ПРОТИВОВИРУСНОЕ СРЕДСТВО ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ИНФЕКЦИОННОГО РИНОТРАХЕИТА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА Российский патент 2015 года по МПК A61K31/7105 A61K31/201 

Изобретение относится к области ветеринарии и фармацевтической промышленности, в частности к противовирусным средствам на основе мылкого амфифильного комплекса одноцепочечной высокополимерной РНК Saccharomyces cerevisiae, содержащей короткие двуспиральные участки с олеиновой кислотой, и может быть использовано для профилактики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (ИРТ КРС).

Среди многообразия вирусных агентов, вызывающих патологию у крупного рогатого скота (КРС), инфекционный ринотрахеит (ИРТ) занимает особое место в связи с многообразием клинических проявлений и тяжестью течения вызываемой им болезни. Вирус ИРТ КРС регистрируется во многих регионах РФ и странах СНГ и причиняет значительный экономический ущерб мясному и молочному скотоводству [1]. Латентная и персистентная формы этой болезни осложняют проведение профилактических мероприятий, что приводит к неконтролируемому распространению возбудителя во внешней среде. В этом процессе немаловажную роль играют животные -вирусоносители [2].

Многие годы вирусные заболевания рассматривались неподверженными селективной противовирусной химиотерапии. Это было связано с тем, что репликативный цикл вируса слишком тесно связан с нормальным обменом веществ в клетках и любая попытка подавить репродукцию вируса была обречена на неудачу, поскольку могла также уничтожить или повредить неинфицированную клетку. По мере выяснения вирусоспецифических особенностей как мишеней для химиотерапевтической атаки и появления большого числа специфических антивирусных препаратов, становилось все более ясно, что селективная химиотерапия вирусных инфекций возможна и что репродукция вируса может быть подавлена без вредного влияния на хозяина.

В настоящее время известно 30 официально одобренных антивирусных препаратов [3]. Однако попытки использования большинства из них для профилактики и лечения ИРТ КРС не выходили за рамки лабораторных испытаний. Применение этих препаратов in vivo существенным образом сдерживалось вследствие большой их стоимости и трудностями, связанными со способами доставки.

Для профилактики и лечения заболеваний животных вирусной этиологии некоторыми исследователями использовались индукторы интерферона, например, дорогостоящий и сложный в производстве Ридостин [4]. Известно, что применение интерферон индуцирующих препаратов при вирусных заболеваниях и при иммунодефицитных состояниях дает положительные результаты, поскольку интерферон является одним из ключевых факторов активации механизмов неспецифической резистентности. Помимо этого, интерферон активизирует эффекторные функции иммунокомпетентных клеток, что приводит к нормализации иммунного статуса и повышению устойчивости организма к заболеваниям различной этиологии [5]. Эффективность применения препаратов интерферона и его индукторов во многом определяется чувствительностью к нему вирусов, вызывающих ту или иную патологию у животных. Однако литературные данные о чувствительности вируса ИРТ КРС к интерферону единичны и не дают полной характеристики его противовирусного влияния.

Целью настоящего изобретения является профилактика заболевания, вызванного вирусом ИРТ КРС, простым в производстве препаратом - индуктором интерферона с низкой себестоимостью.

Цель достигается тем, что в качестве противовирусного средства используется природный высокоэффективный индуктор интерферона, извлекаемый из сухих пекарских дрожжей с помощью олеиновой кислоты, или с помощью додецилсульфата натрия путем обработки выделенной РНК олеиновой кислотой - мылкий амфифильный комплекс одноцепочечной высокополимерной РНК Saccharomyces cerevisiae, содержащей короткие двуспиральные участки с олеиновой кислотой (предполагаемое рыночное название - Виталанг-2).

Поскольку его доклинические ветеринарные испытания прошли успешно, представлялось актуальным изучение его действия в отношении вируса ИРТ КРС на культуре клеток in vitro.

Пример осуществления предлагаемого способа

Препарат Виталанг-2

Виталанг-2 получали и стерилизовали по способу [6]. Растворяли в стерильном физиологическом растворе (ФР), встряхивая 15-30 мин в день проведения эксперимента.

Тест-вирус

В работе использовали Российский референтный цитопатогенный штамм ТК-А вируса ИРТ КРС. Характеристики штамма ТК-А даны в таблице 1. Активность тест-вирусной суспензии для модельных опытов составляла не менее 5,75 lg_l0 ТЦД_50/см3 (десятичный логарифм дозы, вызывающей 50% поражение клеток) для вируса ИРТ КРС.

