СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ГЕНОВ-МИШЕНЕЙ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ И ТЕРАПИИ ЛЕЙКОЗОВ ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2016 года по МПК C12N15/113 C12Q1/68 

Изобретение относится к области молекулярной биологии и может быть использовано для выявления генов-мишеней для диагностики и терапии лейкозов человека.

Лейкозы занимают особое место среди злокачественных заболеваний человека и животных и характеризуются повышенным содержанием бластных клеток, которые, с одной стороны, не выполняют нормальные функции зрелых клеток крови, а с другой, за счет активной пролиферации, вытесняют нормальные ростки кроветворения.

Значительную часть лейкозов человека составляют острые миелоидные лейкозы (ОМЛ). Их возникновение связано с нарушением развития клеток-предшественников миелоидных, эритроидных, мегакариоцитарных и моноцитарных клеточных линий. Полагают, что лейкозы имеют клональную природу, т.е. злокачественные бластные клетки являются потомками одной единственной трансформированной клетки, возникающей в результате нескольких, а возможно, даже одной мутации. Считается, что процесс злокачественного перерождения является многостадийным - активация онкогенов в результате мутаций приводит к дальнейшей активации целого каскада генов и, как следствие, к дезорганизации строго слаженных механизмов, отвечающих за развитие кроветворных клеток и нормальное кроветворение. До сих пор не известно, в какой мере и какие именно гены активируются вследствие возникновения уже известных "ключевых" мутаций. Всё это существенно осложняет диагностику лейкозов и выбор эффективных схем лечения.

В настоящее время основными средствами терапии лейкозов являются химиотерапия, лучевая терапия и трансплантация костного мозга. Однако первые два способа сами по себе является довольно болезненными, далеко не всегда эффективными и нередко приводят к рецидивам заболевания, проявляющимся, как правило, в ещё более острой форме, а последний является крайне дорогим и сложным, что, прежде всего, связано с поиском донора костного мозга. Кроме всего трансплантация костного мозга также несёт целый ряд опасностей для здоровья пациента, к основным из которых относят случаи отторжения трансплантата. Именно поэтому поиск новых эффективных мишеней и подходов для диагностики и лечения лейкозов является крайне актуальным направлением исследований учёных всего мира.

Однако возможности поиска новых эффективных мишеней ограничены несовершенством существующих методов и их высокой стоимостью.

Проблема ещё больше обостряется тем, что до сих пор неизвестно какие ещё гены, ответственные за рост и дифференцировку кроветворных клеток, и в какой степени вовлечены в процесс злокачественного перерождения.

Для большинства видов опухолей установлены лишь некоторые из онкогенов, участвующих в канцерогенезе. Это затрудняет разработку и выбор терапевтических подходов, и в частности, терапевтических целей -генов-мишеней и их белковых продуктов.

В патенте RU 2161309 (международная публикация WO 95/25813) описан ген MTS, соматические мутации этого гена в зародышевой линии и способ выявления предрасположенности к злокачественным опухолям. Также описано применение выявленных мутаций для диагностики предрасположенности к -различным формам злокачественных заболеваний, в частности, лейкозам, и лечению заболеваний, при которых произошла мутация в гене MTS, включая генотерапию, заменяющую белковую терапию и использование белковых миметиков.

В патенте RU 2240125 в качестве гена-мишени для лечения Ph⁺ лейкозов описан онкоген BCR/ABL, и олигонуклеотидная генотерапия Ph⁺ лейкозов путем обработки суспендизооных культур Ph⁺ клеток антисмысловыми олигонуклеотидами, длиною 16-26 нуклеотидных звеньев, специфичными к мРНК онкогена BCR/ABL в сочетании с антисмысловыми олигонуклеотидами к мРНК других генов, блокирующих апоптоз Ph⁺ клеток, отличных от онкогена BCR/ABL.

В патенте RU 2286798 описан способ идентификации хромосомных транслокаций, приводящих к развитию злокачественных заболеваний крови с использованием олигонуклеотидного биологического микрочипа путем гибридизации с олигонуклеотидным микрочипом химерного амплифицированного флуоресцентно меченного продукта, состоящего из последовательностей генов, участвующих в определенной хромосомной транслокации, ассоциированной с лейкозом.

В евразийском патенте ЕА 003637 (международная публикация WO 00/05406) описаны новые способы идентификации биомолекул лигандов и мишеней путем включения случайных нуклеотидных последовательностей в

каркас, состоящий из модулятора активности фермента, трансформации существенно идентичных клеток, полученной таким образом конструкцией и скрининга трансформированных клеток для идентификации клеток, в которых был изменен предварительно выбранный фенотипический признак.

В евразийском патенте ЕА 006512 описаны способы определения генов, детерминирующих синтез диагностически важных белков, определения точечных мутаций, делеций, вставок, инверсий и транслокаций в нуклеиновых кислотах, определения уровня экспрессии генов; определения гомо- и гетерозиготного состояний мутаций основанные на применении методов гибридизации, ПЦР и ее модификаций на микрочипе.

В международной публикации WO 2004/067778 описано выявление дифференциально экспрессирумых генов при лимфогранулематозе, последовательностей этих генов и их применение в качестве маркеров для лимфогранулематоза. Генные последовательности, представленные в изобретении, дифференциально экспрессируются при лимфогранулематозе.

В международной публикации WO 2005/080601 описаны способы генетического анализа для классификации, диагностики и прогнозирования острого миелолейкоза.

В международной публикации WO 2010/111712 описан способ идентификации РНКи мишеней и применение РНКи для рациональной терапии лейкозов, резистентных к химиотерапии. Также представлена мышиная модель, используемая для определения эффективности shPHK in vivo для снижения выживаемости злокачественных клеток, резистентных к химиотерапии.

В международной публикации WO 2009/055907 описана активность не рецепторной тирозинкиназы онкобелков слитого гена Bcr/Abl, которая представляет собой ключевые факторы, ответственные за развитие и прогрессирование Ph+ хронического миелолейкоза и Ph+ острого лимфобластного лейкоза. Также описан пептидный ингибитор Bcr/Abl тирозинкиназы, который индуцирует апоптоз в различных трансформированных клетках и ингибирует Bcr/Abl киназу и, опосредованно, ряд нижележащих мишеней (CrkL, STATS, с-Мус).

В международной публикации WO 02/42482 описаны функциональные лентивирусные векторы на основе химерного гена вируса лейкоза мышей и

вируса иммунодефицита кошачьих, которые используются для генной терапии.

В международной публикации WO 2007/050706 описано применение дифференциального метилирования и гибридизации для идентификации новых маркеров метилирования и профилей метилирования для гематопоэтических злокачественных опухолей, лейкозов, лимфом и т.д., а также маркеров для диагностики, прогноза и мониторинга лечения.

Применение маркеров метилирования генома для идентификации новых генов-мишеней для диагностики и лечения острого миелолейкоза также описано в международной публикации WO 2007/016668.

Гены-мишени и продукты их экспрессии, идентифицированные на основании профиля их экспрессии до и после лечения острого лимфобластного лейкоза, описаны в международной заявке WO 03/087315, изучение профиля экспрессии генов для диагностики и подбора лечения больных лейкозом, описаны в WO 03/083140, способы генотипирования клеток при остром лейкозе ct(llq23)/MLL, и изучение профиля экспрессии генов, а также наборы и системы для их осуществления описаны в WO 2006/048266, при остром промиелоцитарном лейкозе - в WO 2006/048263.

