Настоящее изобретение касается способа выделения нерастворимых искомых белков из суспензии целых или разрушенных клеток хозяев. Изобретение также касается нерастворимых искомых белков, получаемых данным способом.
Уровень техники
Системы для выделения искомых белков из суспензии клеток хозяев, например, микробных клеток, и/или отделения от других примесей были разработаны ранее и поэтому представляют предшествующий уровень знаний.
В качестве примера можно привести стандартные методики очистки белков для очистки и выделения растворимых искомых белков с применением таких хроматографических методов, как ионообменная или эксклюзионная хроматография (Guide to Protein Purification, Academic Press, Vol.182, 1990). Другие методы, которые применяются на сегодняшний день, - это фазовое разделение жидкость-жидкость и ультрафильтрация, среди прочего (Guide to Protein Purification, Academic Press, Vol.182, 1990). С вариациями, эти фундаментальные способы очистки могут быть модифицированы для очистки большинства белков, необходимых для научных или промышленных целей, однако, в общем, они очень дорогостоящие, сложные и требуют много времени.
Специальный способ обработки белков шелка, в частности, был описан в Huemmerich et al., Biochemistry 2004, 43, 13604-13612. В этой публикации для очистки рекомбинантных белков шелка пауков (паутины) для технического применения успешно применялась методика, в которой использовалась тепловая денатурация белков клеток хозяев с последующей стадией осаждения искомого белка, но отсутствовали хроматографические методы очистки. Поскольку белки шелка имеют тенденцию к аутоагрегации, этот способ страдает от потери существенной доли искомых белков, которые осаждаются и поэтому недоступны для способа очистки растворимого белка.
Хотя описанные способы хорошо работают для большинства растворимых белков, очевидно, что они обладают большими недостатками при работе со склонными к агрегации белками. Такие склонные к агрегации белки выпадают в осадок из раствора через определенный период времени, образуя стабильные, часто нерастворимые белковые агрегаты. Эти белковые агрегаты больше невозможно выделить описанными способами очистки фракции растворимых белков. Поэтому для того, чтобы избежать нежелательного осаждения, критическими параметрами обычно являются время ферментации и/или время очистки. Известно, что данные белковые агрегаты можно растворить при помощи некоторых детергентов, однако также известно, что такое растворение отрицательно сказывается на выходе белка, а также на качестве белка. Кроме того, полное растворение белковых агрегатов в течение продолжительного времени почти невозможно.
Таким образом, существует потребность в разработке способа очистки/выделения склонных к агрегации искомых белков и/или уже агрегированных искомых белков, который сосредоточен на отделении фракции склонных к агрегации искомых белков и/или фракции агрегированных искомых белков от фракции, содержащей нерастворимые белки клеток хозяев и другие остатки, без полного растворения этих искомых белков. Такой способ очистки даст возможность выделять нерастворимые искомые белки из суспензии клеток хозяев, например, микробных клеток, и/или других клеточных остатков, с высоким выходом и высокого качества. Такой способ очистки также должен быть экономически эффективным, быстрым, легким и воспроизводимым.
Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что искомые белки нерастворимы и остаются нерастворимыми при определенных условиях, необходимых для растворения всех или почти всех других нерастворимых белков клеток хозяев, обломков клеток хозяев и/или других возможных загрязнений в связи с ферментацией, и именно это позволяет выделить и очистить эти искомые белки всего за несколько стадий очистки без потери значительного количества данных искомых белков вследствие их нежелательного растворения или из-за других перекрестных реакций.
Вне ожидания, очистка нерастворимых искомых белков предпочтительно по меньшей мере на 80% достигается путем отделения нерастворимых искомых белков от растворяющихся нерастворимых частей клеток хозяев в соответствии со способом настоящего изобретения. Даже если некоторые нерастворимые части клеток хозяев и не полностью растворяются, а остаются в суспензии, все-таки можно достичь эффективного разделения, так как удельная плотность этих суспендированных частей клеток хозяев меньше, чем у нерастворимых искомых белков, что способствует эффективному разделению путем центрифугирования, осаждения и/или фильтрации.
Способ настоящего изобретения дает некоторые поразительные преимущества по сравнению с известными методами очистки. Например, способ настоящего изобретения уменьшает количество сложных стадий очистки и поэтому он является быстрым, надежным и легко выполнимым способом очистки. Кроме того, данный способ позволяет очистку/выделение нерастворимых искомых белков с высоким выходом и чистотой. Он позволяет резко сократить затраты по сравнению с традиционными способами. К тому же данный способ является экологически чистым.
Хотя способ настоящего изобретения включает небольшое количество стадий, но до сих пор было совершенно непредвиденно, что некоторые искомые белки являются и остаются нерастворимыми в применяемых условиях. Особенно если учесть то, что применяются такие концентрации оснований (~0,1 М NaOH), которые обычно используются для промывки и очистки биореакторов, а также реакционных сосудов, контактирующих с белками и клетками. Так что было совсем не очевидно, что эти условия также могут применяться для очистки нерастворимых искомых белков в больших масштабах.
Сущность изобретения
В первом аспекте настоящим изобретением предусмотрен способ выделения нерастворимых искомых белков из суспензии целых или разрушенных клеток хозяев, включающий стадии:
a) получение суспензии целых или разрушенных клеток хозяев, содержащих нерастворимый искомый белок и нерастворимые части клеток хозяев,
b) добавление водного раствора по меньшей мере одного основания к данной суспензии в количестве, достаточном для разрушения данных клеток хозяев и/или солюбилизации нерастворимых частей клеток хозяев, и
c) отделение нерастворимого искомого белка от солюбилизированных нерастворимых частей клеток хозяев,
причем на стадии b) искомый белок остается нерастворимым, а по меньшей мере 80% нерастворимых частей клеток хозяев подвергаются солюбилизации.
Во втором аспекте настоящее изобретение касается нерастворимых искомых белков, получаемых способом из первого аспекта.
В этом разделе не обязательно описаны все особенности изобретения.
Раскрытие сущности изобретения
Перед тем, как перейти к подробному описанию настоящего изобретения, следует иметь в виду, что оно не ограничивается конкретной методологией, протоколами и реагентами, описанными здесь, так как они могут различаться. Также следует иметь в виду, что применяемая здесь терминология служит только для описания конкретных воплощений и не предназначена для ограничения объема настоящего изобретения, которые ограничиваются только прилагаемой формулой изобретения. Если не указано иначе, все применяемые здесь технические и научные термины имеют те же значения которые обычно понимаются рядовыми специалистами в данной области.
Предпочтительно применяемые здесь термины определяются так, как описано в "А multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger H.G.W, Nagel B. and Kolbl H., eds. (1995) Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland).
По всему тексту настоящего описания цитируются некоторые документы. Каждый из цитированных здесь документов (включая все патенты, патентные заявки, научные публикации, спецификации, инструкции производителей, номера доступа поданных в GenBank последовательностей и т.д.), будь то выше или ниже, включены сюда путем ссылки во всей полноте. При этом ничто не должно истолковываться как допущение того, будто изобретение не может предвосхищать такие раскрытия в силу более раннего создания изобретения.
В дальнейшем будут описаны элементы настоящего изобретения. Эти элементы перечислены со специфическими воплощениями, однако следует понимать, что их можно комбинировать любым образом и в любом количестве для создания дополнительных воплощений. Описанные по-разному примеры и предпочтительные воплощения не должны истолковываться как ограничение настоящего изобретения только описанными в явном виде воплощениями. Следует иметь в виду, что данное описание поддерживает и охватывает воплощения, в которых подробно описанные воплощения комбинируются с любым числом раскрытых и/или предпочтительных элементов. Более того, любые перестановки и комбинации всех описанных в данной заявке элементов следует считать раскрытыми путем описания настоящей заявки, если контекст не указывает иначе.
По всему описанию и следующей за ним формуле изобретения, если из контекста не следует иное, слово "включать" и его варианты типа "включает" и "включающий" следует понимать как включение указанного точного числа или стадии, либо группы чисел или стадий, но не исключение каких-либо других чисел или стадий, либо группы чисел или стадий.
В настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают значения множественного числа, если из контекста четко не следует иное.
Принимается, что остатки у двух или нескольких полипептидов "соответствуют" друг другу, если они занимают аналогичное положение в структуре полипептидов. При этом хорошо известно, что аналогичные положения в двух или нескольких полипептидах можно определить путем выравнивания последовательностей полипептидов на основе аминокислотной последовательности или структурного сходства. Средства для такого выравнивания хорошо известны специалистам, к примеру, они могут быть получены через Интернет, например, ClustalW (www.ebi.ac.uk/clustalw) или Align (http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html) со стандартными настройками, для Align предпочтительно EMBOSS::needle, Matrix: Blosum62, Gap Open 10.0, Gap Extend 0.5.
В первом аспекте изобретением предусмотрен способ выделения нерастворимых искомых белков из суспензии целых или разрушенных клеток хозяев, включающий стадии:
a) получение суспензии целых или разрушенных клеток хозяев, содержащих нерастворимый искомый белок и нерастворимые части клеток хозяев,
b) добавление водного раствора по меньшей мере одного основания к данной суспензии в количестве, достаточном для разрушения данных клеток хозяев и/или солюбилизации нерастворимых частей клеток хозяев, и
c) отделение нерастворимого искомого белка от солюбилизированных нерастворимых частей клеток хозяев,
причем на стадии b) искомый белок остается нерастворимым, а по меньшей мере 80%, предпочтительно 85%, более предпочтительно 90% и наиболее предпочтительно 95% или даже 100% нерастворимых частей клеток хозяев подвергаются солюбилизации.
Например, изобретением предусмотрен способ выделения нерастворимых искомых белков из суспензии разрушенных клеток хозяев, включающий стадии:
a) получение суспензии разрушенных клеток хозяев, содержащих нерастворимый искомый белок и нерастворимые части клеток хозяев,
b) добавление водного раствора по меньшей мере одного основания к данной суспензии в количестве, достаточном для солюбилизации данных нерастворимых частей клеток хозяев, и
c) отделение нерастворимого искомого белка от солюбилизированных нерастворимых частей клеток хозяев,
причем на стадии b) искомый белок остается нерастворимым, а по меньшей мере 80%, предпочтительно 85%, более предпочтительно 90% и наиболее предпочтительно 95% или даже 100% нерастворимых частей клеток хозяев подвергаются солюбилизации.
Далее, к примеру, изобретением предусмотрен способ выделения нерастворимых искомых белков из суспензии целых клеток хозяев, включающий стадии:
a) получение суспензии целых клеток хозяев, содержащих нерастворимый искомый белок и нерастворимые части клеток хозяев,
b) добавление водного раствора по меньшей мере одного основания к данной суспензии в количестве, достаточном для разрушения данных клеток хозяев и солюбилизации нерастворимых частей клеток хозяев, и
с) отделение нерастворимого искомого белка от солюбилизированных нерастворимых частей клеток хозяев,
причем на стадии b) искомый белок остается нерастворимым, а по меньшей мере 80%, предпочтительно 85%, более предпочтительно 90% и наиболее предпочтительно 95% или даже 100% нерастворимых частей клеток хозяев подвергаются солюбилизации.
Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что нерастворимые искомые белки, например, белки паучьего шелка, присутствующие в суспензии целых или разрушенных клеток хозяев, остаются нерастворимыми в определенных условиях, необходимых для разрушения целых клеток хозяев и/или солюбилизации всех или почти всех других нерастворимых частей клеток хозяев, например, нерастворимых белков клеток хозяев, клеточных стенок, остатков клеток хозяев или других возможных примесей, связанных с процессом ферментации (например, остатков от ферментации), и при этом данные нерастворимые искомые белки, например, белок шелка пауков, можно просто выделить и очистить из суспензии всего за несколько стадий очистки без потери значительного количества белка.
В частности, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что отделение нерастворимых искомых белков от нерастворимых частей клеток хозяев достигается добавлением водного раствора, содержащего по меньшей мере одно основание (например, NaOH) в низкой концентрации (например, 0,05 М NaOH), к суспензии целых или разрушенных клеток хозяев. Авторы изобретения открыли, что водный раствор, содержащий по меньшей мере одно основание, разрушает клетки хозяева и/или солюбилизирует нерастворимые белки клеток хозяев и оставшиеся обломки клеток, не затрагивая нерастворимый искомый белок.
Авторы изобретения также установили, что после этой стадии нужно лишь отделить твердую фазу, содержащую нерастворимый искомый белок, от жидкой фазы, содержащей солюбилизированные нерастворимые части клеток хозяев, например, путем центрифугирования и/или фильтрации, и необязательно промыть осадок искомого белка для очистки представляющего интерес нерастворимого искомого белка. Полученный очищенный нерастворимый искомый белок можно непосредственно использовать для научного или промышленного применения без дальнейшей обработки.
Авторы изобретения неожиданного установили, что способом настоящего изобретения можно выделить нерастворимый искомый белок с чистотой по меньшей мере 80%, предпочтительно 85% или 90%, более предпочтительно 95%, 98% или 99% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99,9% или даже 100%, например, по меньшей мере 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9% или 100%. Большинство нерастворимых искомых белков, выделенных способом настоящего изобретения, не требует дополнительных стадий очистки. Соответственно, способ настоящего изобретения представляет собой очень экономичный и эффективный способ очистки.
В настоящем изобретении термин "клетки хозяева" относится к клеткам, содержащим представляющий интерес искомый белок, например, белок шелка типа белка шелка паука или его вариант. Такой искомый белок, например, белок шелка типа белка шелка паука или его вариант может кодироваться полинуклеотидом, предпочтительно выделенным полинуклеотидом. Такой полинуклеотид может находиться внутри клеток хозяев: (i) в свободном виде, (ii) внедренным в рекомбинантный вектор или (iii) встроенным в геном клетки хозяева или в митохондриальную ДНК. Клетки хозяева могут использоваться для амплификации и экспрессии полинуклеотида, кодирующего данный искомый белок, например, белок шелка типа белка шелка паука или его вариант.
Термин "выделенный полинуклеотид" в настоящем изобретении относится к такому полинуклеотиду, который был (i) выделен из своего естественного окружения, (ii) амплифицирован при полимеразной цепной реакции и/или (iii) полностью или частично синтезирован, и означает одноцепочечный или двухцепочечный полимер из дезоксирибонуклеотидных или рибонуклеотидных оснований и включает молекулы ДНК и РНК, как смысловые, так и антисмысловые нити. Термин включает кДНК, геномную ДНК, мРНК и рекомбинантную ДНК. Полинуклеотид может состоять из целого гена или его части.
В предпочтительном воплощении настоящего изобретения вышеупомянутый полинуклеотид является рекомбинантным полинуклеотидом, кодирующим представляющий интерес искомый белок. Термин "рекомбинантный полинуклеотид" относится к полинуклеотидам, синтезированным или подвергавшимся обработке in vitro. Искомый белок, кодируемый данным рекомбинантным полинуклеотидом, может именоваться рекомбинантным искомым белком. Клетки хозяева, содержащие данный рекомбинантный полинуклеотид и/или данный рекомбинантный искомый белок, могут именоваться рекомбинантными клетками хозяевами.
Термин "рекомбинантный вектор" в настоящем изобретении охватывает любые вектора, известные специалистам, включая плазмидные вектора, космидные вектора, фаговые вектора, как-то фаг лямбда, вирусные вектора, как-то аденовирусные или бакуловирусные вектора, или искусственные хромосомные вектора типа бактериальных искусственных хромосом (ВАС), искусственных хромосом дрожжей (YAC) или искусственных хромосом P1 (РАС). Данные вектора включают как экспрессионные, так и клонирующие вектора. Экспрессионные вектора включают как плазмидные, так и вирусные вектора и обычно содержат требуемую кодирующую последовательность и соответствующие последовательности ДНК, необходимые для экспрессии функционально связанной кодирующей последовательности в определенном организме хозяине (например, бактерий, дрожжей или растений), либо системы экспрессии in vitro. Клонирующие вектора обычно используются для конструирования и амплификации определенных фрагментов ДНК и в них могут отсутствовать функциональные последовательности, необходимые для экспрессии данных фрагментов ДНК.
В предпочтительном воплощении настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес искомый белок, содержится в экспрессионном векторе и функционально связан с контролирующими экспрессию последовательностями для регуляции его экспрессии в клетках хозяевах или же содержится в клонирующем векторе, способствующем его амплификации в клетках хозяевах. Клонирующий вектор или экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес искомый белок, обычно вводится в клетки хозяева путем трансформации или трансфекции.
В предпочтительном воплощении настоящего изобретения клетки хозяева представлены микробными клетками, как-то клетками бактерий или дрожжей, клетками растений или клетками насекомых.
В контексте настоящего изобретения термин "микробные клетки хозяева" в настоящем изобретении относится к клеткам микробного происхождения, к примеру, бактериальным клеткам типа клеток грамм-отрицательных или грамм-положительных бактерий, например, клеткам Escherichia (например, Escherichia coli), Anabaena, Caulobacter, Gluconobacter, Rhodobacter, Pseudomonas, Paracoccus, Bacillus (например, Bacillus subtilis), Brevibacterium, Corynebacterium, Rhizobium (Sinorhizobium), Flavobacterium, Klebsiella, Enterobacter, Lactobacillus, Lactococcus, Methylo bacterium, Propionibacterium, Staphylococcus или Streptomyces, или клеткам дрожжей типа клеток аскоспорогенных (Endomycetales), базидиоспорогенных или клеток, принадлежащих к Fungi Imperfecti (Blastomycetes), например, клеткам Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Saccharomyces (например, Saccharomyces cerevisiae), Schizosaccharomyces, Pichia (например, Pichia pastoris) или Yarrowia.
В контексте настоящего изобретения термин "клетки хозяева из насекомых" относится к клеткам, происходящим из насекомых, типа клеток Spodoptera frugiperda или Trichoplusia ni. Предпочтительными клетками насекомых являются клетки SF9 клетки SF-21 или клетки High-Five. SF-9 и SF-21 - это клетки яичников из Spodoptera frugiperda. Клетки High-Five - это яйцеклетки из Trichoplusia ni.
В контексте настоящего изобретения термин "клетки хозяева из растений" в настоящем изобретении относится к клеткам растительного происхождения типа клеток табака, картофеля или гороха.
Термин "суспензия целых или разрушенных клеток хозяев" в настоящем изобретении относится к гетерогенной жидкости, содержащей целые или разрушенные клетки хозяева. Жидкость, в которой суспендированы целые или разрушенные клетки, может представлять собой среду для ферментации, культуральную среду, водный раствор, например, буферный водный раствор, техническую H2O или деионизированную Н2О. Буферный водный раствор может представлять собой, к примеру, трис/HCl. Значение рН буферного водного раствора может составлять от рН 5,0 до рН 9,0, предпочтительно от рН 6,0 до рН 8,0, более предпочтительно от рН 6,7 до рН 7,2, например, трис/HCl рН 7,0, рН 7,5 или рН 8,0. Предпочтительно буферный водный раствор содержит от 10 до 100 мМ трис/HCl, более предпочтительно от 10 до 50 мМ трис/HCl и наиболее предпочтительно от 10 до 20 мМ трис/HCl, например, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 мМ трис/HCl, причем данный буферный водный раствор предпочтительно имеет рН от 5,0 до 9,0, более предпочтительно от 6,0 до 8,0 и наиболее предпочтительно от 6,7 до 7,2, например, трис/HCl рН 7,0, рН 7,5 или рН 8,0. Культуральная среда может представлять собой минимальную среду или солевую среду (например, см. Korz et al., Journal of Biotechnology 39, 1995, 59-65). Соотношение жидкости к целым или разрушенным клеткам хозяевам в суспензии может составлять, например, от 5% до 95%. Так, термин "суспензия целых или разрушенных клеток хозяев" охватывает суспензии, в которых соотношение жидкости к целым или разрушенным клеткам хозяевам может составлять от 5 до 95%, от 10 до 90%, от 15 до 85%, от 20 до 80%, от 25% до 75%, от 30 до 70%, от 35 до 65%, от 40 до 60%, от 45 до 55%, от 50 до 50%, от 55 до 45%, от 60 до 40%, от 65 до 35%, от 70 до 30%, от 75 до 25%, от 80 до 20%, от 85 до 15%, от 90 до 10% или от 95 до 5%.
В контексте настоящего изобретения термин "суспензия целых клеток хозяев" охватывает целые, обычно не подвергавшиеся лизису клетки хозяева, например, микробные клетки, клетки растений или клетки насекомых, суспендированные в жидкости, например, в водном растворе (например, в буферном водном растворе), технической воде, деионизированной воде, культуральной среде или среде ферментации. Термин "суспензия разрушенных клеток хозяев" в настоящем изобретении охватывает клетки хозяева, например, микробные клетки, клетки растений или клетки насекомых, у которых разрушены клеточные стенки или в большинстве своем подвергались лизису и суспендированы в жидкости, например, в водном растворе (например, буферном водном растворе), технической воде, культуральной среде, деионизированной воде или среде ферментации. "Суспензия разрушенных клеток хозяев" может быть получена: (i) немеханическим разрушением клеток (например, лизисом клеток с помощью ферментов, обработкой клеток химическими реагентами для растворения/частичного растворения или вскрытия/частичного вскрытия клеточных стенок и/или клеточных мембран либо разрушением клеток воздействием осмотического давления), (ii) механическим разрушением клеток (например, механическим растиранием или измельчением на шаровой мельнице), (iii) гомогенизацией под высоким давлением или (iv) обработкой ультразвуком, а также их комбинациями.
В предпочтительном воплощении настоящего изобретения целые клетки хозяева, например, микробные клетки типа бактериальных клеток, полученные на стадии а), находятся в суспензии с влагосодержанием от 5 до 20%, предпочтительно 5, 10, 15 или 20% (например, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20%), т.е. в клеточном осадке, предпочтительно после отделения этих клеток от культуральной среды, например, центрифугированием или фильтрацией. В другом воплощении настоящего изобретения разрушенные клетки хозяева, например, микробные клетки типа бактериальных клеток, находятся в суспензии с влагосодержанием от 5 до 20%, предпочтительно 5, 10, 15 или 20% (например, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20%), т.е. в клеточном осадке, предпочтительно после отделения данных разрушенных, например, лизированных или обработанных ультразвуком клеток, от культуральной среды, например, центрифугированием или фильтрацией.
