Способ лечения вирусных заболеваний амфифильной высокополимерной дрожжевой РНК, упакованной в наноразмерные хитозановые капсулы, per'os Российский патент 2024 года по МПК A61K31/7105 A61K36/64 B82Y5/00 A61P31/12 

Изобретение относится к области ветеринарии, медицины и фармацевтической промышленности, в частности к средствам, обладающим иммуномодулирующим действием, и может быть использовано, например, для лечения per’os вирусных заболеваний с помощью амфифильной высокополимерной дрожжевой РНК, упакованной в наноразмерные хитозановые капсулы.

Умеренные противовирусные свойства гетерологичной РНК известны давно. Так в Российской Федерации из дрожжей Saccharomyces cerevisiae были выделены и изучены препараты высокополимерной РНК, получившие название Полирибонат и Ридостин. Полирибонат обладал противовирусной активностью, стимулировал гемопоэз, являлся иммуномодулятором и адъювантом, использовался в ветеринарии [1]. Ридостин индуцирует биосинтез интерферонов, стимулирует гуморальный иммунный ответ, активизирует функцию макрофагов и нейтрофилов, при совместном использовании с антибактериальными и противовирусными вакцинами обладает иммуноадъювантными свойствами [2]. Полирибонат и Ридостин, состоящие из гидрофильных молекул, хорошо растворимых в воде, в настоящее время по ряду причин сняты с производства.

Недавно нами было описано получение из пекарских дрожжей принципиально иной высокоактивной противовирусной мылкой амфифильной одноцепочечной высокополимерной РНК, содержащей короткие двуспиральные участки. Предложенная технология проста. Она основана на экстракции РНК из клеток промышленных штаммов дрожжей при повышенной температуре с помощью олеиновой кислоты [3]. Препарат был назван Виталангом-2. Наличие в препарате Виталанг-2 связанной олеиновой кислоты приводит к снижению его растворимости в воде. Однако по этой же причине препарат обладает повышенной способностью проникать через биологические мембраны и, как следствие, проявляет более высокую биологическую активность [3, 4].

Транспортированные с помощью, обладающей в анионной форме амфифильными свойствами, олеиновой кислоты внутрь клеток молекулы РНК воспринимаются как некие вирусоподобные частицы. В ответ в организме животного сильно индуцируется биосинтез эндогенного интерферона γ [4]. Кроме того, препарат Виталанг-2 дозозависимо увеличивает массу лимфоидных органов (тимуса и селезенки), количество клеток в них, а также содержание в плазме крови иммуноглобулинов классов М и G [5]. Как следствие, значительно повышается неспецифическая резистентность организма животного в отношении болезнетворных вирусов.

Препарат Виталанг-2 был испытан нами на вирусах: оспы мышей [6], ветряной оспы, гриппа птиц [7], герпеса [8], сезонного гриппа и ОРВИ [9], ринотрахеита крупного рогатого скота (КРС) [10], ринотрахеита и калицивироза кошек, ринотрахеита птиц, коронавирусного гастроэнтерита и диареи собак, ящура КРС и SARS-CoV-2. Результат везде положительный. А в случае вирусной диареи - экономически значимой болезни слизистых оболочек кишечника КРС - успешно проведен в сертифицированной лаборатории полный цикл ветеринарных клинических испытаний [11]. Кроме того, были получены данные о перспективности лечения Виталангом-2 заболеваний с реакциями гиперчувствительности замедленного типа в патогенетическом процессе (туберкулез, проказа, шистосомоз, саркоидоз, болезнь Крона) [5] и гепатита C [4]. Не исключено применение препарата Виталанг-2 и для лечения тяжелых форм рака поскольку кроме интерферона γ он может быть способен индуцировать биосинтез интерферона α-2а (наша гипотеза, подкрепленная двумя успешными излечениями) известного не только своими противовирусными но и противораковыми свойствами.

В терапевтической дозе 0,5-1 мг/кг при LD₅₀ более 2 г/кг препарат Виталанг-2 безвреден (огромное терапевтическое окно). Это же показано доклиническими испытаниями в сертифицированной лаборатории и многолетними испытаниями на себе, членах семьи и близких.

В случае ОРВИ и гриппа излечение достигается за одни, реже двое, суток, а после неоднократного применения Виталанга-2 к этим заболеваниям возникает некоторый иммунитет.

5 сентября 2019 года Федеральная служба по ветеринарному и фитосанитарному надзору Российской Федерации выдала на лекарственный препарат для лечения инфекционных болезней животных Виталанг-2 Регистрационное удостоверение за номером 35-3-15.19-4552№ПВР-3-15.19/03504.

