СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АМФИФИЛЬНОЙ ВЫСОКОПОЛИМЕРНОЙ РНК ИЗ СУХИХ ДРОЖЖЕЙ Российский патент 2023 года по МПК C12N15/10 C12N1/18 A61K31/7105 A61P37/02 

Изобретение относится к области ветеринарии, медицины и фармацевтической промышленности, в частности к средствам, обладающим иммуномодулирующим действием, и может быть использовано, например, для приготовления противовирусных лекарственных препаратов.

Противовирусные свойства гетерологичной РНК известны давно. Так в Российской Федерации из дрожжей Saccharomyces cerevisiae были выделены и изучены препараты высокополимерной РНК, получившие название Полирибонат и Ридостин. Полирибонат обладал противовирусной активностью, стимулировал гемопоэз, являлся иммуномодулятором и адъювантом, использовался в ветеринарии [1]. Ридостин индуцирует биосинтез интерферонов, стимулирует гуморальный иммунный ответ, активизирует функцию макрофагов и нейтрофилов, при совместном использовании с антибактериальными и противовирусными вакцинами обладает иммуноадъювантными свойствами [2]. Полирибонат и Ридостин состоящие из гидрофильных молекул хорошо растворимых в воде в настоящее время по ряду причин сняты с производства.

Недавно нами было описано получение из пекарских дрожжей принципиально иной высокоактивной противовирусной мылкой амфифильной одноцепочечной высокополимерной РНК, содержащей короткие двуспиральные участки. Предложенная технология проста. Она основана на экстракции РНК из клеток промышленных штаммов дрожжей при повышенной температуре с помощью олеиновой кислоты [3]. Препарат был назван Виталангом-2. Наличие в препарате Виталанг-2 связанной олеиновой кислоты приводит к снижению его растворимости в воде. Однако по этой же причине препарат обладает повышенной способностью проникать через биологические мембраны и, как следствие, проявляет более высокую биологическую активность [3, 4].

Транспортированные с помощью, обладающей в анионной форме амфифильными свойствами, олеиновой кислоты внутрь клеток молекулы РНК воспринимаются как некие вирусоподобные частицы. В ответ в организме животного сильно индуцируется биосинтез эндогенного интерферона γ [4]. Кроме того, препарат Виталанг-2 дозозависимо увеличивает массу лимфоидных органов (тимуса и селезенки), количество клеток в них, а также содержание в плазме крови иммуноглобулинов классов М и G [5]. Как следствие, значительно повышается неспецифическая резистентность организма животного в отношении болезнетворных вирусов.

Препарат Виталанг-2 был испытан нами на вирусах: оспы мышей [6], ветряной оспы, гриппа птиц [7], герпеса [8], сезонного гриппа и ОРВИ [9], ринотрахеита крупного рогатого скота (КРС) [10], ринотрахеита и калицивироза кошек, ринотрахеита птиц, коронавирусного гастроэнтерита и диареи собак, ящура КРС и SARS-CoV-2. Результат везде положительный. А в случае вирусной диареи - экономически значимой болезни слизистых оболочек кишечника КРС - успешно проведен в сертифицированной лаборатории полный цикл ветеринарных клинических испытаний [11]. Кроме того, были получены данные о перспективности лечения Виталангом-2 заболеваний с реакциями гиперчувствительности замедленного типа в патогенетическом процессе (туберкулез, проказа, шистосомоз, саркоидоз, болезнь Крона) [5] и гепатита С [4]. Не исключено применение препарата Виталанг-2 и для лечения тяжелых форм рака поскольку кроме интерферона γ он может быть способен индуцировать биосинтез интерферона α-2а (наша гипотеза подкрепленная двумя успешными излечениями) известного не только своими противовирусными но и противораковыми свойствами.

В терапевтической дозе 0,5 мг/кг при LD₅₀ более 2 г/кг препарат Виталанг-2 безвреден (огромное терапевтическое окно). Это же показано доклиническими испытаниями в сертифицированной лаборатории и многолетними испытаниями на себе, членах семьи и близких.

В случае ОРВИ и гриппа излечение достигается за одни, реже двое, суток, а после неоднократного применения Виталанга-2 к этим заболеваниям возникает некоторый иммунитет.