Идентификация новой генной транслокации (3р21, 5q33) при миелолейкозе у людей описана в международной публикации WO 2007/075933, идентификация гена сdс2-зависимой киназы, ассоциированной с лейкозом у людей, описана в WO 00/12719; идентификация лейкоцит-специфичного гена Sp 140 и связанного с ним белка, и его применение в генной терапии для лечения злокачественных заболеваний, а также его применение в качестве диагностического и прогностического маркера, описано в WO 98/14569; идентификация гена MCL-1, ассоциированного с миелоидным лейкозом, а также способы диагностики и лечения с использованием нуклеотидных и полипептидных последовательностей mcl-1, описаны в WO 94/29330; ферментативная молекула РНК, которая специфически расщепляет мРНК, кодируемую геном mdr-1, описана в WO 93/23057; идентификация гена MTS и мутаций этого гена, а также применение в диагностике и прогнозировании, в частности, лейкозов, описано в WO 95/25429.

Перспективным современным подходом исследования функциональной активности генов, в том числе и активированных онкогенов, является РНК-интерференция, основанная на подавлении экспрессии генов

на посттранскрипционном уровне с помощью коротких дуплексов siPHK (small interfering RNA, малые интерферирующие РНК) длиной 21-23 нуклеотидов с выступающими 2-3 нуклеотидами на 3'-концах. Эффективным методом введения интерферирующих РНК в клетки является использование рекомбинантных ретро- и лентивирусных векторов, направляющих в трансдуцированных клетках синтез шпилечных РНК (shPHK) предшественников малых интерферирующих РНК. siPHK образуются из shPHK под действием клеточного белка Дайсера (Dicer), обладающего рибонуклеазной активностью. Шпилечные конструкции могут быть успешно применены для подавления экспрессии генов, принимающих участие в развитии вирусных инфекций, и некоторых активированных онкогенов. Представляется возможным применить этот подход для подавления экспрессии онкогенов, выявляемых при острых миелоидных лейкозах, которые с большой вероятностью могут являться ключевыми факторами развития ОМЛ.

Такие подходы и конструкции малых шпилечных РНК описаны, например, в публикациях китайских патентных заявок CN 102747083, CN 103320444 и в китайском патенте CN 20130925, и в непатентной литературе, например, у BantounasL, Phylactoul L.A., Uney J.B. 2004. RNA interference and the use of small interfering RNA to study gene function in mammalian systems J. Mol. Endocrinol. 33, 545-557, Agrawal N., Dasaradhi P.V., Mohmmed Α., Malhotra P., Bhatnagar R.K., Mukherjee S.K. 2003. RNA interference: biology, mechanism, and applications. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67, 657-685, в статье Вильгельма А.Э., Чумакова СП., Прасолова B.C. 2006 Интерференция РНК: биология и перспективы применения в биомедицине и биотехнологии. Мол биол. 40(3), 387-403.

Однако, несмотря на активное выявление новых генов-мишеней для диагностики и терапии лейкозов человека и создание конструкций малых шпилечных РНК для РНК-интерференции, проблема поиска новых эффективных мишеней для терапевтического воздействия и разработки новых способов диагностики и лечения лейкозов по-прежнему остается актуальной.

Предлагаемый способ основан на подавлении активности активированного онкогена AML-ETO методом РНК-интерференции в злокачественных кроветворных клетках, полученных от больных лейкозом с использованием конструкции малой шпилечной РНК, для встраивания в лентивирусный вектор, по сайтам рестрикции BamHI и EcoRI или Hpal и

Xhol, кодируемой нуклеотидной последовательностью двухцепочечной ДНК, представляющей собой:

для встраивания по сайтам рестрикции BamHI и EcoRI

shAEl SLP -смысловая

5'-р-

gatccgCCTCGAAATCGTACTGAGActtcctgcaaTCTCAGTACGATTTCGAGGttt ttg-3'

shAE 1 SLP-антисмысловая 5'-p-

aattcaaaaaCCTCGAAATCGTACTGAGAttgcaggaagTCTCAGTACGATTTCGA GGcg-3'

или для встраивания по сайтам рестрикции Hpal и Xhol

shAE 1 GO-смысловая

5'-р-

aacgCCTCGAAATCGTACTGAGActtcctgcaaTCTCAGTACGATTTCGAGGttttt с-3'

shAE 1 GO-антисмысловая 5'-р-

tcgagaaaaaCCTCGAAATCGTACTGAGAttgcaggaagTCTCAGTACGATTTCGA GGcgtt-3'

Этот способ позволяет путём ингибирования активности конкретного онкогена, определить спектр изменения экспрессии генов, ответственных за рост и дифференцировку кроветворных клеток, и обнаружить те из них, изменение активности которых напрямую связано с активацией данного онкогена. Кроме того, данный способ позволяет определить, в какой мере воздействие на такие гены-потенциальные мишени для диагностики и терапии лейкозов оказывает влияние на способность злокачественных клеток к неконтролируемому росту.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Структура препаратов экспрессирующих векторов, необходимых для конструирования препаратов лентивирусных частиц, направляющих синтез shPHK и подавление активированного онкогена AMLI-ETOB злокачественных кроветворных клетках.

Интеграцию последовательности, кодирующей shPHK, в геном клетки-хозяина, могут обеспечить лентивирусные векторы, долговременно подавляя экспрессию гена-мишени. Выбор лентивирусных векторов обусловлен также способностью рекомбинантных лентивирусов заражать широкий спектр клеток, в том числе клетки крови. Это может позволить использовать такие векторы для изучения влияния подавления экспрессии онкогенов на восстановление нормальной дифференцировки клеток крови, а также для исследования генов, экспрессия которых будет изменяться при подавлении активности активированных онкогенов AML1-ETO, которые могут быть перспективными терапевтическими и диагностическими мишенями в случае ОМЛ.

Такие векторы были созданы на базе вектора pLSLP, предназначенного для переноса и экспрессии малых шпилечных РНК в клетках млекопитающих. Вектор позволяет осуществлять встраивание последовательности, кодирующей шпилечную РНК по сайтам рестрикции BamHI и EcoRI. В данном случае экспрессия лентивирусной шпилечной конструкции находится под контролем промотора полимеразы III HI. Помимо этого в составе вектора имеется последовательность, гена устойчивости к пуромицину, наличие которого позволяет осуществлять селекцию клеток, трансдуцированных с помощью данной лентивирусной конструкции. Авторами изобретения был осуществлён дизайн последовательностей, кодирующих shPHK шпилечные структуры -предшественники siPHK:

AML1 -ЕТО-смысловая

5'-р-

gatccgCCTCGAAATCGTACTGAGActtcctgcaaTCTCAGTACGATTTCGAGGttt ttg-3'

AML 1 -ЕТО-антисмысловая

5'-р-

aattcaaaaaCCTCGAAATCGTACTGAGAttgcaggaagTCTCAGTACGATTTCGA GGcg-3'

Эти последовательности могут быть клонированы в лентивирусный вектор. Основой для таких генетических конструкций будет служить лентивирусный вектор pLSLP (Фигура 1).

Основные характеристики вектора pLSLP:

Вектор является самоинактивирующимся (SIN) за счет делеции в U3 области 3'концевого LTR.

Вектор содержит ген резистентности к пуромицину.

Вектор содержит генетические элементы сРРТ и WPRE.

Клонирование проводили с помощью стандартных методов генной инженерии. На Фигуре 2 представлена карта рестрикции сконструированного лентивирусного вектора pLSLP-AML-ETO-shRNA, несущего шпилечную структуру, специфичную в отношении места слияния AML1-ETO. Аналогичным образом может быть сконструирован лентивирусный вектор pLSLP-SCR-shRNA, несущий последовательность, кодирующую shRNA-SCR, не имеющую гомологии с мРНК человека и мыши, используемый в качестве отрицательного контроля.