Культура клеток

Культивирование и титрование вируса ИРТ КРС проводили в перевиваемой линии культуры клеток почки теленка (MDBK), которые выращивали во флаконах для клеточных культур (Nunc, Дания) в среде Игла MEM (производство ФГУП «Предприятие по производству бактерийных и вирусных препаратов Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН») с добавлением 5-10% эмбриональной сыворотки крови теленка (HyClone, США, лот №ASA28574), тестированной на наличие вируса ИРТ КРС и антител к нему. При выращивании культур клеток использовали 0,25% раствор трипсина, 0,01% раствор химотрипсина в 0,02% растворе Версена (производство ФГУП «Предприятие по производству бактерийных и вирусных препаратов Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН»).

Определение стерильности трех серий препарата Виталанг-2 проводили в соответствии с ГОСТ 28085-89 Препараты биологические. Метод бактериологического контроля стерильности.

Наработка вирусной суспензии и определение биоконцентрации вируса ИРТ КРС-ТК-А

Проводили 5 последовательных пассажей вируса в перевиваемой культуре клеток MDBK. Для этого во флакон объемом 25 см³ с сформированным монослоем культуры клеток вносили 0,5 см³ содержащей вирус суспензии после предварительного удаления из флакона питательной среды. После 1 ч контакта вируса с культурой клеток во флакон добавляли 20 мл питательной среды Игла MEM. Зараженные флаконы инкубировали при температуре 37±0,5°C с ежедневным просмотром состояния монослоя для выявления цитодеструктивных изменений действия вируса. После выявления таких изменений в более чем 85% клеток флаконы помещали в морозильную камеру при -20°C и однократно оттаивали, после чего проводили последующий пассаж вируса в перевиваемой культуре клеток. Для определения биоконцентрации вируса ИРТ КРС выполняли титрование вируссодержащей суспензии в 96-луночных культуральных планшетах с использованием двухсуточного монослоя клеток MDBK. Предварительно готовили 10-кратные разведения вируссодержащей суспензии на питательной среде Игла MEM от 10^-1 до 10^-7. Из каждого разведения вируса по 100 мкл вносили в четыре параллельных ряда по 7 лунок 96-луночного планшета. Инфицированные клетки инкубировали в течение 3-5 суток. Титр вируса оценивали в lg₁₀ТЦД_50/см3, рассчитывая по методу Рида и Менча [7].

Определение токсичности трех серий препарата Виталанг-2 in vitro проводили в соответствии с «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» [8] с предварительным приготовлением десятикратных разведений препарата (от 10^-1 до 10^-7) в культуральной питательной среде и внесением их в культуры клеток, достигших монослоя (по 4 повтора на каждое разведение). Контакт разведений препарата с клетками осуществляли в течение 72 ч с ежедневной микроскопией для определения цитодеструктивного действия, которое отмечали по 4-крестовой системе по методу Финтера, где 100% деструкция клеток обозначается 4+, 25% - как 1+. Минимальная концентрация препарата, вызывающая цитотоксический эффект на 50% (++), рассматривалась как цитопатогенная доза (ТЦД₅₀).

На основании полученных данных при определении токсичности препарата определяли максимально переносимую концентрацию препарата (МПК), которую вычисляли по формуле: МПК=ТЦД₅₀/4.

Определение противовирусной активности препарата Виталанг-2 in vitro

Определение противовирусного (вирулицидного, профилактического и лечебного) действия препарата проводили методом титрования проб, собранных через 24 часа после заражения вирусом чувствительной к нему культуры клеток, выращенных в плоскодонных культуральных 96-луночных планшетах. В опытах использовали препарат в максимально переносимой концентрации 5 мг/см³.

Для определения лечебной активности препарат Виталанг-2 вносили в монослой используемой культуры клеток MDBK через 1 ч после контакта с тест-вирусом ТК-А в дозе, вызывающей 100% поражение клеток. В качестве контроля использовали клетки, не обработанные препаратом.

Для определения профилактической активности препарат вносили в монослой используемой культуры клеток MDBK за 1 ч до внесения тест-вируса ТК-А в той же дозе, что при определении лечебной активности препарата. В качестве контроля использовали клетки, не обработанные препаратом.

Для определения вирулицидной активности препарат вносили в монослой используемой культуры клеток MDBK одновременно с тест-вирусом ТК-А. В качестве контроля использовали клетки, зараженные только тест-вирусом.