5 сентября 2019 года Федеральная служба по ветеринарному и фитосанитарному надзору Российской Федерации выдала на противовирусный лекарственный препарат для ветеринарного интраназального применения Виталанг-2 Регистрационное удостоверение за номером 35-3-15.19-4552№ПВР-3-15.19/03504.

Наиболее близким к предлагаемому, является способ извлечения противовирусной лекарственной субстанции из сухих пекарских дрожжей с помощью олеиновой кислоты - прототип [3, 12].

Однако получение этой субстанции из пекарских дрожжей по способу - прототипу весьма затратно и осуществляется пока только в лабораторных условиях.

Целью настоящего изобретения является снижение издержек производства и доведение его до полупромышленных масштабов.

Цель достигается путем оптимизации всех стадий получения лекарственной субстанции и семикратным масштабированием технологии с предельным концентрированием исходной суспензии дрожжей.

Пример осуществления предлагаемого способа

Температура в цехе должна быть от 19 до 21 градуса Цельсия.

Для мытья посуды следует использовать апирогенный детергент.

Экстракция РНК (работников 2, рабочее время 7 ч). 700 г свежих сухих пекарских дрожжей (Saccharomyces cerevisiae, ООО «Саф-Нева», г. Воронеж, ТУ 9182-036-48975583-2010) всыпали тонкой струйкой в течение 5-7 мин в 10 л стальную кастрюлю с 6 л перемешиваемой механической мешалкой (250 мин^-1) кипящей дистиллированной воды, содержащей 50 мл 2,5 М NaOH (марки «ч») оттитрованного 100 мл олеиновой кислоты (ЗАО «Купавнареактив», марки «ч»). Температура суспензии не опускалась ниже 98°С. Суспензию кипятили с приоткрытой крышкой 40 мин при 100°С. По окончании экстракции суспензию переливали в 10 л ведро из нержавеющей стали и охлаждали до 25-30°С в раковине в двух-трех сменах холодной воды, затем центрифугировали на центрифуге ОС-6МЦ, Киргизия (2500 мин^-1, 20 мин считая и разгон). Эксперимент повторяли дважды с новыми порциями дрожжей.

Сбор концентрата кормового белка и высаливание высокополимерной РНК хлористым натрием (работников 2, рабочее время входит в упомянутое выше). Отцентрифугированные супернатанты (4,25-4,30 л) сливали через 3 слоя марли в три пластиковых стакана емкостью по 5 л, а плотные осадки дрожжевого шлама, собирающиеся на дне центрифужных стаканов и содержащие до 43% (от сухого веса) денатурированного белка, собирали и сушили открытым способом при 58-62°С. В супернатанты же добавляли по 877,5 г NaCl (марки «х.ч.») и свежую дистиллированную воду до 5 л. Суспензии интенсивно перемешивали механической мешалкой (1000 мин^-1) до полного растворения соли и оставляли при комнатной температуре на 1-2 сут для формирования осадков.

Промывка высоленной РНК 3 М раствором NaCl и 95% этанолом (работник 1, рабочее время 6,5 ч). Высоленные осадки-шроты, содержащие амфифильную высокополимерную РНК, отделяли от супернатантов декантацией (2 л) с последующим центрифугированием (3 л) на центрифуге РС-6МЦ, Киргизия (3000 мин^-1, 30 мин, температура комнатная, супернатанты декантировать осторожно, осадки скользкие и держатся очень слабо) объединяя. Объединенный осадок-шрот промывали 2-мя порциями по 2,5 л 3 М раствора NaCl и 3-мя порциями по 900 мл 95%-ного этанола (ООО «Константа-Фарм М», для наружного применения и приготовления лекарственных форм); при этом шрот диспергировали механической мешалкой (1000 мин^-1, в случае NaCl) или стеклянной палочкой и затем миксером (в случае этанола) минимум по 10 мин, затем выделяли центрифугированием на центрифуге РС-6МЦ (3000 мин^-1, 30 мин в случае NaCl и 7 мин в случае этанола, температура комнатная, в случае NaCl супернатант декантировать осторожно, осадок скользкий и держится слабо). Промытый шрот сушили в центрифужном стакане в стерильном ламинаре при комнатной температуре в течение 5-7 сут (раз в сутки шрот рыхлили стеклянной палочкой) до минимального веса и отсутствия запаха спирта. Сухой шрот растирали в фарфоровой ступке в порошок.