SCR - смысловая

5'-р-

gatccgCAAGTCTCGTATGTAGTGGcttcctgtcaCCACTACATACGAGACTTGtttt tg-3'

SCR- антисмысловая 5'-р-

aattcaaaaaCAAGTCTCGTATGTAGTGGtgacaggaagCCACTACATACGAGACT TGcg-3'

sh-PHK - экспрессионная кассета в U3 области 3'dLTR. (Экспрессионная кассета находится под контролем РНК-полимеразы Ill-зависимого промотора HI.). shPHK, экспрессирующая последовательность ДНК, клонируется в вектор по сайтам рестрикции BamHI и EcoRI.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1

Анализ подавления экспрессии онкогенов, в перевиваемых кроветворных клетках, трансдуцированных лентивирусным вектором, направляющим синтез shPHK, который опосредует подавление одного из активированных онкогенов

Для анализа подавления экспрессии онкогенов, в перевиваемых кроветворных клетках, трансдуцированных лентивирусным вектором, направляющим синтез shPHK, который опосредует подавление активированных онкогенов AML1-ETO, гиперэкспрессия которого является одним из важнейших факторов, способствующих развитию лейкоза, используют метод ОТ-ПЦР (полимеразная ценная реакция, сопряжённая с обратной транскрипцией), модифицированный метод "гнёздной" ОТ-ПЦР и метод ПЦР в реальном времени (Real-timePCR).

Для этого сначала производят разморозку лабораторных образцов злокачественных перевиваемых клеток человека, полученных от больного лейкозом. Для этого ампулы с образцами клеток, извлекают из сосуда с жидким азотом и помещают в термостат 37°С на 3 минуты, после этого суспензию клеток переносят в полипропиленовые пробирки, содержащие 6 мл среды RPMI и 20% FCS, суспендируют и центрифугируют 6 мин со скоростью 800 об/мин. После этого супернатант отбирают, а осадок ресуспендируют в 2 мл среды RPMI 1640, содержащей 20% эмбриональной сыворотки, 4 мМ L-глутамина, стрептомицин/пенициллин в концентрации 100 мкг/мл и 100 ед/мл, соответственно, рН 6,8-7,0, культивирование осуществляют при температуре 37°С в атмосфере 5% СО₂. Культивирование клеток осуществляют в 6-ти луночных планшетах. Через три дня после размораживания к клетки в лунке ресуспендируют, после чего, добавляют 3 мл свежей среды RPMI 1640, после чего опять ресуспендируют и переносят в чашку Петри с площадью поверхности 6 см². Ещё через 3-4 дня 5 мл суспензии клеток переносят в 10 см²чашку Петри и добавляют 7 мл свежей среды RPMI 1640. Через 4-5 дней осуществляют подсчёт количества клеток. Для расчёта количества клеток используют камеру Нойбауэра. Для этого 10 мкл клеточной суспензии вносят под покровное стекло камеры. Считают количество клеток в четырёх больших квадратах, после чего концентрацию клеток в суспензии определяют по формуле: C=N* 10000/4, где С-количество клеток в 1 мл суспензии, а N - количество клеток в четырёх квадратах.

Таким образом, осуществляют наращивание и подготовку к анализу перевиваемых клеток человека, в которых осуществляется синтез shPHK конструкций (shPHK AML1-ETO, shPHK AML5'), направляющих подавление экспрессии онкогена AML1-ETO, и один образец клеток, в которых происходит синтез неспецифической конструкции shSCR, не приводящей к подавлению какого-либо из генов.

Выделение тотальной РНК из культур клеток, в которых осуществляется синтез shPHK - предшественников siPHK, специфичных в отношении онкогена AML1-ЕТО, и в которых происходит синтез неспецифической конструкции shSCR, осуществляют с помощью тризола. Для этого около 5 млн клеток суспензионной культуры клеток суспендируют и переносят в пробирки. Пробирки с клетками центрифугируют 6 минут при 1000g. Затем удаляют супернатант и добавляют 1 мл lxPBS, суспендируют и снова центрифугируют при прежних условиях, после чего снова удаляют супернатант.

Для выделения используют следующие реактивы:

-Тризол (Invitrogen)

-Хлороформ (Applied Biosystems)

-Изопропиловый спирт

-75% этанол (в ДЭПК воде)

-3Мацетат Na (рН= 5,5) (Applied Biosystems)

-mQ вода

Выделение тотальной РНК осуществляют в следующей последовательности:

Рабочее место обрабатывают ингибиторами РНКаз. К клеткам добавляют тризол (необходимое количество рассчитывают, исходя из соотношения 1 мл тризола на 5-10 млн. клеток). Клетки инкубируют в тризоле в течение 5 минут при комнатной температуре. Лизат переносят в новые пробирки и добавляют хлороформ из расчета 0,2 мл на 1 мл тризола, плотно закрывают пробирку и встряхивают рукой 15 секунд, после чего инкубируют смесь 2-3 минуты при комнатной температуре. Далее пробы центрифугируют 15 минут при 12000g в центрифуге с охлаждением (4°С). В результате центрифугирования смесь разделяется на нижнюю хлороформ фенольную фазу красного цвета, интерфазу белого цвета и бесцветную водную фазу. РНК находится в верхней водной фазе. Водную фазу переносят в чистую пробирку. Добавляют изопропиловый спирт из расчета 0,5 мл на 1 мл тризола и инкубируют 10 минут при комнатной температуре. Затем пробы центрифугируют 10 минут при 12000g в центрифуге с охлаждением (4°С). На дне пробирки виден светлый гелеподобный осадок. Промывают осадок 1 мл 75% ледяного этанола, разбивая осадок на вортексе. После отмывки пробы центрифугируют 10 минут при 12000g в центрифуге с охлаждением (4°С). Промывку проводят дважды. После этого спирт удаляют и высушивают осадок на воздухе. Осадок растворяют в 50 мкл mQ (из расчета 1 мкг/мкл).

Количество и чистоту выделенной РНК определяют с помощью спектрофотометра NanoDrop, определяя поглощение при 230, 260, 280 нм. Количество РНК оценивают по значению А260, т.к. 1 А260=40 мкг РНК/мл. Чистоту образца оценивают по отношению А260/А280 (должно быть в пределах 1,8 - 2,0), степень загрязнения низкомолекулярными органическими соединениями - по А260/А230 (в пределах 1,5 - 2,0). Качество выделенной РНК определяют с помощью электрофореза в 1% агарозном геле. Оценивают присутствие двух полос, соответствующих 28S и 18S рибосомальных РНК, а также отсутствие неспецифических полос и ярко-выраженного "шмера".

Далее к раствору РНК добавляют натрия ацетат и этиловый спирт (1/10 и 2,5 объема раствора РНК соответственно). Смесь перемешивают на вортексе, и затем инкубируют в течение 30 минут при 20 °С. Далее смесь центрифугируют в течение 15 мин при 10°С, 12000 g. Супернатант удаляют, к осадку добавляют 1 мл охлажденного 75% этилового спирта. Полученную смесь перемешивают на вортексе, и затем центрифугируют в течение 15 мин при 10°С, 12000 g. Супернатант удаляют, осадок высушивают на воздухе в течение 10-15 минут. К сухому осадку добавляют mQ воду. Объем воды рассчитывают, исходя из исходного количества РНК (мкг) и желаемой итоговой концентрации. В дальнейшей работе используют растворы РНК с концентрацией 1 мкг/мкл.

ОТ-ПЦР - обратная транскрипция, сопряженная с полимеразной цепной реакцией.

