyr

420 425 430

Asp Ile Lys Tyr Thr Trp Ile Val Pro Lys Ile Ala Pro Lys Ser Glu

435 440 445

Asn Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala Tyr Arg Asn Gln Ser Leu Asp

450 455 460

Leu Ala Glu Gln Glu Leu Val Asp Ser Ala Ser Gln His Gly Ser His

465 470 475 480

Gly Asp Thr Ile Pro Arg Gly Ile Glu Tyr Ile Gln Thr Asn Ala Ser

485 490 495

Ser Ile Asn Gly Asn Ala Pro Ala Glu Ile Asp Leu Arg Gln Met Arg

500 505 510

Thr Val Thr Pro Ile Arg Met Gln Gly Gly Ser Gly Ser Ser Trp Ala

515 520 525

Phe Ser Gly Val Ala Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala Tyr Arg Asn

530 535 540

Gln Ser Leu Asp Leu Ala Glu Gln Glu Leu Val Asp Ser Ala Ser Gln

545 550 555 560

His Gly Ser His Gly Asp Thr Ile Pro Arg Gly Ile Glu Tyr Ile Gln

565 570 575

Thr Asn Ala Ser Ser Ile Asn Gly Asn Ala Pro Ala Glu Ile Asp Leu

580 585 590

Arg Gln Met Arg Thr Val Thr Pro Ile Arg Met Gln Gly Gly Ser Gly

595 600 605

Ser Ser Trp Ala Phe Ser Gly

610 615

<210> 30

<211> 615

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> слитый белок

<400> 30

Val Arg Asn Ser Trp Asp Thr Asn Trp Gly Asp Asn Gly Tyr Gly Tyr

1 5 10 15

Phe Ala Ala Asn Ile Asp Leu Met Met Ile Glu Glu Tyr Pro Tyr Val

20 25 30

Val Ile Leu His Asn Gly Val Val Gln Glu Ser Tyr Tyr Arg Tyr Val

35 40 45

Ala Arg Glu Gln Ser Ser Arg Arg Pro Asn Ala Gln Arg Phe Gly Ile

50 55 60

Ser Asn Val Arg Asn Ser Trp Asp Thr Asn Trp Gly Asp Asn Gly Tyr

65 70 75 80

Gly Tyr Phe Ala Ala Asn Ile Asp Leu Met Met Ile Glu Glu Tyr Pro

85 90 95

Tyr Val Val Ile Leu His Asn Gly Val Val Gln Glu Ser Tyr Tyr Arg

100 105 110

Tyr Val Ala Arg Glu Gln Ser Ser Arg Arg Pro Asn Ala Gln Arg Phe

115 120 125

Gly Ile Ser Asn His Gly Ser Glu Pro Ser Ile Ile His Arg Gly Lys

130 135 140

Pro Phe Gln Leu Glu Ala Val Phe Glu Ala Asn Gln Asn Ser Lys Thr

145 150 155 160

Ala Lys His Gly Ser Glu Pro Ser Ile Ile His Arg Gly Lys Pro Phe

165 170 175

Gln Leu Glu Ala Val Phe Glu Ala Asn Gln Asn Ser Lys Thr Ala Lys

180 185 190

Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser

195 200 205

Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala

210 215 220

Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Ile Lys

225 230 235 240

Asp His Trp Pro Ala Ala Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Pro

245 250 255

Gly Leu Thr Pro Pro His Gly Gly Ile Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala

260 265 270

Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Ser Thr Ile Pro Pro Pro Ala Ser Thr

275 280 285

Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg

290 295 300

Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Ala Phe His Gln

305 310 315 320

Ala Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly

325 330 335

Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Ala Pro Asn Ile Ala Ser His Ile

340 345 350

Ser Ser Ile Ser Ala Arg Thr Gly Asp Pro Val Thr Asn Ala Thr Glu

355 360 365

Ser Ala Tyr Leu Ala Tyr Arg Asn Gln Ser Leu Asp Leu Ala Glu Gln

370 375 380

Glu Leu Val Asp Ser Ala Ser Gln His Gly Ser His Gly Asp Thr Ile

385 390 395 400

Pro Arg Gly Ile Glu Tyr Ile Gln Thr Asn Ala Ser Ser Ile Asn Gly

405 410 415

Asn Ala Pro Ala Glu Ile Asp Leu Arg Gln Met Arg Thr Val Thr Pro

420 425 430

Ile Arg Met Gln Gly Gly Ser Gly Ser Ser Trp Ala Phe Ser Gly Val

435 440 445

Ala Glu Val Asp Val Pro Gly Ile Asp Pro Asn Ala Ser His Tyr Met

450 455 460

Lys Ser Pro Leu Val Lys Gly Gln Gln Tyr Asp Ile Lys Tyr Thr Trp

465 470 475 480

Ile Val Pro Lys Ile Ala Pro Lys Ser Glu Asn Glu Val Asp Val Pro

485 490 495

Gly Ile Asp Pro Asn Ala Ser His Tyr Met Lys Ser Pro Leu Val Lys

500 505 510

Gly Gln Gln Tyr Asp Ile Lys Tyr Thr Trp Ile Val Pro Lys Ile Ala

515 520 525

Pro Lys Ser Glu Asn Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala Tyr Arg Asn