В итоге получалось 58,0-65,4 (60,2±4,9) г лекарственной субстанции с весовой экстинкцией 17,1-21,6 (17.8±0,8) ОЕ₂₆₀/мг; содержанием КРФ, % 0,28-0,54 (2,27±0,07); приростом КРФ за 1 сут при 25°С, % 0,00-0,08 (0,12±0,04); спектральными отношениями: D₂₃₀/D₂₆₀ - 0,33-0,36 (0,40±0,01); D₂₅₀/D₂₆₀ - 0,85-0,88 (0,90±0,01); D₂₈₀/D₂₆₀ - 0,48-0,53 (0,51±0,02). В скобках приведены аналогичные данные из табл. 6 прототипа [3].

Семикратное масштабирование с 16,7%-ным концентрированием исходной суспензии дрожжей, замена дрожжей ГОСТ 28483-90 на свежие дрожжи ТУ 9182-036-48975583-2010, однократное добавление в реактор 50 мл 2,5 М NaOH, уменьшение количества 3 М раствора NaCl при промывке им осадка-шрота на 40,5% и количества промывок осадка-шрота этанолом с 5 до 3 при том же выходе целевого продукта на единицу массы дрожжей не отражается на качестве лекарственной субстанции (см. приведенные выше данные в сравнении с данными прототипа), но приводит к экономии 57,1% NaOH, 14,8% олеиновой кислоты, 10,7%) NaCl и 48,6% этанола.

Регенерация этанола и осаждение из отходов 3 М раствора NaCl низкополимерной РНК соляной кислотой. Отработанный спирт регенерировали двойной перегонкой (возврат 80-90%). Содержащуюся же в супернатантах после высаливания и промывки высоленной высокополимерной РНК (~20 л) низкополимерную РНК осаждали добавлением 40 мл концентрированной HCl (марки «х.ч.»). Сформировавшийся в течение 2 сут при комнатной температуре осадок низкополимерной РНК выделяли центрифугированием на центрифуге РС-6МЦ (3500 мин^-1, 30 мин, температура комнатная), промывали 3-мя порциями по 0,5 л 95%-ного этанола; при этом осадок диспергировали стеклянной палочкой и затем миксером минимум по 10 мин, затем выделяли центрифугированием на центрифуге РС-6МЦ (3500 мин^-1, 7 мин, температура комнатная). Промытый осадок-шрот сушили в центрифужном стакане в стерильном ламинаре при комнатной температуре в течение 5-7 сут (раз в сутки шрот рыхлили стеклянной палочкой) до минимального веса и отсутствия запаха спирта и HCl. Сухой шрот растирали в фарфоровой ступке в порошок.

В итоге получалось 11,13 г низко полимер ной РНК с весовой экстинкцией 14,8 ОЕ₂₆₀/мг и спектральными отношениями: D₂₃₀/D₂₆₀ - 0,37; D₂₅₀/D₂₆₀ - 0,87; D₂₈₀/D₂₆₀ - 0,54.

Источники информации

1. Соколов В.Д., Андреева Н.Л., Соколов А.В. Иммуностимуляторы в ветеринарии // Ветеринария. - 1992. - №7-8. - С. 49-50.

2. Кнорроз М.Ю., Попова О.М., Давыдова А.А., Носик Н.Н., Баринский И.Ф., Подгорный В.П., Аликин Ю.С. Сравнительное изучение противовирусной активности природных двуспиральных РНК при экспериментальном клещевом энцефалите // Вопросы вирусологии. - 1985. Т. 30. - №6. - С. 697-700.

3. Ямковая Т.В., Ямковой В.И., Панин Л.Е. Выделение и анализ биологической активности высокополимерной РНК из пекарских дрожжей // Бюл. СО РАМН. - 2012. - Т. 32. - №6. - С. 60-68.

4. Ямковая Т.В., Глотова Т.П., Колесникова О.П., Семенова О.В., Гаврилова Е.В., Гойман Е.В., Ямковой В.И., Панин Л.Е. Легко проникающий через биологические мембраны мылкий амфифильный индуктор интерферона у - перспективный препарат для лечения гепатита С человека // Бюл. СО РАМН. - 2014. - Т. 34. - №1. - С. 15-20.

5. Ямковая Т.В., Колесникова О.П., Ямковой В.П., Козлов В.А., Панин Л.Е. Иммунотропная активность мылкой амфифильной высокополимерной РНК из пекарских дрожжей // Бюл. СО РАМН. - 2013. - т. 33. - №4. - С. 42-48.