Для синтеза кДНК использовали тотальную РНК клеток (полученную, как описано выше). Выделенную РНК переосаждают и растворяют в воде до концентрации 1 мкг/мл. Смешивают 1 мкл растворенной РНК, 1 мкл поли-Т праймеров (5 пкмоль/мкл), 4 мкл обработанной ДЭПК воды и инкубируют

смесь на водяной бане при 70°С в течение 5 минут. Далее, охлаждают смесь на льду в течение 10 минут. После однократного центрифугирования для осаждения капель конденсата в каждую пробу добавляют 4 мкл пятикратного буфера для обратной транскриптазы (Promega), 2 мкл смеси dNTP (10 мМ, Promega), 1 мкл Rnasine (Promega), 1 мкл обратной транскриптазы MLV (Promega) и 6 мкл воды, обработанной ДЭПК. Перемешивают на вортексе и инкубируют на водяной бане при 42°С в течение 1 часа. Далее пробы охлаждают, доводят водой mQ, до конечного объема 50 мкл. Пробы кДНК хранят при -20°С.

Анализ полученной кДНК методом модифицированной "гнездной" ОТ-ПЦР используют для идентификации в полученной из клеток Kasumi-1 тотальной кДНК онкогена AML-ETO, используя модифицированный метод гнездной ПЦР с двумя парами праймеров, специфичными к данному гену ("внешние" - для 1-й стадии, и "внутренние" - для 2-й стадии). Обе стадии гнездной ПЦР.

Амплификацию проводили в следующих условиях, 1 цикл: денатурация 94°С - 30 секунд, отжиг - 30 секунд, синтез - 72°С, 1 минута. Температуру отжига определяли для каждой пары праймеров.

Для определения уровня экспрессии мРНК гена AMLl-ЕТО на первой и второй стадиях соответственно оптимальное число циклов составляет 13 и 15 циклов.

Характеристики праймеров, использованных для анализа уровня: экспрессии интересующих генов, приведены в Таблице 1:

Было показано, что в клетках линии Kasumi-1, трансдуцированных лентивирусными векторами, направляющими синтез shPHK -предшественников siPHK, специфических в отношении активированного онкогена AML1-ETO осуществляется подавление экспрессии указанного онкогена, являющегося ключевым в злокачественном перерождении кроветворной ткани и ответственным за дифференцировку и в определённой степени рост клеток миелоидного ряда. На Фигуре 3 приведена электрофореграмма, иллюстрирующая значительное снижение количества мРНК AML1-ETO в клетках линии Kasumi-1, по сравнению с контрольными клетками, трансдуцированными лентивирусными векторами, направляющими синтез неспецифической в отношении какого либо из генов человека shPHK SCR.

На гистограмме (Фигура 4) представлены средние значения, полученные из трёх независимых экспериментов.

Синтез шпилечных конструкций shPHK-AMLl-ETO или shPHK-AML5' приводит к снижению уровня экспрессии AML1-ETO в 3 и 5 раз соответственно по сравнению с контролем. В качестве контроля были использованы клетки Kasumi-1, трансдуцированные лентивирусным вектором, направляющем синтез shPHK SCR, не имеющей гомологии с мРНК человека и мыши.

ПРИМЕР 2

Анализ экспрессии генов-мишеней, активность которых контролируется активированными онкогенами

Функциональный эффект, оказываемый подавлением экспрессии активированного онкогена AML1-ETO. В качестве оценочного критерия выбрана скорость роста клеток линии Kasumi-1. Было проведено сравнение скорости роста клеток, трансдуцированных лентивирусным вектором, направляющим специфические шпилечные конструкции, специфические в отношении исследуемого онкогена по сравнению с контрольным образцом клеток, трансдуцированных лентивирусным вектором, направляющем синтез неспецифической shPHK SCR.

Исходные клетки линии Kasumi-1, трансдуцированные shPHK SCR, shPHK AML5' или shPHK-AMLl-ETO, высевают в 96 луночные планшеты в концентрациях 4000, 2000, 1000, .500, 250 и 125 клеток на лунку в 100 мкл среды. Эксперимент осуществляют в трёх повторах. Клетки выращивают на

стандартной среде RPMI 1640, содержащей 20% эмбриональной сыворотки, 4 мМ L-глутамина, стрептомицин/пенициллин в концентрации 100 мкг/мл и 100 ед/мл, соответственно, рН 6,8-7,0 при температуре 37°С в атмосфере 5% СО₂. В течение 12 дней после посадки, каждые 2 дня, клетки в лунках ресуспендируют и отбирают по 5 мкл для подсчёта количества клеток в каждой лунке. На протяжении 12 дней контролируют количество среды в каждой лунке на уровне 100 мкл.

На Фигуре 5 приведена диаграмма, иллюстрирующая изменение количества клеток в лунках 96 луночного планшета в течение 10 дней при начальной плотности посадки 4000 клеток на лунку. Представленные результаты получены из трёх независимых экспериментов (р<0,05).

Видно, что скорость пролиферации клеток Kasumi-1, в которых экспрессия эндогенного AML1-ETO подавлена с помощью shPHK-AMLl-ЕТО, значительно ниже, по сравнению с исходными клетками Kasumi-1 или с клетками, в которых происходит синтез shPHK-SCR, не специфичной в отношении какой либо из мРНК человека или мыши.

На Фигуре 6 представлена гистограмма, иллюстрирующая изменение количества клеток в лунках на десятый день после посадки в зависимости от плотности посадки. Представленные результаты получены из трёх независимых экспериментов (р<0,05).

Видно, что при посадке по 4000 на лунку клеток Kasumi-1, в которых экспрессия AML1-ETO подавлена, их количество в 1,7 раз ниже, чем клеток, в которых уровень экспрессии онкогена не был изменён. При плотности посадки 2000 шт на лунку и 1000 шт на лунку эти соотношения составили 4,5 и 14 раз. Показано, что при плотности посадки клеток Kasumi-1 с подавленной экспрессией AML1-ETO ниже 1000 шт на лунку, их рост совсем не происходит, в то время как клетки с неизменённым уровнем экспрессии онкогена способны расти при относительно редкой плотности посадки в 500 шт. на лунку и даже 250 шт на лунку.

Приведённые результаты свидетельствуют о том, что подавление экспрессии онкогена AML1-ETO в клетках Kasumi-1 приводит к значительному снижению их скорости пролиферации, а также значительно снижает их способность давать клоны и расти при низких плотностях посадки относительно исходных клеток Kasumi-1 с неизменённым уровнем экспрессии онкогена AML1-ETO.

Для поиска генов-мишеней, находящихся под контролем активированного онкогена AML1-ETO, которые могут быть потенциальными генами-мишенями при разработке новых подходов для диагностики и терапии ОМЛ, был использован метод глубокого секвенирования на базе платформы Illumina. Для этого осуществляют выделение мРНК из клеток, трансдуцированных лентивирусными векторами, направляющими синтез shPHK, и синтез цепи кДНК, как описано выше. Анализ полученных образцов кДНК осуществляют с помощью метода глубокого секвенирования на базе платформы Illumina. Для каждого гена был выбран один наиболее представленный транскрипт. Для сортировки генов по уровню дифференциальной экспрессии использовали стандартное отклонение нормализованной экспрессии. Нормализация была осуществлена так, чтобы сумма попаданий для каждого образца была равна этой сумме в контрольном образце (кДНК из клеток, трансдуцированных лентивирусным вектором, направляющим синтез shPHK SCR). Гены были отсортированы по уровню дифференциальной экспрессии.

На Фигуре 7 (А,Б,В) приведены примеры гистограмм попарных сравнений некоторых из наиболее дифференциально экспрессируемых генов, экспрессия которых изменяется в результате подавления активированного онкогена AML1 -ЕТО.

В Таблице 2 представлен перечень всех генов, экспрессия которых меняется при подавлении активированного онкогена AML1-ETO в клетках линии Kasumi-1. В таблице представлено 5 столбцов, первый из которых содержит идентификационный номер гена, во втором столбце приведено краткое наименование гена, в третьем столбце приведено количество "ридов" для данного гена в клетках, трансдуцированных лентивирусным вектором, направляющем синтез shPHK SCR, в четвёртом столбце количество "ридов" для данного гена в клетках, трансдуцированных лентивирусным вектором, направляющем синтез shPHK AML1-ETO, в пятом столбце приведено отношение числа "ридов" из третьего столбца на число "ридов" из четвёртого столбца для данного гена. Это соотношение иллюстрирует снижение уровня экспрессии обнаруженного гена относительно контроля (клеток, трансдуцированных лентивирусным вектором, направляющем синтез shPHK SCR) при подавлении активированного онкогена AML1-ETO.