Следует отметить, что количество растворимых частей клеток хозяев, например, органелл, растворимых белков или растворимых остатков клеток хозяев и/или других растворимых ингредиентов, например, растворимых примесей в связи с ферментацией, растворимых частей среды ферментации или растворимых частей культуральной среды, в суспензии целых или разрушенных клеток хозяев, полученных на стадии а), может колебаться. Например, количество растворимых частей клеток хозяев и/или других растворимых ингредиентов будет меньше (i) в клеточном осадке целых или разрушенных клеток хозяев с влагосодержанием от 5 до 10%, полученном при отделении целых или разрушенных клеток хозяев от культуральной или ферментационной среды центрифугированием или фильтрацией, или (ii) в водном растворе, в котором данный клеточный осадок ресуспендирован, по сравнению с количеством растворимых частей клеток хозяев и/или других растворимых ингредиентов (i) в суспензии целых клеток хозяев в культуральной или ферментационной среде или (ii) в суспензии разрушенных клеток хозяев в культуральной или ферментационной среде. Также возможно, что в суспензии, например, водном растворе, нет растворимых частей клеток хозяев и/или других растворимых ингредиентов, особенно в тех случаях, когда клеточный осадок разрушенных клеток хозяев промывают и ресуспендируют в водном растворе, который впоследствии представлен в пункте а).
"Суспензия клеток хозяев", например, микробных, клеток растений или насекомых, может быть получена при культивировании клеток хозяев, например, микробных, клеток растений или насекомых, в культуральной или ферментационной среде. Производство искомых белков может осуществляться в биореакторах, в которых можно эффективно культивировать клетки хозяева, например, микробные, клетки растений или насекомых. Можно использовать три пересекающихся стратегии ферментации: (i) непрерывная ферментация, (ii) периодическая ферментация или (iii) периодическая ферментация с подпиткой. Эти стратегии ферментации также можно комбинировать. Для получения максимального выхода, т.е. получения большой биомассы требуемого искомого белка, нужно обеспечить снабжение клеток хозяев, например, микробных, клеток растений или насекомых, достаточным количеством питательных веществ и совмещать эту обработку с непрерывным мониторингом и адаптацией соответствующих параметров процесса (например, растворенного кислорода, рН и температуры). Можно использовать системы индукции экспрессии искомого белка (например, индукции изопропил-β-D-тиогалактопиранозидом (IPTG), индукции сахарами или их аналогами, температурной индукции с использованием зависимых от температуры промоторов, индукции с помощью промоторов, контролируемых осмотическим стрессом, или индукции, запускаемой метаболическими изменениями в клетке). Многие параметры могут оказывать воздействие на продукцию искомого белка и его качество. Для увеличения выхода нерастворимого искомого белка можно использовать, в частности, более продолжительную фазу индукции, изменение температуры при инкубации, оптимизировать подачу питательных веществ и/или применять различные типы клеточного стресса. Также можно повлиять на количество агрегатов искомого белка, образующихся при культивировании клеток и в процессе очистки, путем тщательного контроля окружающей среды (например, компонентов среды, температуры в процессе ферментации, продолжительности процесса ферментации) и реализации соответствующих стратегий для максимизации степени агрегации.
"Суспензия клеток хозяев", например, микробных, клеток растений или насекомых, также может быть получена путем ресуспендирования культивируемых клеток хозяев, например, микробных, клеток растений или насекомых, выделенных из культуральной среды, например, центрифугированием или фильтрацией, в водном растворе, например, буферном водном растворе, в технической воде или в деионизированной воде. Суспензия растительных клеток также может быть получена путем суспендирования клеток растений, полученных из целых растений, например, путем извлечения этих растительных клеток или разрушения целых растений, в водном растворе, например, буферном водном растворе, в технической воде или в деионизированной воде.
В том случае, когда на стадии а) способа настоящего изобретения представлена суспензия целых клеток хозяев, можно непосредственно использовать одну из вышеописанных суспензий клеток хозяев. В том случае, когда на стадии а) способа настоящего изобретения представлена суспензия разрушенных клеток хозяев, можно сначала разрушить (целые) клетки хозяева, содержащиеся в одной из описанных выше суспензий, например, методами немеханического разрушения клеток или методами механического разрушения клеток (см. выше).
В контексте настоящего изобретения термин "суспензия разрушенных клеток хозяев, содержащая нерастворимый искомый белок и нерастворимые части клеток хозяев" относится к суспензии, например, культуральной среде, буферному водному раствору, технической воде или деионизированной воде, непосредственно содержащей нерастворимый искомый белок и нерастворимые части клеток хозяев (например, нерастворимые части клеточной стенки или нерастворимые обломки клеток) из разрушенных клеток хозяев. В противоположность этому, используемый здесь термин "суспензия целых клеток хозяев, содержащая нерастворимый искомый белок и нерастворимые части клеток хозяев" относится к суспензии, например, культуральной среде, водному раствору (например, буферному водному раствору), технической воде или деионизированной воде, содержащей целые клетки хозяева, в которых содержится нерастворимый искомый белок и нерастворимые части клеток хозяев (например, нерастворимая клеточная стенка или нерастворимые белки клеток хозяев).
Термин "нерастворимые части клеток хозяев" в настоящем изобретении относится к нерастворимым белкам клеток хозяев, клеточным стенкам, клеточным мембранам, частям клеточной стенки, частям клеточной мембраны, частям цитоскелета, обломкам клеток хозяев и/или нерастворимым цитоплазматическим включениям (например, кристаллам оксалата кальция или диоксида кремния, гранулам запасающих энергию материалов, таких как крахмал, гликоген или полигидроксибутират), которые входят в состав клеток хозяев, например, микробных, клеток растений или насекомых, или систем экспрессии, используемых для экспрессии искомого белка. Этот термин не охватывает нерастворимый искомый белок настоящего изобретения. Термин "нерастворимые части клеток хозяев" также относится к тем частям клеток хозяев, которые нерастворимы в условиях, существующих на стадии а), но подвергаются солюбилизации в условиях, существующих на стадии b).
Термин "растворимые части клеток хозяев" в настоящем изобретении относится к растворимым белкам клеток хозяев, клеточным органеллам, частям клеточных органелл и/или другим растворимым компонентам клетки, которые входят в состав клеток хозяев, например, микробных, клеток растений или насекомых, или системы экспрессии, используемой для экспрессии искомого белка. Термин "растворимые части клеток хозяев" также относится к тем частям клеток хозяев, которые уже растворимы в условиях, существующих на стадии а), и остаются растворимыми в условиях, существующих на стадии b).
Термин "искомый белок" в контексте настоящего изобретения относится к представляющему интерес белку, например, белку шелка типа белка шелка паука или белка шелка насекомых, коллагену, резилину или кератину, который может быть выделен из суспензии клеток хозяев, например, микробных, клеток растений или насекомых. В предпочтительном воплощении данный искомый белок является рекомбинантным искомым белком, более предпочтительно рекомбинантным искомым белком, кодируемым рекомбинантным полинуклеотидом. В другом воплощении рекомбинантный искомый белок является гибридным белком белка шелка паука и белка шелка насекомых, белка шелка паука и коллагена, белка шелка паука и резилина или белка шелка паука и кератина. Особенно предпочтительно, чтобы данный искомый белок вырабатывался рекомбинантно в данных клетках хозяевах.
В предпочтительном воплощении искомые белки представляют собой белки, содержащие повторяющиеся звенья/домены, которые обладают свойством образовывать агрегаты искомого белка в клетках хозяевах или в суспензии, например, в культуральной среде, в водном растворе (например, буферном водном растворе), в технической воде или в деионизированной воде.
В другом предпочтительном воплощении искомые белки присутствуют в виде агрегатов искомого белка в клетках хозяевах или в суспензии, например, в культуральной среде, водном растворе (например, буферном водном растворе), в технической воде или в деионизированной воде. Такие агрегаты искомого белка могут образовываться путем аутоагрегации искомых белков в клетках хозяевах без влияния клеточного скелета или других внутриклеточных механизмов.
В частности, агрегаты искомого белка могут образоваться путем аутоагрегации множественных копий/звеньев искомого белка в частицы или твердую массу без влияния клеточного скелета или других внутриклеточных механизмов. Агрегаты искомого белка также могут образоваться путем аутоагрегации искомого белка в суспензии, например, в культуральной среде, другом водном растворе (например, буферном водном растворе), в технической воде или деионизированной воде. Агрегаты искомого белка могут образовываться по нескольким механизмам, которые могут включать ковалентные или нековалентные взаимодействия между молекулами искомого белка.
Предпочтительно агрегаты искомого белка содержат по меньшей мере 85%, более предпочтительно 90% и наиболее предпочтительно 95% или даже 100%, например, по меньшей мере 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или 100% одного и того же искомого белка и образуются при агрегации множественных копий данного искомого белка. Поразительно, что агрегаты данного искомого белка не только совместно локализуются внутри неспецифических агрегатов, но содержат по меньшей мере 85% или даже 100% одного и того же искомого белка, что свидетельствует о склонности искомых белков к аутоагрегации.
Термины "нерастворимый искомый белок" или "агрегат нерастворимого искомого белка" в настоящем изобретении относятся к такому искомому белку или агрегату искомого белка, который нерастворим в суспензии, например, культуральной среде, среде ферментации, водном растворе (например, буферном водном растворе типа трис/HCl, рН 7,5), технической воде или деионизированной воде, и поэтому может быть отделен от растворимых частей клеток хозяев, присутствующих в данной суспензии, например, центрифугированием и/или фильтрацией. Кроме того, термин "нерастворимый искомый белок" или термин "агрегат нерастворимого искомого белка" относятся к такому искомому белку или агрегату искомого белка, который также нерастворим в суспензии, например, культуральной среде, среде ферментации, водном растворе (например, буферном водном растворе типа трис/HCl, рН 7,5), технической воде или деионизированной воде, после добавления к данной суспензии водного раствора, содержащего основание (например, 0,05 М NaOH), тогда как другие части клеток хозяев, которые нерастворимы в суспензии, например, клеточной культуральной среде, среде ферментации, водном растворе (например, буферном водной растворе типа трис/HCl, рН 7,5), технической воде или деионизированной воде, становятся растворимыми после добавления к данной суспензии водного раствора, содержащего основание, и поэтому могут быть далее отделены от солюбилизированных нерастворимых частей клеток хозяев присутствующих в данной суспензии, например, центрифугированием и/или фильтрацией.
Предпочтительно, чтобы нерастворимый искомый белок или агрегат нерастворимого искомого белка был нерастворим в буферном водном растворе от 10 до 100 мМ трис/HCl, более предпочтительно от 10 до 50 мМ трис/HCl и наиболее предпочтительно от 10 до 20 мМ трис/HCl, например, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 мМ трис/HCl, причем данный буферный водный раствор предпочтительно имеет рН от 5,0 до 9,0, более предпочтительно от 6,0 до 8,0 и наиболее предпочтительно от 6,7 до 7,2, например, трис/HCl, рН 7,0, рН 7,5 или рН 8,0.
Если, к примеру, на стадии а) способа настоящего изобретения представлена суспензия целых клеток хозяев, например, микробных, клеток растений или насекомых, то на стадии b) добавляют водный раствор, содержащий по меньшей мере одно основание, в количестве, достаточном/необходимом для разрушения данных клеток хозяев на нерастворимые части клеток хозяев, а затем солюбилизации этих нерастворимых частей клеток хозяев в такой степени, чтобы подверглись солюбилизации по меньшей мере 80%, предпочтительно 90% и более предпочтительно 95% или 100%, например, по меньшей мере 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9% или 100% этих нерастворимых частей клеток хозяев. Далее, если, к примеру, на стадии а) способа настоящего изобретения представлена суспензия уже разрушенных клеток хозяев, например, микробных, клеток растений или насекомых, т.е. суспензия, содержащая нерастворимые части клеток из разрушенных клеток хозяев, то на стадии b) добавляют водный раствор, содержащий по меньшей мере одно основание, в количестве, достаточном/необходимом для солюбилизации данных нерастворимых частей клеток хозяев в такой степени, чтобы подверглись солюбилизации по меньшей мере 80%, предпочтительно 90% и более предпочтительно 95% или даже 100%, например, по меньшей мере 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9% или 100% нерастворимых частей клеток хозяев.
Специалист легко сможет установить, какое количество водного раствора, содержащего основание, достаточно/необходимо для разрушения клеток хозяев, например, микробных, клеток растений или насекомых, и/или солюбилизации нерастворимых частей клеток в такой степени, чтобы подверглись солюбилизации по меньшей мере 80%, предпочтительно 90% и более предпочтительно 95% или даже 100% данных нерастворимых частей клеток, например, путем (i) приготовления серийных разведении выбранного основания, например, NaOH, (ii) добавления выбранного основания (например, NaOH) при нескольких концентрациях в суспензию целых или разрушенных клеток хозяев (например, NaOH в конечной концентрации 0,01 М NaOH, 0,02 M NaOH, 0,03 M NaOH, 0,04 M NaOH, 0,05 M NaOH, 0,06 M NaOH, 0,07 M NaOH, 0,08 M NaOH, 0,09 M NaOH, 0,1 M NaOH, 0,2 M NaOH, 0,3 NaOH, 0,4 M NaOH, 0,5 M NaOH, 0,6 M NaOH, 0,7 M NaOH, 0,8 M NaOH, 0,9 M NaOH или 1 M NaOH), (iii) отделения нерастворимого искомого белка от полностью или частично солюбилизированных нерастворимых частей клеток хозяев, например, центрифугированием или фильтрацией, (iv) определения доли нерастворимых частей клеток хозяев в выделенной фракции нерастворимого искомого белка, например, в центрифугате или ретентате, и (v) определения количества основания, достаточного/ необходимого для растворения по меньшей мере 80%, предпочтительно 90%, более предпочтительно 95% или даже 100% нерастворимых частей клеток хозяев.
Выражение "искомый белок остается нерастворимым" в настоящем изобретении относится к такому искомому белку, который нерастворим в суспензии, например, водном растворе (например, буферном водном растворе), культуральной среде, среде ферментации, в технической воде или деионизированной воде, и остается нерастворимым, например, по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 90% и более предпочтительно на 95% или даже на 100%, к примеру, по меньшей мере на 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9% или 100% в этой суспензии, в данном водном растворе (например, буферном водном растворе), в культуральной среде, среде ферментации, в технической воде или деионизированной воде, содержащих основание, например, в течение определенного периода времени и/или при определенной температуре, что позволяет отделить и выделить данный искомый белок, например, фильтрацией и/или центрифугированием.
В предпочтительном воплощении настоящего изобретения искомый белок нерастворим в суспензии, например, водном растворе (например, буферном водном растворе), культуральной среде, среде ферментации, в технической воде или деионизированной воде, и остается нерастворимым, например, по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 90% и более предпочтительно на 95% или даже на 100%, к примеру, по меньшей мере на 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9% или 100% в данной суспензии, например, в данном водном растворе (например, буферном водном растворе), культуральной среде, среде ферментации, в технической воде или деионизированной воде, содержащих основание, в течение периода времени по меньшей мере 5 минут, предпочтительно 10 минут, более предпочтительно 90 минут и наиболее предпочтительно 180 минут, например, по меньшей мере 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170 или 180 минут.
В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения искомый белок нерастворим в суспензии, например, водном растворе (например, буферном водном растворе), культуральной среде, среде ферментации, в технической воде или деионизированной воде, и остается нерастворимым, например, по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 90% и более предпочтительно на 95% или даже на 100%, к примеру, по меньшей мере на 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9% или 100% в данной суспензии, например, в данном водном растворе (например, буферном водном растворе), культуральной среде, среде ферментации, в технической воде или деионизированной воде, содержащих основание, в течение периода времени от 5 до 180 минут, предпочтительно от 10 до 90 минут, к примеру, в течение 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170 или 180 минут, и/или при температуре от 4 до 60°С, к примеру, при 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55 или 60°С.
В более предпочтительном воплощении настоящего изобретения искомый белок нерастворим в суспензии, например, водном растворе (например, буферном водном растворе), культуральной среде, среде ферментации, в технической воде или деионизированной воде, и остается нерастворимым по меньшей мере на 90%, предпочтительно на 95%, в данном растворе, например, в данном водном растворе, культуральной среде, среде ферментации, технической воде или деионизированной воде, содержащих основание, в течение периода времени 10 минут при температуре 15°С, 20°С, 25°С, 30°С, 35°С или 40°С, в течение 20 минут при температуре 15°С, 20°С, 25°С, 30°С, 35°С или 40°С, в течение 30 минут при температуре 15°С, 20°С, 25°С, 30°С, 35°С или 40°С, в течение 40 минут при температуре 15°С, 20°С, 25°С, 30°С, 35°С или 40°С в водном растворе, в течение 50 минут при температуре 15°С, 20°С, 25°С, 30°С, 35°С или 40°С, в течение 60 минут при температуре 15°С, 20°С, 25°С, 30°С, 35°С или 40°С либо в течение 90 минут при температуре 15°С, 20°С, 25°С, 30°С, 35°С или 40°С.
В наиболее предпочтительном воплощении настоящего изобретения искомый белок нерастворим в суспензии, например, водном растворе (например, буферном водном растворе), культуральной среде, среде ферментации, в технической воде или деионизированной воде, и остается нерастворимым по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 90% и более предпочтительно на 95% или даже на 100%, к примеру, по меньшей мере на 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9% или 100%, в данной суспензии, например, в данном водном растворе (например, буферном водном растворе), в культуральной среде, среде ферментации, в технической воде или деионизированной воде, содержащих основание, к примеру, гидроокись металла и/или аммония, как-то гидроокись натрия (NaOH), гидроокись калия (KOH) и/или гидроокись кальция (СаОН), конечная концентрация которого составляет от 0,005 М до 1 М, предпочтительно от 0,01 М до 0,6 М, более предпочтительно от 0,02 М до 0,2 М, от 0,05 М до 0,15 М или от 0,04 М до 0,1 М и наиболее предпочтительно от 0,04 М до 0,06 М, в течение периода времени от 5 до 180 минут, предпочтительно от 10 до 90 минут, к примеру, в течение 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170 или 180 минут и/или при температуре от 4 до 60°С, к примеру, при 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55 или 60°С.
Особенно предпочтительно, чтобы искомый белок оставался нерастворимым по меньшей мере на 90%, предпочтительно на 95% или даже на 100%, например, по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9% или 100% после добавления на стадии b) водного раствора, содержащего по меньшей мере одно основание, в течение периода времени от 10 до 40 мин при температуре от 15°С до 25°С. Особенно предпочтительно, чтобы искомый белок оставался нерастворимым по меньшей мере на 90%, предпочтительно на 95% или даже на 100%, например, по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9% или 100% после добавления на стадии b) водного раствора, содержащего по меньшей мере одно основание, в течение периода времени от 20 до 30 мин и при температуре между 20°С и 25°С.
В следующем предпочтительном воплощении настоящего изобретения искомые белки, например, белки шелка пауков, которые остаются нерастворимыми, отделяют от солюбилизированных нерастворимых частей клеток хозяев с помощью фильтра, например, фильтра с размером пор 0,1 мкм или 0,22 мкм и/или центрифугированием, например, от 3000 до 8000×g в течение 20-30 минут.
В другом предпочтительном воплощении искомые белки остаются нерастворимыми в виде агрегатов искомого белка (например, агрегатов белка шелка типа агрегатов белка шелка паука). При этом термин "агрегат искомого белка остается нерастворимым" относится к такому образованию агрегатов искомого белка, которое необратимо или обратимо не более чем на 0,1, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20% в суспензии, например, водном растворе (например, буферном водном растворе), в культуральной среде, среде ферментации, в технической воде или деионизированной воде, содержащей основание, например, в течение определенного периода времени и/или при определенной температуре, что позволяет отделить и выделить данные агрегаты искомого белка, например, фильтрацией и/или центрифугированием.
Выражение "агрегат искомого белка остается нерастворимым" также относится к таким агрегатам искомого белка, которые остаются нерастворимыми, например, по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 90% и более предпочтительно на 95% или даже на 100%, к примеру, по меньшей мере на 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9% или 100% в суспензии, например, водном растворе (например, буферном водном растворе), в культуральной среде, среде ферментации, в технической воде или деионизированной воде, содержащей основание, например, в течение определенного периода времени и/или при определенной температуре, что позволяет отделить и выделить данные агрегаты искомого белка, например, фильтрацией и/или центрифугированием.
В более предпочтительном воплощении настоящего изобретения образование агрегатов искомого белка необратимо или обратимо не более чем на 0,1, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20% в суспензии, например, водном растворе (например, буферном водном растворе), в культуральной среде, среде ферментации, в технической воде или деионизированной воде, содержащей основание, например, гидроокись металла и/или аммония, в течение периода времени от 5 до 180 минут, предпочтительно от 10 до 90 минут, к примеру, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170 или 180 минут, при температуре от 4 до 60°С, к примеру, при 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55 или 60°С.
В другом воплощении настоящего изобретения агрегат искомого белка остается нерастворимым по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 90% и более предпочтительно на 95% или даже на 100%, к примеру, по меньшей мере на 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9% или 100% в суспензии, например, водном растворе (например, буферном водном растворе), в культуральной среде, среде ферментации, в технической воде или деионизированной воде, содержащей основание, например, гидроокись металла и/или аммония, в течение периода времени от 5 до 180 минут, предпочтительно от 10 до 90 минут, к примеру, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170 или 180 минут и/или при температуре от 4 до 60°С, к примеру, при 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55 или 60°С.
В особенно предпочтительном воплощении настоящего изобретения образование агрегата искомого белка обратимо не более чем на 10% в суспензии, например, водном растворе (например, буферном водном растворе), в культуральной среде, среде ферментации, в технической воде или деионизированной воде, содержащей основание, например, гидроокись металла и/или аммония, в течение периода времени 10 минут при температуре 15°С, 20°С, 25°С, 30°С, 35°С или 40°С, в течение 20 минут при температуре 15°С, 20°С, 25°С, 30°С, 35°С или 40°С, в течение 30 минут при температуре 15°С, 20°С, 25°С, 30°С, 35°С или 40°С, в течение 40 минут при температуре 15°С, 20°С, 25°С, 30°С, 35°С или 40°С в водном растворе, в течение 50 минут при температуре 15°С, 20°С, 25°С, 30°С, 35°С или 40°С, в течение 60 минут при температуре 15°С, 20°С, 25°С, 30°С, 35°С или 40°С либо в течение 90 минут при температуре 15°С, 20°С, 25°С, 30°С, 35°С или 40°С.
