СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ПРОТЕЗОВ СОСУДОВ МАЛОГО ДИАМЕТРА С НИЗКОЙ ПОРИСТОСТЬЮ(ВАРИАНТЫ) Российский патент 2016 года по МПК A61L27/58 A61L33/06 A61F2/06 

Группа изобретений относится к области медицины и тканевой инженерии, а именно к сосудистой хирургии, и может быть использована при изготовлении протезов сосудов малого диаметра (до 6 мм), предназначенных для хирургической реконструкции периферических/коронарных кровеносных сосудов.

Большинство используемых тканных, плетеных или вязаных протезов сосудов из синтетических материалов, таких как лавсан или политетрафторэтилен, имеют ряд серьезных недостатков, основным из которых является образование слоя неоинтимы и инициация процессов, приводящих к уменьшению и закупориванию просвета протеза (A. Lafont, et al, Circulation Research, 1995, V. 76. P. 996-1002).

Одной из принципиальных причин недостаточной био- и гемосовместимости таких протезов является высокая хирургическая пористость протезов, составляющая от 10-20 до 2000 мл/мин, определяемая по ГОСТ Ρ 51556-2000. Такие протезы быстро пропитываются кровью, стенки протезов и их анастомозы с нативной артерией герметизируются за счет свертывания аутокрови, что приводит к повышенной интраоперационной кровопотере. Кроме того, формирование парапротезной гематомы в условиях постоянного присутствия в ране инородного материала повышает риск инфицирования имплантированного сосуда, а формирование тромбов в стенке протеза и микротромбов на внутренней поверхности способствует развитию воспаления, росту неоинтимы, блокирует миграцию клеток в стенку протеза, формирование соединительнотканной основы в стенке протеза и экстрапротезной соединительной капсулы.

Плетеные, вязаные и нетканые протезы имеют неровную, ворсистую поверхность, что дополнительно замедляет ток крови и инициирует утолщение стенки протеза с внутренней стороны из-за плохой адгезии и пролиферации на такой поверхности эндотелиальных клеток и их предшественников, которые не способны сформировать на такой поверхности однослойный эндотелий. Протезы из пористого политетрафторэтилена, напротив, имеют давление пропитывания 120-350 мм рт.ст. (ГОСТ Ρ 51556-2000), имеют изолированные полости и плохую биосовместимость в силу плохой диффузии белков и низкомолекулярных веществ крови, плохого прорастания клетками тканей и эндотелия и также, как и плетеные/вязаные/нетканые протезы, низкую эластичность и, таким образом, плохую механическую совместимость с сосудистой стенкой.

Для того чтобы улучшить биосовместимость материалов, повысить эффективность адгезии и пролиферации клеток была предпринята попытка изготовить материалы из волокон разного диаметра (от 0,117 до 1,647 микрон) методом электроспиннинга (M. Chen, et al. Tissue Engineering, 2007, V. 13. P. 579-587).

Принцип метода электроспиннинга заключается в образовании волокон в сильном электрическом поле, образованном между двумя электродами противоположной полярности. При этом раствор или расплав полимерного материала подается из электрода-фильеры с заданной скоростью. Раствор полимера при выходе из шприца растягивается в электрическом поле и превращается в полимерные нити (растворитель испаряется), которые собираются на вращающийся металлический коллектор (электрод-коллектор), являющийся вторым электродом, образуя пористый материал (H. Wu, et al. J Mater Sci: Mater Med, 2010, V. 21. P. 3207-3215).

Однако полученные с помощью электроспиннинга материалы обладают высокой проницаемостью для клеток крови. Например, исследование матриксов из поликапролактона, полученных с помощью электроспиннинга, показало, что размер пор варьирует от 56.442±26.28 до 69.228±29.647, что в терминах проницаемости составляет не менее 20 мл/см²/мин, т.е. через стенку такого протеза легко проходят клетки крови.

Известен способ получения протезов сосудов методом электроспиннинга из сополимера L-лактида с капролактоном (J. Lee, et al. Biomaterials, 2008, V. 29. P. 1872-1879), включающий изготовление протезов электроспиннингом из растворов с разной концентрацией синтетического полимера и желатина, с последующей обработкой полученных изделий водорастворимым карбодиимидом. Полученные протезы хорошо поддерживали адгезию и пролиферацию клеток, имели хорошие механические свойства.

Однако пористость протезов, полученных известным способом, составляет (по данным меркуриметрии) 50-70%, что с учетом толщины волокна 1÷1,5 микрон соответствует проницаемости не менее 20 мл/см²/мин, т.е. такие протезы легко проницаемы для клеток крови и не обеспечивают нулевую хирургическую порозность. Кроме того, сшивка белков в описанных авторами условиях малоэффективна; авторы не провели динамических испытаний механических свойств протезов.

Для уменьшения пористости тканых и нетканых протезов сосудов используется пропитывание биополимерами, такими как белки и полисахариды, или синтетическими полимерами. Наиболее часто для такой обработки используется желатин - дешевый и доступный гидролизат коллагенов, не индуцирующий иммунные реакции (M. Li, et al. Biomaterials, 2005, V. 26. P. 5999-6008).