Таблица 2 ID ген shSCR shAE shSCR/shAE NM 144708 ANKAR 28 1 28,0 NM 182689 EFNA4 28 1 28,0 NM 153631 HOXA3 27 1 27,0 NM 004981 KCNJ4 21 1 21,0 NM 000606 C8G 19 1 19,0 NM 001171136 1 ZBTB12 18 1 18,0 NM 004943 DMWD 33   16,5 NR 039856 MIR4707 16 1 16,0 NM 003890 FCGBP 15 1 15,0 NM 025211 GKAP1 15 1 15,0 NM 021135 RPS6KA2 15 1 15,0 NM 005775 SP6 15 1 15,0 NM 001166339 SPDYE5 13 1 13,0 NM 001023561 ZNF774 13 1 13,0 NM 001101426 ISPD 25   12,5 NM 001003674 C18orf1 12 1 12,0 NM 016210 C3orf18 12 1 12,0 NM 033510 DISP2 24   12,0 NR 026771 DKFZP434L187 12 1 12,0 NM 001167857 PPP1R12B 12 1 12,0 NM 130795 RGS3 24 2 12,0 NM 001636 SLC26A1 24 2 12,0 NM 017575 SMPD3 12 1 12,0 NM 033394 TAP1 24 2 12,0 NM 006297 YAF2 36 3 12,0 NM 001122962 SIRPB2 22 2 11,0 NM 198216 SNTA1 43 4 10,8 NM 001975 EN02 10 1 10,0 NR 027051 FLJ39582 10 1 10,0 NR 004390 SNORD110 10 1 10,0 NR 000021 SNORD5 10 1 10,0 NM 032786 ZDHHC1 10 1 10,0 NM 001010880 ZNF782 31 3 10,3 NM 001195605 ZNRD1 10 1 10,0 NM 005683 GPR55 30 3 10,0 NM 021184 4 C6orf47 19 2 9,5 NM 001142966 GREB1L 19 2 9,5 NM 198850 PHLDB3 19 2 9,5 NR 037918 PRH1-PRR4 19 2 9,5 NM 001161440 PTPRH 19 2 9,5 NM 017836 SLC44A2 19 2 9,5 NM 138448 ACYP2 28 3 9,3 NM 152240 ZMAT5 46 5 9,2 NM 033031 CCNB3 63 7 9,0 NR 024009 CN5H6.4 9 1 9,0 NM 000106 CYP2D6 18 2 9,0 NM 207305 FOXD4 18 2 9,0 NM 001004056 GRK4 9 1 9,0 NM 172193 KLHDC1 9 1 9,0 NM 203397 MBLAC1 9 1 9,0 NR 039901 MIR4746 9 1 9,0

NR 030368 MIR638 9 1 9,0 NM 024302 MMP28 9 1 9,0 NM 001204295 MUC1 9 1 9,0 NM 020904 PLEKHA4 9 1 9,0 NM 020780 PTCHD2 18 2 9,0 NM 000355 TCTEX1D4 9 1 9,0 NM 003969 UBE2Q2P2 9 1 9,0 NM 001001974 PLEKHA1 34 4 8,5 NR 037428 MIR3655 25 3 8,3 NM 001033082 MYCL1 25 3 8,3 NM 014686 KIAA0355 42 5 8,4 NM 022842 CDCP1 16 2 8,0 NM 032727 INA 33 4 8,3 NR 031576 MIR762 16 2 8,0 NM_007162 TFPI 16 2 8,0 NM 024807 TRIM16L 16 2 8,0 NM 001199161 USP6 33 4 8,3 NM 017715 ZNF319 66 8 8,3 NM 145271 ZNF701 16 2 8,0 NM 024906 SCD5 24 3 8,0 NM 001197129 SYS1-DBNDD2 24 3 8,0 NM 000407 GP1BB 31 4 7,8 NM 173201 ATP2A1 15 2 7,5 NR 027129 C21orf67 15 2 7,5 NM 001098808 C9orf129 30 4 7,5 NM 001242369 C9orf7 15 2 7,5 NM 015557 CHD5 15 2 7,5 NM 001166346 MDFIC 37 5 7,4 NR 033851 MGC39372 15 2 7,5 NM 020201 NT5M 30 4 7,5 NM 022463 NXN 15 2 7,5 NM 006418 OLFM4 15 2 7,5 NM 017439 PION 15 2 7,5 NM 002702 POU6F1 60 8 7,5 NM 153336 PSTK 22 3 7,3 NM 134428 RFX3 15 2 7,5 NM 014496 RPS6KA6 15 2 7,5 NR 003010 SCARNA12 15 2 7,5 NR 002588 SNORA51 15 2 7,5 NM 016639 TNFSF14 15 2 7,5 NM 001173513 TYMP 22 3 7,3 NM 001102664 EPN2 81 11 7,4 NM 033120 NKD2 72 10 7,2 NM 007122 USP18 36 5 7,2 NM 001141936 C4orf48 28 4 7,0 NM 001040113 MYH11 49 7 7,0 NR 028330 C15orf37 21 3 7,0 NM 001039508 SIRPG 21 3 7,0 NM 001080523 ARRDC5 13 2 6,5 NM 152792 ASPRV1 13 2 6,5 NM 001012279 C6orf174 13 2 6,5 NM 017525 CDC42BPG 13 2 6,5 NR 003529 CDKN2B-AS1 13 2 6,5 NM 033641 COL4A6 13 2 6,5

NM 001144962 1 NFKBIL1 13 2 6,5 NM 001017989 OPA3 13 2 6,5 NM 194248 OTOF 13 2 6,5 NM 178518 TMEM107 27 4 6,8 NM 138396 MARCH9 46 7 6,6 NR 027861 ZNF664-FAM101A 33 5 6,6 NR 038190 3 AGER 19 3 6,3 NM 001145951 TIPARP-AS1 19 3 6,3 NM 001040697 UGT3A2 19 3 6,3 NM 022553 2 VSIG10L 19 3 6,3 NM 014322 OPN3 25 4 6,3 NM 001775 CD38 82 13 6,3 NM 133463 AMZ1 31 5 6,2 NM 002542 OGG1 31 5 6,2 NM 181843 NUDT8 100 16 6,3 NM 001164688 RD3 37 6 6,2 NM 207340 ZEB1-AS1 37 6 6,2 NM 016466 ANKRD39 43 7 6,1 NM 004043 1 ASMT 12 2 6,0 NM 005172 ATOH1 12 2 6,0 NM 145178 ATOH7 12 2 6,0 NM 001008223 C1QL4 12 2 6,0 NM 007337 DLEC1 12 2 6,0 NR 002834 DUSP5P 12 2 6,0 NM 023933 FAM173A 24 4 6,0 NM 182759 FAM19A3 12 2 6,0 NM 005803 2 FLOT1 30 5 6,0 NM 005309 GPT 24 4 6,0 NM 014234 5 HSD17B8 18 3 6,0 NM 212551 LYSMD1 24 4 6,0 NM 020932 MAGEE1 12 2 6,0 NM 018670 MESP1 12 2 6,0 NM 000253 MTTP 12 2 6,0 NM 024927 PLEKHH3 12 2 6,0 NM 080923 PTPRC 36 6 6,0 NM 032709 PYROXD2 12 2 6,0 NM 000334 SCN4A 12 2 6,0 NM 006080 SEMA3A 12 2 6,0 NM 003975 SH2D2A 18 3 6,0 NM 138356 SHF 12 2 6,0 NM 139157 ST7-AS2 12 2 6,0 NM 003807 TNNI3 12 2 6,0 NM 001142646 TPSB2 18 3 6,0 NM 001080461 UPP1 12 2 6,0 NM 001128833 ZBTB42 24 4 6,0 NM 021915 ZNF703 12 2 6,0 NM 198540 B3GNT8 106 18 5,9 NM 000054 AVPR2 34 6 5,7 NM 003587 1 DHX16 34 6 5,7 NM 032090 PCDHGA10 34 6 5,7 NM 001172668 ZNF688 34 6 5,7 NR 026811 1 AGSK1 57 10 5,7 NR 026680 MGC57346 28 5 5,6 NM 133475 ANKRD24 22 4 5,5