530 535 540

Gln Ser Leu Asp Leu Ala Glu Gln Glu Leu Val Asp Ser Ala Ser Gln

545 550 555 560

His Gly Ser His Gly Asp Thr Ile Pro Arg Gly Ile Glu Tyr Ile Gln

565 570 575

Thr Asn Ala Ser Ser Ile Asn Gly Asn Ala Pro Ala Glu Ile Asp Leu

580 585 590

Arg Gln Met Arg Thr Val Thr Pro Ile Arg Met Gln Gly Gly Ser Gly

595 600 605

Ser Ser Trp Ala Phe Ser Gly

610 615

<210> 31

<211> 568

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> слитый белок

<400> 31

Tyr Asn Tyr Glu Phe Ala Leu Glu Ser Ile Lys Leu Leu Ile Lys Lys

1 5 10 15

Leu Asp Glu Leu Ala Lys Lys Val Lys Ala Val Asn Pro Asp Glu Tyr

20 25 30

Tyr Tyr Asn Tyr Glu Phe Ala Leu Glu Ser Ile Lys Leu Leu Ile Lys

35 40 45

Lys Leu Asp Glu Leu Ala Lys Lys Val Lys Ala Val Asn Pro Asp Glu

50 55 60

Tyr Tyr Tyr Asn Tyr Glu Phe Ala Leu Glu Ser Ile Lys Leu Leu Ile

65 70 75 80

Lys Lys Leu Asp Glu Leu Ala Lys Lys Val Lys Ala Val Asn Pro Asp

85 90 95

Glu Tyr Tyr Gly Tyr Phe Ala Asp Pro Lys Asp Pro His Lys Phe Tyr

100 105 110

Ile Cys Ser Asn Trp Glu Ala Val His Lys Asp Cys Pro Gly Asn Thr

115 120 125

Gly Tyr Phe Ala Asp Pro Lys Asp Pro His Lys Phe Tyr Ile Cys Ser

130 135 140

Asn Trp Glu Ala Val His Lys Asp Cys Pro Gly Asn Thr Gly Gly Trp

145 150 155 160

Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn

165 170 175

Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala

180 185 190

Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Ile Lys Asp His Trp

195 200 205

Pro Ala Ala Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Pro Gly Leu Thr

210 215 220

Pro Pro His Gly Gly Ile Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile

225 230 235 240

Leu Thr Thr Val Ser Thr Ile Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln

245 250 255

Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp Ser His

260 265 270

Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Ala Phe His Gln Ala Leu Gln

275 280 285

Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser

290 295 300

Gly Thr Val Asn Pro Ala Pro Asn Ile Ala Ser His Ile Ser Ser Ile

305 310 315 320

Ser Ala Arg Thr Gly Asp Pro Val Thr Asn Lys Phe Tyr Ile Cys Ser

325 330 335

Asn Trp Glu Ala Val His Lys Asp Cys Pro Gly Asn Thr Arg Trp Asn

340 345 350

Glu Asp Glu Glu Thr Cys Thr Lys Phe Tyr Ile Cys Ser Asn Trp Glu

355 360 365

Ala Val His Lys Asp Cys Pro Gly Asn Thr Arg Trp Asn Glu Asp Glu

370 375 380

Glu Thr Cys Thr Asp Tyr Gln Asn Glu Phe Asp Phe Leu Leu Met Glu

385 390 395 400

Arg Ile His Glu Gln Ile Lys Lys Gly Glu Leu Ala Leu Phe Tyr Leu

405 410 415

Gln Asp Tyr Gln Asn Glu Phe Asp Phe Leu Leu Met Glu Arg Ile His

420 425 430

Glu Gln Ile Lys Lys Gly Glu Leu Ala Leu Phe Tyr Leu Gln Asp Pro

435 440 445

Ile His Tyr Asp Lys Ile Thr Glu Glu Ile Asn Lys Ala Val Asp Glu

450 455 460

Ala Val Ala Ala Ile Glu Lys Ser Glu Thr Phe Asp Asp Pro Ile His

465 470 475 480

Tyr Asp Lys Ile Thr Glu Glu Ile Asn Lys Ala Val Asp Glu Ala Val

485 490 495

Ala Ala Ile Glu Lys Ser Glu Thr Phe Asp Glu Gln Tyr Asn Leu Glu

500 505 510

Met Ala Lys Lys Ser Gly Asp Ile Leu Glu Arg Asp Leu Lys Lys Glu

515 520 525

Glu Ala Arg Val Lys Lys Ile Glu Val Glu Gln Tyr Asn Leu Glu Met

530 535 540

Ala Lys Lys Ser Gly Asp Ile Leu Glu Arg Asp Leu Lys Lys Glu Glu

545 550 555 560

Ala Arg Val Lys Lys Ile Glu Val

565

<210> 32

<211> 545

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> слитый белок

<400> 32

Tyr Asn Tyr Glu Phe Ala Leu Glu Ser Ile Lys Leu Leu Ile Lys Lys

1 5 10 15

Leu Asp Glu Leu Ala Lys Lys Val Lys Ala Val Asn Pro Asp Glu Tyr

20 25 30

Tyr Tyr Asn Tyr Glu Phe Ala Leu Glu Ser Ile Lys Leu Leu Ile Lys

35 40 45

Lys Leu Asp Glu Leu Ala Lys Lys Val Lys Ala Val Asn Pro Asp Glu

50 55 60

Tyr Tyr Tyr Asn Tyr Glu Phe Ala Leu Glu Ser Ile Lys Leu Leu Ile

65 70 75 80

Lys Lys Leu Asp Glu Leu Ala Lys Lys Val Lys Ala Val Asn Pro Asp

85 90 95

Glu Tyr Tyr Tyr Asn Tyr Glu Phe Ala Leu Glu Ser Ile Lys Leu Leu

100 105 110

Ile Lys Lys Leu Asp Glu Leu Ala Lys Lys Val Lys Ala Val Asn Pro

115 120 125

Asp Glu Tyr Tyr Asp Pro Ile His Tyr Asp Lys Ile Thr Glu Glu Ile

130 135 140

Asn Lys Ala Val Asp Glu Ala Val Ala Ala Ile Glu Lys Ser Glu Thr

145 150 155 160

Phe Asp Asp Pro Ile His Tyr Asp Lys Ile Thr Glu Glu Ile Asn Lys

165 170 175

Ala Val Asp Glu Ala Val Ala Ala Ile Glu Lys Ser Glu Thr Phe Asp

180 185 190

Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser

195 200 205

Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala

210 215 220

Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Ile Lys

225 230 235 240

Asp His Trp Pro Ala Ala Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Pro

245 250 255

Gly Leu Thr Pro Pro His Gly Gly Ile Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala

260 265 270

Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Ser Thr Ile Pro Pro Pro Ala Ser Thr

275 280 285

Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg

290 295 300

Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Ala Phe His Gln

305 310 315 320

Ala Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly

325 330 335

Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Ala Pro Asn Ile Ala Ser His Ile