В другом воплощении настоящего изобретения агрегат искомого белка остается нерастворимым по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 90% и более предпочтительно на 95% или даже на 100%, к примеру, по меньшей мере на 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9% или 100% в суспензии, например, водном растворе (например, буферном водном растворе), в культуральной среде, среде ферментации, в технической воде или деионизированной воде, содержащей основание, к примеру, гидроокись металла и/или аммония, как-то гидроокись натрия (NaOH), гидроокись калия (KOH) и/или гидроокись кальция (СаОН), конечная концентрация которого составляет от 0,005 М до 1 М, предпочтительно от 0,01 М до 0,6 М, более предпочтительно от 0,02 М до 0,2 М, от 0,05 М до 0,15 М или от 0,04 М до 0,1 М и наиболее предпочтительно от 0,04 М до 0,06 М, в течение периода времени от 5 до 180 минут, предпочтительно от 10 до 90 минут, к примеру, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170 или 180 минут, и/или при температуре от 4 до 60°С, к примеру, при 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55 или 60°С.
В более предпочтительном воплощении искомый белок представляет собой искомый белок с повторяющимися доменами/повторяющимися звеньями (например, белок шелка типа белка шелка паука) и имеет свойство образовывать белковые агрегаты. Как только белковые агрегаты сформируются, такие белковые агрегаты предпочтительно нерастворимы в суспензии, например, водном растворе (например, буферном водном растворе), в культуральной среде, среде ферментации, в технической воде или деионизированной воде, и остаются нерастворимыми по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 90% и более предпочтительно на 95% или даже на 100%, к примеру, по меньшей мере на 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9% или 100% в данной суспензии, например, водном растворе (например, буферном водном растворе), в культуральной среде, среде ферментации, в технической воде или деионизированной воде, содержащей основание, например, гидроокись металла и/или аммония, в течение периода времени от 5 до 180 минут, предпочтительно от 10 до 90 минут, к примеру, в течение 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170 или 180 минут и/или при температуре от 4 до 60°С, к примеру, при 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55 или 60°С.
Агрегаты искомого белка, например, агрегаты белка шелка паука, которые остаются нерастворимыми, видны как отдельные частицы, к примеру, невооруженным глазом, под световым микроскопом или электронным микроскопом, и/или могут быть выделены/отделены от солюбилизированных нерастворимых частей клеток хозяев с помощью фильтра, например, фильтра с размером пор 0,1 мкм или 0,22 мкм.
Предпочтительно нерастворимый искомый белок образует белковый агрегат, который содержит по меньшей мере 85%, более предпочтительно 90% и наиболее предпочтительно 98% или даже 100%, например, по меньшей 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9% или 100% данного искомого белка. Выражение "агрегат искомого белка, который содержит по меньшей мере 85%, более предпочтительно 90% и наиболее предпочтительно 98% или даже 100% данного искомого белка", используемое в контексте настоящего изобретения, означает, что агрегат искомого белка образуется при агрегации множественных копий/звеньев одного и того же искомого белка и содержит по меньшей мере 85%, более предпочтительно 90% и наиболее предпочтительно 98% или даже 100% данного искомого белка.
Предпочтительно стадия b) способа настоящего изобретения выполняется за период времени, в течение которого искомый белок остается нерастворимым.
Более предпочтительно стадия b) способа настоящего изобретения выполняется в течение периода времени от 5 до 180 мин, предпочтительно от 10 до 90 мин и наиболее предпочтительно от 10 до 40 мин, например, в течение 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170 или 180 минут. Например, стадия b) способа настоящего изобретения выполняется в течение периода времени от 30 до 180 мин для солюбилизации нерастворимых частей клеток хозяев из культуральной среды целых бактериальных клеток хозяев, например, при температуре между 20°С и 25°С.
Предпочтительно нерастворимый искомый белок или агрегат нерастворимого искомого белка, выделенного/отделенного способом настоящего изобретения, обладает чистотой по меньшей мере 50% или 60%, более предпочтительно 70% или 80% и наиболее предпочтительно 90%, 95% или даже 100%, например, по меньшей мере 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9% или 100%.
Чистота по меньшей мере в 50% или 60%, более предпочтительно в 70% или 80% и наиболее предпочтительно в 90%, 95% или даже в 100%, например, по меньшей мере в 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9% или 100% нерастворимого искомого белка или агрегата искомого белка предпочтительно означает, что он по меньшей мере на 50% или 60%, более предпочтительно на 70% или 80% и наиболее предпочтительно на 90%, 95% или даже на 100%, например, по меньшей мере на 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9% или 100% свободен от (i) нерастворимых частей клеток хозяев (например, нерастворимых белков клеток хозяев, частей клеточной стенки, частей клеточной мембраны, частей цитоскелета, обломков клеток хозяев и/или цитоплазматических включений) и/или растворимых частей клеток хозяев (например, растворимых белков клеток хозяев, частей клеточных органелл и/или клеточных компонентов), более предпочтительно свободен от (i) нерастворимых частей клеток хозяев (например, нерастворимых белков клеток хозяев, частей клеточной стенки, частей клеточной мембраны, частей цитоскелета, обломков клеток хозяев и/или цитоплазматических включений) и/или растворимых частей клеток хозяев (например, растворимых белков клеток хозяев, частей клеточных органелл и/или клеточных компонентов) и (ii) растворимых и/или нерастворимых остатков суспензии (например, примесей, связанных с процессом ферментации/культивирования, таких как минералы и/или микроэлементы).
Далее чистота по меньшей мере в 50% или 60%, более предпочтительно в 70% или 80% и наиболее предпочтительно в 90%, 95% или даже 100%, например, по меньшей мере в 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9% или 100% выделенного нерастворимого искомого белка или агрегата искомого белка более предпочтительно означает, что он по меньшей мере на 50% или 60%, более предпочтительно на 70% или 80% и наиболее предпочтительно на 90%, 95% или даже 100%, например, по меньшей мере на 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9% или 100% свободен от (i) нерастворимых и/или растворимых белков клеток хозяев, еще более предпочтительно свободен от (i) нерастворимых и/или растворимых белков клеток хозяев и (ii) нерастворимых частей клеточной стенки, частей клеточной мембраны, частей цитоскелета, обломков клеток хозяев, цитоплазматических включений, растворимых частей клеточных органелл и/или растворимых клеточных компонентов, а наиболее предпочтительно свободен от (i) нерастворимых и/или растворимых белков клеток хозяев, (ii) нерастворимых частей клеточной стенки, частей клеточной мембраны, частей цитоскелета, обломков клеток хозяев, цитоплазматических включений, растворимых частей клеточных органелл и/или растворимых клеточных компонентов и (iii) растворимых и/или нерастворимых остатков суспензии (например, примесей в связи с ферментацией/культивированием, таких как минералы и/или микроэлементы).
С другой стороны, чистота по меньшей мере в 50% или 60%, более предпочтительно в 70% или 80% и наиболее предпочтительно в 90%, 95% или даже 100%, например, по меньшей мере в 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9% или 100%, выделенного нерастворимого искомого белка или агрегата искомого белка предпочтительно означает, что он содержит не более 50% или 40%, более предпочтительно не более 30% или 20% и наиболее предпочтительно не более 10%, 5% или 0%, например, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% или 0% (i) нерастворимых частей клеток хозяев (например, нерастворимых белков клеток хозяев, частей клеточной стенки, частей клеточной мембраны, частей цитоскелета, обломков клеток хозяев и/или цитоплазматических включений) и/или растворимых частей клеток хозяев (например, растворимых белков клеток хозяев, частей клеточных органелл и/или клеточных компонентов), более предпочтительно (i) нерастворимых частей клеток хозяев (например, нерастворимых белков клеток хозяев, частей клеточной стенки, частей клеточной мембраны, частей цитоскелета, обломков клеток хозяев и/или цитоплазматических включений) и/или растворимых частей клеток хозяев (например, растворимых белков клеток хозяев, частей клеточных органелл и/или клеточных компонентов) и (ii) растворимых и/или нерастворимых остатков суспензии (например, примесей, связанных с процессом ферментации/культивирования, таких как минералы и/или микроэлементы).
Далее, чистота по меньшей мере в 50% или 60%, более предпочтительно в 70% или 80% и наиболее предпочтительно в 90%, 95% или даже 100%, например, по меньшей мере в 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9% или 100% выделенного нерастворимого искомого белка или агрегата искомого белка более предпочтительно означает, что он содержит не более 50% или 40%, более предпочтительно не более 30% или 20% и наиболее предпочтительно не более 10%, 5%, или 0%, например, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% или 0% (i) нерастворимых и/или растворимых белков клеток хозяев, еще более предпочтительно (i) нерастворимых и/или растворимых белков клеток хозяев и (ii) нерастворимых частей клеточной стенки, частей клеточной мембраны, частей цитоскелета, обломков клеток хозяев, цитоплазматических включений, растворимых частей клеточных органелл и/или растворимых клеточных компонентов и наиболее предпочтительно (i) нерастворимых и/или растворимых белков клеток хозяев, (ii) нерастворимых частей клеточной стенки, частей клеточной мембраны, частей цитоскелета, обломков клеток хозяев, цитоплазматических включений и/или растворимых клеточных компонентов и (iii) растворимых и/или нерастворимых остатков суспензии (например, примесей, связанных с процессом ферментации/культивирования, таких как минералы и/или микроэлементы).
Специалистам известны методы определения чистоты нерастворимого искомого белка или агрегата искомого белка, выделенного способом настоящего изобретения.
Чистота выделенного нерастворимого искомого белка или агрегата искомого белка предпочтительно измеряется методом (i) спектрометрии, предпочтительно масс-спектрометрии (MS), (ii) хроматографии, предпочтительно жидкостной хроматографии (LC), более предпочтительно высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC), (iii) гель-электрофореза, предпочтительно гель-электрофореза в присутствии SDS, (iv) Вестерн блота/иммуноблота или (v) их комбинации.
Предпочтительно хроматография, предпочтительно жидкостная хроматография (LC), более предпочтительно высокоэффективная жидкостная хроматография (HPLC) сочетается со спектрометрией, предпочтительно масс-спектрометрией (MS). Соответственно, чистота выделенного нерастворимого искомого белка или агрегата искомого белка предпочтительно измеряется методом жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (LC-MS), более предпочтительно методом высокоэффективной жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (HPLC-MS).
Предпочтительно чистота нерастворимого искомого белка или агрегата искомого белка, выделенного способом настоящего изобретения, рассчитывается в пересчете на сухой вес, например, выражается в % от сухого веса.
Особенно предпочтительно сухой вес выделенного нерастворимого искомого белка или агрегата искомого белка рассчитывается относительно сухого веса (i) нерастворимых и/или растворимых частей клеток хозяев, более предпочтительно (i) нерастворимых и/или растворимых частей клеток хозяев и (ii) растворимых и/или нерастворимых остатков суспензии (см. выше).
Еще более предпочтительно сухой вес выделенного нерастворимого искомого белка или агрегата искомого белка рассчитывается относительно сухого веса (i) нерастворимых и/или растворимых белков клеток хозяев, более предпочтительно (i) нерастворимых и/или растворимых белков клеток хозяев и (ii) нерастворимых частей клеточной стенки, частей клеточной мембраны, частей цитоскелета, обломков клеток хозяев, цитоплазматических включений, растворимых частей клеточных органелл и/или растворимых клеточных компонентов и наиболее предпочтительно (i) нерастворимых и/или растворимых белков клеток хозяев, (ii) нерастворимых частей клеточной стенки, частей клеточной мембраны, частей цитоскелета, обломков клеток хозяев, цитоплазматических включений, растворимых частей клеточных органелл и/или растворимых клеточных компонентов и (iii) растворимых и/или нерастворимых остатков суспензии (например, примесей в связи с ферментацией/культивированием, таких как минералы и/или микроэлементы).
Предпочтительно водный раствор, содержащий основание, на стадии b) имеет рН от 7 до 14, более предпочтительно от 9 до 13 и наиболее предпочтительно от 10 до 12. Например, водный раствор, содержащий основание, на стадии b) имеет рН 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5 или 14.
В предпочтительном воплощении настоящего изобретения основанием является гидроокись металла или аммония. В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения используется гидроокись металла и аммония. Предпочтительно гидроокись металла выбирается из группы, состоящей из гидроокиси натрия (NaOH), гидроокиси калия (KOH) и гидроокиси кальция (СаОН) или их комбинаций. Наиболее предпочтительно основанием является гидроокись натрия (NaOH).
Предпочтительно конечная концентрация основания на стадии b) составляет от 0,005 М до 1 М, предпочтительно от 0,01 М до 0,6 М, более предпочтительно от 0,02 М до 0,2 М, от 0,05 М до 0,15 М или от 0,04 М до 0,1 М и наиболее предпочтительно от 0,04 М до 0,06 М. Например, конечная концентрации основания на стадии b) способа настоящего изобретения составляет 0,005 М, 0,01 М, 0,015 М, 0,02 М, 0,025 М, 0,03 М, 0,035 М, 0,04 М, 0,045 М, 0,05 М, 0,055 М, 0,06 М, 0,065 М, 0,07 М, 0,075 М, 0,08 М, 0,085 М, 0,09 М, 0,095 М, 0,1 М, 0,15 М, 0,2 М, 0,25 М, 0,3 М, 0,35 М, 0,4 М, 0,45 М, 0,5 М, 0,55 М, 0,6 М, 0,65 М, 0,7 М, 0,75 М, 0,8 М, 0,85 М, 0,9 М, 0,95 М или 1 М.
В предпочтительном воплощении способа настоящего изобретения конечная концентрация гидроокиси натрия (NaOH), гидроокиси калия (KOH) и/или гидроокиси кальция (СаОН) на стадии b) составляет от 0,005 М до 1 М, предпочтительно от 0,01 М до 0,6 М, более предпочтительно от 0,02 М до 0,2 М, от 0,05 М до 0,15 М или от 0,04 М до 0,1 М и наиболее предпочтительно от 0,04 М до 0,06 М. Например, конечная концентрация гидроокиси натрия (NaOH), гидроокиси калия (KOH) и/или гидроокиси кальция (СаОН) на стадии b) предпочтительных воплощений способа настоящего изобретения составляет 0,005 М, 0,01 М, 0,015 М, 0,02 М, 0,025 М, 0,03 М, 0,035 М, 0,04 М, 0,045 М, 0,05 М, 0,055 М, 0,06 М, 0,065 М, 0,07 М, 0,075 М, 0,08 М, 0,085 М, 0,09 М, 0,095 М, 0,1 М, 0,15 М, 0,2 М, 0,25 М, 0,3 М, 0,35 М, 0,4 М, 0,45 М, 0,5 М, 0,55 М, 0,6 М, 0,65 М, 0,7 М, 0,75 М, 0,8 М, 0,85 М, 0,9 М, 0,95 М или 1 М.
В более предпочтительных воплощениях способа настоящего изобретения основание на стадии b) представлено гидроокисью натрия (NaOH), причем конечная концентрация гидроокиси натрия (NaOH) на стадии b) составляет от 0,005 М до 1 М, предпочтительно от 0,01 М до 0,6 М, более предпочтительно от 0,02 М до 0,2 М, от 0,05 М до 0,15 М или от 0,04 М до 0,1 М и наиболее предпочтительно от 0,04 М до 0,06 М. Например, конечная концентрация гидроокиси натрия (NaOH) на стадии b) предпочтительных воплощений способа настоящего изобретения составляет 0,005 М, 0,01 М, 0,015 М, 0,02 М, 0,025 М, 0,03 М, 0,035 М, 0,04 М, 0,045 М, 0,05 М, 0,055 М, 0,06 М, 0,065 М, 0,07 М, 0,075 М, 0,08 М, 0,085 М, 0,09 М, 0,095 М, 0,1 М, 0,15 М, 0,2 М, 0,25 М, 0,3 М, 0,35 М, 0,4 М, 0,45 М, 0,5 М, 0,55 М, 0,6 М, 0,65 М, 0,7 М, 0,75 М, 0,8 М, 0,85 М, 0,9 М, 0,95 М или 1 М.
Предпочтительно доля суспензии целых или разрушенных клеток хозяев, например, культуральной среды, среды ферментации, водного раствора (например, буферного водного раствора) или суспензии с влагосодержанием от 5 до 20%, например, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20%, т.е. клеточного осадка к водному раствору, содержащему основание, составляет от 3:1 до 1:20, более предпочтительно от 1:1 до 1:10 и наиболее предпочтительно от 1:2 до 1:4, например, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13. 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20.
Особенно предпочтительно стадия b) настоящего изобретения выполняется с водным раствором, содержащим гидроокись натрия (NaOH) в качестве основания в конечной концентрации от 0,05 М до 0,15 М, предпочтительно в конечной концентрации 0,05 М, в течение периода времени от 10 до 30 мин, предпочтительно от 20 до 30 мин и при температуре от 20 до 25°С, предпочтительно при температуре 20°С.
Предпочтительно для улучшения выхода, чистоты и/или лучшей возможности обработки выделенного нерастворимого искомого белка способ дополнительно включает добавление по меньшей мере одного реагента (i) перед стадией b), (ii) на стадии b) и/или (iii) после стадии b), например, перед стадией b), на стадии b), после стадии b), перед стадией b) и на стадии b), перед стадией b) и после стадии b), на стадии b) и после стадии b) либо перед стадией b), на стадии b) и после стадии b).
Предпочтительно реагент выбирается из группы, состоящей из денатурирующего средства, космотропного средства и детергента или их комбинаций.
Соответственно, в предпочтительном воплощении настоящего изобретения денатурирующее средство, космотропное средство и/или детергент добавляется (i) перед стадией b), (ii) на стадии b) и/или (iii) после стадии b).
Денатурирующие средства усиливают солюбилизацию нерастворимых частей клеток хозяев, тогда как детергенты способствуют солюбилизации клеточной стенки и/или клеточных мембран клеток хозяев, например, микробных клеток хозяев, растительных клеток хозяев или клеток-хозяев насекомых. А космотропные средства способствуют стабилизации агрегатов искомого белка.
Так, предпочтительно в суспензию целых клеток хозяев, например, бактериальных или растительных клеток хозяев, перед стадией b), на стадии b) и/или после стадии b) добавляется детергент, способствующий солюбилизации клеточной стенки и/или клеточных мембран, предпочтительно в комбинации с денатурирующим средством, которое дополнительно усиливает солюбилизацию оставшихся нерастворимых частей клеток хозяев. А в суспензию уже разрушенных клеток хозяев, например, бактериальных или растительных клеток хозяев, перед стадией b), на стадии b) или после стадии b) предпочтительно также добавляется денатурирующее средство, которое усиливает солюбилизацию оставшихся нерастворимых частей клеток хозяев, предпочтительно в комбинации с космотропным средством, которое стабилизирует нерастворимые агрегаты искомого белка.
Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что добавление денатурирующего средства, космотропного средства и/или детергента перед стадией b), на стадии b) и/или после стадии b) может увеличить чистоту выделенного нерастворимого искомого белка примерно на 5-20%, например, на 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20%, и/или выход выделенного нерастворимого искомого белка на 5-20% например, на 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20%. Например, выделенный нерастворимый искомый белок с чистотой после стадии с) в 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 или 95% без добавления денатурирующего средства, космотропного средства и/или детергента перед стадией b), на стадии b) и/или после стадии b) может иметь чистоту в 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% после добавления денатурирующего средства, космотропного средства и/или детергента перед стадией b), на стадии b) и/или после стадии b).
Предпочтительно (i) денатурирующим средством является мочевина (CH4N2O) или гуанидиний гидрохлорид (CH5N3·HCl), (ii) космотропным средством - соль фосфата или соль сульфата, a (iii) детергентом - Tween 20, Tween 60, Tween 80, Triton X-15, Triton X-45, Triton X-100, Triton X-102, Triton X-114, Triton X-151, Triton X-165, Triton X-200, Triton X-207, Triton X-301, Triton X-305, Triton X-405, Triton X-705, SDS или Brij. Специалист в этой области сможет выбрать и другие подходящие денатурирующие средства, космотропные средства или детергенты.
Предпочтительно соль фосфата представлена фосфатом аммония, фосфатом калия или фосфатом натрия. Соль фосфата может уменьшить растворимость искомого белка или агрегатов искомого белка в суспензии целых или разрушенных клеток хозяев, например, в водном растворе, в среде ферментации, культуральной среде, в технической воде или деионизированной воде. Предпочтительно соль сульфата представлена сульфатом аммония.
Предпочтительно конечная концентрация мочевины составляет от 0,1 М до 10 М, предпочтительно от 1 М до 5 М и более предпочтительно от 4 до 5 М. Например, конечная концентрация мочевины составляет 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5 или 10 М. Также предпочтительно конечная концентрация гуанидиния гидрохлорида составляет от 0,01 М до 3 М, предпочтительно от 0,1 М до 2 М. Например, конечная концентрация гуанидиния гидрохлорида составляет 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9 или 3 М.
В предпочтительном воплощении настоящего изобретения искомый белок или агрегат искомого белка остается нерастворимым по меньшей мере на 85%, предпочтительно на 90% и более предпочтительно на 95% или даже на 100% в водном растворе, содержащем гидроокись натрия (NaOH) (например, в конечной концентрации от 0,005 М до 0,5 М) и гуанидиний гидрохлорид (CH5N3HCl) (например, в конечной концентрации от 0,01 М до 3 М) или мочевину (например, в конечной концентрации от 0,1 М до 10 М), в течение периода времени от 20 до 40 мин при температуре от 20°С до 25°С.
В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения искомый белок, например, белок шелка паука типа белка паутины C16, или агрегат искомого белка остается нерастворимым по меньшей мере на 85%, предпочтительно на 90% и более предпочтительно на 95% или даже на 100% в водной среде, содержащей гидроокись натрия (NaOH) (например, в конечной концентрации от 0,005 М до 0,2 М) и гуанидиний гидрохлорид (CH5N3HCl) (например, в конечной концентрации от 0,1 М до 2 М) или мочевину (например, в конечной концентрации от 1 М до 5 М), в течение периода времени от 20 до 40 мин при температуре от 20°С до 25°С.
В следующем предпочтительном воплощении настоящего изобретения искомый белок, например, белок шелка паука типа белка паутины C16, или агрегат искомого белка остается нерастворимым по меньшей на 85%, предпочтительно на 90% и более предпочтительно на 95% или даже на 100% в водной среде, содержащей гидроокись натрия (NaOH) в конечной концентрации 0,5 М, в течение 30 мин при температуре от 20 до 25°С.