NM 001855 COL15A1 22 4 5,5 NM 145315 LACE1 22 4 5,5 NR 037421 MIR3648 90 16 5,6 NM 020979 SH2B2 22 4 5,5 NM 032296 FLYWCH1 94 17 5,5 NM 001887 CRYBB1 16 3 5,3 NM 004409 DMPK 33 6 5,5 NR 033968 GUSBP9 16 3 5,3 NR 036751 HSP90AA6P 16 3 5,3 NM 032452 JPH4 16 3 5,3 NR 028135 KCNMB3 16 3 5,3 NR 039802 MIR4658 16 3 5,3 NM 001083 PDE5A 16 3 5,3 NM 178314 RILPL1 16 3 5,3 NM 000934 SERPINF2 33 6 5,5 NM 024676 SH3D21 33 6 5,5 NM 017844 ANKMY1 60 11 5,5 NM 032370 ZNF469 120 22 5,5 NM 001134876 C14orf80 130 24 5,4 NR 002936 TOM1L2 70 13 5,4 NM 181598 ATL1 27 5 5,4 NM 001083537 FAM86B1 27 5 5,4 NM 007085 FSTL1 27 5 5,4 NM 002183 1 IL3RA 27 5 5,4 NM 001105199 TMEM180 54 10 5,4 NM 000099 CST3 183 34 5,4 NM 080387 CLEC4D 37 7 5,3 NR 024071 PLCD1 37 7 5,3 NM 003794 SOBP 37 7 5,3 NM 032731 TXNRD3 75 14 5,4 NM 001134870 2 KIAA1949 121 23 5,3 NM 002910 RENBP 142 27 5,3 NR 026711 1 ASMTL-AS1 21 4 5,3 NM 130851 BMP4 21 4 5,3 NR 026906 1 C17orf69 10 2 5,0 NM 001374 DNASE1L2 10 2 5,0 NM 017820 EXD3 10 2 5,0 NM 013445 GAD1 21 4 5,3 NM 003516 HIST2H2AA3 10 2 5,0 NM 001242525 2 HLA-DPA1 10 2 5,0 NM 002192 INHBA 10 2 5,0 NM 178863 KCTD13 52 10 5,2 NM 001199659 LETM2 21 4 5,3 NM 002315 LM01 10 2 5,0 NM 001161573 MAFF 21 4 5,3 NM 130385 MRVI1 10 2 5,0 NR 033343 PSCA 10 2 5,0 NM 001024938 SLC2A14 10 2 5,0 NM 001082968 TOMM20L 10 2 5,0 NM 001009958 ZNF658B 21 4 5,3 NM 001159293 ZNF75A 10 2 5,0 NM 024876 ADCK4 93 18 5,2 NM 024785 FAM124B 46 9 5,1 NM 032777 GPR124 108 21 5,1

NM 001098531 RAPGEF3 36 7 5,1 NM 031232 NECAB3 61 12 5,1 NM 130759 GIMAP1 25 5 5,0 NM 018013 SORBS3 25 5 5,0 NM 080678 UBE2Q2P1 25 5 5,0 NM 005773 ZNF296 51 10 5,1 NM 001010877 3 ZNF321P 66 13 5,1 NM 021630 PDLIM2 96 19 5,1 NM 001136528 SERPINE2 55 11 5,0 NM 152783 D2HGDH 115 23 5,0 NM 007053 CD160 15 3 5,0 NM 145019 FAM124A 15 3 5,0 NM 024642 GALNT12 15 3 5,0 NM 145910 NEK11 15 3 5,0 NM 016223 PACSIN3 75 15 5,0 NM 001242319 PNMA6D 15 3 5,0 NM 030907 RSG1 30 6 5,0 NM 001161331 ST20 15 3 5,0 NM 024786 ZDHHC24 148 30 4,9 NM 021047 ZNF256 49 10 4,9 NM 020807 ZNF323 49 10 4,9 NM 001170820 IFITM10 34 7 4,9 NM 014055 IFT81 34 7 4,9 NM 024681 KCTD17 34 7 4,9 NM 145232 CTU1 54 11 4,9 NM 014694 ADAMTSL2 19 4 4,8 NM 181506 LRRC70 19 4 4,8 NR 026808 NCRNA00321 39 8 4,9 NM 000290 PGAM2 19 4 4,8 NM 003709 KLF7 43 9 4,8 NM 001145784 MEF2BNB 67 14 4,8 NM 014787 DNAJC6 24 5 4,8 NM 139245 PPM1L 24 5 4,8 NM 004159 5 PSMB8 48 10 4,8 NM 001098612 SIGLEC14 24 5 4,8 NM 006470 TRIM22 48 10 4,8 NR 026575 GK3P 28 6 4,7 NM 005994 TBX3 61 13 4,7 NM 001964 EGR1 33 7 4,7 NM 001101391 LING03 66 14 4,7 NM 001143821 PLEKHA5 33 7 4,7 NM 182907 PRDM1 33 7 4,7 NM 002904 RDBP 33 7 4,7 NM 020740 ANKFY1 37 8 4,6 NM 001185101 CD22 42 9 4,7 NM 012446 SSH1 46 10 4,6 NM 004163 RAB27B 199 43 4,6 NM 001242416 WDR25 51 11 4,6 NM 004029 IRF7 96 21 4,6 NM 001010887 ACER2 22 5 4,4 NM 138430 ADPRHL1 27 6 4,5 NM 001190724 4 ATAT1 9 2 4,5 NM 001141972 ATPBD4 22 5 4,4 NM 174896 C1orf162 9 2 4,5

NR 026784 C6orf164 9 2 4,5 NM012298 CAND2 9 2 4,5 NM 000732 CD3D 13 3 4,3 NM 139158 CDK15 13 3 4,3 NM 153221 CILP2 9 2 4,5 NM 206833 CTXN1 9 2 4,5 NM 013974 6 DDAH2 18 4 4,5 NR 040063 DKFZP564C196 9 2 4,5 NR 026855 DKFZP686I15217 18 4 4,5 NM 018163 DNAJC17 13 3 4,3 NM 032281 ELAVL3 9 2 4,5 NM 199280 FAM179A 22 5 4,4 NM 001164379 FAM180B 9 2 4,5 NM 001099338 FAM22A 31 7 4,4 NM 017556 FBLIM1 9 2 4,5 NM 145032 FBXL13 13 3 4,3 NR 024101 FLJ35776 9 2 4,5 NM 148899 FOXP2 13 3 4,3 NM 181703 GJA5 9 2 4,5 NM 033177 GPANK1 45 10 4,5 NM 006149 LGALS4 9 2 4,5 NM 001015002 LLGL2 9 2 4,5 NM 005572 LMNA 45 10 4,5 NM 023948 MOSPD3 22 5 4,4 NM 004540 NCAM2 9 2 4,5 NM 201539 NDRG2 9 2 4,5 NM 005386 NNAT 9 2 4,5 NM 006172 NPPA 9 2 4,5 NM 018930 PCDHB10 9 2 4,5 NM 001200053 PMEL 9 2 4,5 NM 014906 PPM1E 9 2 4,5 NM 006663 PPP1R13L 9 2 4,5 NM 004283 RAB3D 22 5 4,4 NM 173587 RCOR2 9 2 4,5 NM 001036 RYR3 9 2 4,5 NM 001204204 SEC14L2 18 4 4,5 NM 004155 SERPINB9 36 8 4,5 NM 003041 SLC7A10 9 2 4,5 NR 004380 SNORD32A 9 2 4,5 NM 201441 TEX22 9 2 4,5 NR 037646 TNFRSF12A 18 4 4,5 NM 001024843 TOB2P1 58 13 4,5 NM 021138 TRAF3IP2-AS1 22 5 4,4 NM 133462 TTC16 9 2 4,5 NM 001039783 TYR03P 9 2 4,5 NM 198129 LAMA3 159 36 4,4 NM 001171133 FAM3A 132 30 4,4 NM 005072 SLC12A4 57 13 4,4 NM 015177 DTX4 52 12 4,3 NM 144596 TTYH3 135 31 4,4 NM 001013693 LDLRAD2 178 41 4,3 NM 015916 CALHM2 117 27 4,3 NM 001002837 INPP5J 34 8 4,3 NM 020418 PCBP4 34 8 4,3