Оценку противовирусной активности препарата Виталанг-2 в отношении вируса ИРТ КРС проводили по степени ингибирования размножения (редукции) тест-вируса. Для расчета вирусной редукции использовали формулу: R=(lg₁₀A₀)-(lg₁₀A_n), где А₀ - титр вируса/мл в исходном образце, A_n - титр вируса/мл в образце после обработки.

Препаратом, обладающим выраженным антивирусным эффектом, считали соединение, подавляющее размножение вируса в культуре клеток на 1,7-2,0 lg₁₀ [9].

Результаты исследований

В результате проведенных нами исследований было установлено, что все три тестированные в настоящей работе серии препарата Виталанг-2, полученного по способу [6], являются стерильными и могут быть использованы для проведения дальнейших исследований в условиях in vitro без дополнительной ультрафильтрации.

Концентрация вирусной суспензии штамма ТК-А вируса ИРТ КРС составила 5,75±0,12 lg₁₀ТЦД_50/мл.

Установили, что максимальная нетоксичная концентрация препарата Виталанг-2 для данной культуры составляет 20 мг/см³. Все три тестированные нами серии препарата Виталанг-2 не отличались друг от друга по токсичности для перевиваемой культуры клеток MDBK. Максимальная переносимая концентрация препарата Виталанг-2 для этих культур клеток составила 5 мг/см³.

Результаты определения лечебной, профилактической и вирулицидной активности препарата Виталанг-2 представлены в таблице 2. Полученные результаты свидетельствуют о том, что препарат Виталанг-2 в максимально переносимой дозе оказывает профилактическое действие в отношении вируса ИРТ КРС. Уровень редукции вируса составил 1,91 lg₁₀ТЦД_50мг/см3.

Вывод

В условиях in vitro, на перевиваемой культуре клеток MDBK инфицированных штаммом ТК-А вируса ИРТ КРС, установлено, что препарат Виталанг-2 обладает выраженным ингибирующим действием в отношении этого вируса при профилактическом применении.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (Государственный контракт №16.512.11.2018 от 11.02.2011).

Источники информации

1. Юров К.П. Распространение инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота в различных регионах России / К.П. Юров, А.Ф. Шуляк, О.Г. Петрова, О.В. Майджи // Труды ВИЭВ. - 73. - 2003. - С. 15-22.

2. Андреев Е.В. Ассоциированное воздействие на организм вируса и условно-патогенных бактерий / Е.В. Андреев // Ветеринария. - 1984. - №6. - С. 25-27.

3. De Clercq Е. Molecular Targets for Antiviral Agents // Pharmacolgy And Experimental Therapeutics. - 2001. - Vol. 297. - P. 1-10.

4. Даниленко Е.Д. Индуктор интерферона ридостин. Результаты экспериментального изучения / Е.Д. Даниленко, В.И. Масычева // Применение ридостина для лечения вирусных и бактериальных инфекций и перспективы его использования при заболеваниях неинфекционной природы: Сб. мат.«Круглого стола» научной конференции. - Бердск, 2000. - С. 11-16.

5. Taylor-Papadimitriou J. Antiviral and antiproliferative effects of interferons in quiescent fibroblasts are dissociable / J. Taylor-Papadimitriou, F. Balkwill, N. Ebsworth, E. Rozengurt // Virolgy. 1985. - V. 147(2). - P. 405-412.

6. Ямковая T.B., Ямковой В.И., Панин Л.Е. Выделение и анализ биологической активности высокополимерной РНК из пекарских дрожжей // Бюл. СО РАМН. - 2012. - Т. 32. - №6. - с. 60-68.

7. Медицинская вирусология: Руководство // Под ред. Д.К. Львова. - М.: ООО «Медицинское информационное агентство», 2008. - 656 с.

8. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ // Под общ. ред. Р.У. Хабриева. - М.: Изд-во Медицина, 2005.

9. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств // Под общ. ред. А.Н. Миронова. - М.: Изд-во Медицина, 2005.

Изобретение относится к области ветеринарии и фармацевтической промышленности, в частности к противовирусным средствам на основе мылкого амфифильного комплекса одноцепочечной высокополимерной РНК Saccharomyces cerevisiae, содержащей короткие двуспиральные участки с олеиновой кислотой. Может быть использовано для профилактики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (ИРТ КРС). 2 табл., 1 пр.

Применение в качестве противовирусного средства для профилактики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота мылкой амфифильной одноцепочечной высокополимерной РНК Saccharomyces cerevisiae, содержащей короткие двуспиральные участки, извлекаемой из сухих пекарских дрожжей с помощью олеиновой кислоты или с помощью додецилсульфата натрия путем обработки выделенной РНК олеиновой кислотой.