Известен, например, способ обработки протезов сосудов, включающий обработку текстильной основы водным раствором глутарового альдегида в концентрации 0,5-0,75% в течение 2-3 мин с последующей инкубацией в растворе желатина с концентрацией 5,0-7,5 мас.% в 0,9% растворе хлорида натрия с антибиотиками и 20-30% глицерином при температуре 40-55°С в течение 2-5 мин с последующей пропиткой и высушиванием протеза в течение суток при комнатной температуре (патент RU 2470671 C1, опубл. 27.12.2012). Протез непроницаем при давлении до 300 мм рт.ст., однако на примере протезов кровеносных сосудов марки "Gelsoft" (Vascutek, Шотландия) известно, что желатиновая пропитка полностью растворяется в организме человека в течение двух недель, т.е. выполняет только временную гемостатическую функцию. Кроме того, белковый матрикс не связан ковалентно с основой протеза и поэтому не отличается стабильностью и не способствует нормальной эндотелизации протеза, а большое количество использованного для пропитки чужеродного белка может стимулировать развитие иммунных реакций.

Известен способ подготовки фторлон-лавсанового протеза сосуда, заключающийся в том, что синтетический фторлон-лавсановый протез стерилизуют кипячением в дистиллированной воде в течение 45 минут, инкубируют в течение 5 минут в 76% этиловом спирте, высушивают в течение 3 минут до полного испарения спирта, и инкубируют в стерильном водном растворе аутофибриногена с гепарином (соотношение 1 мг/20 ЕД) в течение 5 мин (патент RU 2216296 C1, опубл. 20.11.2003). После этого протез замораживают на тефлоновом стержне до температуры -40°С и лиофильно высушивают. Обработанный таким образом протез приобретает временную нулевую хирургическую порозность.

Известный способ отличается сложностью, требует специальных стерильных условий, фибриноген является специфическим белком воспаления и, следовательно, может стимулировать стенозирование, фибриноген не имеет ковалентных связей со стенкой протеза и в условиях постоянно меняющейся нагрузки может отслаиваться от основы, процесс отличается низкой технологичностью, стадии процесса плохо воспроизводимы и контролируемы.

Таким образом, все известные на сегодняшний день способы уменьшения пористости сосудистого протеза обеспечивают слабую фиксацию белка на синтетической основе, выполняют только временную герметизирующую функцию, не способствуют формированию новой биологически инертной внутренней выстилки синтетического протеза и миграции в стенку протеза клеток внешних тканей, повышающих биосовместимость протезов.

Наиболее ближайшим к заявляемой группе изобретений - прототипом, является способ изготовления биорезорбируемого гибридного сосудистого имплантата малого диаметра, включающий использование биодеградируемой полимерной композиции, полученной путем смешивания в хлороформе полигидроксибутирата (ПГБВ) с молекулярной массой 2307 кДа с включением оксивалериата от 8.5% до 37% и эпсилон-поликапролактона (ПКЛ) с молекулярной массой 80000 кДа, и выполненный методом двухстадийного электроспиннинга, где размер пор между хаотично расположенными нитями составляет 30-150 мкм, при этом соотношение полимеров в сухой смеси композиции ПГБВ : ПКЛ составляет 23.1-36.4:76.9-63.6, при этом на первом этапе электроспиннинга к раствору полимера добавляют коллаген IV типа в концентрации 100 мкг на 1 мл раствора и человеческий фибронектин в концентрации 10 мкг на 1 мл композиции, а второй этап электроспиннинга осуществляют с использованием полимерной композиции, дополненной фактором роста фибробластов в концентрации 0.01 мкг на 1 мл раствора (патент RU 2504406 С1, опубл. 20.01.2014).

Недостатками известного способа являются высокая пористость стенки протеза, недостаточная размерная стабильность, недостаточная прочность, а также недостаточная био- и гемосовместимость протезов сосудов.

Задачей группы изобретений является снижение пористости, улучшение механических характеристик и повышение био- и гемосовместимости протезов сосудов, изготовленных методом электроспиннинга.

Технический результат: получение протезов сосудов малого диаметра с низкой пористостью, улучшение механических характеристик, а также повышение био- и гемосовместимости протезов сосудов.

Поставленная задача достигается предлагаемым способом (варианты), заключающимся в следующем:

Изготовление протезов сосудов осуществляют методом электроспиннинга со следующими параметрами: напряжение - 20 кВ, скорость подачи раствора полимеров - 1,5 мл/час, расстояние между иглой и коллектором - 20 см, скорость вращения коллектора - 300 об/мин.