NM 016044 FAHD2A 64 15 4,3 NM 004753 DHRS3 94 22 4,3 NM 006820 IFI44L 30 7 4,3 NM 001135704 ACBD4 25 6 4,2 NR 002710 ALOX12P2 25 6 4,2 NM 014417 BBC3 25 6 4,2 NM 001178135 HDHD1 25 6 4,2 NM 002207 ITGA9 51 12 4,3 NM 001100425 KIAA0895 51 12 4,3 NR 030407 MIR671 51 12 4,3 NM 020229 PRDM11 25 6 4,2 NM 001199577 GIMAP1-GIMAP5 123 29 4,2 NM 012458 TIMM8A 160 38 4,2 NM 018132 CENPQ 88 21 4,2 NM 006889 CD86 21 5 4,2 NM 017803 DUS2L 63 15 4,2 NM 138690 GRIN3B 21 5 4,2 NM 024042 METRN 21 5 4,2 NM 001195628 MLLT10 42 10 4,2 NR 003109 TRO 21 5 4,2 NM 005685 GTF2IRD1 163 39 4,2 NM 006332 IFI30 79 19 4,2 NM 012225 NUBP2 196 47 4,2 NM 021996 GBGT1 58 14 4,1 NM 001135005 DNAJB5 37 9 4,1 NM 021641 ADAM 12 16 4 4,0 NR 027833 APOL3 16 4 4,0 NM 198545 C1orf187 16 4 4,0 NM 014143 CD274 16 4 4,0 NM 001111319 CLDN22 16 4 4,0 NM 152536 FGD5 16 4 4,0 NR 038275 FLJ31813 16 4 4,0 NM 001517 GTF2H4 16 4 4,0 NR 027386 GUSBP3 16 4 4,0 NM 006896 HOXA7 16 4 4,0 NM 005931 3 MICB 16 4 4,0 NM 007243 4 NRM 16 4 4,0 NM 001101401 SBK2 16 4 4,0 NM 001037 SCN1B 16 4 4,0 NM 004858 SLC6A6 49 12 4,1 NM 001199760 ST5 16 4 4,0 NM 198517 TBC1D19 16 4 4,0 NM 015023 WNK2 49 12 4,1 NM .014699 ZNF653 16 4 4,0 NM 007155 ZSCAN12P1 16 4 4,0 NM 002528 NTHL1 61 15 4,1 NM 199285 PRR19 61 15 4,1 NM 002535 OAS2 45 11 4,1 NM 003820 TNIK 73 18 4,1 NM 053050 MRPL53 159 39 4,1 NM 012420 IFIT5 28 7 4,0 NM 018689 KIAA1199 28 7 4,0 NM 001142299 SRCRB4D 28 7 4,0 NM 033093 TRIM71 28 7 4,0

NM 001190810 1 AGAP9 40 10 4,0 NM 004267 CHST2 40 10 4,0 NR 024034 KIAA0664L3 81 20 4,1 NM 001204872 NPEPL1 202 50 4,0 NM 001017530 PRR5 40 10 4,0 NM 001128635 1 RIMBP3B 40 10 4,0 NM 145159 JAG2 52 13 4,0 NM 018384 GIMAP5 117 29 4.0 NM 006602 TCN2 64 16 4,0 NM 199165 ADSSL1 12 3 4,0 NM 005582 CD 180 24 6 4,0 NM 206918 DEGS2 12 3 4,0 NM_ 174899 FBX036 12 3 4,0 NM 005897 IPP 24 6 4,0 NR 024061 LOH12CR2 12 3 4,0 NM 002356 MARCKS 24 6 4,0 NR 024322 MSL3P1 36 9 4,0 NM 006212 PFKFB2 84 21 4,0 NM 002632 PGF 12 3 4,0 NM 032882 PNMA6A 12 3 4,0 NM 002800 2 PSMB9 12 3 4,0 NM 144770 RBM11 12 3 4,0 NM 017452 STK19 12 3 4,0 NM 172209 4 TAPBPL 60 15 4,0 NM 006858 TMEM102 108 27 4,0 NM 001145635 TRIM47 12 3 4,0 NM 003443 ZBTB22 24 6 4,0 NM 001170640 CDK20 43 11 3,9 NM 007220 CA5B 75 19 3,9 NM 032421 CLIP2 75 19 3,9 NM 032836 FIZ1 75 19 3,9 NM 001146175 ZNF462 31 8 3,9 NM 001042601 TTC15 177 45 3,9 NM 001014979 C16orf93 51 13 3,9 NM 152320 ZNF649 51 13 3,9 NM 003507 FZD7 160 41 3,9 NM 001039651 5 C6orf26 19 5 3,8 NM 032961 PCDH10 19 5 3,8 NM 001145199 C12orf75 27 7 3,9 NM 001223 CASP1 27 7 3,9 NM 001128613 NUDT22 61 16 3,8 NM 002648 PIM1 61 16 3,8 NM 003830 SIGLEC5 96 25 3,8 NM 001206665 IGSF8 138 36 3,8 NM 020817 KIAA1407 34 9 3,8 NM 005275 2 GNL1 76 20 3,8 NM 007283 MGLL 84 22 3,8 NM 001172624 NE01 126 33 3,8 NM 031909 C1QTNF4 91 24 3,8 NM 003484 HMGA2 49 13 3,8 NM 001102594 DTX2 79 21 3,8 NM 001031827 1 BOLA2 87 23 3,8 NM 001039182 1 BOLA2B 87 23 3,8 NM 000755 CRAT 132 35 3,8