340 345 350

Ser Ser Ile Ser Ala Arg Thr Gly Asp Pro Val Thr Asn Asp Tyr Gln

355 360 365

Asn Glu Phe Asp Phe Leu Leu Met Glu Arg Ile His Glu Gln Ile Lys

370 375 380

Lys Gly Glu Leu Ala Leu Phe Tyr Leu Gln Asp Tyr Gln Asn Glu Phe

385 390 395 400

Asp Phe Leu Leu Met Glu Arg Ile His Glu Gln Ile Lys Lys Gly Glu

405 410 415

Leu Ala Leu Phe Tyr Leu Gln Asp Pro Ile His Tyr Asp Lys Ile Thr

420 425 430

Glu Glu Ile Asn Lys Ala Val Asp Glu Ala Val Ala Ala Ile Glu Lys

435 440 445

Ser Glu Thr Phe Asp Asp Pro Ile His Tyr Asp Lys Ile Thr Glu Glu

450 455 460

Ile Asn Lys Ala Val Asp Glu Ala Val Ala Ala Ile Glu Lys Ser Glu

465 470 475 480

Thr Phe Asp Glu Gln Tyr Asn Leu Glu Met Ala Lys Lys Ser Gly Asp

485 490 495

Ile Leu Glu Arg Asp Leu Lys Lys Glu Glu Ala Arg Val Lys Lys Ile

500 505 510

Glu Val Glu Gln Tyr Asn Leu Glu Met Ala Lys Lys Ser Gly Asp Ile

515 520 525

Leu Glu Arg Asp Leu Lys Lys Glu Glu Ala Arg Val Lys Lys Ile Glu

530 535 540

Val

545

<210> 33

<211> 545

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> слитый белок

<400> 33

Tyr Asn Tyr Glu Phe Ala Leu Glu Ser Ile Lys Leu Leu Ile Lys Lys

1 5 10 15

Leu Asp Glu Leu Ala Lys Lys Val Lys Ala Val Asn Pro Asp Glu Tyr

20 25 30

Tyr Tyr Asn Tyr Glu Phe Ala Leu Glu Ser Ile Lys Leu Leu Ile Lys

35 40 45

Lys Leu Asp Glu Leu Ala Lys Lys Val Lys Ala Val Asn Pro Asp Glu

50 55 60

Tyr Tyr Tyr Asn Tyr Glu Phe Ala Leu Glu Ser Ile Lys Leu Leu Ile

65 70 75 80

Lys Lys Leu Asp Glu Leu Ala Lys Lys Val Lys Ala Val Asn Pro Asp

85 90 95

Glu Tyr Tyr Tyr Asn Tyr Glu Phe Ala Leu Glu Ser Ile Lys Leu Leu

100 105 110

Ile Lys Lys Leu Asp Glu Leu Ala Lys Lys Val Lys Ala Val Asn Pro

115 120 125

Asp Glu Tyr Tyr Asp Tyr Gln Asn Glu Phe Asp Phe Leu Leu Met Glu

130 135 140

Arg Ile His Glu Gln Ile Lys Lys Gly Glu Leu Ala Leu Phe Tyr Leu

145 150 155 160

Gln Asp Tyr Gln Asn Glu Phe Asp Phe Leu Leu Met Glu Arg Ile His

165 170 175

Glu Gln Ile Lys Lys Gly Glu Leu Ala Leu Phe Tyr Leu Gln Gly Gly

180 185 190

Trp Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro

195 200 205

Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly

210 215 220

Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Ile Lys Asp His

225 230 235 240

Trp Pro Ala Ala Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Pro Gly Leu

245 250 255

Thr Pro Pro His Gly Gly Ile Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly

260 265 270

Ile Leu Thr Thr Val Ser Thr Ile Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg

275 280 285

Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp Ser

290 295 300

His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Ala Phe His Gln Ala Leu

305 310 315 320

Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser

325 330 335

Ser Gly Thr Val Asn Pro Ala Pro Asn Ile Ala Ser His Ile Ser Ser

340 345 350

Ile Ser Ala Arg Thr Gly Asp Pro Val Thr Asn Asp Pro Ile His Tyr

355 360 365

Asp Lys Ile Thr Glu Glu Ile Asn Lys Ala Val Asp Glu Ala Val Ala

370 375 380

Ala Ile Glu Lys Ser Glu Thr Phe Asp Asp Pro Ile His Tyr Asp Lys

385 390 395 400

Ile Thr Glu Glu Ile Asn Lys Ala Val Asp Glu Ala Val Ala Ala Ile

405 410 415

Glu Lys Ser Glu Thr Phe Asp Asp Pro Ile His Tyr Asp Lys Ile Thr

420 425 430

Glu Glu Ile Asn Lys Ala Val Asp Glu Ala Val Ala Ala Ile Glu Lys

435 440 445

Ser Glu Thr Phe Asp Asp Pro Ile His Tyr Asp Lys Ile Thr Glu Glu

450 455 460

Ile Asn Lys Ala Val Asp Glu Ala Val Ala Ala Ile Glu Lys Ser Glu

465 470 475 480

Thr Phe Asp Glu Gln Tyr Asn Leu Glu Met Ala Lys Lys Ser Gly Asp

485 490 495

Ile Leu Glu Arg Asp Leu Lys Lys Glu Glu Ala Arg Val Lys Lys Ile

500 505 510

Glu Val Glu Gln Tyr Asn Leu Glu Met Ala Lys Lys Ser Gly Asp Ile

515 520 525

Leu Glu Arg Asp Leu Lys Lys Glu Glu Ala Arg Val Lys Lys Ile Glu

530 535 540

Val

545

<210> 34

<211> 222

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> слитый белок

<400> 34

Thr Asn Ala Cys Ser Ile Asn Gly Asn Ala Pro Ala Glu Ile Asp Leu

1 5 10 15

Arg Gln Met Arg Thr Val Thr Pro Ile Arg Met Gln Gly Gly Cys Gly

20 25 30

Ser Cys Trp Ala Phe Ser Gly Val Ala Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu

35 40 45

Ala Tyr Arg Asn Gln Ser Leu Asp Leu Ala Glu Gln Glu Leu Val Asp

50 55 60

Cys Ala Ser Gln His Gly Cys His Gly Asp Thr Ile Pro Arg Gly Ile

65 70 75 80

Glu Tyr Ile Gln His Asn Gly Val Val Gln Glu Ser Tyr Tyr Arg Tyr

85 90 95

Val Ala Arg Glu Gln Ser Cys Arg Arg Pro Asn Ala Gln Arg Phe Gly

100 105 110

Ile Ser Asn Tyr Cys Gln Ile Tyr Pro Pro Asn Val Asn Lys Ile Arg

115 120 125

Glu Ala Leu Ala Gln Thr His Ser Ala Ile Ala Val Ile Ile Gly Ile

130 135 140

Lys Asp Leu Asp Ala Phe Arg His Tyr Asp Gly Arg Thr Ile Ile Gln

145 150 155 160

Arg Asp Asn Gly Tyr Gln Pro Asn Tyr His Ala Val Asn Ile Val Gly

165 170 175

Tyr Ser Asn Ala Gln Gly Val Asp Tyr Trp Ile Val Arg Asn Ser Trp

180 185 190

Asp Thr Asn Trp Gly Asp Asn Gly Tyr Gly Tyr Phe Ala Ala Asn Ile

195 200 205

Asp Leu Met Met Ile Glu Glu Tyr Pro Tyr Val Val Ile Leu

210 215 220

<210> 35

<211> 131

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> слитый белок

<400> 35

Asp Gln Val Asp Val Lys Asp Cys Ala Asn His Glu Ile Lys Lys Val

1 5 10 15

Leu Val Pro Gly Cys His Gly Ser Glu Pro Cys Ile Ile His Arg Gly

20 25 30

Lys Pro Phe Gln Leu Glu Ala Val Phe Glu Ala Asn Gln Asn Ser Lys

35 40 45

Thr Ala Lys Ile Glu Ile Lys Ala Ser Ile Glu Gly Leu Glu Val Asp

50 55 60

Val Pro Gly Ile Asp Pro Asn Ala Cys His Tyr Met Lys Cys Pro Leu

65 70 75 80

Val Lys Gly Gln Gln Tyr Asp Ile Lys Tyr Thr Trp Ile Val Pro Lys

85 90 95

Ile Ala Pro Lys Ser Glu Asn Val Val Val Thr Val Lys Val Met Glu

100 105 110

Thr Gly Asp Asn Gly Val Leu Ala Cys Ala Ile Ala Thr His Ala Lys

115 120 125

Ile Arg Asp

130

<210> 36

<211> 617

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> слитый белок

<400> 36

Val Arg Asn Ser Trp Asp Thr Thr Trp Gly Asp Ser Gly Tyr Gly Tyr

1 5 10 15

Phe Gln Ala Gly Asn Asn Leu Met Met Ile Glu Gln Tyr Pro Tyr Val

20 25 30

Val Ile Met Gln Asn Gly Val Val Glu Glu Arg Ser Tyr Pro Tyr Val

35 40 45

Ala Arg Glu Gln Gln Ser Arg Arg Pro Asn Ser Gln His Tyr Gly Ile

50 55 60

Ser Asn His Gly Ser Asp Pro Ser Ile Ile His Arg Gly Lys Pro Phe

65 70 75 80

Asn Leu Glu Ala Ile Phe Asp Ala Asn Gln Asn Thr Lys Thr Ala Lys

85 90 95

His Gly Ser Asp Pro Ser Ile Ile His Arg Gly Lys Pro Phe Asn Leu

100 105 110

Glu Ala Ile Phe Asp Ala Asn Gln Asn Thr Lys Thr Ala Lys Val Arg

115 120 125

Asn Ser Trp Asp Thr Thr Trp Gly Asp Ser Gly Tyr Gly Tyr Phe Gln

130 135 140

Ala Gly Asn Asn Leu Met Met Ile Glu Gln Tyr Pro Tyr Val Val Ile

145 150 155 160

Met Gln Asn Gly Val Val Glu Glu Arg Ser Tyr Pro Tyr Val Ala Arg

165 170 175

Glu Gln Gln Ser Arg Arg Pro Asn Ser Gln His Tyr Gly Ile Ser Asn

180 185 190

Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser

195 200 205

Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala

210 215 220

Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Ile Lys

225 230 235 240

Asp His Trp Pro Ala Ala Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Pro

245 250 255

Gly Leu Thr Pro Pro His Gly Gly Ile Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala

260 265 270

Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Ser Thr Ile Pro Pro Pro Ala Ser Thr

275 280 285

Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg

290 295 300

Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Ala Phe His Gln

305 310 315 320

Ala Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly

325 330 335

Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Ala Pro Asn Ile Ala Ser His Ile

340 345 350

Ser Ser Ile Ser Ala Arg Thr Gly Asp Pro Val Thr Asn Glu Val Asp

355 360 365

Val Pro Gly Ile Asp Thr Asn Ala Ser His Tyr Ile Lys Ser Pro Leu

370 375 380

Val Lys Gly Gln Gln Tyr Asp Ala Lys Tyr Thr Trp Asn Val Pro Lys

385 390 395 400

Ile Ala Pro Lys Ser Glu Asn Glu Val Asp Val Pro Gly Ile Asp Thr

405 410 415

Asn Ala Ser His Tyr Ile Lys Ser Pro Leu Val Lys Gly Gln Gln Tyr

420 425 430

Asp Ala Lys Tyr Thr Trp Asn Val Pro Lys Ile Ala Pro Lys Ser Glu

435 440 445

Asn Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala Tyr Arg Asn Thr Ser Leu Asp

450 455 460

Leu Ser Glu Gln Glu Leu Val Asp Ser Ala Ser Gln His Gly Ser His

465 470 475 480

Gly Asp Thr Ile Pro Arg Gly Ile Glu Tyr Ile Gln Thr Ser Ala Ser

485 490 495

Arg Ile Asn Ser Val Asn Val Pro Ser Glu Leu Asp Leu Arg Ser Leu

500 505 510

Arg Thr Val Thr Pro Ile Arg Met Gln Gly Gly Ser Gly Ser Ser Trp

515 520 525

Ala Phe Ser Gly Val Ala Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala Tyr Arg