Предварительно готовят раствор полимера и белка. Для этого синтетический полимер смешивают с гексафторизопропанолом (ГФИП) до конечной концентрации 7,0-15,0%, а выбранный белок - до конечной концентрации 10,0-50,0%. Затем к раствору полимера добавляют раствор белка в массовом соотношении полимер : белок, равном (7-9):(1-3), и получают раствор композиции, готовый для изготовления протезов сосудов при помощи электроспиннинга. В качестве синтетического полимера может быть использован полимер, выбранный из группы, но не ограничиваясь: поликапролактон (ПКЛ), полибутилентерефталат (ПБТФ), полилактид-ко-гликолид, нейлон и т.д. В качестве белка может быть использован гелеобразующий белок, выбранный из группы, но не ограничиваясь: желатин, эластин, фибронектин и т.д.

Первый вариант способа. На первом этапе электроспиннинга на электрод-коллектор выбранного диаметра наносят 1,0-10,0% от требуемого объема раствора композиции. Затем полученный слой протеза пропитывают 1,0-5,0% водным раствором белка из расчета 1-25 мкл/см². Далее на сформированный внутренний слой протеза наносят оставшийся объем раствора композиции (при помощи электроспиннинга) и формируют внешний слой протеза сосуда, составляющий 90-99% от заданной толщины стенки протеза сосуда.

По завершении электроспиннинга заготовку протеза сосудов снимают с электрода-коллектора и инкубируют в буферном растворе, содержащем 0,05 M гидрокарбоната натрия (NaHCO₃), рН 9.0 в течение 5 минут, затем протез обрабатывают раствором бифункционального поперечно-сшивающего реагента, преимущественно 0,5-4,0% раствором глутарового альдегида, в этом же буфере в течение 1-3 часов с последующей дезактивацией реакционно-способных групп обработкой щелочным раствором глицина и высушиванием.

Второй вариант способа.

На первом этапе электроспиннинга на электрод-коллектор выбранного диаметра наносят 0,1-90,0% от требуемого объема раствора композиции, затем на сформированный внутренний слой протеза наносят раствор композиции, содержащей смесь полимера и белка в массовом соотношении полимер : белок, равном (1-3):(1-7), и получают промежуточный слой, составляющий 1,0-10,0% от заданной толщины стенки протеза сосуда. Далее на сформированный промежуточный слой протеза наносят оставшийся объем раствора композиции (при помощи электроспиннинга) и формируют внешний слой протеза, составляющий 9,0-98,9% от заданной толщины стенки протеза сосудов. При этом для формирования внутреннего и внешнего слоя протеза на первом и третьем этапах электроспиннинга могут быть использованы разные полимеры

Таким образом, второй вариант способа отличается от первого варианта тем, что вместо пропитки внутреннего слоя 1,0-5,0% раствором белка на него наносят раствор композиции, содержащей смесь полимера и белка в соотношении полимер : белок, равном (1:3)-(1:7), и получают промежуточный слой протеза (составляющий 1,0-10,0% от заданной толщины стенки протеза сосуда), на который наносят оставшийся объем раствора композиции и формируют внешний слой протеза (составляющий 9,0-98,9% от заданной толщины стенки протеза сосудов), при этом для формирования внутреннего и внешнего слоя протеза могут быть использованы разные полимеры.

Заявляемый способ позволяет получать протезы сосудов с любой требуемой проницаемостью, причем низкопористый (малопроницаемый) слой по данным динамических гидравлических испытаний сохраняется в течение не менее чем 500000 циклов нагрузки 100-200 мм рт.ст. Кроме того, протезы с таким слоем демонстрируют нулевую хирургическую порозность (не проницаемы для клеток крови), менее склонны к формированию неоинтимы и обеспечивают достоверно более высокую проходимость при длительном времени функционирования.

Существенными отличительными признаками первого варианта предлагаемого способа по сравнению с прототипом являются:

1. В качестве растворителя для синтетических полимеров и белка используют гексафторизопропанол (ГФИП), что позволяет приготавливать растворы синтетических полимеров с высоким содержанием белка и формировать волокна толщиной менее 1 микрона, создающие оптимальную поверхность для адгезии клеток.

2. На первом этапе электроспиннинга для получения внутреннего низкопористого слоя (стенки) протеза сосуда на электрод-коллектор наносят 1,0-10,0% от требуемого объема раствора композиции, что позволяет сформировать тонкий малопроницаемый слой протеза, обеспечивающий эффективную миграцию в стенки протеза клеток из прилегающих тканей и быструю наработку внеклеточного матрикса в стенке протеза.

3. Полученный внутренний слой протеза сосуда пропитывают раствором белка в концентрации 1,0-5,0% из расчета 1-25 мкл/см², а затем на сформированный внутренний слой протеза наносят оставшиеся 90-99% от требуемого объема раствора композиции и формируют внешний слой протеза сосудов, что позволяет обеспечить нулевую хирургическую порозность, уменьшить кровопотери во время операции, исключить тромбообразование, повысить гемо- и биосовместимость протеза, выражающуюся в формировании существенно более тонкого слоя неоинтимы в близкой и отдаленной перспективах.