Предпочтительно отделение нерастворимого искомого белка или агрегата нерастворимого искомого белка от солюбилизированных нерастворимых частей клеток хозяев на стадии с) осуществляется центрифугированием. Стадия центрифугирования позволяет отделить твердую фазу, содержащую нерастворимый искомый белок или агрегат нерастворимого искомого белка, от жидкой фазы, например, водного раствора (например, буферного водного раствора), культуральной среды, среды ферментации, технической воды или деионизированной воды, содержащей солюбилизированные нерастворимые части клеток хозяев (например, белки клеток хозяев, обломки клеток хозяев) и необязательно солюбилизированные нерастворимые остатки (например, остатки от ферментации), растворимые части клеток хозяев и/или другие растворимые примеси. После стадии центрифугирования нерастворимый искомый белок или агрегат нерастворимого искомого белка присутствует в виде осадка, тогда как супернатант содержит солюбилизированные нерастворимые части клеток хозяев и необязательно солюбилизированные нерастворимые остатки (например, остатки ферментации), растворимые клеточные части и/или другие растворимые примеси и может быть отброшен. Так, специалистам должно быть ясно, что во время этой стадии отделения нерастворимый искомый белок отделяется от солюбилизированных нерастворимых частей клеток хозяев и необязательно от растворимых частей клеток хозяев, которые присутствуют или все еще присутствуют в жидкой фазе, например, водном растворе или культуральной среде.
Также предпочтительно отделение нерастворимого искомого белка или агрегата нерастворимого искомого белка от солюбилизированных нерастворимых частей клеток хозяев на стадии с) осуществляется фильтрацией. В этом способе разделения нерастворимый искомый белок концентрируется пропусканием жидкой фазы, например, водного раствора (например, буферного водного раствора), культуральной среды, среды ферментации, технической воды или деионизированной воды, содержащей нерастворимый искомый белок, солюбилизированные нерастворимые части клеток хозяев и необязательно солюбилизированные растворимые остатки (например, остатки ферментации), растворимые части клеток хозяев и/или другие растворимые примеси, через мембранный фильтр, который удерживает нерастворимый искомый белок и пропускает солюбилизированные части клеток хозяев и необязательно солюбизилированные нерастворимые остатки (например, остатки ферментации), растворимые части клеток хозяев и/или другие растворимые загрязнения. Так, специалистам должно быть ясно, что на стадии разделения нерастворимый искомый белок отделяется от солюбилизированных нерастворимых частей клеток хозяев и необязательно от растворимых частей клеток хозяев, которые присутствуют или все еще присутствуют в жидкой фазе, например, водном растворе или культуральной среде, пропускаемой через мембранный фильтр. В предпочтительных воплощениях способа настоящего изобретения прохождение жидкой фазы, например, водного раствора (например, буферного водного раствора), культуральной среды, среды ферментации, технической воды или деионизированной воды, содержащей нерастворимый искомый белок и солюбилизированные нерастворимые части клеток хозяев, ускоряется под действием гравитационной силы, давления, вакуума и/или центрифугирования.
Также предпочтительно отделение нерастворимого искомого белка от солюбилизированных нерастворимых частей клеток хозяев на стадии с) осуществляется седиментацией. В этом способе разделения нерастворимый искомый белок или агрегат нерастворимого искомого белка выпадает в осадок из жидкой фазы, например, водного раствора (например, буферного водного раствора), культуральной среды, среды ферментации, технической воды или деионизированной воды, в которой он содержится, и оседает на стенках. Это обусловлено продвижением нерастворимого искомого белка или агрегата нерастворимого искомого белка через жидкость в ответ на силы, действующие на него, например, гравитацию. Солюбилизированные нерастворимые части клеток хозяев и необязательно солюбилизированные нерастворимые остатки (например, остатки ферментации), растворимые части клеток хозяев и/или другие растворимые примеси остаются в растворе, образуют супернатант и поэтому просто могут быть отброшены.
Особенно предпочтительно отделение нерастворимого искомого белка от солюбилизированных нерастворимых частей клеток хозяев на стадии с) осуществляется комбинацией центрифугирования, седиментации и/или фильтрации, например, центрифугирования и фильтрации, седиментации и фильтрации, седиментации и центрифугирования или центрифугирования, седиментации и фильтрации.
В зависимости от различных нерастворимых искомых белков параметры центрифугирования, седиментации или фильтрации могут отличаться. Специалист в данной области легко сможет адаптировать соответствующие параметры разделения, например, ускорение силы тяжести G и/или время при использовании центрифугирования для разделения, размер фильтра при использовании фильтрации для разделения и/или время седиментации при использовании седиментации для разделения, чтобы отделить солюбилизированные нерастворимые части клеток хозяев от нерастворимого искомого белка.
Предпочтительно центрифугирование проводится при таком ускорении силы тяжести G и/или в течение такого времени центрифугирования, которые достаточны для осаждения по меньшей мере 80%, более предпочтительно 90% и наиболее предпочтительно 95% или даже 100%, например, по меньшей мере 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9% или 100% нерастворимого искомого белка или нерастворимого агрегата искомого белка, тогда как солюбилизированные части клеток хозяев или большинство солюбилизированных частей клеток хозяев останутся в растворе. В предпочтительном воплощении способа настоящего изобретения центрифугирование проводится при 3000×g - 12000×g, например, при 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10000, 10500, 11000, 11500 или 12000×g, и/или в течение 10-40 мин, например, в течение 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 мин. Эти параметры центрифугирования позволяют осадить по меньшей мере 80%, предпочтительно 90% и более предпочтительно 95% или даже 100%, например, по меньшей мере 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9% или 100% нерастворимого искомого белка или агрегата нерастворимого искомого белка, тогда как солюбилизированные нерастворимые части клеток хозяев или большинство солюбилизированных нерастворимых частей клеток хозяев останутся в растворе.
То же самое относится к седиментации или фильтрации. Предпочтительно осаждение ведется в течение такого времени, которое достаточно для осаждения по меньшей мере 80%, более предпочтительно 90% и наиболее предпочтительно 95% или даже 100%, например, по меньшей мере 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9% или 100% нерастворимого искомого белка или агрегата нерастворимого искомого белка, тогда как солюбилизированные нерастворимые части клеток хозяев или большинство солюбилизированных нерастворимых частей клеток хозяев останутся в растворе и легко могут быть удалены. В предпочтительном воплощении способа настоящего изобретения седиментация проводится в течение периода времени от 1 до 24 часов, предпочтительно от 3 до 15 часов, более предпочтительно от 5 до 10 часов, например, в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 часов. Время осаждения, указанное выше, позволяет осадить по меньшей мере 80%, предпочтительно 90% и более предпочтительно 95% или даже 100%, например, по меньшей мере 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9% или 100% нерастворимого искомого белка или агрегата нерастворимого искомого белка, тогда как солюбилизированные нерастворимые части клеток хозяев или большинство солюбилизированных нерастворимых частей клеток хозяев останутся в растворе.
Предпочтительно фильтрация проводится на фильтрах таким с размером пор, который достаточен для удержания по меньшей мере 80%, более предпочтительно 90% и наиболее предпочтительно 95% или даже 100%, например, по меньшей мере 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9% или 100% нерастворимого искомого белка или агрегата нерастворимого искомого белка, тогда как солюбилизированные нерастворимые части клеток хозяев или большинство солюбилизированных нерастворимых частей клеток хозяев могут проходить через поры фильтра. Таким образом, в случае применения фильтрации как способа разделения, размер пор фильтра может быть слегка меньше, чем размер нерастворимого искомого белка или агрегата нерастворимого искомого белка. В предпочтительном воплощении способа настоящего изобретения фильтрация проводится с фильтрами, у которых размером пор составляет от 10 нм до 200 нм, предпочтительно от 20 нм до 180 нм и боолее предпочтительно от 50 до 100 нм, например, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 или 200 нм. Такие параметры размера пор фильтров позволяют удержать по меньшей мере 80%, предпочтительно 90% и более предпочтительно 95% или даже 100%, например, по меньшей мере 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9% или 100% нерастворимого искомого белка или агрегата нерастворимого искомого белка, тогда как солюбилизированные нерастворимые части клеток хозяев или большая часть солюбилизированных нерастворимых частей клеток хозяев может проходить через поры фильтра.
Предпочтительно для улучшения смешивания уже солюбилизированных и/или неполностью солюбилизированных нерастворимых частей клеток хозяев в суспензии и/или для улучшения образования меньших фрагментов из уже солюбилизированных и/или не полностью солюбилизированных нерастворимых частей клеток хозяев, чтобы облегчить отделение нерастворимого искомого белка или агрегата нерастворимого искомого белка от солюбилизированных и/или не полностью солюбилизированных нерастворимых частей клеток хозяев на стадии с), способ после стадии b) и перед стадией с) дополнительно включает стадию b') гомогенизации данной суспензии, предпочтительно с помощью гомогенизатора (например, по методике, описанной в примере 1) или посредством лизиса клеток, предпочтительно с использованием соответствующих ферментов. В качестве альтернативы гомогенизация данной суспензии осуществляется при помощи шаровой мельницы или обработки ультразвуком.
Предпочтительно для того, чтобы удалить дальнейшие примеси, как-то осколки клеток, остатки ферментации, основание, денатурирующее средство, детергент и/или соли, способ настоящего изобретения после стадии с) дополнительно включает стадию d) промывки отделенного нерастворимого искомого белка или агрегата нерастворимого искомого белка, предпочтительно центрифугата, выпавшего осадка или ретентата. Более предпочтительно способ настоящего изобретения после стадии с) дополнительно включает стадию d) промывки отделенного нерастворимого искомого белка или агрегата нерастворимого искомого белка, предпочтительно центрифугата, выпавшего осадка или ретентата водным раствором, органическим раствором и/или мочевиной.
Эта дополнительная стадия очистки может потребоваться в случаях, когда на стадии а) способа настоящего изобретения предусмотрена культуральная среда, содержащая целые клетки хозяева, содержащие нерастворимый искомый белок. Эта стадия может и не потребоваться в тех случаях, когда на стадии а) способа настоящего изобретения предусмотрен полученный седиментацией или центрифугированием осадок клеток хозяев, ресуспендированный в воде или водном растворе. В последнем случае клетки хозяева уже отделены или в основном отделены от культуральной среды или среды ферментации и тем самым от всех или почти всех остатков ферментации и/или примесей.
Предпочтительно водный раствор представляет собой буферный водный раствор. Кроме того, предпочтительно органический раствор содержит этанол (EtOH), метанол (СН3ОН), гексан (С6Н14), диэтиловый эфир (С4Н10О) и/или изопропанол (C3H8O).
Как указано выше, в более предпочтительном воплощении способа настоящего изобретения отделенный нерастворимый искомый белок или агрегат нерастворимого искомого белка, предпочтительно центрифугат, выпавший осадок или ретентат после стадии с) промывают на стадии d) мочевиной. Применение мочевины позволяет дополнительно удалить потенциально оставшиеся белки клеток хозяев, которые не были отделены на стадии с).
Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что последующая стадия промывки d) может увеличить чистоту выделенного нерастворимого искомого белка примерно на 5-20%, например, на 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20%. Например, выделенный нерастворимый искомый белок, имеющий после стадии отделения с) чистоту 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 или 95% без последующей стадии промывки d), может иметь чистоту в 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% после последующей стадии промывки d).
Предпочтительно способ настоящего изобретения выполняется при температуре от 4°С до 60°С, более предпочтительно от 15°С до 40°С и наиболее предпочтительно от 15°С до 25°С или от 20°С до 25°С, например, при 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 или 60°С.
Предпочтительно способ настоящего изобретения выполняется при давлении от 10 кПа до 1000 кПа, предпочтительно от 50 кПа до 150 кПа, например, при 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 или 1000 кПа.
Предпочтительно способ выделения нерастворимого искомого белка (например, белка шелка паука) из культуральной среды, клеточного осадка или буферного раствора целых бактериальных клеток хозяев включает стадии:
a) получение (i) культуральной среды целых бактериальных клеток хозяев, содержащих нерастворимый искомый белок (например, белок шелка паука) и нерастворимые части бактериальных клеток хозяев, (ii) клеточного осадка целых бактериальных клеток хозяев, содержащих нерастворимый искомый белок (например, белок шелка паука) и нерастворимые части бактериальных клеток хозяев, предпочтительно с остаточным влагосодержанием 20%, или (iii) буферного раствора, в котором этот клеточный осадок ресуспендирован,
b) добавление NaOH в конечной концентрации от 0,05 М до 0,15 М, предпочтительно 0,05 М, к данной (i) культуральной среде, (ii) клеточному осадку или (iii) буферному раствору для разрушения данных бактериальных клеток хозяев и солюбилизации нерастворимых частей бактериальных клеток хозяев, и
c) отделение нерастворимого искомого белка (например, белка шелка паука) от солюбилизированных нерастворимых частей бактериальных клеток хозяев посредством центрифугирования при ускорении от 3000×g до 12000×g, т.е. нерастворимый искомый белок находится в осадке, а солюбилизированные нерастворимые части клеток хозяев - в супернатанте, который можно отбросить,
причем на стадии b) искомый белок остается нерастворимым, а по меньшей мере 80% или 85%, предпочтительно 95% нерастворимых частей бактериальных клеток хозяев подвергаются солюбилизации.
Также предпочтительно способ выделения нерастворимого искомого белка (например, белка шелка паука) из культуральной среды, клеточного осадка или буферного раствора разрушенных бактериальных клеток хозяев включает стадии:
a) получение (i) культуральной среды разрушенных бактериальных клеток хозяев, содержащих нерастворимый искомый белок (например, белок шелка паука) и нерастворимые части бактериальных клеток хозяев, (ii) клеточного осадка разрушенных бактериальных клеток хозяев, содержащих нерастворимый искомый белок (например, белок шелка паука) и нерастворимые части бактериальных клеток хозяев, предпочтительно с остаточным влагосодержанием 15%, или (iii) буферного раствора, в котором данный клеточный осадок ресуспендирован,
b) добавление NaOH до конечной концентрации от 0,05 М до 0,15 М, предпочтительно 0,15 М, к данной (i) культуральной среде, (ii) клеточному осадку или (iii) буферному раствору для солюбилизации нерастворимых частей бактериальных клеток хозяев, и
c) отделение нерастворимого искомого белка (например, белка шелка паука) от солюбилизированных нерастворимых частей бактериальных клеток хозяев посредством центрифугирования при ускорении от 3000×g до 12000×g, т.е. нерастворимый искомый белок находится в осадке, а солюбилизированные нерастворимые части клеток хозяев - в супернатанте, который можно отбросить,
причем на стадии b) искомый белок остается нерастворимым, а по меньшей мере 80% или 85%, предпочтительно 95% нерастворимых частей бактериальных клеток хозяев подвергаются солюбилизации.
Термины "полипептид" и "белок" здесь применяются взаимозаменяемым образом и обозначают любую соединенную пептидными связями цепь аминокислот, независимо от длины или посттрансляционной модификации.
Любой нерастворимый искомый белок, предпочтительно агрегат нерастворимого искомого белка, как определено выше, может быть выделен способом настоящего изобретения. Однако предпочтительно нерастворимый искомый белок, предпочтительно агрегат нерастворимого искомого белка выбирается из группы, состоящей из белка шелка, в частности белка шелка, содержащего по меньшей мере два идентичных повторяющихся звена (например, белок шелка членистоногих типа белка шелка паука или белок шелка насекомых), коллагена, резилина и кератина. Предпочтительно коллаген представляет собой биссусный белок мидий или коллаген человека. Предпочтительно кератин представляет собой кератин человека.
В контексте настоящего изобретения термины "белок шелка", "коллаген", "резилин" или "кератин" могут относиться к белкам типа рекомбинантных белков, которые экспрессируются в клетках хозяевах (например, микробных, клетках насекомых или растений) типа рекомбинантных клеток хозяев или в системе экспрессии (например, в экспрессионной системе микробов, насекомых или растений) типа рекомбинантной системы экспрессии, то есть отдельно от своей естественной среды. Кроме того, в контексте настоящего изобретения термины "выделенный белок шелка", "выделенный коллаген", "выделенный резилин" или "выделенный кератин" могут относиться к белкам типа рекомбинантных белков, которые экспрессируются в клетках хозяевах (например, микробных, клетках насекомых или растений) типа рекомбинантных клеток хозяев или в системе экспрессии (например, в экспрессионной системе микробов, насекомых или растений) типа рекомбинантной системы экспрессии, то есть отдельно от своей естественной среды, причем он (белок) выделен из данных клеток хозяев или данной системы экспрессии. При этом вышеуказанные термины "экспрессионная система" и "клетки хозяева" применяются взаимозаменяемым образом.
"Белок шелка" в контексте настоящего изобретения также означает белок с аминокислотной последовательностью, содержащей или состоящей по меньшей мере на 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, предпочтительно по меньшей мере на 95% и наиболее предпочтительно на 100% из множественных копий одного идентичного повторяющегося звена (например, А2, Q6 или C16, причем цифры 2, 6 или 16 означают число повторяющихся звеньев) или множественных копий двух или нескольких различных повторяющихся звеньев (например, (AQ)24 или (AQ)12C16).
Термины "повторяющееся звено" и "повтор" могут применяться взаимозаменяемо в контексте настоящего изобретения.
В контексте настоящего изобретения термин "белок шелка" также означает белок шелка, содержащий или состоящий из по меньшей мере двух идентичных повторяющихся звеньев, содержащих или состоящих из идентичных копий аминокислотных последовательностей природных полипептидов шелка или вариантов аминокислотных последовательностей природных полипептидов шелка или комбинаций того и другого.
В контексте настоящего изобретения "повторяющееся звено" означает участок, который по аминокислотной последовательности соответствует участку, содержащему или состоящему из по меньшей мере одного пептидного мотива (например, АААААА (SEQ ID NO:13) или GPGQQ (SEQ ID NO:4)), многократно встречающегося в природном полипептиде шелка (например, MaSpI, ADF-3, ADF-4 или Flag) (т.е. это идентичная аминокислотная последовательность), или аминокислотной последовательности, существенно сходной с ним (т.е. варианта аминокислотной последовательности). В этой связи "существенно сходная" означает степень идентичности аминокислот по меньшей мере на 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или даже на 99,9%, предпочтительно по всей длине соответствующей контрольной природной аминокислотной последовательности. "Повторяющееся звено", у которого аминокислотная последовательность "существенно сходна" с соответствующей аминокислотной последовательностью в природном полипептиде шелка (т.е. повторяющимся звеном дикого типа) также похожа по своим свойствам, например, белок шелка, содержащий "существенно сходное повторяющееся звено", все так же нерастворим и сохраняет свою нерастворимость и поэтому может быть отделен от солюбилизированных нерастворимых частей клеток хозяев на стадии с) способа настоящего изобретения. Предпочтительно белок шелка, содержащий "существенно сходное повторяющееся звено", нерастворим в водном растворе, например, буферном водном растворе, в культуральной среде, среде ферментации, в технической воде или деионизированной воде и остается нерастворимым более чем на 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9% или даже 100% в водном растворе, например, буферном водном растворе, в культуральной среде, среде ферментации, в технической воде или деионизированной воде, содержащих основание (например, NaOH от 0,005 до 1М) на протяжении от 10 до 90 минут, например, в течение 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 или 90 минут и/или при температуре от 4 до 60°С, например, при 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55 или 60°С. В предпочтительном воплощении настоящего изобретения белок шелка, содержащий "существенно сходное повторяющееся звено", который остается нерастворимым, отделяется от солюбилизированных нерастворимых частей клеток хозяев посредством фильтрации, предпочтительно с помощью мембранного фильтра с размером пор от 10 нм до 200 нм, и/или путем центрифугирования, предпочтительно при 3000-12000×g, более предпочтительно при 4000-8000×g в течение 10-40 мин, предпочтительно 20-40 мин.
"Повторяющееся звено", у которого аминокислотная последовательность "идентична" аминокислотной последовательности природного полипептида шелка к примеру, может быть частью полипептида шелка, соответствующей одному или нескольким пептидным мотивам MaSp I (SEQ ID NO:43), MaSp II (SEQ ID NO:44), ADF-3 (SEQ ID NO:1) и/или ADF-4 (SEQ ID NO:2). "Повторяющееся звено", у которого аминокислотная последовательность "существенно сходна" с аминокислотной последовательностью природного полипептида шелка, к примеру, может быть частью полипептида шелка, соответствующей одному или нескольким пептидным мотивам MaSpI (SEQ ID NO:43), MaSpII (SEQ ID NO:44), ADF-3 (SEQ ID NO:1) и/или ADF-4 (SEQ ID NO:2), но с одной или несколькими заменами аминокислот в определенных положениях.
"Повторяющееся звено" не включает неповторяющийся гидрофильный аминокислотный домен, который, как обычно считается, находится на N- и/или С-конце природных полипептидов шелка.
"Повторяющееся звено" по настоящему изобретению также относится к аминокислотной последовательности длиной от 3 до 200 аминокислот или от 5 до 150 аминокислот, предпочтительно длиной от 10 до 100 аминокислот или от 15 до 80 аминокислот и более предпочтительно длиной от 18 до 60 или от 20 до 40 аминокислот. Например, повторяющееся звено по настоящему изобретению может иметь длину в 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195 или 200 аминокислот. Наиболее предпочтительно повторяющееся звено по настоящему изобретению состоит из 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 18, 20, 24, 27, 28, 30, 34, 35 или 39 аминокислот.
Белок шелка, выделенный способом настоящего изобретения, предпочтительно состоит из 6-1500 аминокислот или из 200-1300 аминокислот и наиболее предпочтительно из 250-1200 аминокислот или 500-1000 аминокислот.