530 535 540

Asn Thr Ser Leu Asp Leu Ser Glu Gln Glu Leu Val Asp Ser Ala Ser

545 550 555 560

Gln His Gly Ser His Gly Asp Thr Ile Pro Arg Gly Ile Glu Tyr Ile

565 570 575

Gln Thr Ser Ala Ser Arg Ile Asn Ser Val Asn Val Pro Ser Glu Leu

580 585 590

Asp Leu Arg Ser Leu Arg Thr Val Thr Pro Ile Arg Met Gln Gly Gly

595 600 605

Ser Gly Ser Ser Trp Ala Phe Ser Gly

610 615

<210> 37

<211> 563

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> слитый белок

<400> 37

Tyr Asn Phe Glu Thr Ala Val Ser Thr Ile Glu Ile Leu Val Lys Asp

1 5 10 15

Leu Ala Glu Leu Ala Lys Lys Val Lys Ala Val Lys Ser Asp Asp Tyr

20 25 30

Asn Phe Glu Thr Ala Val Ser Thr Ile Glu Ile Leu Val Lys Asp Leu

35 40 45

Ala Glu Leu Ala Lys Lys Val Lys Ala Val Lys Ser Asp Asp Tyr Asn

50 55 60

Phe Glu Thr Ala Val Ser Thr Ile Glu Ile Leu Val Lys Asp Leu Ala

65 70 75 80

Glu Leu Ala Lys Lys Val Lys Ala Val Lys Ser Asp Asp Gly Tyr Phe

85 90 95

Ala Asp Pro Lys Asp Pro Ser Lys Phe Tyr Ile Ser Ser Asn Trp Glu

100 105 110

Ala Ile His Lys Ser Ser Pro Gly Asn Thr Arg Trp Asn Glu Lys Glu

115 120 125

Leu Thr Ser Thr Gly Tyr Phe Ala Asp Pro Lys Asp Pro Ser Lys Phe

130 135 140

Tyr Ile Ser Ser Asn Trp Glu Ala Ile His Lys Ser Ser Pro Gly Asn

145 150 155 160

Thr Arg Trp Asn Glu Lys Glu Leu Thr Ser Thr Gly Tyr Phe Ala Asp

165 170 175

Pro Lys Asp Pro Ser Lys Phe Tyr Ile Ser Ser Asn Trp Glu Ala Ile

180 185 190

His Lys Ser Ser Pro Gly Asn Thr Arg Trp Asn Glu Lys Glu Leu Thr

195 200 205

Ser Thr Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn

210 215 220

Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp

225 230 235 240

Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro

245 250 255

Ile Lys Asp His Trp Pro Ala Ala Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe

260 265 270

Gly Pro Gly Leu Thr Pro Pro His Gly Gly Ile Leu Gly Trp Ser Pro

275 280 285

Gln Ala Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Ser Thr Ile Pro Pro Pro Ala

290 295 300

Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro

305 310 315 320

Leu Arg Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Ala Phe

325 330 335

His Gln Ala Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala

340 345 350

Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Ala Pro Asn Ile Ala Ser

355 360 365

His Ile Ser Ser Ile Ser Ala Arg Thr Gly Asp Pro Val Thr Asn Asp

370 375 380

Tyr Gln Asn Glu Phe Asp Phe Leu Leu Met Gln Arg Ile His Glu Gln

385 390 395 400

Met Arg Lys Gly Glu Glu Ala Leu Leu His Leu Gln Asp Tyr Gln Asn

405 410 415

Glu Phe Asp Phe Leu Leu Met Gln Arg Ile His Glu Gln Met Arg Lys

420 425 430

Gly Glu Glu Ala Leu Leu His Leu Gln Asp Pro Ile His Tyr Asp Lys

435 440 445

Ile Thr Glu Glu Ile Asn Lys Ala Ile Asp Asp Ala Ile Ala Ala Ile

450 455 460

Glu Gln Ser Glu Thr Ile Asp Asp Pro Ile His Tyr Asp Lys Ile Thr

465 470 475 480

Glu Glu Ile Asn Lys Ala Ile Asp Asp Ala Ile Ala Ala Ile Glu Gln

485 490 495

Ser Glu Thr Ile Asp Glu Arg Tyr Asn Val Glu Ile Ala Leu Lys Ser

500 505 510

Asn Glu Ile Leu Glu Arg Asp Leu Lys Lys Glu Glu Gln Arg Val Lys

515 520 525

Lys Ile Glu Val Glu Arg Tyr Asn Val Glu Ile Ala Leu Lys Ser Asn

530 535 540

Glu Ile Leu Glu Arg Asp Leu Lys Lys Glu Glu Gln Arg Val Lys Lys

545 550 555 560

Ile Glu Val

<210> 38

<211> 42

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 38

Thr Ser Ala Cys Arg Ile Asn Ser Val Asn Val Pro Ser Glu Leu Asp

1 5 10 15

Leu Arg Ser Leu Arg Thr Val Thr Pro Ile Arg Met Gln Gly Gly Cys

20 25 30

Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Gly Val Ala

35 40

<210> 39

<211> 43

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 39

Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala Tyr Arg Asn Thr Ser Leu Asp Leu