Инфекционные болезни, в том числе новые, представляют угрозу и для человечества, поскольку являются причиной трети общего ежегодного количества смертей в мире [12]. Среди огромного количества возбудителей инфекционных болезней особое место принадлежит вирусам. Всемирная Организация Здравоохранения (ВОЗ) объявила 21 век столетием вирусов [12].

Сегодня, как никогда, реальна угроза биотерроризма с использованием высокопатогенных вирусов, в том числе возбудителей ортопоксвирусных инфекций. После глобальной ликвидации натуральной оспы и отмены вакцинации против нее в 1980 году в мире сложилась опасная ситуация в связи с отсутствием у более чем половины населения планеты иммунитета против ортопоксвирусных инфекций [13]. Ситуация усугубляется существованием природных очагов вирусов, входящих в род Orthopoxvirus; увеличением в последние десятилетия масштабности и частоты эпидемических вспышек в экваториальной Африке оспы обезьян и оспы коров с возрастанием смертности среди людей [14]; возможностью сохранения ортопоксвирусов в трупах людей, захороненных в вечной мерзлоте Евразии и Америки [15].

В связи с вышеизложенным, а также с тем, что в России в настоящее время нет зарегистрированного лекарственного препарата для защиты людей от ортопоксвирусных инфекций, необходимы исследования по поиску и разработке таких препаратов.

При разработке противооспенных препаратов для первоначального скрининга их эффективности, в том числе и против вируса натуральной оспы, могут быть использованы другие ортопоксвирусы, в частности на животных моделях - вирус эктромелии (оспы мышей).

Именно поэтому в качестве прототипа наиболее близкого к предлагаемому в настоящей работе был выбран способ лечения эктромелии путем внутримышечного введения препарата Виталанг-2 [6].

Однако лечение по способу - прототипу весьма инвазивно и вряд ли может быть использовано в случае мелких животных и детей.

Целью настоящего изобретения является разработка безболезненного способа введения пациентам противовирусного препарата Виталанг-2.

Цель достигается путем заключения лекарственной субстанции в наноразмерные хитозановые капсулы и введения их per’os.

Пример осуществления предлагаемого способа

А - субстанцию противовирусного препарата Виталанг-2 получали по методу [16]. Далее ее ампулировали, лиофилизовали и стерилизовали.

В итоге получалось лекарственное средство (Виталанг-2) с весовой экстинкцией 20,6 - 23,0 ОЕ₂₆₀/мг; содержанием КРФ, % 1,27-1,44; отсутствием прироста КРФ за 1 сут при 25°С; спектральными отношениями: D₂₃₀ / D₂₆₀ - 0,33-0,37; D₂₅₀ / D₂₆₀ - 0,85-0,89; D₂₈₀ / D₂₆₀ - 0,50-0,56).

Б - наноразмерные хитозановые капсулы содержащие субстанцию амфифильной высокополимерной дрожжевой РНК получали по методу [17], за исключением того, что инертное ядро формировали из двуокиси титана, а в качестве действующего вещества использовали субстанцию Виталанга-2.

В итоге получался лиофилизованный порошок наноразмерных (170-200 нм) хитозановых капсул содержащих во внутреннем слое 40% субстанции амфифильной высокополимерной дрожжевой РНК. Препарат был назван Виталангом-4.

В - пример лечения эктромелии по способу - прототипу (внутримышечное введение Виталанга-2).

В работе использовали здоровых половозрелых животных беспородных белых мышей обоего пола, массой тела 14-16 г., полученных из питомника лабораторных животных ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор». Все эксперименты проводились в соответствии с [18].

В эксперименте было использовано 63 мыши, из них 42 животных - в опыте (6 групп по 7 мышей в группе) и 21 - в контроле (3 группы по 7 мышей в группе).

Виталанг-2 растворяли в стерильном физиологическом растворе (ФР) встряхивая 15 - 30 мин в день проведения эксперимента.

В работе использовали вирус эктромелии, штамм К-1, полученный из отдела коллекции микроорганизмов ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» и наработанный на перевиваемой клеточной линии Vero (клетки почки зеленой мартышки) с титром 9,33×10⁵ БОЕ/мл.

Мышей опытных и контрольных групп инфицировали интраназально под эфирным наркозом летальной дозой (10 LD₅₀, содержащих 2,57 lg БОЕ) вируса эктромелии в объеме 40 мкл/мышь (10.00).

Через 1 ч (11.00) после инфицирования мышам вводили препарат Виталанг-2 внутримышечно и затем еще дважды в течение дня с интервалом в 4 ч (15.00 и 19.00) в суммарной дозе 0,5 мг/кг массы (3-и группы по 7 мышей в группе) и 1,0 мг/кг массы (3-и группы по 7 мышей в группе) в объеме 200 мкл/одно введение. В качестве отрицательного контроля использовали 3-и группы по 7 инфицированных мышей, которым через 1 ч внутримышечно вводили ФР в объеме 200 мкл/одно введение и затем еще дважды в течение дня с интервалом в 4 ч (15.00 и 19.00) в том же объеме. Гибель животных учитывали ежедневно в течение последующих 16 дней, оценивали процент гибели, коэффициент защиты и среднюю продолжительность жизни.

Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета прикладных программ «Statistica 6.0», используя t-критерий Стьюдента, а также U-критерий Манна-Уитни. Достоверность различий средних величин устанавливали с помощью t-критерия Стьюдента при p≤0,05.

Г - пример лечения эктромелии по предлагаемому способу (введение Виталанга-4 per’os).

В работе использовали здоровых половозрелых животных беспородных белых мышей обоего пола, массой тела 14-16 г., полученных из питомника лабораторных животных ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». Все эксперименты проводились в соответствии с [18].

В эксперименте было использовано 63 мыши, из них 42 животных - в опыте (6 групп по 7 мышей в группе) и 21 - в контроле (3 группы по 7 мышей в группе).

Виталанг-4 суспендировали в стерильном ФР встряхивая 15 - 30 мин в день проведения эксперимента.

В работе использовали вирус эктромелии, штамм К-1, полученный из отдела коллекции микроорганизмов ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» и наработанный на перевиваемой клеточной линии Vero (клетки почки зеленой мартышки) с титром 9,7х10⁵ БОЕ/мл.

Мышей опытных и контрольных групп инфицировали интраназально под эфирным наркозом летальной дозой (10 LD₅₀, содержащих 3,4 lg БОЕ) вируса эктромелии в объеме 40 мкл/мышь (10.00).

Через 1 ч (11.00) после инфицирования мышам вводили суспензию Виталанга-4 per’os (через рот) и затем еще дважды в течение дня с интервалом в 4 ч (15.00 и 19.00) в суммарной дозе 1,25 мг/кг массы (3-и группы по 7 мышей в группе) и 2,5 мг/кг массы (3-и группы по 7 мышей в группе) в объеме 200 мкл/одно введение. В качестве отрицательного контроля использовали 3-и группы по 7 инфицированных мышей, которым через 1 ч per’os вводили ФР в объеме 200 мкл/одно введение и затем еще дважды в течение дня с интервалом в 4 ч (15.00 и 19.00) в том же объеме. Гибель животных учитывали ежедневно в течение последующих 16 дней, оценивали процент гибели, коэффициент защиты и среднюю продолжительность жизни.

Статистическую обработку данных проводили как описано в разделе В.

Д - результаты исследования приведены в таблицах:

Изучение выживаемости в экспериментальных группах белых беспородных мышей, получавших Виталанг-2 внутримышечно, при заражении вирусом эктромелии К-1 в дозе 10 ЛД₅₀ (лечебная схема)

Группа мышей Число и % выживших Число и % павших СПЖ (сут) КЗ Виталанг-2, 0,5 мг/кг, n = 21 8, 38,1 % 13, 61,9% 12,52±0,58 19,0% Виталанг-2, 1,0 мг/кг, n = 21 10, 47,6% 11, 52,4% 12,47±0,41 28,5% Контроль, n = 21 4, 19,1% 17, 80,9% 10,86±0,49 -

Изучение выживаемости в экспериментальных группах белых беспородных мышей, получавших Виталанг-4 per’os, при заражении вирусом эктромелии К-1 в дозе 10 ЛД₅₀ (лечебная схема)

Группа мышей Число и % выживших Число и % павших СПЖ (сут) КЗ Виталанг-4, 1,25 мг/кг, n = 21 6, 28,6 % 15, 71,4% 12,43±0,25 14,3% Виталанг-4, 2,5 мг/кг, n = 21 10, 47,6% 11, 52,4% 13,86±0,25 33,3% Контроль, n = 21 3, 14,3% 18, 85,7% 10,52±0,08 -

Где: СПЖ - средняя продолжительность жизни, КЗ - коэффициент защиты (КЗ = % гибели в контроле - % гибели в опыте), ЛД₅₀ - 50%-я летальная доза и n - количество животных в опыте. Содержание амфифильной высокополимерной РНК в Виталанге-4 - 40%.

Как видно из таблиц результаты лечения эктромелии Виталангом-2 и Виталангом-4 практически одинаковы, т.е. лечение per’os не менее эффективно, чем внутримышечное.

Источники информации

1. Соколов В.Д., Андреева Н.Л., Соколов А.В. Иммуностимуляторы в ветеринарии // Ветеринария. - 1992. - №7-8. - С. 49-50.