Предпочтительно белок шелка, выделенный способом настоящего изобретения, содержит или состоит из 2-80 повторяющихся звеньев, из 3-80 повторяющихся звеньев или из 4-60 повторяющихся звеньев, более предпочтительно из 8-48 повторяющихся звеньев или из 10-40 повторяющихся звеньев и наиболее предпочтительно из 16-32 повторяющихся звеньев. Например, белок шелка, выделенный способом настоящего изобретения, может содержать или состоять из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 15 16 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 или 80 повторяющихся звеньев. Наиболее предпочтительно полипептид шелка содержит 4, 8, 12, 16, 24, 32 или 48 повторяющихся звеньев. Как указано выше, по меньшей мере два повторяющихся звена, содержащиеся в полипептиде шелка, выделенном способом настоящего изобретения, являются идентичными повторяющимися звеньями. Так, полипептид шелка, выделенный способом настоящего изобретения, может содержать множественные копии одного идентичного повторяющегося звена (например, А2 или C16, где цифры 2 или 16 означают количество повторяющихся звеньев) или множественные копии двух или нескольких различных повторяющихся звеньев (например, (AQ)24 или (QAQ)8). Например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 или 80 из 80 повторяющихся звеньев, которые могут содержаться в полипептиде шелка, выделенном способом настоящего изобретения, являются идентичными повторяющимися звеньями.
Полипептид шелка, выделенный способом настоящего изобретения, может содержать или состоять из аминокислотной последовательности любого полипептида шелка, известного специалистам в данной области. Предпочтительно полипептид шелка, выделенный способом настоящего изобретения, содержит или состоит из аминокислотной последовательности полипептида шелка членистоногих, предпочтительно полипептида шелка паука, или полипептида шелка насекомых. Полипептид шелка, выделенный способом настоящего изобретения, также может содержать или состоять из аминокислотной последовательности полипептида шелка мидий.
Предпочтительно полипептид шелка паука содержит или состоит из аминокислотной последовательности паутинного полипептида большой ампуловидной (ampullate major) железы, как-то полипептида каркасной нити (dragline), полипептида малой ампуловидной (ampullate minor) железы, полипептида жгутиковидной (flagelliform) железы, полипептида дольковидной (aggregate) железы, полипептида гроздевидной (aciniform) железы или полипептида грушевидной (pyriform) железы. Наиболее предпочтительно полипептид шелка паука содержит или состоит из аминокислотной последовательности полипептида каркасной нити или паутинного полипептида жгутиковидной железы. Аминокислотную последовательность полипептида каркасной нити или паутинного полипептида жгутиковидной железы обычно предпочтительно выбирают из полипептида каркасной нити или паутинного полипептида жгутиковидной железы пауков-кругопрядов Araneidae или Araneoids.
Предпочтительно полипептид шелка насекомых содержит или состоит из аминокислотной последовательности полипептида шелка Lepidoptera. Более предпочтительно полипептид шелка насекомых содержит или состоит из аминокислотной последовательности полипептида шелка Bombycidae, наиболее предпочтительно - Bombyx mori.
Предпочтительно вышеуказанные полипептиды шелка получают рекомбинантным способом, т.е. это рекомбинантные полипептиды шелка. Например, полипептиды шелка, выделенные способом настоящего изобретения, являются рекомбинантными полипептидами шелка пауков типа полипептидов каркасной нити или паутинных полипептидов жгутиковидной железы, рекомбинантными полипептидами шелка насекомых или рекомбинантными полипептидами шелка мидий.
Повторяющееся звено полипептида шелка, выделенного способом настоящего изобретения, может содержать или состоять из аминокислотной последовательности любого участка, содержащего или состоящего по меньшей мере из одного пептидного мотива, который многократно встречается в природном полипептиде шелка, известном специалистам. Предпочтительно повторяющееся звено полипептида шелка, выделенного способом настоящего изобретения, содержит или состоит из аминокислотной последовательности участка, содержащего или состоящего по меньшей мере из одного полипептидного мотива, который многократно встречается в природном полипептиде шелка членистоногих, более предпочтительно в полипептиде шелка паука или полипептиде шелка насекомых. Повторяющееся звено полипептида шелка, выделенного способом настоящего изобретения, также может содержать или состоять из аминокислотной последовательности участка, содержащего или состоящего по меньшей мере из одного пептидного мотива, который многократно встречается в полипептиде шелка мидий.
Предпочтительно повторяющееся звено полипептида шелка паука содержит или состоит из аминокислотной последовательности участка, содержащего или состоящего из по меньшей мере одного пептидного мотива, который многократно встречается в природном полипептиде большой ампуловидной железы типа паутинного полипептида каркасной нити, паутинном полипептиде малой ампуловидной железы, жгутиковидной железы, дольковидной железы, гроздевидной железы или грушевидной железы. Наиболее предпочтительно повторяющееся звено содержит или состоит из аминокислотной последовательности участка, содержащего или состоящего по меньшей мере из одного пептидного мотива, который многократно встречается в природном полипептиде каркасной нити или паутинном полипептиде жгутиковидной железы.
Предпочтительно повторяющееся звено шелка насекомых содержит или состоит из аминокислотной последовательности участка, содержащего или состоящего по меньшей мере из одного пептидного мотива, который многократно встречается в природном полипептиде шелка Lepidoptera. Более предпочтительно повторяющееся звено шелка насекомых содержит или состоит из аминокислотной последовательности участка, содержащего или состоящего по меньшей мере из одного пептидного мотива, который многократно встречается в природном полипептиде шелка насекомых Bombycidae, наиболее предпочтительно - Bombyx mori.
Термин "консенсусная последовательность" в контексте настоящего изобретения относится к аминокислотной последовательности, содержащей аминокислоты, которые часто встречаются в определенном положении (например, "G"), при этом другие аминокислоты, которые точно не установлены, заменяются символом-заполнителем "X".
Предпочтительно белок шелка, выделенный способом настоящего изобретения, содержит, в основном состоит или состоит из по меньшей мере двух идентичных повторяющихся звеньев, каждое из которых содержит по меньшей мере одну, предпочтительно одну консенсусную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
i) GPGXX (SEQ ID NO:3), где X - любая аминокислота, предпочтительно в каждом случае выбранная независимо из числа A, S, G, Y, Р и Q;
ii) GGX, где Х - любая аминокислота, предпочтительно в каждом случае выбранная независимо из числа Y, Р, R, S, А, Т, N и Q, более предпочтительно в каждом случае выбранная независимо из числа Y, Р и Q; и
iii) Ax, где x - целое число от 5 до 10.
Также предпочтительно белок шелка, выделенный способом настоящего изобретения, содержит или состоит по меньшей мере из двух идентичных повторяющихся звеньев, каждое из которых содержит по меньшей мере одну, предпочтительно одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: GGRPSDTYG (SEQ ID NO:18) и GGRPSSSYG (SEQ ID NO:19).
Повторяющиеся (пептидные) мотивы GPGXX (SEQ ID NO:3) и GGX, т.е. обогащенные глицином мотивы, придают гибкость полипептиду шелка, а тем самым и нити, образованной белком шелка, содержащим данные мотивы. Так, повторный мотив GPGXX (SEQ ID NO:3) образует спиральные β-структуры, что придает эластичность полипептидам шелка. Белки шелка большой ампуловидной и жгутиковидной железы содержат мотив GPGXX (SEQ ID NO:3). Повторяющийся мотив GGX связан со спиральной структурой, содержащей по три аминокислоты на виток, и встречается у большинства паутинных белков. Мотив GGX может придавать дополнительные эластические свойства шелку. Повторяющийся полиаланиновый (пептидный) мотив Ax образует кристаллическую складчатую β-структуру, придающую прочность полипептиду шелка (WO 03/057727). (Пептидные) мотивы GGRPSDTYG (SEQ ID NO:18) и GGRPSSSYG (SEQ ID NO:19) были выбраны из резилина (WO 2008/155304). Резилин - это эластомерный белок, встречающийся у большинства членистоногих (arthropoda). Он локализован в специализированных участках кутикулы, придавая ей низкую жесткость и высокую прочность (Elvin et al., Nature (473):999-1002, 2005).
Таким образом, в предпочтительном воплощении настоящего изобретения белок шелка содержит или состоит из повторяющихся звеньев, каждое из которых содержит по меньшей мере одну (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9), предпочтительно одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из GPGAS (SEQ ID NO:5), GPGSG (SEQ ID NO:6), GPGGY (SEQ ID NO:7), GPGGP (SEQ ID NO:8), GPGGA (SEQ ID NO:9), GPGQQ (SEQ ID NO:4), GPGGG (SEQ ID NO:10), GPGQG (SEQ ID NO:40) и GPGGS (SEQ ID NO:11). В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения полипептид шелка содержит или состоит из повторяющихся звеньев, каждое из которых содержит по меньшей мере одну (например, 1, 2, 3, 4, 5, 8, 7 или 8), предпочтительно одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из GGY, GGP, GGA, GGR, GGS, GGT, GGN, и GGQ. В еще одном предпочтительном воплощении настоящего изобретения полипептид шелка содержит или состоит из повторяющихся звеньев, каждое из которых содержит по меньшей мере одну (например, 1, 2, 3, 4, 5 или б), предпочтительно одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из ААААА (SEQ ID NO:12), АААААА (SEQ ID NO:13), AAAAAAA (SEQ ID NO:14), AAAAAAAA (SEQ ID NO:15), AAAAAAAAA (SEQ ID NO:16) и АААААААААА (SEQ ID NO:17).
В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения белок шелка содержит или состоит из повторяющихся звеньев, каждое из которых содержит по меньшей мере одну (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25), предпочтительно одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из GPGAS (SEQ ID NO:5), GPGSG (SEQ ID NO:6), GPGGY (SEQ ID NO:7), GPGGP (SEQ ID NO:8), GPGGA (SEQ ID NO:9), GPGQQ (SEQ ID NO:4), GPGGG (SEQ ID NO:10), GPGQG (SEQ ID NO:40), GPGGS (SEQ ID NO:11), GGY, GGP, GGA, GGR, GGS, GGT, GGN, GGQ, ААААА (SEQ ID NO:12), АААААА (SEQ ID NO:13), AAAAAAA (SEQ ID NO:14), AAAAAAAA (SEQ ID NO:15), AAAAAAAAA (SEQ ID NO:16), АААААААААА (SEQ ID NO:17), GGRPSDTYG (SEQ ID NO:18) и GGRPSSSYG (SEQ ID NO:19).
Наиболее предпочтительно белок шелка, выделенный способом настоящего изобретения, содержит, в основном состоит или состоит из повторяющихся звеньев, содержащих или состоящих из:
(i) GPGAS (SEQ ID NO:5), AAAAAA (SEQ ID NO:13), GGY и GPGSG (SEQ ID NO:6) в качестве аминокислотной последовательности, предпочтительно в этом порядке,
(ii) AAAAAAAA (SEQ ID NO:15), GPGGY (SEQ ID NO:7), GPGGY (SEQ ID NO:7) и GPGGP (SEQ ID NO:8) в качестве аминокислотной последовательности, предпочтительно в этом порядке,
(iii) GPGQQ (SEQ ID NO:4), GPGQQ (SEQ ID NO:4), GPGQQ (SEQ ID NO:4) и GPGQQ (SEQ ID NO:4) в качестве аминокислотной последовательности,
(iv) GPGGA (SEQ ID NO:9), GGP, GPGGA (SEQ ID NO:9), GGP, GPGGA (SEQ ID NO:9) и GGP в качестве аминокислотной последовательности, предпочтительно в этом порядке,
(v) AAAAAAAA (SEQ ID NO:15), GPGQG (SEQ ID NO:40) и GGR в качестве аминокислотной последовательности, предпочтительно в этом порядке,
(vi) AAAAAAAA (SEQ ID NO:15), GPGGG (SEQ ID NO:10), GGR, GGN и GGR в качестве аминокислотной последовательности, предпочтительно в этом порядке,
(vii) GGA, GGA, GGA, GGS, GGA и GGS в качестве аминокислотной последовательности, предпочтительно в этом порядке, и/или
(viii) GPGGA (SEQ ID NO:9), GPGGY (SEQ ID NO:7), GPGGS (SEQ ID NO:11), GPGGY (SEQ ID NO:7), GPGGS (SEQ ID NO:11) и GPGGY (SEQ ID NO:7) в качестве аминокислотной последовательности, предпочтительно в этом порядке.
Следует отметить, что по меньшей мере два из повторяющихся звеньев, содержащихся в полипептидах шелка, приведенных выше, являются идентичными повторяющимися звеньями.
Предпочтительно полипептид шелка, выделенный способом настоящего изобретения, содержит, в основном состоит или состоит из 2-80 повторяющихся звеньев, 3-80 повторяющихся звеньев или 4-60 повторяющихся звеньев, более предпочтительно 8-48 повторяющихся звеньев или 10-40 повторяющихся звеньев и наиболее предпочтительно 16-32 повторяющихся звеньев, т.е. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 или 80 повторяющихся звеньев, каждое из которых содержит по меньшей мере одну, предпочтительно одну консенсусную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
i) GPGXX (SEQ ID NO:3), где X - любая аминокислота, предпочтительно в каждом случае выбранная независимо из числа A, S, G, Y, Р и Q;
ii) GGX, где Х - любая аминокислота, предпочтительно в каждом случае выбранная независимо из числа Y, Р, R, S, А, Т, N и Q, более предпочтительно в каждом случае выбранная независимо из числа Y, Р и Q; и
iii) Ax, где x - целое число от 5 до 10.
Как указано выше, по меньшей мере два из повторяющихся звеньев, содержащихся в полипептиде шелка, выделенном способом настоящего изобретения, являются идентичными повторяющимися звеньями.
Также предпочтительно белок шелка, выделенный способом настоящего изобретения, содержит или состоит из 2-80 повторяющихся звеньев, 3-80 повторяющихся звеньев или 4-60 повторяющихся звеньев, более предпочтительно 8-48 повторяющихся звеньев или 10-40 повторяющихся звеньев и наиболее предпочтительно 16-32 повторяющихся звеньев, каждое из которых содержит по меньшей мере одну, предпочтительно одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: GGRPSDTYG (SEQ ID NO:18) и GGRPSSSYG (SEQ ID NO:19).
Таким образом, белок шелка, выделенный способом настоящего изобретения, предпочтительно содержит или состоит из 2-80 повторяющихся звеньев, 3-80 повторяющихся звеньев или 4-60 повторяющихся звеньев, более предпочтительно 8-48 повторяющихся звеньев или 10-40 повторяющихся звеньев и наиболее предпочтительно 16-32 повторяющихся звеньев, каждое из которых содержит по меньшей мере одну (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25), предпочтительно одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из GPGAS (SEQ ID NO:5), GPGSG (SEQ ID NO:6), GPGGY (SEQ ID NO:7), GPGGP (SEQ ID NO:8), GPGGA (SEQ ID NO:9), GPGQQ (SEQ ID NO:4), GPGQG (SEQ ID NO:40), GPGGG (SEQ ID NO:10), GPGGS (SEQ ID NO:11), GGY, GGP, GGA, GGR, GGS, GGT, GGN, GGQ, AAAAA (SEQ ID NO:12), AAAAAA (SEQ ID NO:13), AAAAAAA (SEQ ID NO:14), AAAAAAAA (SEQ ID NO:15), AAAAAAAAA (SEQ ID NO:16), AAAAAAAAAA (SEQ ID NO:17), GGRPSDTYG (SEQ ID NO:18) и GGRPSSSYG (SEQ ID NO:19).
Наиболее предпочтительно белок шелка, выделенный способом настоящего изобретения, содержит, в основном состоит или состоит из:
(i) повторяющихся звеньев, содержащих или состоящих из GPGAS (SEQ ID NO:5), AAAAAA (SEQ ID NO:13), GGY, и GPGSG (SEQ ID NO:б), в качестве аминокислотной последовательности, предпочтительно в этом порядке,
(ii) повторяющихся звеньев, содержащих или состоящих из AAAAAAAA (SEQ ID NO:15), GPGGY (SEQ ID NO:7), GPGGY (SEQ ID NO:7) и GPGGP (SEQ ID NO:8), в качестве аминокислотной последовательности, предпочтительно в этом порядке,
(iii) повторяющихся звеньев, содержащих или состоящих из GPGQQ (SEQ ID NO:4), GPGQQ (SEQ ID NO:4), GPGQQ (SEQ ID NO:4) и GPGQQ (SEQ ID NO:4), в качестве аминокислотной последовательности,
(iv) повторяющихся звеньев, содержащих или состоящих из GPGGA (SEQ ID NO:9), GGP, GPGGA (SEQ ID NO:9), GGP, GPGGA (SEQ ID NO:9) и GGP, в качестве аминокислотной последовательности, предпочтительно в этом порядке,
(v) повторяющихся звеньев, содержащих или состоящих из АААААААА (SEQ ID NO:15), GPGQG (SEQ ID NO:40) и GGR, в качестве аминокислотной последовательности, предпочтительно в этом порядке,
(vi) повторяющихся звеньев, содержащих или состоящих из АААААААА (SEQ ID NO:15), GPGGG (SEQ ID NO:10), GGR, GGN и GGR, в качестве аминокислотной последовательности, предпочтительно в этом порядке,
(vii) повторяющихся звеньев, содержащих или состоящих из GGA, GGA, GGA, GGS, GGA и GGS, в качестве аминокислотной последовательности, предпочтительно в этом порядке, и/или
(viii) повторяющихся звеньев, содержащих или состоящих из GPGGA (SEQ ID NO:9), GPGGY (SEQ ID NO:7), GPGGS (SEQ ID NO:11), GPGGY (SEQ ID NO:7), GPGGS (SEQ ID NO:11) и GPGGY (SEQ ID NO:7), в качестве аминокислотной последовательности, предпочтительно в этом порядке.
Следует отметить, что по меньшей мере два из повторяющихся звеньев, содержащихся в полипептидах шелка, приведенных выше, являются идентичными повторяющимися звеньями.
Предпочтительно полипептид шелка, выделенный способом настоящего изобретения, содержит, в основном состоит или состоит из:
(i) (GPGXX)n (SEQ ID NO:3) в качестве повторяющегося звена, где Х - любая аминокислота, предпочтительно в каждом случае выбранная независимо из числа A, S, G, Y, Р и Q, a n=2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9;
ii) (GGX)n в качестве повторяющегося звена, где Х - любая аминокислота, предпочтительно в каждом случае выбранная независимо из числа Y, Р, R, S, А, Т, N и Q, более предпочтительно в каждом случае выбранная независимо из числа Y, Р и Q, а n=2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8; и/или
iii) (Ax)n в качестве повторяющегося звена, где x - целое число от 5 до 10, а n=2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10.
Как указано выше, по меньшей мере два из повторяющихся звеньев, содержащихся в полипептидах шелка, приведенных выше, являются идентичными повторяющимися звеньями.
Предпочтительно повторяющиеся звенья выбирают независимо из модуля A (SEQ ID NO:20), модуля С (SEQ ID NO:21), модуля Q (SEQ ID NO:22), модуля K (SEQ ID NO:23), модуля sp (SEQ ID NO:24), модуля S (SEQ ID NO:25), модуля R (SEQ ID NO:26), модуля X (SEQ ID NO:27) или модуля Y (SEQ ID NO:28) либо их вариантов (т.е. вариантов модуля А, вариантов модуля С, вариантов модуля Q, вариантов модуля K, вариантов модуля sp, вариантов модуля S, вариантов модуля R, вариантов модуля Х или вариантов модуля Y). Модуль A (SEQ ID NO:20) и Q (SEQ ID NO:22) основывается на аминокислотной последовательности ADF-3 паука Araneus diadematus. Модуль С (SEQ ID NO:21) основывается на аминокислотной последовательности ADF-4 паука Araneus diadematus. Модули K (SEQ ID NO:23), sp (SEQ ID NO:24), X (SEQ ID NO:27) и Y (SEQ ID NO:28) основываются на аминокислотной последовательности белка FLAG жгутиковидной железы паука Nephila clavipes (WO 2006/008163). Модули S (SEQ ID NO:25) и R (SEQ ID NO:26) основываются на резилине (Arthropoda) (WO 2008/155304).
Таким образом, в предпочтительном воплощении настоящего изобретения повторяющиеся звенья полипептида шелка состоят из:
модуля A: GPYGPGASAAAAAAGGYGPGSGQQ (SEQ ID NO:20),
модуля С: GSSAAAAAAAASGPGGYGPENQGPSGPGGYGPGGP (SEQ ID NO:21),
модуля Q: GPGQQGPGQQGPGQQGPGQQ (SEQ ID NO:22),
модуля K: GPGGAGGPYGPGGAGGPYGPGGAGGPY (SEQ ID NO:23),
модуля sp: GGTTIIEDLDITIDGADGPITISEELTI (SEQ ID NO:24),
модуля S: PGSSAAAAAAAASGPGQGQGQGQGQGGRPSDTYG (SEQ ID NO:25),
модуля R: SAAAAAAAAGPGGGNGGRPSDTYGAPGGGNGGRPSSSYG (SEQ ID NO:26),
модуля X: GGAGGAGGAGGSGGAGGS (SEQ ID NO:27) или
модуля Y: GPGGAGPGGYGPGGSGPGGYGPGGSGPGGY (SEQ ID NO:28)
либо их вариантов.
Предпочтительно белок шелка, выделенный способом настоящего изобретения, содержит, в основном состоит или состоит из 2-80 повторяющихся звеньев, 3-80 повторяющихся звеньев или 4-60 повторяющихся звеньев, более предпочтительно 8-48 повторяющихся звеньев или 10-40 повторяющихся звеньев и наиболее предпочтительно 16-32 повторяющихся звеньев, т.е. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 или 80 повторяющихся звеньев, выбранных независимо из модуля A (SEQ ID NO:20), модуля С (SEQ ID NO:21), модуля Q (SEQ ID NO:22), модуля K (SEQ ID NO:23), модуля sp (SEQ ID NO:24), модуля S (SEQ ID NO:25), модуля R (SEQ ID NO:26), модуля X (SEQ ID NO:27) или модуля Y (SEQ ID NO:28) либо их вариантов (т.е. вариантов модуля А, вариантов модуля С, вариантов модуля Q, вариантов модуля K, вариантов модуля sp, вариантов модуля S, вариантов модуля R, вариантов модуля Х или вариантов модуля Y). Следует отметить, что по меньшей мере два из повторяющихся звеньев, содержащихся в полипептиде шелка, выделенном способом настоящего изобретения, являются идентичными повторяющимися звеньями.