1 5 10 15

Ser Glu Gln Glu Leu Val Asp Cys Ala Ser Gln His Gly Cys His Gly

20 25 30

Asp Thr Ile Pro Arg Gly Ile Glu Tyr Ile Gln

35 40

<210> 40

<211> 31

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 40

Gln Asn Gly Val Val Glu Glu Arg Ser Tyr Pro Tyr Val Ala Arg Glu

1 5 10 15

Gln Gln Cys Arg Arg Pro Asn Ser Gln His Tyr Gly Ile Ser Asn

20 25 30

<210> 41

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 41

Val Arg Asn Ser Trp Asp Thr Thr Trp Gly Asp Ser Gly Tyr Gly Tyr

1 5 10 15

Phe Gln Ala Gly Asn Asn Leu Met Met Ile Glu Gln Tyr Pro Tyr Val

20 25 30

Val Ile Met

35

<210> 42

<211> 30

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 42

His Gly Ser Asp Pro Cys Ile Ile His Arg Gly Lys Pro Phe Asn Leu

1 5 10 15

Glu Ala Ile Phe Asp Ala Asn Gln Asn Thr Lys Thr Ala Lys

20 25 30

<210> 43

<211> 42

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 43

Glu Val Asp Val Pro Gly Ile Asp Thr Asn Ala Cys His Tyr Ile Lys

1 5 10 15

Cys Pro Leu Val Lys Gly Gln Gln Tyr Asp Ala Lys Tyr Thr Trp Asn

20 25 30

Val Pro Lys Ile Ala Pro Lys Ser Glu Asn

35 40

<210> 44

<211> 29

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 44

Asp Tyr Gln Asn Glu Phe Asp Phe Leu Leu Met Gln Arg Ile His Glu

1 5 10 15

Gln Met Arg Lys Gly Glu Glu Ala Leu Leu His Leu Gln

20 25

<210> 45

<211> 31

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 45

Glu Arg Tyr Asn Val Glu Ile Ala Leu Lys Ser Asn Glu Ile Leu Glu

1 5 10 15

Arg Asp Leu Lys Lys Glu Glu Gln Arg Val Lys Lys Ile Glu Val

20 25 30

<210> 46

<211> 30

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 46

Asp Pro Ile His Tyr Asp Lys Ile Thr Glu Glu Ile Asn Lys Ala Ile

1 5 10 15

Asp Asp Ala Ile Ala Ala Ile Glu Gln Ser Glu Thr Ile Asp

20 25 30

<210> 47

<211> 31

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 47

Tyr Asn Phe Glu Thr Ala Val Ser Thr Ile Glu Ile Leu Val Lys Asp

1 5 10 15

Leu Ala Glu Leu Ala Lys Lys Val Lys Ala Val Lys Ser Asp Asp

20 25 30

<210> 48

<211> 39

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 48

Gly Tyr Phe Ala Asp Pro Lys Asp Pro Cys Lys Phe Tyr Ile Cys Ser

1 5 10 15

Asn Trp Glu Ala Ile His Lys Ser Cys Pro Gly Asn Thr Arg Trp Asn

20 25 30

Glu Lys Glu Leu Thr Cys Thr

35

<210> 49

<211> 37

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 49

Arg Glu Gln Ser Cys Arg Arg Pro Asn Ala Gln Arg Phe Gly Ile Ser

1 5 10 15

Asn Tyr Cys Gln Ile Tyr Pro Pro Asn Val Asn Lys Ile Arg Glu Ala

20 25 30

Leu Ala Gln Thr His

35

<210> 50

<211> 31

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 50

Lys Asp Leu Asp Ala Phe Arg His Tyr Asp Gly Arg Thr Ile Ile Gln

1 5 10 15

Arg Asp Asn Gly Tyr Gln Pro Asn Tyr His Ala Val Asn Ile Val

20 25 30

<210> 51

<211> 33

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 51

Gly Arg Thr Ile Ile Gln Arg Asp Asn Gly Tyr Gln Pro Asn Tyr His

1 5 10 15

Ala Val Asn Ile Val Gly Tyr Ser Asn Ala Gln Gly Val Asp Tyr Trp

20 25 30

Ile

<210> 52

<211> 34

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 52

Val Gly Tyr Ser Asn Ala Gln Gly Val Asp Tyr Trp Ile Val Arg Asn

1 5 10 15

Ser Trp Asp Thr Asn Trp Gly Asp Asn Gly Tyr Gly Tyr Phe Ala Ala

20 25 30

Asn Ile

<210> 53

<211> 33

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 53

Asp Gln Val Asp Val Lys Asp Cys Ala Asn His Glu Ile Lys Lys Val

1 5 10 15

Leu Val Pro Gly Cys His Gly Ser Glu Pro Cys Ile Ile His Arg Gly

20 25 30

Lys

<210> 54

<211> 32

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 54

Glu Ala Asn Gln Asn Ser Lys Thr Ala Lys Ile Glu Ile Lys Ala Ser

1 5 10 15

Ile Glu Gly Leu Glu Val Asp Val Pro Gly Ile Asp Pro Asn Ala Cys

20 25 30

<210> 55

<211> 32

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 55

Ala Pro Lys Ser Glu Asn Val Val Val Thr Val Lys Val Met Gly Asp

1 5 10 15

Asn Gly Val Leu Ala Cys Ala Ile Ala Thr His Ala Lys Ile Arg Asp

20 25 30

<210> 56

<211> 34

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 56

Glu Asp Lys Lys His Asp Tyr Gln Asn Glu Phe Asp Phe Leu Leu Met

1 5 10 15

Glu Arg Ile His Glu Gln Ile Lys Lys Gly Glu Leu Ala Leu Phe Tyr

20 25 30

Leu Gln

<210> 57

<211> 36

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 57

Lys Lys Gly Glu Leu Ala Leu Phe Tyr Leu Gln Glu Gln Ile Asn His

1 5 10 15

Phe Glu Glu Lys Pro Thr Lys Glu Met Lys Asp Lys Ile Val Ala Glu

20 25 30

Met Asp Thr Ile

35

<210> 58

<211> 31

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 58

Asp Gly Val Arg Gly Val Leu Asp Arg Leu Met Gln Arg Lys Asp Leu

1 5 10 15

Asp Ile Phe Glu Gln Tyr Asn Leu Glu Met Ala Lys Lys Ser Gly

20 25 30

<210> 59

<211> 36

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 59

Asp Leu Asp Ile Phe Glu Gln Tyr Asn Leu Glu Met Ala Lys Lys Ser

1 5 10 15

Gly Asp Ile Leu Glu Arg Asp Leu Lys Lys Glu Glu Ala Arg Val Lys

20 25 30

Lys Ile Glu Val

35

<210> 60

<211> 29

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 60

Glu Asp Lys Lys His Asp Tyr Gln Asn Glu Phe Asp Phe Leu Leu Met

1 5 10 15

Glu Arg Ile His Glu Gln Ile Lys Lys Gly Glu Leu Ala

20 25

<210> 61

<211> 31

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 61

Asp Leu Asp Ile Phe Glu Gln Tyr Asn Leu Glu Met Ala Lys Lys Ser

1 5 10 15

Gly Asp Ile Leu Glu Arg Asp Leu Lys Lys Glu Glu Ala Arg Val

20 25 30

<210> 62

<211> 34

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 62

Phe Ile Val Gly Asp Lys Lys Glu Asp Glu Trp Arg Met Ala Phe Asp

1 5 10 15

Arg Leu Met Met Glu Glu Leu Glu Thr Lys Ile Asp Gln Val Glu Lys

20 25 30