6. Ямковая Т.В., Мазуркова Н.А., Загребельный С.Н., Панин Л.Е., Ямковой В.И. Способ лечения оспы // Патент России №2480219. 2013. Бюл. №12.

7. Ямковая Т.В., Мазуркова Н.А., Загребельный С.Н., Панин Л.Е., Ямковой В.И. Способ лечения гриппа птиц // Патент России №2502512. 2013. Бюл. №36.

8. Ямковая Т.В., Загребельный С.Н., Панин Л.Е., Ямковой В.И. Противогерпетическое средство // Патент России №2502504. 2013. Бюл. №36.

9. Ямковая Т.В., Загребельный С.Н., Панин Л.Е., Ямковой В.И. Противовирусное средство // Патент России №2436583. 2011. Бюл. №35.

10. Спицын А.А., Ямковая Т.В., Глотова Т.И., Ямковой В.И. Противовирусное средство для профилактики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота // Патент России №2571935. 2015. Бюл. №36.

11. Ямковая Т.В., Глотова Т.И., Глотов А.Г., Семенова О.В., Ямковой В.И., Панин Л.Е. Активность препарата Виталанг-2 в отношении возбудителя вирусной диареи - болезни слизистых оболочек КРС // Ветеринария. - 2014. - №3. - С. 10-14.

12. Ямковая Т.В., Загребельный С.Н., Панин Л.Е., Ямковой В.И. Способ получения высокополимерной РНК из сухих пекарских дрожжей // Патент России №2403288. 2010. Бюл. №31.

Изобретение относится к биотехнологии и фармацевтической промышленности. Предложен способ получения амфифильной высокополимерной РНК из сухих дрожжей, включающий суспендирование сухих пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae в кипящем водном 1,5%-ном растворе олеиновой кислоты, оттитрованной 2,5 М NaOH до рН 7-8, суспензию выдерживают при 98-100°С в течение 40 мин, центрифугируют охлажденный до 25-30°С лизат в низкоскоростной центрифуге без охлаждения, к слитой через 3 слоя марли надосадочной жидкости добавляют NaCl до концентрации 3 М, суспензию выдерживают 1-2 сут при 19-21°С, декантируют 40% супернатанта, а остальные 60% центрифугируют в низкоскоростной центрифуге без охлаждения, полученный осадок-шрот промывают последовательно двумя порциями 3 М раствора NaCl и тремя порциями 95%-ного этанола путем ресуспендирования и низкоскоростного центрифугирования его при комнатной температуре, высушивают на воздухе в стерильных условиях до минимального веса и отсутствия запаха спирта, затем растирают в фарфоровой ступке в порошок. Изобретение обеспечивает расширение арсенала способов получения амфифильной высокополимерной РНК для приготовления противовирусных лекарственных препаратов. 1 пр.

Способ получения амфифильной высокополимерной РНК из сухих дрожжей путем суспендирования их без предварительного замачивания в кипящем растворе оттитрованной щелочью олеиновой кислоты с последующим продолжительным кипячением суспензии, низкоскоростным центрифугированием охлажденного лизата, осаждением высокополимерной РНК из супернатанта хлористым натрием и промывкой осадка-шрота раствором хлористого натрия и этанолом путем последовательного его ресуспендирования - низкоскоростного центрифугирования, отличающийся тем, что сухие пекарские дрожжи Saccharomyces cerevisiae суспендируют в кипящем водном 1,5%-ном растворе олеиновой кислоты, оттитрованной 2,5 М NaOH до рН 7-8, суспензию выдерживают при 98-100°С в течение 40 мин, центрифугируют охлажденный до 25-30°С лизат в низкоскоростной центрифуге без охлаждения, к слитой через 3 слоя марли надосадочной жидкости добавляют NaCl до концентрации 3 М, суспензию выдерживают 1-2 сут при температуре 19-21°С для формирования осадка, декантируют 40% супернатанта, а остальные 60% центрифугируют в низкоскоростной центрифуге без охлаждения, полученный осадок-шрот промывают последовательно двумя порциями 3 М раствора NaCl и тремя порциями 95%-ного этанола путем ресуспендирования и низкоскоростного центрифугирования его при комнатной температуре, высушивают на воздухе в стерильных условиях до минимального веса и отсутствия запаха спирта, затем растирают в фарфоровой ступке в порошок.