4. Полученный протез сосудов обрабатывают бифункциональным сшивающим реагентом, преимущественно 0,5-4,0% раствором глутарового альдегида, с последующей дезактивацией реакционно-способных групп обработкой щелочным раствором глицина, что позволяет повысить прочность, эластичность и долговечность внутреннего слоя, а также размерную стабильность всего протеза за счет формирования прочных химических связей в синтетических волокнах.

Существенными отличительными признаками второго варианта способа по сравнению с первым вариантом являются:

1. Вместо пропитки внутреннего слоя 1,0-5,0% водным раствором белка на него наносят раствор композиции (на требуемом расстоянии от внутреннего просвета протеза), содержащей смесь полимера и белка в соотношении полимер : белок, равном (1-3):(1-7), и получают промежуточный слой протеза, составляющий 1,0-10% от заданной толщины стенки протеза сосуда, что позволяет регулировать пористость и структуру протезов сосудов, что приводит к улучшению гемо- и биосовместимости таких протезов.

2. Для формировании внутреннего и внешнего слоя протеза на первом и третьем этапах электроспиннинга могут быть использованы разные полимеры, выбранные из группы, но не ограничиваясь: поликапролактон (ПКЛ), полибутилентерефталат (ПБТФ), полилактид-ко-гликолид, нейлон и т.д., что позволяет обеспечить нормальную эндотелизацию протеза, регулировать шероховатость, прочность и скорость биодеградации протезов сосудов.

Предлагаемый способ позволяет с минимальными затратами сформировать внутренний или промежуточный низкопористый (малопроницаемый) слой протеза сосудов и повысить прочность стенки протеза сосудов в 1,3÷1,5 раза по сравнению с прототипом за счет высокого содержания белка в смеси полимера.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения способа.

Пример 1

Первый вариант способа. 500 мг поликапролактона (ПКЛ) растворили в 9 мл гексафтоизопропанола (ГФИП) при перемешивании и комнатной температуре и получили 7% раствор. Затем к 9 мл приготовленного 7% раствора ПКЛ добавили 1 мл 5% раствора желатина в гексафтоизопропаноле (массовое соотношение ПКЛ : желатин равно 9:1, концентрация ПКЛ в пересчете на сухой вес составила 5%) и тщательно перемешали полученный раствор. Стерильный шприц заполнили 0,75 мл готовой композицией, состоящей из ПКЛ и желатина в ГФИП, и запустили первый этап процесса изготовления протеза (2 мин, 10% от необходимого объема раствора композиции) при следующем режиме: напряжение - 20 кВ, скорость подачи полимерной композиции - 1,5 мл/час, скорость вращения электрода-коллектора - 300 об/мин. Сформировали внутренний слой протеза с диаметром 1,7 мм и толщиной 20 мкм длиной 85 мм. На сформированный внутренний слой протеза нанесли 150 мкл 2% водного раствора желатина, нагретого до температуры 37°С, и разровняли раствор вдоль заготовки протеза, одновременно вращая электрод-коллектор для равномерного распределения раствора по длине заготовки протеза. После пропитывания продолжили процесс электроспиннинга в том же режиме, для чего на сформированный внутренний слой протеза нанесли оставшийся объем раствора композиции (0,675 мл) и сформировали внешний слой протеза, составляющий 90% от заданной толщины стенки протеза сосудов.

По завершении электроспиннинга заготовку протеза сосудов сняли с электрода-коллектора, инкубировали в растворе, содержащем 0,05 M гидрокарбоната натрия (NaHCO₃), рН 9.0 в течение 5 минут, затем протез перенесли в свежеприготовленный раствор 4,0% глутарового альдегида в этом же буфере и инкубировали в течение 2 часов. По окончании инкубации в реакционную смесь внесли 1/10 объема 0,1 M раствора, содержащего глицин, оттитрованный соляной кислотой (глицин/HCl) до рН=9.0, инкубировали в течение 10-15 минут для блокировки оставшихся альдегидных групп, затем внесли 1/10 объема раствора боргидрида натрия (NaBH₄) в концентрации 4 мг/мл и инкубировали 20 минут. После инкубации заготовку протеза сосудов отмыли 5-ю сменами апирогенной дистиллированной воды (по 5 минут, 5-10 мл на один протез/одну смену), 1 раз апирогенной дистиллированной водой с 2% глицерином и высушили на воздухе в стерильном месте (ламинарном боксе).

В результате получили протез сосудов, представляющий собой трубку из ПКЛ с толщиной стенки 180 мкм (внутренний диаметр 1,7 мм) и длиной 85 мм, который может быть сегментирован на необходимую длину для конкретного применения при хирургических операциях. Исследование полученного протеза сосудов методом сканирующей электронной микроскопии (фиг. 1) показало, что в протезе сформирован внутренний уплотненный слой толщиной 15±3 микрона.