Gly Leu

<210> 63

<211> 37

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 63

Leu His Leu Ser Glu Gln Tyr Lys Glu Leu Glu Lys Thr Lys Ser Lys

1 5 10 15

Glu Leu Lys Glu Gln Ile Leu Arg Glu Leu Thr Ile Gly Glu Asn Phe

20 25 30

Met Lys Gly Ala Leu

35

<210> 64

<211> 29

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 64

Met Lys Gly Ala Leu Lys Phe Phe Glu Met Glu Ala Lys Arg Thr Asp

1 5 10 15

Leu Asn Met Phe Glu Arg Tyr Asn Tyr Glu Phe Ala Leu

20 25

<210> 65

<211> 31

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 65

Val Ala Ala Ile Glu Lys Ser Glu Thr Phe Asp Pro Met Lys Val Pro

1 5 10 15

Asp His Ser Asp Lys Phe Glu Arg His Ile Gly Ile Ile Asp Leu

20 25 30

<210> 66

<211> 31

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 66

Leu Lys Gly Glu Leu Asp Met Arg Asn Ile Gln Val Arg Gly Leu Lys

1 5 10 15

Gln Met Lys Arg Val Gly Asp Ala Asn Val Lys Ser Glu Asp Gly

20 25 30

<210> 67

<211> 36

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 67

Val His Asp Asp Val Val Ser Met Glu Tyr Asp Leu Ala Tyr Lys Leu

1 5 10 15

Gly Asp Leu His Pro Asn Thr His Val Ile Ser Asp Ile Gln Asp Phe

20 25 30

Val Val Glu Leu

35

<210> 68

<211> 26

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 68

Val Glu Leu Ser Leu Glu Val Ser Glu Glu Gly Asn Met Thr Leu Thr

1 5 10 15

Ser Phe Glu Val Arg Gln Phe Ala Asn Val

20 25

<210> 69

<211> 28

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 69

Val Asn His Ile Gly Gly Leu Ser Ile Leu Asp Pro Ile Phe Ala Val

1 5 10 15

Leu Ser Asp Val Leu Thr Ala Ile Phe Gln Asp Thr

20 25

<210> 70

<211> 29

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 70

Thr Ala Ile Phe Gln Asp Thr Val Arg Ala Glu Met Thr Lys Val Leu

1 5 10 15

Ala Pro Ala Phe Lys Lys Glu Leu Glu Arg Asn Asn Gln

20 25

<210> 71

<211> 32

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 71

Met Ala Asn Asp Asn Asp Asp Asp Pro Thr Thr Thr Val His Pro Thr

1 5 10 15

Thr Thr Glu Gln Pro Asp Asp Lys Phe Glu Cys Pro Ser Arg Phe Gly

20 25 30

<210> 72

<211> 34

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 72

Pro Thr Thr Thr Glu Gln Pro Asp Asp Lys Phe Glu Cys Pro Ser Arg

1 5 10 15

Phe Gly Tyr Phe Ala Asp Pro Lys Asp Pro His Lys Phe Tyr Ile Cys

20 25 30

Ser Asn

<210> 73

<211> 39

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 73

Gly Tyr Phe Ala Asp Pro Lys Asp Pro His Lys Phe Ala Ile Cys Ser

1 5 10 15

Asn Trp Ala Ala Val His Lys Ala Cys Pro Gly Asn Thr Arg Trp Asn

20 25 30

Ala Ala Ala Ala Thr Cys Thr

35

<210> 74

<211> 39

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 74

Gly Tyr Phe Ala Asp Pro Lys Asp Pro His Ala Phe Tyr Ile Cys Ser

1 5 10 15

Asn Trp Glu Ala Val Ala Ala Asp Cys Pro Gly Asn Thr Arg Trp Asn

20 25 30

Glu Asp Glu Glu Thr Cys Thr

35

<210> 75

<211> 29

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 75

Gly Tyr Phe Ala Asp Pro Lys Asp Pro His Lys Phe Tyr Ile Cys Ser

1 5 10 15

Asn Trp Glu Ala Val His Lys Asp Cys Pro Gly Asn Thr

20 25

<210> 76

<211> 29

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 76

Gly Tyr Phe Ala Asp Pro Lys Asp Pro His Lys Phe Tyr Ile Ser Ser

1 5 10 15

Asn Trp Glu Ala Val His Lys Asp Ser Pro Gly Asn Thr

20 25

<210> 77

<211> 29

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 77

Lys Phe Tyr Ile Cys Ser Asn Trp Glu Ala Val His Lys Asp Cys Pro

1 5 10 15

Gly Asn Thr Arg Trp Asn Glu Asp Glu Glu Thr Cys Thr

20 25

<210> 78

<211> 29

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 78

Lys Phe Tyr Ile Ser Ser Asn Trp Glu Ala Val His Lys Asp Ser Pro

1 5 10 15

Gly Asn Thr Arg Trp Asn Glu Asp Glu Glu Thr Ser Thr

20 25

<210> 79

<211> 24

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 79

Ser Asn Trp Glu Ala Val His Lys Asp Cys Pro Gly Asn Thr Arg Trp

1 5 10 15

Asn Glu Asp Glu Glu Thr Cys Thr

20

<210> 80

<211> 33

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 80

Gly Tyr Phe Ala Asp Pro Lys Asp Pro His Lys Phe Tyr Ile Cys Ser

1 5 10 15

Asn Trp Glu Ala Val His Lys Asp Cys Pro Gly Asn Thr Arg Trp Asn

20 25 30

Glu

<210> 81

<211> 37

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент аллергена

<400> 81

Gly Tyr Phe Ala Asp Pro Lys Asp Pro His Lys Phe Tyr Ile Cys Ser

1 5 10 15

Asn Trp Glu Ala Val His Lys Asp Cys Pro Gly Asn Thr Arg Trp Asn

20 25 30

Glu Asp Glu Glu Thr

35

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению слитых белков на основе аллергенов клещей домашней пыли, и может быть использовано в медицине в иммунотерапии пациентов, страдающих аллергией на клещей домашней пыли. Предложен слитый белок формулы (I): X₁-Y-X₂ (I), где X₁ и X₂ каждый содержит четыре-восемь фрагментов аллергенов, слитых друг с другом, где указанные фрагменты аллергенов получены по меньшей мере из двух аллергенов клещей Dermatophagoides pteronyssinus, выбранных из группы, состоящей из Der p 1, Der p 2, Der p 5, Der p 7, Der p 21 и Der p 23, и где Y представляет собой поверхностный полипептид вируса семейства гепаднавирусов или фрагмент поверхностного полипептида, использующийся в качестве белка-носителя. Изобретение обеспечивает индукцию образования in vivo антител, направленных по меньшей мере на два аллергена клещей рода Dermatophagoides и ингибирующих взаимодействие аллергенспецифических IgE с их соответствующим аллергеном, что позволяет уменьшить или даже предупредить аллергические реакции, приводящие к необходимости лечения аллергии, вызванной аллергенами клещей рода Dermatophagoides. 6 н. и 6 з.п. ф-лы, 9 ил., 3 табл., 6 пр.