Таким образом, предпочтительно полипептид шелка, выделенный способом настоящего изобретения, содержит, в основном состоит или состоит из (i) повторяющихся звеньев, состоящих из модуля А, и/или повторяющихся звеньев, состоящих из вариантов модуля A, (ii) повторяющихся звеньев, состоящих из модуля С, и/или повторяющихся звеньев, состоящих из вариантов модуля С, (iii) повторяющихся звеньев, состоящих из модуля Q, и/или повторяющихся звеньев, состоящих из вариантов модуля Q, (iv) (a) повторяющихся звеньев, состоящих из модуля А, и повторяющихся звеньев, состоящих из модуля Q, (b) повторяющихся звеньев, состоящих из модуля А, и повторяющихся звеньев, состоящих из вариантов модуля Q, (с) повторяющихся звеньев, состоящих из вариантов модуля А, и повторяющихся звеньев, состоящих из модуля Q, (d) повторяющихся звеньев, состоящих из вариантов модуля А, и повторяющихся звеньев, состоящих из вариантов модуля Q, (v) (а) повторяющихся звеньев, состоящих из модуля А, и повторяющихся звеньев, состоящих из модуля С, (b) повторяющихся звеньев, состоящих из модуля А, и повторяющихся звеньев, состоящих из вариантов модуля С, (с) повторяющихся звеньев, состоящих из вариантов модуля А, и повторяющихся звеньев, состоящих из модуля С, (d) повторяющихся звеньев, состоящих из вариантов модуля А, и повторяющихся звеньев, состоящих из вариантов модуля С, (vi) (а) повторяющихся звеньев, состоящих из модуля С, и повторяющихся звеньев, состоящих из модуля Q, (b) повторяющихся звеньев, состоящих из модуля С, и повторяющихся звеньев, состоящих из вариантов модуля Q, (с) повторяющихся звеньев, состоящих из вариантов модуля С, и повторяющихся звеньев, состоящих из модуля Q, (d) повторяющихся звеньев, состоящих из вариантов модуля С, и повторяющихся звеньев, состоящих из вариантов модуля Q, или (vii) (а) повторяющихся звеньев, состоящих из модуля А, повторяющихся звеньев, состоящих из модуля Q, и повторяющихся звеньев, состоящих из модуля С, (b) повторяющихся звеньев, состоящих из модуля А, повторяющихся звеньев, состоящих из модуля Q, и повторяющихся звеньев, состоящих из вариантов модуля С, (с) повторяющихся звеньев, состоящих из модуля А, повторяющихся звеньев, состоящих из вариантов модуля Q, и повторяющихся звеньев, состоящих из модуля С, (d) повторяющихся звеньев, состоящих из вариантов модуля А, повторяющихся звеньев, состоящих из модуля Q, и повторяющихся звеньев, состоящих из модуля С, (е) повторяющихся звеньев, состоящих из модуля А, повторяющихся звеньев, состоящих из вариантов модуля Q, и повторяющихся звеньев, состоящих из вариантов модуля С, (f) повторяющихся звеньев, состоящих из вариантов модуля А, повторяющихся звеньев, состоящих из вариантов модуля Q, и повторяющихся звеньев, состоящих из модуля С, (g) повторяющихся звеньев, состоящих из вариантов модуля А, повторяющихся звеньев, состоящих из модуля Q, и повторяющихся звеньев, состоящих из вариантов модуля С, (h) повторяющихся звеньев, состоящих из вариантов модуля А, повторяющихся звеньев, состоящих из вариантов модуля Q, и повторяющихся звеньев, состоящих из вариантов модуля С.
Модули А, С, Q, K, sp, S, R, Х или Y либо их варианты (т.е. варианты модуля А, варианты модуля С, варианты модуля Q, варианты модуля К, варианты модуля sp, варианты модуля S, варианты модуля R, варианты модуля Х или варианты модуля Y) также могут сочетаться друг с другом в любой комбинации и с любым количеством каждого из них, т.е. модуль (повторяющееся звено) А может сочетаться с модулем (повторяющимся звеном) Q (т.е. комбинация AQ), модуль (повторяющееся звено) С может сочетаться с модулем (повторяющимся звеном) Q (т.е. комбинация CQ), модуль (повторяющееся звено) Q может сочетаться с модулем (повторяющимся звеном) А и с модулем (повторяющимся звеном) Q (т.е. комбинация QAQ), модуль (повторяющееся звено) А может сочетаться с модулем (повторяющимся звеном) А и с модулем (повторяющимся звеном) Q (т.е. комбинация AAQ) и т.д., при условии, что полипептид шелка, выделенный способом настоящего изобретения, содержит или состоит из по меньшей мере двух повторяющихся звеньев, которые являются идентичными. Например, полипептид шелка, выделенный способом настоящего изобретения, может содержать или состоять из An, (AA)n, (AQ)n, (QA)n, Qn, (QQ)n, (QAQ)n, (AQA)n, Cn, (CC)n, (CCC)n, (CQ)n, (QC)n, (QCQ)n, (CQC)n, (AA)nQn, (QQ)nAn, (AAA)nQn, (QQQ)nAn, (AQQ)n, (QQA)n, Kn, spn, Sn, Rn, Xn, Yn, (Ksp)n, (spK)n, (XY)n, (YX)n, (XX)n, (YY)n, (XXX)n, (YYY)n, (AX)n, (XA)n, (CX)n, (XC)n, (QX)n, (XQ)n, (YQ)n, (QY)n, (SS)n, (SR)n, (RS)n или (RR)n, где n по меньшей мере = 2, предпочтительно 4, 8, 9, 10, 12, 16, 20, 24 или 32. В случае, когда полипептид шелка состоит из (AQ)12, отметим, что модуль (повторяющееся звено) А присутствует 12 раз и модуль (повторяющееся звено) Q также присутствует 12 раз в полипептиде шелка, таким образом, полипептид шелка состоит из 24 модулей (повторяющихся звеньев). Расположение модулей (повторяющихся звеньев) полипептида шелка, состоящего из (AQ)12, имеет следующий вид: AQAQAQAQAQAQAQAQAQAQAQAQ. Далее, в случае, когда полипептид шелка состоит из (QAQ)8, отметим, что модуль (повторяющееся звено) А присутствует 8 раз и модуль (повторяющееся звено) Q присутствует 16 раз в полипептиде шелка, таким образом, полипептид шелка состоит из 24 модулей (повторяющихся звеньев). Расположение модулей (повторяющихся звеньев) полипептида шелка, состоящего из (QAQ)8, имеет следующий вид: QAQQAQQAQQAQQAQQAQQAQQAQ.
Полипептид шелка, выделенный способом настоящего изобретения, также может содержать или состоять из (A*Q)n, (AQ*)n, (A*Q*)n, (Q*A)n, (QA*)n, (Q*A*)n, (QAQ*)n, (QA*Q)n, (Q*AQ)n, (QA*Q*)n, (Q*A*Q)n, (Q*AQ*)n, (Q*A*Q*)n, (AQA*)n, (AQ*A)n, (A*QA)n, (AQ*A*)n, (A*Q*A)n, (A*QA*)n, (A*Q*A*)n, где n по меньшей мере = 2, предпочтительно 4, 8, 9, 10, 12, 16, 20, 24 или 32, а * означает вариант модуля, т.е. вариант модуля А или Q.
Термины "сочетаются друг с другом" или "соединяются друг с другом" могут означать в контексте настоящего изобретения, что модули (повторяющиеся звенья) непосредственно сочетаются или соединяются друг с другом или могут означать в контексте настоящего изобретения, что модули (повторяющиеся звенья) сочетаются или соединяются друг с другом через одну или несколько разделительных (спейсерных) аминокислот. В предпочтительных воплощениях модули (повторяющиеся звенья), содержащиеся в полипептиде шелка, непосредственно сочетаются или соединяются друг с другом. В других предпочтительных воплощениях модули (повторяющиеся звенья), содержащиеся в полипептиде шелка, сочетаются или соединяются друг с другом через 1-25 или 1-20 разделительных аминокислот, более предпочтительно через 1-15 или 1-10 разделительных аминокислот и наиболее предпочтительно через 1-5 разделительных аминокислот, т.е. через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 разделительных аминокислот. Этими разделительными аминокислотами могут быть любые аминокислоты, встречающиеся в белках. Предпочтительно пролин не является такой разделительной аминокислотой. Особенно предпочтительны незаряженные аминокислоты, такие как аланин или глицин. Предпочтительно эти разделительные аминокислоты не изменяют свойства белков шелка как нерастворимых и сохраняющих нерастворимость с тем, чтобы данный белок шелка все-таки можно было отделить от солюбилизированных нерастворимых частей клеток хозяев на стадии с) способа настоящего изобретения. Кроме того, предпочтительно такими разделительными аминокислотами являются аминокислоты, не вызывающие стерических препятствий, например, аминокислоты малого размера, такие как аланин или глицин. В более предпочтительных воплощениях полипептид шелка содержит модули, которые непосредственно сочетаются друг с другом, и модули, которые сочетаются друг с другом через 1-25 или 1-20 разделительных аминокислот, более предпочтительно через 1-15 или 1-10 разделительных аминокислот и наиболее предпочтительно через 1-5 разделительных аминокислот, т.е. через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 разделительных аминокислот.
Варианты модулей А, С, Q, K, sp, S, R, Х или Y отличаются от контрольных модулей (дикого типа) А, С, Q, K, sp, S, R, X или Y, из которых они получены, изменением 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 аминокислот в аминокислотной последовательности (а именно: заменой, добавлением, вставкой, делецией, укорочением N-концов и/или укорочением С-концов). Такой вариант модуля может к тому же характеризоваться определенной степенью идентичности последовательности с контрольным модулем (дикого типа), из которого он получен. Таким образом, вариант модуля А, С, Q, K, sp, S, R, Х или Y по последовательности идентичен по меньшей мере на 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или даже 99,9% соответствующему контрольному модулю (дикого типа) А, С, Q, K, sp, S, R, Х или Y. Предпочтительно последовательности идентичны на непрерывном отрезке из по меньшей мере 10, 15, 18, 20, 24, 27, 28, 30, 34, 35 или более аминокислот, предпочтительно по всей длине соответствующего контрольного модуля (дикого типа) А, С, Q, K, sp, S, R, Х или Y.
Особенно предпочтительно, чтобы идентичность последовательностей составляла по меньшей мере 80% по всей длине, 85% по всей длине, 90% по всей длине, 95% по всей длине, 98% по всей длине или 99% по всей длине соответствующего контрольного модуля (дикого типа) А, С, Q, K, sp, S, R, Х или Y. Также особенно предпочтительно, чтобы идентичность последовательностей составляла по меньшей мере 80% на непрерывном отрезке из по меньшей мере 10, 15, 18, 20, 24, 28 или 30 аминокислот, по меньшей мере 85% на непрерывном отрезке из по меньшей мере 10, 15, 18, 20, 24, 28 или 30 аминокислот, 90% на непрерывном отрезке из по меньшей мере 10, 15, 18, 20, 24, 28 или 30 аминокислот, 95% на непрерывном отрезке из по меньшей мере 10, 15, 18, 20, 24, 28 или 30 аминокислот, 98% на непрерывном отрезке из по меньшей мере 10, 15, 18, 20, 24, 28 или 30 аминокислот или 99% на непрерывном отрезке из по меньшей мере 10, 15, 18, 20, 24, 28 или 30 аминокислот соответствующего контрольного модуля (дикого типа) А, С, Q, K, sp, S, R, Х или Y.
Фрагмент (или делеционный вариант) модуля А, С, Q, K, sp, S, R, Х или Y предпочтительно содержит делецию 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 аминокислот на своем N-конце и/или С-конце. Делеция может быть и внутренней.
Кроме того, вариант или фрагмент модуля А, С, Q, K, sp, S, R, Х или Y только тогда считается вариантом или фрагментом модуля А, С, Q, K, sp, S, R, Х или Y в контексте настоящего изобретения, если модификации относительно аминокислотной последовательности, на которой основан вариант или фрагмент, не изменяют свойства белка шелка быть нерастворимым и сохранять нерастворимость с тем, чтобы этот белок шелка все-таки можно было отделить от солюбилизированных нерастворимых частей клеток хозяев на стадии с) способа настоящего изобретения. Предпочтительно белок шелка, содержащий вариант или фрагмент модуля А, С, Q, K, sp, S, R, Х или Y, нерастворим в водном растворе, например, буферном водном растворе, в культуральной среде, среде ферментации, в технической воде или деионизированной воде, и остается нерастворимым более, чем на 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9% или даже на 100% в водном растворе, например, буферном водном растворе, в культуральной среде, среде ферментации, в технической воде или деионизированной воде, содержащей основание (например, NaOH от 0,005 до 1М), на протяжении от 10 до 90 минут, например, в течение 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 или 90 минут и/или при температуре от 4 до 60°С, например, при 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55 или 60°С. В предпочтительных воплощениях настоящего изобретения белок шелка, содержащий вариант или фрагмент модуля А, С, Q, K, sp, S, R, Х или Y, который остается нерастворимым, отделяется от солюбилизированных нерастворимых частей клеток хозяев путем фильтрации, предпочтительно с помощью мембранного фильтра с размером пор от 10 нм до 200 нм, и/или путем центрифугирования, предпочтительно при 3000-12000×g и более предпочтительно при 4000-8000×g, в течение 10-40 мин, предпочтительно 20-40 мин.
Так, в предпочтительном воплощении настоящего изобретения повторяющиеся звенья выбираются независимо из модуля AC (SEQ ID NO:29), модуля AK (SEQ ID NO:30), модуля CC (SEQ ID NO:31), модуля CK1 (SEQ ID NO:32), модуля CK2 (SEQ ID NO:33) или модуля CKC (SEQ ID NO:34). Модули AC (SEQ ID NO:29), AK (SEQ ID NO:30), CC (SEQ ID NO:31), CK1 (SEQ ID NO:32), CK2 (SEQ ID NO:33) и CKC (SEQ ID NO:34) являются вариантами модуля А на основе аминокислотной последовательности ADF-3 паука Araneus diadematus и модуля С на основе аминокислотной последовательности ADF-4 паука Araneus diadematus (WO 2007/025719). В модуле AC (SEQ ID NO:29) аминокислота S (серии) в положении 21 заменена аминокислотой С (цистеин), в модуле AK (SEQ ID NO:30) аминокислота S в положении 21 заменена аминокислотой K (лизин), в модуле CC (SEQ ID NO:31) аминокислота S в положении 25 заменена аминокислотой С, в модуле CK1 (SEQ ID NO:32) аминокислота S в положении 25 заменена аминокислотой K, в модуле CK2 (SEQ ID NO:33) аминокислота Е (глутамат) в положении 20 заменена аминокислотой K, а в модуле CKC (SEQ ID NO:34) аминокислота Е в положении 20 заменена аминокислотой K и аминокислота S в положении 25 заменена аминокислотой С (WO 2007/025719).
Предпочтительно повторяющиеся звенья в полипептиде шелка, выделенном способом настоящего изобретения, состоят из:
модуля AC: GPYGPGASAAAAAAGGYGPGCGQQ (SEQ ID NO:29),
модуля AK: GPYGPGASAAAAAAGGYGPGKGQQ (SEQ ID NO:30),
модуля CC: GSSAAAAAAAASGPGGYGPENQGPCGPGGYGPGGP (SEQ ID NO:31),
модуля CK1: GSSAAAAAAAASGPGGYGPENQGPKGPGGYGPGGP (SEQ ID NO:32),
модуля CK2: GSSAAAAAAAASGPGGYGPKNQGPSGPGGYGPGGP (SEQ ID NO:33) или
модуля CKC: GSSAAAAAAAASGPGGYGPKNQGPCGPGGYGPGGP (SEQ ID NO:34).
Также предпочтительно полипептид шелка, выделенный способом настоящего изобретения, содержит, в основном состоит или состоит из 2-80 повторяющихся звеньев, 3-80 повторяющихся звеньев или 4-60 повторяющихся звеньев, предпочтительно 8-48 повторяющихся звеньев или 10-40 повторяющихся звеньев и наиболее предпочтительно 16-32 повторяющихся звеньев, т.е. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 или 80 повторяющихся звеньев, выбранных независимо из модуля AC (SEQ ID NO:29), модуля AK (SEQ ID NO:30), модуля CC (SEQ ID NO:31), модуля CK1 (SEQ ID NO:32), модуля CK2 (SEQ ID NO:33) или модуля CKC (SEQ ID NO:34). Например, полипептид шелка, выделенный способом настоящего изобретения, может содержать или состоять из модулей CC 4, CC 8, CC 16, CC 32, AC 5, AC 8 или AC 10. Следует отметить, что по меньшей мере два из повторяющихся звеньев, содержащихся в полипептиде шелка, выделенном способом настоящего изобретения, являются идентичными повторяющимися звеньями (модулями).
Например, полипептид шелка может содержать или состоять из модулей CC 4, CC 8, CC 16, CC 32, AC 5, AC 8 или AC 10.
Модули AK, CC, CK1, CK2 и CKC также могут сочетаться друг с другом, т.е. модуль (повторяющееся звено) AK может сочетаться с модулем (повторяющимся звеном) CC (т.е. комбинация AKCC), модуль (повторяющееся звено) CK1 может сочетаться с модулем (повторяющимся звеном) CK2 и модулем (повторяющимся звеном) CKC (т.е. комбинация CK1CK2CKC) и т.д., при условии, что полипептид шелка, выделенный способом настоящего изобретения, содержит или состоит из по меньшей мере двух повторяющихся звеньев, которые являются идентичными. Таким образом, полипептид шелка, выделенный способом настоящего изобретения, также может содержать или состоять из модулей (AK)n, (CC)n, (CK1)n, (CK2)n, (CKC)n, (AKAC)n, (CCCC)n, (CK1CK2)n, (CK2CK1)n, (CK1CK2CK1)n, (CK2CK1CK2)n, (CK1CK2CKC)n, (CKCCK2CKC)n, или (CKCCK2CK1)n, где n по меньшей мере = 2, предпочтительно 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12, 16 или 20. Термин "сочетаются друг с другом" определен выше.
Кроме того, предпочтительно полипептид шелка, выделенный способом настоящего изобретения, содержит, в основном состоит или состоит из 2-80 повторяющихся звеньев, 3-80 повторяющихся звеньев или из 4-60 повторяющихся звеньев, предпочтительно из 8-48 повторяющихся звеньев или 10-40 повторяющихся звеньев и наиболее предпочтительно из 16-32 повторяющихся звеньев, т.е. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 или 80 повторяющихся звеньев, которые независимо выбраны из модуля A (SEQ ID NO:20) или его вариантов, модуля С (SEQ ID NO:21) или его вариантов, модуля Q (SEQ ID NO:22) или его вариантов, модуля K (SEQ ID NO:23) или его вариантов, модуля sp (SEQ ID NO:24) или его вариантов, модуля S (SEQ ID NO:25) или его вариантов, модуля R (SEQ ID NO:26) или его вариантов, модуля Х (SEQ ID NO:27) или его вариантов, модуля Y (SEQ ID NO:28) или его вариантов, модуля AC (SEQ ID NO:29), модуля AK (SEQ ID NO:30), модуля CC (SEQ ID NO:31), модуля CK1 (SEQ ID NO:32), модуля CK2 (SEQ ID NO:33) или модуля CKC (SEQ ID NO:34). Опять же следует отметить, что по меньшей мере два из повторяющихся звеньев, содержащихся в полипептиде шелка, выделенном способом настоящего изобретения, являются идентичными повторяющимися звеньями (модулями).
Модули AK, CC, CK1, CK2 и CKC также могут сочетаться с модулями А, С, Q, K, sp, S, R, Х или Y, т.е. модуль (повторяющееся звено) AK может сочетаться с модулем (повторяющимся звеном) С (т.е. комбинация AKC) или модуль (повторяющееся звено) CC может сочетаться с модулем (повторяющимся звеном) С (т.е. комбинация CCC) и т.д., при условии, что полипептид шелка, выделенный способом настоящего изобретения, содержит или состоит по меньшей мере из двух повторяющихся звеньев, которые являются идентичными. Таким образом, полипептид шелка, выделенный способом настоящего изобретения, также может содержать или состоять из модулей (AQAK)n, (QAK)n, (QAKQ)n, (AKQA)n, (AKQAK)n, (CCC)n, (CCCC)n, (CCCCC)n, (CCCCC)n, (CCQ)n, (QCC)n, (QCCQ)n, (CCQC)n, (CQCC)n, (CCQCC)n, (CCK1)n, (CK1C)n, (CK1CC)n, (CCK1C)n, (CKCCKCC)n, (CCKCCKC)n, (CKCQ)n, (QCKC)n, (QCKCQ)n, (AKCK1Q)n, (QCK2AK)n или (CK1CK2C)n, где n по меньшей мере = 2, предпочтительно 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12, 16 или 20. Термин "сочетаются друг с другом" определен выше.
Например, полипептид шелка, выделенный способом настоящего изобретения, содержит или состоит из модулей C16CC, CCC16, C8CCC8, C8CC 8, CC 8C8, C4CC 8C4, CC 4C8CC 4, CC(AQ)24 или (AQ)24CC.
Полипептид шелка, выделенный способом настоящего изобретения, может кроме того содержать по меньшей мере одно неповторяющееся (NR) звено, т.е. 1, 2, 3, 4, 5, 6, или более NR-звеньев, предпочтительно одно NR-звено. В контексте настоящего изобретения термин "неповторяющееся (NR) звено" относится к участку аминокислот, присутствующему в природном полипептиде шелка, который не проявляет никаких явных повторов (неповторяющееся звено или NR-звено). Предпочтительно аминокислотная последовательность неповторяющегося звена соответствует неповторяющейся аминокислотной последовательности природных полипептидов каркасной нити (dragline), предпочтительно ADF-3 (SEQ ID NO:1) или ADF-4 (SEQ ID NO:2), либо аминокислотной последовательности, существенно сходной с ней.
Особенно предпочтительно, чтобы аминокислотная последовательность неповторяющегося звена соответствовала неповторяющейся C-концевой аминокислотной последовательности природного полипептида каркасной нити, предпочтительно ADF-3 (SEQ ID NO:1) или ADF-4 (SEQ ID NO:2), либо аминокислотной последовательности, существенно сходной с ней. Более предпочтительно, чтобы аминокислотная последовательность неповторяющегося звена соответствовала неповторяющейся C-концевой аминокислотной последовательности ADF-3 (SEQ ID NO:1), содержащей аминокислоты 513-636, или ADF-4 (SEQ ID NO:2), содержащей аминокислоты 302-410, либо аминокислотной последовательности, существенно сходной с ней.