Пример 2

Первый вариант способа. 500 мг ПКЛ растворили в 9 мл ГФИП при комнатной температуре и перемешивании. Затем к 9 мл полученного 7% раствора ПКЛ добавили 1 мл 12,5% раствора желатина в ГФИП при перемешивании (массовое соотношение ПКЛ : желатин равно 7:3, концентрация ПКЛ в пересчете на сухой вес составила 5%). Стерильный шприц заполнили 0,75 мл раствора композиции, состоящей из ПКЛ и желатина в ГФИП, и запустили первый этап электроспиннинга (2% от объема раствора композиции) при следующем режиме: напряжение - 20 кВ, скорость подачи полимерной композиции - 1,5 мл/час, скорость вращения электрода-коллектора - 300 об/мин. Сформировали внутренний слой протеза с диаметром 1,7 мм и длиной 80 мм.

На сформированный внутренний слой протеза нанесли 50 мкл 5% водного раствора желатина и разровняли раствор вдоль заготовки протеза, одновременно вращая коллектор для равномерного распределения раствора по длине заготовки протеза. На втором этапе электроспиннинга, в том же режиме, на сформированный внутренний слой протеза нанесли оставшийся объем раствора композиции (0,735 мл) и сформировали внешний слой протеза сосуда, составляющий 98% от заданной толщины стенки протеза сосуда.

По завершении электроспиннинга заготовку протеза сняли с электрода-коллектора инкубировали в растворе, содержащем 0,05 M гидрокарбонат натрия (NaHCO₃), рН 9.0 в течение 5 минут, затем протез сосудов перенесли в свежеприготовленный раствор 0,5% глутарового альдегида в этом же буфере и инкубировали в течение 2 часов. По окончании инкубации в реакционную смесь внесли 1/10 объема 0,1 M раствора, содержащего глицин, оттитрованный соляной кислотой до (глицин/HCl), рН=9.0, смесь инкубировали в течение 10-15 минут для блокировки оставшихся альдегидных групп, затем внесли 1/10 объема раствора боргидрида натрия (NaBH₄) в концентрации 4 мг/мл и инкубировали еще 20 минут. После инкубации протез отмыли 5-ю сменами апирогенной дистиллированной воды (по 5 минут, 5-10 мл на один протез/одну смену), 1 раз апирогенной дистиллированной водой с 2% глицерином и высушили на воздухе в стерильном месте (ламинарном боксе).

В результате получили протез сосудов, представляющий собой трубочку из ПКЛ с толщиной стенки 150 мкм (внутренний диаметр 1,7 мм) и длиной 80 мм.

Пример 3

Процедуру изготовления протеза сосудов осуществляли аналогично примеру 1, за исключением того, что в качестве полимера использовали 15% раствор полибутилентерефталата (ПБТФ), а в качестве белка использовали 10% раствор водорастворимого эластина. Для электроспиннинга приготавливали композицию, содержащую смесь ПБТФ и эластина, взятых в массовом соотношении, равном 8:2 (концентрация ПБТФ в растворе в пересчете на сухой вес составила 10%). В результате получили протез сосудов, представляющий собой трубочку из ПБТФ с толщиной стенки 150 мкм (внутренний диаметр 1,7 мм) и длиной 80 мм.

Пример 4

Процедуру изготовления протеза сосудов осуществляли аналогично примеру 1, за исключением того, что в качестве полимера использовали 15% раствор полилактид-ко-гликолида, а в качестве белка использовали 20% раствор фибронектина. Для электроспиннинга готовили композицию, содержащую смесь полилактид-ко-гликолида и фибронектина, взятых в массовом соотношении, равном 7:3 (концентрация полилактид-ко-гликолида в растворе в пересчете на сухой вес составила 10%). В результате получили протез сосудов, представляющий собой трубочку из полилактид-ко-гликолида с толщиной стенки 180 мкм (внутренний диаметр 1,7 мм) и длиной 85 мм.

Пример 5

Процедуру изготовления протеза сосудов осуществляли аналогично примеру 1, за исключением того, что в качестве полимера использовали 15% раствор нейлона, а в качестве белка использовали 12,5% раствор желатина. Для электроспиннинга готовили композицию, содержащую смесь нейлона и желатина, взятых в массовом соотношении, равном 9:1 (концентрация нейлона в пересчете на сухой вес составила 7%). В результате получили протез сосудов, представляющий собой трубочку из нейлона с толщиной стенки 180 мкм (внутренний диаметр 1,7 мм) и длиной 85 мм.

Пример 6

Второй вариант способа. 500 мг ПКЛ растворили в 9 мл ГФИП при перемешивании и комнатной температуре и получили 7% раствор. Затем к 9 мл приготовленного 7% раствора ПКЛ добавили 1 мл 5% раствора желатина в ГФИП (массовое соотношение ПКЛ : желатин равно 9:1, концентрация ПКЛ в пересчете на сухой вес составила 5%) и тщательно перемешали полученный раствор. Стерильный шприц заполнили 0,75 мл готовой композиции, состоящей из ПКЛ и желатина в ГФИП, запустили первый этап процесса изготовления протеза (2 мин, 10% необходимого объема раствора композиции (0,075 мл), и сформировали внутренний слой протеза с диаметром 1,7 мм и длиной 85 мм.