1. Слитый белок для лечения или профилактики аллергии, вызванной аллергеном клеща домашней пыли, имеющий формулу (I):

X₁-Y-X₂ (I),

где X₁ и X₂ каждый содержит четыре-восемь фрагментов аллергенов, слитых друг с другом, где указанные фрагменты аллергенов получены по меньшей мере из двух аллергенов клещей Dermatophagoides pteronyssinus , выбранных из группы, состоящей из Der p 1, Der p 2, Der p 5, Der p 7, Der p 21 и Der p 23, и где Y представляет собой белок-носитель, где белок-носитель представляет собой поверхностный полипептид вируса семейства гепаднавирусов или фрагмент поверхностного полипептида; причем слитый белок содержит по меньшей мере один полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No. 18, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. ID No. 23, SEQ ID No. 24 и/или SEQ ID No. 25, причем

а) фрагмент аллергена Der p 1 состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из: TNACSINGNAPAEIDLRQMRTVTPIRMQGGCGSCWAFSGVA (SEQ ID NO: 1), ATESAYLAYRNQSLDLAEQELVDCASQHGCHGDTIPRGIEYIQ (SEQ ID NO: 2), HNGVVQESYYRYVAREQSCRRPNAQRFGISN (SEQ ID NO: 3), VRNSWDTNWGDNGYGYFAANIDLMMIEEYPYVVIL (SEQ ID NO: 4), TNASSINGNAPAEIDLRQMRTVTPIRMQGGSGSSWAFSGVA (SEQ ID NO: 5), ATESAYLAYRNQSLDLAEQELVDSASQHGSHGDTIPRGIEYIQ (SEQ ID NO: 6) и HNGVVQESYYRYVAREQSSRRPNAQRFGISN (SEQ ID NO: 7), и/или

b) фрагмент аллергена Der p 2 состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из: CHGSEPCIIHRGKPFQLEAVFEANQNSKTAK (SEQ ID NO: 8), EVDVPGIDPNACHYMKCPLVKGQQYDIKYTWIVPKIAPKSEN (SEQ ID NO: 9), HGSEPSIIHRGKPFQLEAVFEANQNSKTAK (SEQ ID NO: 10) и EVDVPGIDPNASHYMKSPLVKGQQYDIKYTWIVPKIAPKSEN (SEQ ID NO: 11),

c) фрагмент аллергена Der p 5 состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из: DYQNEFDFLLMERIHEQIKKGELALFYLQ (SEQ ID NO: 12) и EQYNLEMAKKSGDILERDLKKEEARVKKIEV (SEQ ID NO: 13), и/или

d) фрагмент аллергена Der p 7 состоит из аминокислотной последовательности DPIHYDKITEEINKAVDEAVAAIEKSETFD (SEQ ID NO: 14), и/или

e) фрагмент аллергена Der p 21 состоит из аминокислотной последовательности YNYEFALESIKLLIKKLDELAKKVKAVNPDEYY (SEQ ID No. 15), и/или

f) фрагмент аллергена Der p 23 состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из GYFADPKDPHKFYICSNWEAVHKDCPGNTRWNEDEETCT (SEQ ID NO: 16) и GYFADPKDPHKFYISSNWEAVHKDSPGNTRWNEDEETST (SEQ ID NO: 17);

g) фрагмент аллергена Der f 1, состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из TSACRINSVNVPSELDLRSLRTVTPIRMQGGCGSCWAFSGVA (SEQ ID NO: 38), ATESAYLAYRNTSLDLSEQELVDCASQHGCHGDTIPRGIEYIQ (SEQ ID NO: 39), QNGVVEERSYPYVAREQQCRRPNSQHYGISN (SEQ ID NO: 40) и VRNSWDTTWGDSGYGYFQAGNNLMMIEQYPYVVIM (SEQ ID NO: 41), и/или

h) фрагмент аллергена Der f 2, состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из HGSDPCIIHRGKPFNLEAIFDANQNTKTAK (SEQ ID NO: 42) и EVDVPGIDTNACHYIKCPLVKGQQYDAKYTWNVPKIAPKSEN (SEQ ID NO: 43), и/ или

i) фрагмент аллергена Der f 5, состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из DYQNEFDFLLMQRIHEQMRKGEEALLHLQ (SEQ ID NO: 44) и ERYNVEIALKSNEILERDLKKEEQRVKKIEV (SEQ ID NO: 45), и/или

j) фрагмент аллергена Der f 7, состоящий из аминокислотной последовательности DPIHYDKITEEINKAIDDAIAAIEQSETID (SEQ ID NO: 46), и/или

k) фрагмент аллергена Der f 21, состоящий из аминокислотной последовательности YNFETAVSTIEILVKDLAELAKKVKAVKSDD (SEQ ID NO: 47), и/или

l) фрагмент аллергена Der f 23, состоящий из аминокислотной последовательности GYFADPKDPCKFYICSNWEAIHKSCPGNTRWNEKELTCT (SEQ ID NO: 48).

2. Слитый белок по п.1, где белок-носитель представляет собой PreS.

3. Слитый белок по любому из пп.1-2, где слитый белок содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27 или аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28.

4. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок по любому из пп.1-3.

5. Вектор для лечения или профилактики аллергии, вызванной аллергеном клеща домашней пыли, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.4.

6. Клетка-хозяин для лечения или профилактики аллергии, вызванной аллергеном клеща домашней пыли, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п.4 или вектор по п.5.

7. Фармацевтический препарат для лечения или профилактики аллергии, вызванной аллергеном клеща домашней пыли, содержащий эффективное количество по меньшей мере одного слитого белка по любому из пп.1-3.

8. Фармацевтический препарат по п.7, где, когда в препарате содержатся два слитых белка, два слитых белка имеют массовое соотношение от 1:10 до 10:1.

9. Фармацевтический препарат по п.7, где, когда в препарате содержатся два слитых белка, два слитых белка имеют массовое соотношение от 1:5 до 5:1.

10. Фармацевтический препарат по п.7, где, когда в препарате содержатся два слитых белка, два слитых белка имеют массовое соотношение от 2:1 до 1:2.

11. Фармацевтический препарат по любому из пп.7-10, где указанный препарат содержит слитый белок, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, и/или слитый белок, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28.

12. Применение слитого белка по любому из пп.1-3 для получения фармацевтического препарата для лечения или профилактики аллергии, вызванной аллергеном клеща домашней пыли.