В этом отношении "существенно сходная" означает степень аминокислотной идентичности по меньшей мере на 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или даже 99,9%, предпочтительно на отрезке из 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 или больше аминокислот, предпочтительно по всей длине соответствующей контрольной неповторяющейся (C-концевой) аминокислотной последовательности природного полипептида каркасной нити, предпочтительно ADF-3 (SEQ ID NO:1) или ADF-4 (SEQ ID NO:2).
"Неповторяющееся звено" с аминокислотной последовательностью, которая "существенно сходна" с соответствующей неповторяющейся (C-концевой) аминокислотной последовательностью в природном полипептиде каркасной нити (т.е. с неповторяющимся (C-концевым) звеном дикого типа), предпочтительно внутри ADF-3 (SEQ ID NO:1) или ADF-4 (SEQ ID NO:2), также имеет сходство в отношении свойств, например, белок шелка, содержащий "существенно сходное неповторяющееся звено", все-таки нерастворим и сохраняет нерастворимость и поэтому все еще может быть отделен от солюбилизированных нерастворимых частей клеток хозяев на стадии с) способа настоящего изобретения. Предпочтительно белок шелка, содержащий "существенно сходное неповторяющееся звено", нерастворим в водном растворе, например, буферном водном растворе, в культуральной среде, среде ферментации, в технической воде или деионизированной воде и остается нерастворимым на 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9% или даже на 100% в водном растворе, например, буферном водном растворе, в культуральной среде, среде ферментации, в технической воде или деионизированной воде, содержащей основание, например, NaOH от 0,005 до 1М) на протяжении от 10 до 90 минут, например, в течение 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 или 90 минут и/или при температуре от 4 до 60°С, например, при 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55 или 60°С. В предпочтительных воплощениях настоящего изобретения белок шелка, содержащий "существенно сходное неповторяющееся звено", который остается нерастворимым, отделяется от солюбилизированных нерастворимых частей клеток хозяев путем фильтрации, предпочтительно с помощью мембранного фильтра с размером пор от 10 нм до 200 нм, и/или путем центрифугирования, предпочтительно при 3000-12000×g и более предпочтительно при 4000-8000×g, в течение 10-40 мин, предпочтительно 20-40 мин.
Наиболее предпочтительно неповторяющимся звеном (NR) является NR3 (SEQ ID NO:41) или его варианты либо NR4 (SEQ ID NO:42) или его варианты. Звено NR3 (SEQ ID NO:41) основывается на аминокислотной последовательности ADF-3 паука Araneus diadematus, а звено NR4 (SEQ ID NO:42) основывается на аминокислотной последовательности ADF-4 паука Araneus diadematus (WO 2006/008163).
Варианты звена NR3 или NR4 отличаются от контрольного звена NR3 (SEQ ID NO:41) или NR4 (SEQ ID NO:42), из которых они получены, изменением 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 или 30 аминокислот в аминокислотной последовательности (т.е. замен, добавлений, вставок, делеций, укорочения по N-концам и/или укорочения по С-концам). Такой вариант звена NR3 или NR4 может к тому же характеризоваться определенной степенью идентичности с контрольным звеном NR3 или NR4, из которого он получен. Таким образом, вариант звена NR3 или NR4 имеет последовательность, которая по меньшей мере на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%. 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или даже на 99,9% идентична соответствующему контрольному звену NR3 или NR4. Предпочтительно последовательность идентична на непрерывном отрезке из по меньшей мере 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или больше аминокислот, предпочтительно по всей длине соответствующего контрольного звена NR3 или NR4.
Особенно предпочтительно, чтобы последовательность была идентична по меньшей мере на 80% по всей длине, на 85% по всей длине, на 90% по всей длине, на 95% по всей длине, на 98% по всей длине или на 99% по всей длине соответствующего контрольного звена NR3 или NR4. Кроме того, особенно предпочтительно, чтобы последовательность была идентична по меньшей мере на 80% на непрерывном отрезке из по меньшей мере 20, 30, 40, 50, 60, 70 или 80 аминокислот, на 85% на непрерывном отрезке из по меньшей мере 20, 30, 40, 50, 60, 70 или 80 аминокислот, на 90% на непрерывном отрезке из по меньшей мере 20, 30, 40, 50, 60, 70 или 80 аминокислот, на 95% на непрерывном отрезке из по меньшей мере 20, 30, 40, 50, 60, 70 или 80 аминокислот, на 98% на непрерывном отрезке из по меньшей мере 20, 30, 40, 50, 60, 70 или 80 аминокислот или на 99% на непрерывном отрезке из по меньшей мере 20, 30, 40, 50, 60, 70 или 80 аминокислот соответствующего контрольного звена NR3 или NR4.
Фрагмент (или делеционный вариант) звена NR3 или NR4 предпочтительно содержит делецию до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 аминокислот на своем N-конце и/или на С-конце. Делеция может быть и внутренней.
Кроме того, вариант или фрагмент звена NR3 или NR4 только тогда считается вариантом или фрагментом звена NR3 или NR4 в контексте настоящего изобретения, если модификации относительно аминокислотной последовательности, на которой основан вариант или фрагмент, не изменяют свойства белка шелка быть нерастворимым и сохранять нерастворимость с тем, чтобы этот белок шелка все-таки можно было отделить от солюбилизированных нерастворимых частей клеток хозяев на стадии с) способа настоящего изобретения. Предпочтительно белок шелка, содержащий вариант или фрагмент звена NR3 или NR4, нерастворим в водном растворе, например, буферном водном растворе, в культуральной среде, среде ферментации, в технической воде или деионизированной воде и остается нерастворимым более, чем на 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9% или даже на 100% в водном растворе, например, буферном водном растворе, в культуральной среде, среде ферментации, в технической воде или деионизированной воде, содержащей основание (например, NaOH от 0,005 до 1М) на протяжении от 10 до 90 минут, например, в течение 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 или 90 минут и/или при температуре от 4 до 60°С, например, при 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55 или 60°С. В предпочтительных воплощениях настоящего изобретения белок шелка, содержащий вариант или фрагмент звена NR3 или NR4, который остается нерастворимым, отделяется от солюбилизированных нерастворимых частей клеток хозяев путем фильтрации, предпочтительно с помощью мембранного фильтра с размером пор от 10 нм до 200 нм, и/или путем центрифугирования, предпочтительно при 3000-12000×g и более предпочтительно при 4000-8000×g, в течение 10-40 мин, предпочтительно 20-40 мин.
Предпочтительно белок шелка, выделенный способом настоящего изобретения, выбирается из группы, состоящей из ADF-3 (SEQ ID NO:1) или его вариантов, ADF-4 (SEQ ID NO:2) или его вариантов, MaSp I (SEQ ID NO:43) или его вариантов, MaSp II (SEQ ID NO:44) или его вариантов, (С)m, (C)mNRz, NRz(C)m, NRz(C)mNRz, (AQ)n, (AQ)nNRz, NRz(AQ)n, NRz(AQ)nNRz, (QAQ)o, NRz(QAQ)o, (QAQ)oNRz, Yp, Xp и Kp, где m - целое число от 2 до 64 (т.е. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67 или 68), n - целое число от 6 до 24 (т.е. 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24), o - целое число от 8 до 16 (т.е. 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16), p - целое число от 8 до 16 (т.е. 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16) и z - целое число от 1 до 3 (т.е. 1, 2 или 3), a NR означает неповторяющееся звено. Вышеприведенные формулы определяются следующим образом. В формуле:
(i) (C)m - соединяются друг с другом "m" модулей С, а именно, от 2 до 64 модулей С, представленных аминокислотной последовательностью согласно SEQ ID NO:21;
(ii) (C)mNRz - соединяются друг с другом "m" модулей С, а именно, от 2 до 64 модулей С, представленных аминокислотной последовательностью согласно SEQ ID NO:21, причем эти модули С дополнительно сочетаются с числом "z" неповторяющихся (NR) звеньев, а именно, от 1 до 3 неповторяющихся (NR) звеньев, например, неповторяющихся звеньев NR3, представленных аминокислотной последовательностью согласно SEQ ID NO:41, либо NR4, представленных аминокислотной последовательностью согласно SEQ ID NO:42;
(iii) NRz(C)m - присутствуют (z=1) или соединяются (z=2 или 3) друг с другом "z" неповторяющихся (NR) звеньев, а именно, от 1 до 3 неповторяющихся (NR) звеньев, например, неповторяющихся звеньев NR3, представленных аминокислотной последовательностью согласно SEQ ID NO:41, либо NR4, представленных аминокислотной последовательностью согласно SEQ ID NO:42, причем эти неповторяющиеся звенья дополнительно сочетаются с числом "m" модулей С, а именно, от 2 до 64 модулей С, представленных аминокислотной последовательностью согласно SEQ ID NO:21;
(iv) NRz(C)mNRz - присутствуют (z=1) или соединяются (z=2 или 3) друг с другом "z" неповторяющихся (NR) звеньев, а именно, от 1 до 3 неповторяющихся (NR) звеньев, например, неповторяющихся звеньев NR3, представленных аминокислотной последовательностью согласно SEQ ID NO:41, либо NR4, представленных аминокислотной последовательностью согласно SEQ ID NO:42, причем эти неповторяющиеся звенья дополнительно сочетаются с числом "m" модулей С, а именно, от 2 до 64 модулей С, представленных аминокислотной последовательностью согласно SEQ ID NO:21, при этом данные модули С дополнительно сочетаются с числом "z" неповторяющихся (NR) звеньев, а именно, от 1 до 3 неповторяющихся (NR) звеньев, например, неповторяющихся звеньев NR3, представленных аминокислотной последовательностью согласно SEQ ID NO:41, либо NR4, представленных аминокислотной последовательностью согласно SEQ ID NO:42;
(v) (AQ)n - соединяются друг с другом "n" комбинаций из модулей А и Q, а именно, от 2 до 64 комбинаций из модулей А и Q, причем модуль А представлен аминокислотной последовательностью согласно SEQ ID NO:20, а модуль Q представлен аминокислотной последовательностью согласно SEQ ID NO:22;
(vi) (AQ)nNRz - соединяются друг с другом "n" комбинаций из модулей А и Q, а именно, от 2 до 64 комбинаций из модулей А и Q, причем модуль А представлен аминокислотной последовательностью согласно SEQ ID NO:20, а модуль Q представлен аминокислотной последовательностью согласно SEQ ID NO:22, при этом данные комбинации из модулей А и Q дополнительно сочетаются с числом "z" неповторяющихся (NR) звеньев, а именно, от 1 до 3 неповторяющихся (NR) звеньев, например, неповторяющихся звеньев NR3, представленных аминокислотной последовательностью согласно SEQ ID NO:41, либо NR4, представленных аминокислотной последовательностью согласно SEQ ID NO:42;
(vii) NRz(AQ)n - присутствуют (z=1) или соединяются (z=2 или 3) друг с другом "z" неповторяющихся (NR) звеньев, а именно, от 1 до 3 неповторяющихся (NR) звеньев, например, неповторяющихся звеньев NR3, представленных аминокислотной последовательностью согласно SEQ ID NO:41, либо NR4, представленных аминокислотной последовательностью согласно SEQ ID NO:42, причем данные неповторяющиеся (NR) звенья дополнительно сочетаются с числом "n" комбинаций из модулей А и Q, а именно, от 2 до 64 комбинаций из модулей А и Q, причем модуль А представлен аминокислотной последовательностью согласно SEQ ID NO:20, а модуль Q представлен аминокислотной последовательностью согласно SEQ ID NO:22;
(viii) NRz(AQ)nNRz - присутствуют (z=1) или соединяются (z=2 или 3) друг с другом "z" неповторяющихся (NR) звеньев, а именно, от 1 до 3 неповторяющихся (NR) звеньев, например, неповторяющихся звеньев NR3, представленных аминокислотной последовательностью согласно SEQ ID NO:41, либо NR4, представленных аминокислотной последовательностью согласно SEQ ID NO:42, причем данные неповторяющиеся (NR) звенья дополнительно сочетаются с числом "n" комбинаций из модулей А и Q, а именно, от 2 до 64 комбинаций из модулей А и Q, причем модуль А представлен аминокислотной последовательностью согласно SEQ ID NO:20, а модуль Q представлен аминокислотной последовательностью согласно SEQ ID NO:22, и при этом данные комбинации из модулей А и Q дополнительно сочетаются с числом "z" неповторяющихся (NR) звеньев, а именно, от 1 до 3 неповторяющихся (NR) звеньев, например, неповторяющихся звеньев NR3, представленных аминокислотной последовательностью согласно SEQ ID NO:41, либо NR4, представленных аминокислотной последовательностью согласно SEQ ID NO:42;
(ix) (QAQ)o - соединяются друг с другом "о" комбинаций из модулей Q, А и Q, a именно, от 8 до 16 комбинаций из модулей Q, А и Q, причем модуль Q представлен аминокислотной последовательностью согласно SEQ ID NO:22, а модуль А представлен аминокислотной последовательностью согласно SEQ ID NO:20;
(x) (QAQ)oNRz - соединяются друг с другом "о" комбинаций из модулей Q, А и Q, а именно, от 8 до 16 комбинаций из модулей Q, А и Q, причем модуль Q представлен аминокислотной последовательностью согласно SEQ ID NO:22, а модуль А представлен аминокислотной последовательностью согласно SEQ ID NO:20, при этом данные комбинации из модулей Q, А и Q дополнительно сочетаются с числом "z" неповторяющихся (NR) звеньев, а именно, от 1 до 3 неповторяющихся (NR) звеньев, например, неповторяющихся звеньев NR3, представленных аминокислотной последовательностью согласно SEQ ID NO:41, либо NR4, представленных аминокислотной последовательностью согласно SEQ ID NO:42;
(xi) NRz(QAQ)o - присутствуют (z=1) или соединяются (z=2 или 3) друг с другом "z" неповторяющихся (NR) звеньев, а именно, от 1 до 3 неповторяющихся (NR) звеньев, например, неповторяющихся звеньев NR3, представленных аминокислотной последовательностью согласно SEQ ID NO:41, либо NR4, представленных аминокислотной последовательностью согласно SEQ ID NO:42, причем данные неповторяющиеся (NR) звенья дополнительно сочетаются с числом "о" комбинаций из модулей Q, А и Q, а именно, от 8 до 16 комбинаций из модулей Q, А и Q, причем модуль Q представлен аминокислотной последовательностью согласно SEQ ID NO:22, а модуль А представлен аминокислотной последовательностью согласно SEQ ID NO:20;
(xii) Yp - соединяются друг с другом "p" модулей Y, а именно, от 8 до 16 модулей Y, представленных аминокислотной последовательностью согласно SEQ ID NO:28;
(xiii) Xp - соединяются друг с другом "p" модулей X, а именно, от 8 до 16 модулей X, представленных аминокислотной последовательностью согласно SEQ ID NO:27; и
(xiv) Kp - соединяются друг с другом "p" модулей K, а именно, от 8 до 16 модулей K, представленных аминокислотной последовательностью согласно SEQ ID NO:23.
Более предпочтительно:
(i) в (C)mNRz или NRz(C)m z=1 и m - целое число от 2 до 64 (т.е. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63 или 64), в (C)mNRz или NRz(C)m z=2 и m - целое число от 2 до 64 (т.е. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63 или 64) либо в (C)mNRz или NRz(C)m z=3 и m - целое число от 2 до 64 (т.е. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63 или 64);
(ii) в (AQ)nNRz или NRz(AQ)n z=1 и n - целое число от 6 до 24 (т.е. 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24), в (AQ)nNRz или NRz(AQ)n z=2 и n - целое число от 6 до 24 (т.е. 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24) либо в (AQ)nNRz or NRz(AQ)n z=3 и n - целое число от 6 до 24 (т.е. 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24);
(iii) в NRz(QAQ)o или (QAQ)oNRz z=1 и о - целое число от 8 до 16 (т.е. 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16), в NRz(QAQ)o или (QAQ)oNRz z=2 и o - целое число от 8 до 16 (т.е. 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16) либо в NRz(QAQ)o или (QAQ)oNRz z=3 и о - целое число от 8 до 16 (т.е. 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16);
(iv) в NRz(C)mNRz z=1 и m - целое число от 2 до 64 (т.е. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63 или 64), в NRz(C)mNRz z=2 и m - целое число от 2 до 64 (т.е. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63 или 64) либо в NRz(C)mNRz z=3 и m - целое число от 2 до 64 (т.е. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63 или 64); или
(v) в NRz(AQ)nNRz z=1 и n - целое число от 6 до 24 (т.е. 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24), в NRz(AQ)nNRz z - 2 и n - целое число от 6 до 24 (т.е. 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24) либо в NRz(AQ)nNRz z=3 и n - целое число от 6 до 24 (т.е. 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24);
причем NR означает неповторяющееся звено, предпочтительно NR3 или NR4.
Наиболее предпочтительно белок шелка, выделенный способом настоящего изобретения, представляет собой C16NR4, C32NR4, (AQ)12NR3, (AQ)24NR3, (AQ)12, (AQ)24, C16, С32, NR4C16NR4, NR4C32NR4, NR3C16NR3, NR3C32NR3, NR4(AQ)12NR4, NR4(AQ)24NR4, NR3(AQ)12NR3, NR3(AQ)24NR3, (QAQ)8 или (QAQ)16.
Вариант ADF-3, ADF-4, MaSp I или MaSp II отличается от контрольного полипептида (дикого типа) ADF-3 (SEQ ID NO:1), ADF-4 (SEQ ID NO:2), MaSp I (SEQ ID NO:43) или MaSp II (SEQ ID NO:44), из которого он получен, изменением до 150 (до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140 или 150) аминокислот в аминокислотной последовательности (т.е. замен, вставок, делеций, укорочения по N-концам и/или укорочения по С-концам). Такой вариант может к тому же характеризоваться определенной степенью идентичности с контрольным полипептидом (дикого типа), из которого он получен. Таким образом, вариант ADF-3, ADF-4, MaSp I или MaSp II имеет последовательность, которая по меньшей мере на 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или даже 99,9% идентична соответствующему контрольному полипептиду (дикого типа) ADF-3, ADF-4, MaSp I или MaSp II. Предпочтительно последовательность идентична на непрерывном отрезке из по меньшей мере 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 150, 180, 200, 250, 300, 350, 400 или больше аминокислот, предпочтительно по всей длине соответствующего контрольного полипептида (дикого типа) ADF-3, ADF-4, MaSp I или MaSp II.
Особенно предпочтительно, чтобы последовательность была идентична по меньшей мере на 80% по всей длине, на 85% по всей длине, на 90% по всей длине, на 95% по всей длине, на 98% по всей длине или на 99% по всей длине соответствующего контрольного полипептида (дикого типа) ADF-3, ADF-4, MaSp I или MaSp II. Также особенно предпочтительно, чтобы последовательность была идентична по меньшей мере на 80% на непрерывном отрезке из по меньшей мере 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250 или 300 аминокислот, на 85% на непрерывном отрезке из по меньшей мере 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250 или 300 аминокислот, на 90% на непрерывном отрезке из по меньшей мере 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250 или 300 аминокислот, на 95% на непрерывном отрезке из по меньшей мере 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250 или 300 аминокислот, на 98% на непрерывном отрезке из по меньшей мере 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250 или 300 аминокислот или на 99% на непрерывном отрезке из по меньшей мере 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250 или 300 аминокислот соответствующего контрольного полипептида (дикого типа) ADF-3, ADF-4, MaSp I или MaSp II.
Фрагмент (или делеционный вариант) полипептида ADF-3 (SEQ ID NO:1) предпочтительно содержит делецию до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 120, 150, 170, 200, 220, 250, 270, 300, 320, 350, 370, 400, 420, 450, 470, 500, 520, 550, 570, 600 или 610 аминокислот на своем N-конце и/или на С-конце. Делеция может быть и внутренней.
Фрагмент (или делеционный вариант) полипептида ADF-4 (SEQ ID NO:2) предпочтительно содержит делецию до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 120, 150, 170, 200, 220, 250, 270, 300, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380 или 390 аминокислот на своем N-конце и/или на С-конце. Делеция может быть и внутренней.
Фрагмент (или делеционный вариант) полипептида MaSp I (SEQ ID NO:43) предпочтительно содержит делецию до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 620, 640, 660, 670, 680 или 690 аминокислот на своем N-конце и/или на С-конце. Делеция может быть и внутренней.
Фрагмент (или делеционный вариант) полипептида MaSp II (SEQ ID NO:44) предпочтительно содержит делецию до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 520, 540, 560 или 570 аминокислот на своем N-конце и/или на С-конце. Делеция может быть и внутренней.
Кроме того, вариант или фрагмент ADF-3, ADF-4, MaSp I или MaSp II только тогда считается вариантом или фрагментом ADF-3, ADF-4, MaSp I или MaSp II в контексте настоящего изобретения, если модификации относительно аминокислотной последовательности, на которой основан вариант или фрагмент, не изменяют свойства белка шелка быть нерастворимым и сохранять нерастворимость с тем, чтобы этот белок шелка все-таки можно было отделить от солюбилизированных нерастворимых частей клеток хозяев на стадии с) способа настоящего изобретения. Предпочтительно вариант или фрагмент ADF-3, ADF-4, MaSp I или MaSp II все еще нерастворим в водном растворе, например, буферном водном растворе, в культуральной среде, среде ферментации, в технической воде или деионизированной воде и остается нерастворимым более, чем на 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9% или даже на 100% в водном растворе, например, буферном водном растворе, в культуральной среде, среде ферментации, в технической воде или деионизированной воде, содержащей основание (например, NaOH от 0,005 до 1М) на протяжении от 10 до 90 минут, например, в течение 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 или 90 минут и/или при температуре от 4 до 60°С, например, при 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55 или 60°С. В предпочтительных воплощениях настоящего изобретения вариант или фрагмент ADF-3, ADF-4, MaSp I или MaSp II, который остается нерастворимым, отделяется от солюбилизированных нерастворимых частей клеток хозяев путем фильтрации, предпочтительно с помощью мембранного фильтра с диаметром пор от 10 нм до 200 нм, и/или путем центрифугирования, предпочтительно при 3000-12000×g и более предпочтительно при 4000-8000×g, в течение 10-40 мин, предпочтительно 20-40 мин.