Далее на сформированный внутренний слой протеза нанесли электроспиннингом 0,075 мл раствора композиции, содержащей ПКЛ : желатин в массовом соотношении, равном 1:1 (концентрация ПКЛ в пересчете на сухой вес составила 5%), и получили промежуточный слой протеза, составляющий 10,0% от заданной толщины стенки протеза сосуда. Затем продолжили процесс электроспиннинга: на сформированный промежуточный слой протеза нанесли оставшийся объем раствора композиции (0,6 мл) и сформировали внешний слой протеза сосуда, составляющий 80% от заданной толщины стенки протеза сосуда.

По завершении электроспиннинга заготовку протеза сосудов сняли с электрода-коллектора, инкубировали в растворе, содержащем 0,05 M гидрокарбоната натрия (NaHCO₃), рН 9.0 в течение 5 минут, затем протез сосуда перенесли в свежеприготовленный раствор 4,0% глутарового альдегида в этом же буфере и инкубировали в течение 2 часов. По окончании инкубации в реакционную смесь внесли 1/10 объема 0,1 M раствора, содержащего глицин в соляной кислоте (глицин/HCl) рН=9.0, инкубировали смесь в течение 10-15 минут для блокировки оставшихся альдегидных групп, затем внесли 1/10 объема раствора боргидрида натрия (NaBH₄) в концентрации 4 мг/мл и инкубировали еще 20 минут. После инкубации заготовку протеза сосудов отмыли 5-ю сменами апирогенной дистиллированной воды (по 5 минут, 5-10 мл на один протез/одну смену), 1 раз апирогенной дистиллированной водой с 2% глицерином и высушили на воздухе в стерильном месте (ламинарном боксе).

В результате получили протез сосудов, представляющий собой трубку из ПКЛ с толщиной стенки 180 мкм (внутренний диаметр 1,7 мм) и длиной 85 мм.

Пример 7

Второй вариант способа осуществили аналогично примеру 6, за исключением того, что для изготовления внутреннего слоя протеза сосудов использовали композицию, состоящую из смеси полилактид-ко-гликолида и желатин, взятых в массовом соотношении, равном 9:1 (концентрация полилактид-ко-гликолида в растворе в пересчете на сухой вес составила 10%); для изготовления промежуточного слоя протеза использовали композицию, состоящую из смеси ПКЛ и желатина, взятых в массовом соотношении, равном 3:7 (концентрация ПКЛ в пересчете на сухой вес составила 5%); а для изготовления внешнего слоя протеза сосудов использовали композицию, состоящую из смеси ПКЛ и желатина, взятых в массовом соотношении, равном 9:1 (концентрация ПКЛ в растворе в пересчете на сухой вес составила 5%). В результате получили протез сосудов, представляющий собой трубку с толщиной стенки 180 мкм (внутренний диаметр 1,7 мм) и длиной 85 мм.

Были исследованы физико-механические свойства протезов сосудов, полученных по примерам 1-7.

Для измерения «пористости» в процессе изменяющейся гидравлической нагрузки протезы вымачивали в дистиллированной воде в течение 20 минут и измеряли пористость в соответствии с ГОСТ Р 51556-2000. Пористость протезов сосудов без малопроницаемого слоя составляла не менее 10-30 мл, пористость протезов с малопроницаемым слоем из белка составляла 0,2÷0,5 мл.

Для тестирования стабильности малопроницаемого слоя в условиях изменяющейся гидравлической нагрузки протез сосуда устанавливали в гидравлический стенд, состоящий из резервуара для создания избыточного давления, системы установки и поддержания избыточного давления (120 мм рт.ст.), впускного и выпускного клапанов, контроллера, управляющего клапанами, и компьютерной программы, управляющей контроллером. Цикл нагрузки включал подачу давления (500 мс), удержание (100 мс), стравливание давления (200 мс) и временной разрыв (50 мс). Обнаружено, что 100000 циклов гидравлической нагрузки не приводят к изменению проницаемости протезов сосудов с малопроницаемым внутренним слоем, что демонстрирует высокую стабильность полученной структуры протеза сосудов.

Для исследования диффузии низко- и высокомолекулярных веществ через стенку протез сосуда длиной 2 см заполняли 0,265 мМ раствора флуоресцеина или 15 мкМ раствора флуоресцентно-меченого бычьего сывороточного альбумина в физрастворе, протез погружали физиологический раствор и измеряли скорость изменения концентрации флуоресцеина или флуоресцентно-меченого альбумина во внешней камере объемом 3 мл. Было показано, что коэффициент диффузии для флуоресцеина составляет 0,8×10^-11 см²/с, а для альбумина - 0,22×10^-14 см²/с. Таким образом, малопроницаемый слой, будучи непроницаем для клеток крови, легко проницаем для низкомолекулярных и для высокомолекулярных веществ и не затрудняет транспорт питательных веществ из крови в стенку протеза и окружающую ткань.