2. Кнорроз М.Ю., Попова О.М., Давыдова А.А., Носик Н.Н., Баринский И.Ф., Подгорный В.П., Аликин Ю.С. Сравнительное изучение противовирусной активности природных двуспиральных РНК при экспериментальном клещевом энцефалите // Вопросы вирусологии. -1985. - Т. 30. - №6. - С. 697-700.

3. Ямковая Т.В., Ямковой В.И., Панин Л.Е. Выделение и анализ биологической активности высокополимерной РНК из пекарских дрожжей // Бюл. СО РАМН. - 2012. - Т. 32. - № 6. - С. 60-68.

4. Ямковая Т.В., Глотова Т.И., Колесникова О.П., Семенова О.В., Гаврилова Е.В., Гойман Е.В., Ямковой В.И., Панин Л.Е. Легко проникающий через биологические мембраны мылкий амфифильный индуктор интерферона γ - перспективный препарат для лечения гепатита С человека // Бюл. СО РАМН. - 2014. - Т. 34. - № 1. - С. 15-20.

5. Ямковая Т.В., Колесникова О.П., Ямковой В.И., Козлов В.А., Панин Л.Е. Иммунотропная активность мылкой амфифильной высокополимерной РНК из пекарских дрожжей // Бюл. СО РАМН. - 2013. - т. 33. - № 4. - С. 42-48.

6. Ямковая Т.В., Мазуркова Н.А., Загребельный С.Н., Панин Л.Е., Ямковой В.И. Способ лечения оспы // Патент России №2480219. 2013. Бюл. №12.

7. Ямковая Т.В., Мазуркова Н.А., Загребельный С.Н., Панин Л.Е., Ямковой В.И. Способ лечения гриппа птиц // Патент России №2502512. 2013. Бюл. №36

8. Ямковая Т.В., Загребельный С.Н., Панин Л.Е., Ямковой В.И. Противогерпетическое средство // Патент России №2502504. 2013. Бюл. №36.

9. Ямковая Т.В., Загребельный С.Н., Панин Л.Е., Ямковой В.И. Противовирусное средство // Патент России №2436583. 2011. Бюл. №35.

10. Спицын А.А., Ямковая Т.В., Глотова Т.И., Ямковой В.И. Противовирусное средство для профилактики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота // Патент России №2571935 . 2015. Бюл. №36.

11. Ямковая Т.В., Глотова Т.И., Глотов А.Г., Семенова О.В., Ямковой В.И., Панин Л.Е. Активность препарата Виталанг-2 в отношении возбудителя вирусной диареи - болезни слизистых оболочек КРС // Ветеринария. - 2014. - №3. - С. 10-14.

12. Яковлев С.А. Инфекционные заболевания как глобальная проблема современности // Территория науки. - 2017. - № 1. - С. 20-23.

13. Львов Д.К., Зверев В.В, Гинцбург А.Л., Маренникова С.С., Пальцев М.А. Натуральная оспа - дремлющий вулкан // Вопросы вирусологии. - 2008. - № 4. - С. 4-8.

14. Маренникова С. С., Щелкунов С. Н., Патогенные для человека ортопоксвирусы. М., КМК Scientific Press Ltd., 1998. 386 с., ил. ISBN: 5-87317-051-7.

15. McCollum, A.M., Li, Y., Wilkins, K., Karem, K.L., Davidson, W.B., Paddock, C.D., Reynolds, M.G. & Damon, I.K. (2014). Poxvirus viability and signatures in historical relics. Emerg Infect Dis 20(2), 177-184.

16. Ямковая Т.В., Ямковой В.И. Способ получения амфифильной высокополимерной РНК из сухих дрожжей // Патент России №2801533. 2023. Бюл. №22.

17. Глазова И. А., Мочалова А. Е., Зайцев С. Д., Смирнова Л. А. Наноструктурированная композиция для пероральной доставки инсулина и способ ее получения // Патент России №2753018. 2021. Бюл. №23.

18. Руководство по содержанию и использованию лабораторных животных. - Washington, D.C.: National Academy Press, 1996. - 138 Р.

Изобретение относится к области ветеринарии, медицины и фармацевтической промышленности, и может быть использовано для лечения вирусного заболевания эктромелии. Предложено применение амфифильной высокополимерной дрожжевой РНК, упакованной в наноразмерные хитозановые капсулы с содержанием лекарственной субстанции в них 30-50%, в качестве противовирусного перорального средства для лечения эктромелии. Изобретение обеспечивает возможность безболезненного перорального введения пациентам противовирусного препарата, эффективность которого не меньше, чем при внутримышечном введении. 2 табл., 1 пр.

Применение в качестве противовирусного средства для лечения per’os эктромелии амфифильной высокополимерной дрожжевой РНК, упакованной в наноразмерные хитозановые капсулы с содержанием лекарственной субстанции в них 30-50%.