В другом воплощении белок шелка дополнительно содержит N-концевой и/или C-концевой тег, выбранный из группы, состоящей из:
(i) тегCYS1, состоящий из последовательности аминокислот GCGGGGGGSGGGG (SEQ ID NO:35),
(ii) тегCYS2, состоящий из последовательности аминокислот GCGGGGGG (SEQ ID NO:36),
(iii) тегCYS3, состоящий из последовательности аминокислот GCGGSGGGGSGGGG (SEQ ID NO:37),
(iv) тегLYS1, состоящий из последовательности аминокислот GKGGGGGGSGGGG (SEQ ID NO:38), и
(v) тегLYS2, состоящий из аминокислотной последовательности GKGGGGGG (SEQ ID NO:39).
Эти теги содержат цистеин и/или лизин и могут использоваться для ковалентного присоединения веществ к данному белку шелка после выделения. Предпочтительно ковалентно присоединенное вещество выбрано из группы, состоящей из полипептида, липида, красителя, конъюгированного металла, активированного углерода и агента.
Наиболее предпочтительно белок шелка, выделенный способом настоящего изобретения, содержит или состоит из тегCYS1-C16, C16-тегCYS1, тегCYS1-C16-тегCYS1, тегCYS2-C16, С16-тегCYS2, тегCYS2-С16-тегCYS2, тегCYS3-С16, С16-тегCYS3, тегCYS3-С16-тегCYS3, тегLYS1-С16, С16-тегLYS1, тегLYS1-С16-тегLYS1, тегLYS2-C16, С16-тегLYS2 или тегLYS2-С16-тегLYS2.
Во втором аспекте изобретение касается нерастворимых искомых белков, получаемых способом из первого аспекта.
В другом аспекте изобретением предусмотрен способ выделения нерастворимых искомых белков из раствора белка, включающий стадии:
a) получение раствора белка, содержащего нерастворимый искомый белок,
b) добавление в данный раствор водного раствора по меньшей мере одного основания в количестве, достаточном для разрушения данных клеток хозяев и/или солюбилизации нерастворимых частей клеток хозяев, и
c) отделение нерастворимого искомого белка от солюбилизированных нерастворимых частей клеток хозяев,
причем на стадии b) искомый белок остается нерастворимым, а по меньшей мере 80% нерастворимых частей клеток хозяев подвергаются солюбилизации.
Предпочтительно раствором белка является молоко от трансгенного животного, например, козы, овцы или кролика, в котором экспрессируется нерастворимый искомый белок. В отношении определений, выбора основания, добавляемого на стадии b), используемых реагентов, условий и параметров процесса и выделяемого искомого белка, следует обратиться к разъяснениям, приведенным выше в отношении первого аспекта изобретения.
Специалистам в данной области должны быть очевидными различные модификации и варианты изобретения, не выходящие за его рамки. Хотя изобретение было описано в связи с конкретными предпочтительными воплощениями, однако следует понимать, что заявленное изобретение не следует неоправданно ограничивать такими конкретными воплощениями. Действительно, настоящее изобретение должно охватывать различные модификации описанных способов осуществления изобретения, которые очевидны специалистам в соответствующих областях.
Следующие фигуры и примеры приводятся лишь для иллюстрации настоящего изобретения и никоим образом не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения, который определяется прилагаемой формулой изобретения.
Краткое описание фигур
Фиг.1. Визуализация разделения фаз. Остатки клеток полностью растворились, тогда как искомый белок C16 остался нерастворимым во фракции осадка. Добавление различных агентов влияет на результат фазового разделения осадка искомого белка C16. На фиг.1 представлена очистка в одну стадию, как описано в примере 2. Клеточные обломки инкубировали в течение 45 мин с растворами: А - 0,05 М NaOH, В - 0,05 М NaOH и 4,8 М мочевина, С - 0,05 М NaOH и 0,1% Tween 20, D - 4,8 М мочевина, Е - 2 М гуанидиний гидрохлорид, F - 0,1% Tween 20. После инкубации и последующего центрифугирования осадки А, В и С представляют собой белые осадки, которые почти полностью состоят из искомого белка C16 высокой чистоты. В образцах D, Е и F не наблюдалось четкого разделения фаз.
Фиг.2. Анализ методом иммуноблота (Вестерн блота) рекомбинантного белка шелка паука C16, очищенного в соответствии с примером 2. На дорожке 2 с нанесенным C16 виден сигнал единственного белка (С16-положительный контроль на дорожке 1). Не наблюдается деградации белка. Специфическое выявление искомого белка осуществляли с помощью конъюгированного с тегом Т7 пептида по методике, приложенной к SERVAGel™ TG10 (43210). Подробно: дорожка 1-0,5 мкг положительного контроля на C16 (очистка согласно Huemmerich et al., Biochemistry 2004, 43, 13604-13612); дорожка 2-5 мкг C16 (очистка согласно примеру 2). Антитело: конъюгированное с HRP антитело Т7-Tag®, кат. №69048-3, Novagen; мембрана из PVDF: Roti® Fluoro-PVDF, PVM020C-099, Roth; иммуноблот (Вестерн блот) проводили по методике, приложенной к SERVAGel™ TG10 (43210). Блокирующий раствор: 5% сухое молоко в буфере 1×PBS, инкубация 30 мин; детектирование осуществляли с помощью раствора Lumi-LightPlus, 12015196001, Roche, по приложенной методике.
Фиг.3. Анализ методом SDS-PAGE (окрашивание серебром) рекомбинантного белка шелка паука C16, очищенного способом, описанным в примере 2. На дорожке 2 с нанесенным C16 виден единственный сигнал белка (С16-положительный контроль на дорожке 1). Судя по фиг.1, не наблюдается загрязнений. Дорожка 1 - положительный контроль, 10 мкг C16 (очистка согласно Huemmerich et al., Biochemistry 2004, 43, 13604-13612); дорожка 2-10 мкг C16 (очистка, как описано в примере 2). SDS-PAGE проводили на SERVAGel™ TG10 (43210) по приложенной методике. Окрашивание осуществляли с помощью набора SERVA Silverstain Kit (35076) по приложенной методике.
Фиг.4. Анализ методом HPLC рекомбинантного белка шелка паука C16, очищенного в соответствии с примером 2. На хроматограмме виден единственный четкий пик через 15,057 мин (идентифицирован как белок C16, детектирование при длине волны 280 нм). Загрязнений не наблюдалось. Параметры колонки: TSK-Gel® HPLC Column G3000 SWXL, Tosoh Bioscience, Nr. 08541, внутр. диаметр - 7,8 мм, длина - 30,0 см. Скорость протока была постоянной на уровне 0,5 мл/мин.
Фиг.5. Сравнивали способ очистки согласно Huemmerich et al., Biochemistry 2004, 43, 13604-13612, и способ очистки в соответствии с примером 2, в отношении количества очищенного белка C16 (искомого белка). Видно, что выход искомого белка C16 значительно выше (примерно в 9 раз) при очистке способом изобретения, см. пример 2 (89%), по сравнению со способом Huemmerich et al., Biochemistry 2004, 43, 13604-13612 (10,4%). На фиг.5 приведен выход искомого белка C16, очищенного в соответствии с примером 2. Оба способа очистки - Huemmerich et al., Biochemistry 2004, 43, 13604-13612, и способ очистки, описанный в примере 2, сравнивали по количеству очищенного белка C16.
Фиг.6. Анализ стабильности очищенного рекомбинантно белка шелка паука C16, обработанного 0,05 М гидроокисью натрия, как описано в примере 2. Не наблюдалось существенной деградации белка после инкубации с 0,05 М NaOH в течение времени от 5 мин до 24 часов. Определение искомого белка проводили на детекторе флуоресценции при разделении методом HPLC (длина волны возбуждения: 275 нм - длина волны излучения: 305 нм; градиент: изократический, элюент: 100 мМ трис/HCl, рН 7,5). Через различные промежутки времени при инкубации брали пробы: через 5 мин, 10 мин, 20 мин, 30 мин, 1 ч, 3 ч, 7 ч и 24 ч. Данные по каждой хроматограмме приводили к 100% для лучшего выявления небольших отличий.
ПРИМЕРЫ
Для разделения искомых белков авторы изобретения для примера разработали синтетический полипептид шелка C16, который происходит из белка каркасной нити ADF-4 европейского паука-крестовика Araneus diadematus. Белок был выбран, исходя из предыдущих наблюдений о том, что ADF-3 и/или ADF-4, а также их варианты проявляют свойства эффективной сборки.
Пример I. Получение суспензии микробных клеток
Микробные клетки подвергали лизису/разрушали два раза с помощью гомогенизатора [APV Gaulin GmbH, LAB60-15 RBFI] при давлении в 900 бар при комнатной температуре. Полученный раствор с обломками клеток центрифугировали при 9000×g в течение 30 мин, 20°С. Супернатант отбрасывали, а осадок клеточных обломков использовали для очистки в одну стадию.
Пример II. Выделение C16
Определяли вес влажного осадка клеточных обломков, полученного из суспензии микробных клеток (пример 1), чтобы подобрать необходимый объем разведения. Соотношение между осадком клеточных обломков (влажный вес) и 0,05 М NaOH составляет 1:3 (w/w). В этом примере вес осадка клеточных обломков составил 5 г. Поэтому вес различных добавок должен составлять 15 г.В этом эксперименте добавляли следующие растворы: А - 0,05 М NaOH, В - 0,05 М NaOH и 4,8 М мочевина, С - 0,05 М NaOH и 0,1% Tween 20, D - 4,8 М мочевина, Е - 2 М гуанидиний гидрохлорид, F - 0,1% Tween 20. Все образцы инкубировали в течение 45 мин при 20°C с тщательным перемешиванием. После инкубации образцы центрифугировали при 8000×g в течение 30 мин, 20°С (см. фиг.1). Осадки А, В и С представляли собой белые осадки, которые почти полностью состоят из искомого белка С16 высокой чистоты. В образцах D, Е и F не наблюдалось четкого разделения фаз.
После этого агрегированный белок C16 (искомый белок) находился во фракции осадка, тогда как супернатант отбрасывали. Для повышения чистоты искомого белка C16 проводили две дополнительные промывки в Н2О (центрифугирование при 8000×g, 30 мин, 20°С). Полученный при этом искомый белок C16 анализировали методом SDS-PAGE (с окрашиванием серебром) (окрашивание проводили с помощью набора SERVA Silverstain Kit (35076) по приложенной методике) (см. фиг.3), методом иммуноблота (Вестерн блота) (проводили по методике, приложенной к SERVAGel™ TG10 (43210); блокирующий раствор: 5% сухое молоко в буфере 1×PBS, инкубация 30 мин; детектирование осуществляли с помощью раствора Lumi-LightPlus, 12015196001, Roche, по приложенной методике) (см. фиг.2) и методом HPLC (параметры колонки: TSK-Gel® HPLC Column G3000 SWXL, Tosoh Bioscience, Nr. 08541, внутр. диаметр - 7,8 мм, длина - 30,0 см; скорость протока была постоянной на уровне 0,5 мл/мин) (см. фиг.4).
Пример III. Выделение C16 по сравнению со стандартным способом
Определяли вес влажного осадка клеточных обломков, полученного из суспензии микробных клеток, чтобы подобрать необходимый объем разведения. Соотношение между осадком клеточных обломков (влажный вес) и 0,05 М NaOH составляет 1:3 (w/w). В этом эксперименте вес осадка клеточных обломков составил 1 кг. Поэтому вес 0,05 М NaOH должен составлять 3 кг (общий вес 4 кг). Образец инкубировали в течение 45 мин при 20°C с перемешиванием. После инкубации образец центрифугировали при 8000×g в течение 30 мин, 20°С. После этого искомый белок C16 находился во фракции осадка, тогда как супернатант отбрасывали. Для повышения чистоты искомого белка C16 проводили две дополнительные промывки в H2O (центрифугирование при 8000×g, 30 мин, 20°С). В этом примере количество очищенного искомого белка Ci6 сравнивали со способом очистки, описанным Huemmerich et al., Biochemistry 2004, 43, 13604-13612. В отличие от способа изобретения, очистка согласно Huemmerich et al. проводилась на супернатанте после разрушения клеток из препарата микробных клеток.
В отношении количества очищенного искомого белка C16 видно, что выход искомого белка C16 был существенно выше (примерно в 9 раз) при очистке так, как описано в примере 2 (см. табл.1, фиг.5).
Пример IV. Стабильность белка C16
Суспензию микробных клеток, содержащих искомый белок C16, обрабатывали 0,05 М NaOH. Как описано в примере 1 и 2, микробные клетки подвергали лизису два раза с помощью гомогенизатора [APV Gaulin GmbH, LAB60-15 RBFI] при давлении в 900 бар при комнатной температуре. Полученный раствор с обломками клеток центрифугировали при 9000×g в течение 30 мин, 20°С. Супернатант отбрасывали, а осадок клеточных обломков использовали для очистки в одну стадию. Определяли вес влажного осадка клеточных обломков, полученного из суспензии микробных клеток (пример 1), чтобы подобрать необходимый объем разведения. Соотношение между осадком клеточных обломков (влажный вес) и 0,05 М NaOH составляет 1:3 (w/w).
Через различные промежутки времени при инкубации брали пробы: через 5 мин, 10 мин, 20 мин, 30 мин, 1 ч, 3 ч, 7 ч и 24 ч. Данные по каждой хроматограмме приводили к 100% для лучшего выявления небольших отличий. Как видно из фиг.6, не происходило существенной деградации белка после инкубации с 0,05 М NaOH в течение времени от 5 мин до 24 часов. Параметры приборов: колонка TSK-Gel® HPLC Column G3000 SWXL, Tosoh Bioscience, Nr. 08541, внутр. диаметр: 7,8 мм, длина: 30,0 см, скорость протока: 0,5 мл/мин; детектирование флуоресценции: длина волны возбуждения: 275 нм - длина волны излучения: 305 нм; градиент: изократический, элюент: 100 мМ трис/HCl, рН 7,5.
Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ выделения рекомбинантного нерастворимого искомого белка шелка из суспензии целых или разрушенных клеток хозяев. Предложенный способ включает получение суспензии целых или разрушенных клеток хозяев, содержащих рекомбинантный нерастворимый белок шелка, добавление водного раствора основания к данной суспензии для разрушения клеток хозяев и солюбилизации нерастворимых частей клеток хозяев, при которой белок шелка остается нерастворимым в суспензии, отделение рекомбинантного нерастворимого белка шелка от солюбилизированных частей клеток хозяев. При этом основание является гидроксилом металла или аммония, и водный раствор основания имеет значения рН от 9 до 14. Предложенный способ выделения позволяет получить рекомбинантный белок шелка с высоким выходом и чистотой за счет эффективного отделения нерастворимого рекомбинантного белка шелка от солюбилизированных нерастворимых частей клеток хозяев. При этом предложенный способ является быстрым и легко выполнимым способом очистки. 21 з.п. ф-лы, 1 табл., 4 пр., 6 ил.
1. Способ выделения рекомбинантного нерастворимого искомого белка шелка из суспензии целых или разрушенных клеток хозяев, включающий стадии:
a) получение суспензии целых или разрушенных клеток хозяев, содержащих рекомбинантный нерастворимый искомый белок шелка и нерастворимые части клеток хозяев,
b) добавление водного раствора по меньшей мере одного основания к данной суспензии в количестве, достаточном для разрушения данных клеток хозяев и/или солюбилизации нерастворимых частей клеток хозяев, и
c) отделение рекомбинантного нерастворимого искомого белка шелка от солюбилизированных нерастворимых частей клеток хозяев,
причем на стадии b) искомый рекомбинантный белок шелка остается нерастворимым, а по меньшей мере 80% нерастворимых частей клеток хозяев подвергаются солюбилизации, где водный раствор по меньшей мере одного основания имеет pH от 9 до 14 и где по меньшей мере одно основание является гидроксидом металла или аммония.
2. Способ по п. 1, в котором клетками хозяевами являются бактериальные, дрожжевые, растительные клетки хозяева или клетки-хозяева насекомых.
3. Способ по п. 1, в котором выделенный рекомбинантный нерастворимый искомый белок шелка имеет чистоту по меньшей мере 80% масс по сухому весу, предпочтительно по меньшей мере 90% масс по сухому весу и более предпочтительно по меньшей мере 95% масс по сухому весу, относительно сухого веса нерастворимых частей клеток хозяев.
4. Способ по п. 1, в котором гидроокись металла выбрана из группы, состоящей из гидроокиси натрия (NaOH), гидроокиси калия (KOH) и гидроокиси кальция (Са(ОН)2) или их комбинаций.
5. Способ по п. 1, в котором конечная концентрация основания на стадии (b) составляет от 0,005 М до 1 М, предпочтительно от 0,01 М до 0,6 М, более предпочтительно от 0,02 М до 0,2 М и наиболее предпочтительно от 0,04 М до 0,06 М.
6. Способ по п. 1, в котором способ дополнительно включает добавление по меньшей мере одного реагента (i) в суспензию перед стадией b), (ii) в раствор или суспензию на стадии b) и/или (iii) в суспензию после стадии b) и в котором по меньшей мере один реагент выбран из группы, состоящей из денатурирующего средства, космотропного средства и детергента или их комбинаций.
7. Способ по п. 6, в котором:
(i) денатурирующим средством является водный раствор мочевины (CH4N2O) или гуанидиний гидрохлорид (CH5N3·HCl),
(ii) космотропным средством является водный раствор соли фосфата или соли сульфата или
(iii) детергентом является Tween 20, Triton Х-100, SDS или Brij.
8. Способ по п. 7, в котором конечная концентрация:
(i) мочевины в суспензии или растворе составляет от 0,1 М до 10 М, предпочтительно от 1 М до 5 М или
(ii) гуанидиния гидрохлорида в суспензии или растворе составляет от 0,01 М до 3 М, предпочтительно от 0,1 М до 2 М.
9. Способ по п. 1, в котором отделение рекомбинантного нерастворимого искомого белка шелка от солюбилизированных нерастворимых частей клеток хозяев на стадии с) осуществляется центрифугированием, седиментацией и/или фильтрацией.
10. Способ по п. 1, в котором способ после стадии b) и перед стадией с) дополнительно включает стадию b′) гомогенизации данной суспензии.
11. Способ по п. 1, в котором способ после стадии с) дополнительно включает стадию d) промывки отделенного рекомбинантного нерастворимого искомого белка шелка, предпочтительно центрифугата, выпавшего осадка или ретентата, водным раствором или органическим раствором, где водный раствор представляет собой воду, буферный водный раствор и где органический раствор содержит этанол (EtOH), метанол (СН3ОН), гексан (С6Н14), диэтиловый эфир (С4Н10О) и/или изопропанол (C3H8O).
12. Способ по п. 1, в котором рекомбинантный искомый белок шелка остается нерастворимым по меньшей мере на 90% масс по сухому весу, предпочтительно по меньшей мере на 95% масс по сухому весу после добавления на стадии b) водного раствора, содержащего по меньшей мере одно основание, в течение периода времени от 10 до 40 мин при температуре от 15°C до 25°C по сравнению с состоянием до добавления водного раствора, содержащего по меньшей мере одно основание.
13. Способ по п. 1, в котором нерастворимый рекомбинантный искомый белок шелка образует белковый агрегат, который включает по меньшей мере 85% масс по сухому весу данного искомого белка шелка.
14. Способ по п. 1, в котором рекомбинантный нерастворимый искомый белок шелка является белком шелка, содержащим по меньшей мере два идентичных повторяющихся звена.
15. Способ по п. 14, в котором белок шелка включает по меньшей мере два идентичных повторяющихся звена, каждое из которых содержит по меньшей мере одну консенсусную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
i) GPGXX (SEQ ID NO: 3), где X - любая аминокислота, предпочтительно в каждом случае выбранная независимо из числа A, S, G, Y, Р и Q;
ii) GGX, где X - любая аминокислота, предпочтительно в каждом случае выбранная независимо из числа Y, Р, R, S, А, Т, N и Q; и
iii) Ах, где x - целое число от 5 до 10.
16. Способ по п. 15, в котором повторяющиеся звенья выбраны независимо из модуля A (SEQ ID NO: 20), модуля С (SEQ ID NO: 21), модуля Q (SEQ ID NO: 22), модуля К (SEQ ID NO: 23), модуля sp (SEQ ID NO: 24), модуля S (SEQ ID NO: 25), модуля R (SEQ ID NO: 26), модуля X (SEQ ID NO: 27) или модуля Y (SEQ ID NO: 28) либо их вариантов.
17. Способ по п. 14, в котором белок шелка дополнительно содержит по меньшей мере одно неповторяющееся (NR) звено.
18. Способ по п. 17, в котором NR-звеном является NR3 (SEQ ID NO: 41) или его варианты либо NR4 (SEQ ID NO: 42) или его варианты.
19. Способ по п. 14, в котором белок шелка выбран из группы, состоящей из ADF-3 (SEQ ID NO: 1) или его вариантов, ADF-4 (SEQ ID NO: 2) или его вариантов, MaSp I (SEQ ID NO: 43) или его вариантов, MaSp II (SEQ ID NO: 44) или его вариантов, (C)m, (C)mNRz, NRz(C)m, NRz(C)mNRz, (AQ)n, (AQ)nNRz, NRz(AQ)n, NRz(AQ)nNRz, (QAQ)o, NRz(QAQ)o, (QAQ)oNRZ, Yp, Xp и Kp, где m - целое число от 2 до 64, n - целое число от 6 до 24, о - целое число от 8 до 16, p - целое число от 8 до 16 и z - целое число от 1 до 3, а NR означает неповторяющееся звено.
20. Способ по п. 19, в котором белок шелка представляет собой C16NR4, C32NR4, (AQ)12NR3, (AQ)24NR3, (AQ)12, (AQ)24, C16, C32, NR4C16NR4, NR4C32NR4, NR3C16NR3, NR3C32NR3, NR4(AQ)12NR4, NR4(AQ)24NR4, NR3(AQ)12NR3, NR3(AQ)24NR3, (QAQ)8 или (QAQ)16.
21. Способ по п. 1, в котором способ выполняется при температуре от 4°C до 60°C, предпочтительно от 15°C до 40°C.
22. Способ по п. 1, в котором способ выполняется при давлении от 10 кПа до 1000 кПа, предпочтительно от 50 кПа до 150 кПа.
| US 20030166062 A1 04.09.2003 | |||
| WO 2003057720 A2 17.07.2003 | |||
| WO 2000011890 A2 02.03.2000 | |||
| US 0005332805 A1 26.07.1994 | |||
| WO 1999001548 A2 14.01.1999 | |||
| WO 2009152176 A2 17.12.2009 | |||
| RU 2007102846 A 27.08.2008. |