Для сравнения прочностных характеристик протезов сосудов, содержащих и не содержащих малопроницаемый внутренний слой, были проведены механические испытания образцов.

Механические свойства протезов сосудов, изучали, как описано в ГОСТ 51556-2000, с использованием универсальной разрывной машины для испытания материалов Zwick/Roell Z100 (Германия) при постоянной скорости приложения силы 10 мм/мин. Прочность протеза сосуда на прорыв ниткой измеряли, как описано в (Schaner P.J., et al, Journal of vascular surgery, 2004). Было показано, что формирование малопроницаемого внутреннего слоя не влияет на прочность протезов сосудов: прочность на разрыв составляет 2,2÷2,5 МПа, прочность на прорыв ниткой составляла в 160±20 грамм силы.

Биосовместимость исследовали в условия in vitro на протезах сосудов, полученных по примерам 1-7. Было установлено, что эндотелиальные клетки хорошо адгезируют и активно пролиферируют на поверхности материалов с малопроницаемым слоем. При инкубации первичных фибробластов с внешним слоем протезов сосудов не было обнаружено разницы в адгезии и пролиферации этих клеток на поверхности волокон.

В условиях in vivo были исследованы протезы сосудов, полученные по примерам 6 и 7.

В качестве контроля были использованы протезы сосудов, состоящие из ПКЛ (тип а). Тип б - протез сосудов, полученный по примеру 6; тип в - протез сосудов, полученный по примеру 7. Протезы сосудов (типы б и в) содержат малопроницаемый слой. Такие типы протезов сосудов были имплантированы в брюшную аорту крыс линии Wistar (по 15 животных на каждый тип протез сосудов).

За проходимостью протезов следили при помощи MP-томографии с использованием томографа «BioSpec 117/16USR» (Bruker, Germany) и двойного ультразвукового сканирования на установке (Vivid I, GE). При длительном наблюдении (от 2 до 19-20 недель) проходимость протезов сохранялась при отсутствии специальной послеоперационной антитромботической терапии (антикоагулянты и дезагреганты). Эти наблюдения подтверждают высокую тромборезистентность изготовленных сосудистых протезов.

Интраоперационно было показано, что протезы сосудов с малопроницаемым внутренним слоем (типы б и в) в процессе имплантации не пропитываются кровью. Микроскопическое исследование проводили при помощи обзорной микроскопии на бинокулярном микроскопе Stereo Discovery VI2 (ZEISS, Germany)

На фиг. 2 представлены фотографии световой микроскопии в отраженном свете (А, Б) и фотография флуоресцентной микроскопии (В) эксплантированных протезов сосудов, где: А - протез сосудов типа а, Б - протез сосудов типа б, В - флуоресцентная микроскопия протеза сосуда типа 6, где клетки окрашены SiberGreen I. На фиг. 2 видно, что клетки окружающих тканей быстро мигрируют в стенку протеза (Фиг. 2, В) и формируют соединительно-тканную капсулу.

При оценке степени формирования неоинтимы было обнаружено, что протезы сосудов с малопроницаемым слоем (типы б и в) образуют более тонкую неоинтиму, по сравнению с протезами сосудов типа а, как на 2-й, так и на 19-20 неделе после имплантации. Средняя толщина стенки протезов сосудов типа а на 20 неделе составила 374±99 микрометра против 261±56 микрометра для протезов сосудов типа в. Кроме того, в процессе функционирования протезы типа а увеличивались в диаметре в 1,2-1,3 раза, в то время как сосуды типов б и в сохраняли исходный диаметр.

При проведении иммуногистохимического анализа (окраска Isolectin) выявлено, что процесс васкуляризации на 2-й неделе после имплантации в протезах сосудов типа в наиболее выражен, по сравнению с протезами сосудов типа а, в котором на 4-й неделе видны небольшие признаки неоваскуляризации. Анализ срезов показал, что количество клеток (в большей степени гладкомышечных клеток, в меньшей эндотелиальных) на внутренней и внешней (гладкомышечных клеток) поверхностях протезов сосудов типа а увеличивается в зависимости от времени, которое протез провел в организме. Активная выработка фибронектина и коллагена в исследуемых протезах свидетельствует о жизнедеятельности клеток. Предварительные данные экспериментов in vivo демонстрируют высокую био- и гемосовместимость протезов сосудов с непроницаемым внутренним слоем.

Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет получать микроволокнистые протезы, которые имеют низкую пористость, улучшенные прочностные и эластические характеристики, а также отличаются высокой био- и гемосовместимостью для использования в медицинской практике. Процедура изготовления протезов отличается простотой, воспроизводимостью и технологичностью.

Группа изобретений относится к области медицины. Описан способ, который включает растворение исходного синтетического полимера и белка в гексафторизопропаноле, смешивание раствора полимера с раствором белка в соотношении полимер : белок, равном (7-9):(1-3), при этом согласно первому варианту на первом этапе электроспиннинга на электрод-коллектор наносят 1,0-10,0% от требуемого объема раствора полученной композиции, затем сформированный внутренний слой протеза пропитывают раствором белка в концентрации 1,0-5,0%, а на втором этапе на сформированный внутренний слой наносят оставшиеся 90-99% раствора композиции и формируют внешний слой протеза. По второму варианту способа на сформированный внутренний слой протеза, составляющий 0,1-90,0% от заданной толщины стенки протеза, наносят раствор композиции, содержащей смесь полимера и белка в соотношении полимер : белок, равном (1-3):(1-7), и формируют промежуточный слой, составляющий 1,0-10,0% от заданной толщины стенки протеза, на который затем наносят оставшийся объем раствора композиции и формируют внешний слой протеза, составляющий 9,0-98,9% от заданной толщины стенки протеза, при этом для формирования внутреннего и внешнего слоя протеза могут быть использованы разные полимеры. Технический результат: получение протезов сосудов малого диаметра с низкой пористостью, улучшение прочностных и эластических характеристик, а также повышение био- и гемосовместимости протезов сосудов. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 7 пр.

1. Способ изготовления протезов сосудов малого диаметра с низкой пористостью путем электроспиннинга, включающий растворение исходного синтетического полимера в растворителе, смешивание раствора полимера с раствором белка и проведение первого этапа электроспиннинга путем нанесения на электрод-коллектор полученной композиции и формированием внутреннего слоя протеза сосуда, затем проведение второго этапа электроспиннинга путем нанесения на электрод-коллектор оставшегося раствора композиции и формирование внешнего слоя протеза сосуда, отличающийся тем, что раствор полимера смешивают с раствором белка в соотношении полимер : белок, равном (7-9):(1-3), затем на первом этапе электроспиннинга на электрод-коллектор наносят 1,0-10,0% от требуемого объема раствора полученной композиции, далее сформированный внутренний слой протеза пропитывают 1,0-5,0% водным раствором белка из расчета 1-25 мкл/см² и осуществляют второй этап электроспиннинга путем нанесения на сформированный внутренний слой оставшегося 90-99% раствора композиции и формируют внешний слой протеза, далее полученный протез сосудов обрабатывают бифункциональным сшивающим реагентом с последующей дезактивацией реакционно-способных групп обработкой щелочным раствором глицина и высушиванием, при этом в качестве полимера используют полимер, выбранный из группы: поликапролактон, полибутилентерефталат, полилактид-ко-гликолид, нейлон, в качестве белка используют гелеобразующий белок, выбранный из группы: желатин, эластин, фибронектин, а в качестве растворителя для полимера и белка используют гексафторизопропанол.

2. Способ изготовления протезов сосудов малого диаметра с низкой пористостью путем электроспиннинга, включающий растворение исходного синтетического полимера в растворителе, смешивание раствора полимера с раствором белка и проведение первого этапа электроспиннинга путем нанесения на электрод-коллектор полученной композиции и формированием внутреннего слоя протеза сосуда, затем проведение второго этапа электроспиннинга и формирование малопроницаемого слоя в структуре протеза сосудов, проведение третьего этапа электроспиннинга путем нанесения на электрод-коллектор оставшегося раствора композиции и формирование внешнего слоя протеза сосуда, отличающийся тем, что раствор полимера смешивают с раствором белка в соотношении полимер : белок, равном (7-9):(1-3), затем на первом этапе электроспиннинга на электрод-коллектор наносят 0,1-90,0% от требуемого объема раствора полученной композиции, далее на сформированный внутренний слой протеза наносят раствор композиции, содержащей смесь полимера и белка в соотношении полимер : белок, равном (1-3):(1-7), и получают промежуточный слой, составляющий 1,0-10,0% от заданной толщины стенки протеза сосуда, на который затем наносят оставшийся объем раствора композиции и формируют внешний слой протеза, составляющий 9,0-98,9% от заданной толщины стенки протеза, далее полученный протез сосуда обрабатывают бифункциональным сшивающим реагентом с последующей дезактивацией реакционно-способных групп обработкой щелочным раствором глицина и высушиванием, при этом в качестве полимера используют полимер, выбранный из группы: поликапролактон, полибутилентерефталат, полилактид-ко-гликолид, нейлон, в качестве белка используют гелеобразующий белок, выбранный из группы: желатин, эластин, фибронектин, а в качестве растворителя для полимера и белка используют гексафторизопропанол.

3. Способ по пп. 1, 2, отличающийся тем, что полученный протез сосудов обрабатывают 0,5-4,0% раствором глутарового альдегида в буферном растворе, содержащем 0,05 М NaHCO₃, pH 9.0.

4. Способ по пп. 1, 2, отличающийся тем, что дезактивацию реакционно-способных групп осуществляют путем инкубации протеза сначала в ОДМ буферном растворе, содержащем глицин/HCl, pH=9.0, а затем в растворе боргидрида натрия (NaBH₄) с концентрацией 4 мг/мл.