NM 153697 ANKRD44 15 4 3,8 NM 020811 CARNS1 15 4 3,8 NM 013246 CLCF1 15 4 3,8 NM 001882 CRHBP 15 4 3,8 NM 005232 EPHA1 90 24 3,8 NM 145059 FUK 60 16 3,8 NM 022041 GAN 67 18 3,7 NM 002048 GAS1 15 4 3,8 NR 036632 GOLGA2B 22 6 3,7 NM 001004439 ITGA11 15 4 3,8 NM 139248 LIPH 15 4 3,8 NM 001025101 MBP 75 20 3,8 NR 026902 MGC16142 15 4 3,8 NR 040072 NDRG4 22 6 3,7 NM 012387 PADI4 15 4 3,8 NM 001195263 PDZD7 45 12 3,8 NM 001080492 PRSS54 15 4 3,8 NM 213613 SLC29A4 15 4 3,8 NM 000455 STK32C 15 4 3,8 NM 001144923 TTC28-AS1 37 10 3,7 NM 198310 TUBB2A 52 14 3,7 NM 001039886 ZNF837 22 6 3,7 NM 001128302 LYRM1 78 21 3,7 NM 001129979 SYNE1 70 19 3,7 NM 001114185 MVK 48 13 3,7 NM 000920 PC 154 42 3,7 NM 001122674 ABCD3 33 9 3,7 NM 001173539 BAN Ρ 33 9 3,7 NM 199248 CACNB1 33 9 3,7 NM 052843 OBSCN 99 27 3,7 NM 194250 ZNF816-ZNF321P 66 18 3,7 NM 032290 ANKRD32 124 34 3,6 NM 014726 TBX2 58 16 3,6 NM 031213 FAM108A1 135 37 3,6 NM 001005855 ATP8B2 25 7 3,6 NM 173550 C9orf93 51 14 3,6 NM 006531 IFT88 25 7 3,6 NM 178496 MB21D2 51 14 3,6 NR 037429 MIR3656 25 7 3,6 NM 031430 RILP 51 14 3,6 NM 080861 SPTBN4 25 7 3,6 NM 001025616 ARHGAP24 43 12 3,6 NM 058195 CDKN2A 217 60 3,6 NR 033742 FKSG43 43 12 3,6 NM 018485 GPR77 43 12 3,6 NM 003259 ICAM5 61 17 3,6 NM 006995 BTN2A2 97 27 3,6 NM 004110 FDXR 97 27 3,6 NM 138420 AHNAK2 126 35 3,6 NM 152326 ANKRD9 36 10 3,6 NM 003568 ANXA9 54 15 3,6 NM 004925 AQP3 18 5 3,6 NM 032266 C2orf16 18 5 3,6 NM 016243 CYB5R1 36 10 3,6

NM 001136265 IFF02 54 15 3,6 NM 014994 MAPKBP1 54 15 3,6 NR 031592 MIR1181 18 5 3,6 NM 207127 PAOX 18 5 3,6 NM 015149 RGL1 18 5 3,6 NM 001080496 RGP1 54 15 3,6 NR 002312 RPPH1 36 10 3,6 NM 015278 SASH1 72 20 3,6 NM 001099435 SPINT1 72 20 3,6 NM 003608 GPR65 118 33 3,6 NM 004269 MED27 82 23 3,6 NM 024108 TREML2 82 23 3,6 NM 001170957 SMO 64 18 3,6 NM 002663 PLD2 46 13 3,5 NM 001242788 BRF1 150 42 3,6 NM_003560 PLA2G6 103 29 3,6 NM 005481 MED16 349 98 3,6 NM_003916 AP1S2 28 8 3,5 NM 004952 EFNA3 28 8 3,5 NM_014872 ZCWPW1 57 16 3,6 NM 033375 MY01C 39 11 3,5 NM 001171091 UEVLD 49 14 3,5 NM 000584 IL8 172 49 3,5 NM 000154 GALK1 274 78 3,5 NM 001145128 AKD1 10 3 3,3 NM 001109938 6 C6orf136 10 3 3,3 NM 006566 CD226 10 3 3,3 NR 023386 CROCCP3 10 3 3,3 NR 037860 2 EGFL8 10 3 3,3 NM 025193 HSD3B7 10 3 3,3 NM 003866 INPP4B 31 9 3,4 NR 031598 MIR1229 10 3 3,3 NR 036199 MIR4315-1 10 3 3,3 NR 036271 MIR4315-2 10 3 3,3 NR 030369 MIR639 10 3 3,3 NM 001114132 NBEAL1 52 15 3,5 NM 178140 PDZD2 10 3 3,3 NM 001190728 RALGPS1 10 3 3,3 NR 033396 SLC22A20 10 3 3,3 NM 001199693 SLC4A8 10 3 3,3 NM 032038 SPSB2 42 12 3,5 NM 033278 TRIM39 21 6 3,5 NM 021253 5 TRIM39-RPP21 10 3 3,3 NM 152736 ZNF200 129 37 3,5 NM 001204299 ZNF668 76 22 3,5 NM 020703 AMIG01 66 19 3,5 NM 024816 RABEP2 66 19 3,5 NM 001134492 HS2ST1 121 35 3,5 NM 001170881 GPR137 45 13 3,5 NM 006929 3 SKIV2L 45 13 3,5 NR 002451 ABCA11P 103 30 3,4 NM 004913 C16orf7 103 30 3,4 NM 152742 GPC2 34 10 3,4 NM 004761 3 RGL2 34 10 3,4

NM 000048 ASL 93 27 3,4 NM 001204240 TBC1D16 151 44 3,4 NM 001200001 NOTCH2 327 95 3,4 NM 001042432 CLN3 58 17 3,4 NM 001172780 LRRC34 58 17 3,4 NM 130786 A1BG 24 7 3,4 NM 014885 ANAPC10 48 14 3,4 NM 001723 DST 24 7 3,4 NM 004463 FGD1 48 14 3,4 NM 022107 4 GPSM3 24 7 3,4 NM 001160166 HRH4 24 7 3,4 NM 000428 LTBP2 24 7 3,4 NR 003189 SYTL3 24 7 3,4 NM 007261 CD300A 123 36 3,4 NM 058180 C21orf58 150 44 3,4 NM 014675 CROCC 112 33 3,4 NM 006519 DYNLT1 75 22 3,4 NM 002926 RGS12 265 78 3,4 NM 002333 LRP3 295 87 3,4 NM 152504 C20orf196 78 23 3,4 NM 005246 FER 78 23 3,4 NM 001173474 1 ASMTL 91 27 3,4 NM 145691 ATPAF2 67 20 3,4 NM 001012502 C9orf117 13 4 3,3 NM 024705 DHRS12 27 8 3,4 NR 034098 EML2 54 16 3,4 NM 001001794 FAM116B 13 4 3,3 NM 032301 FBXW9 40 12 3,3 NR 015369 FLJ42709 13 4 3,3 NM 207647 FSD1L 40 12 3,3 NM 174942 GAS2L3 13 4 3,3 NM 178231 ICA1L 13 4 3,3 NM 002204 ITGA3 27 8 3,4 NM 153487 MDGA1 13 4 3,3 NM 175058 PLEKHA7 13 4 3,3 NM 181808 POLN 13 4 3,3 NM 181882 PRX 40 12 3,3 NM 032167 RUNDC2A 13 4 3,3 NR 033801 SLFNL1 13 4 3,3 NM 178509 SUN1 67 20 3,4 NM 001042463 TMEM92 27 8 3,4 NM 031434 TNFRSF11A 13 4 3,3 NM 015516 TSPAN15 67 20 3,4 NM 007191 WNT11 13 4 3,3 NM 145288 ZNF311 13 4 3,3 NM 001243241 ZNF345 27 8 3,4 NM 020928 ZYG11A 13 4 3,3 NM 001099220 ZNHIT2 124 37 3,4 NM 014806 RUSC2 181 54 3,4 NM 001164115 CASS4 70 21 3,3 NM 173540 FUT11 130 39 3,3 NM 001033045 GPR155 43 13 3,3 NM 053053 TAF13 43 13 3,3 NM 001720 BMP8B 60 18 3,3

NM 152759 LRRC43 30 9 3,3 NM 015016 MAST3 120 36 3,3 NM 024578 OCEL1 60 18 3,3 NR 024525 FAM96B 166 50 3,3 NM 033340 CASP7 106 32 3,3 NM 015157 PHLDB1 123 37 3,3 NM 016148 SHANK1 142 43 3,3 NM 001142501 MON1A 129 39 3,3 NM 080622 ABHD16B 33 10 3,3 NM 016584 IL23A 16 5 3,2 NM 001010844 IRAK1BP1 16 5 3,2 NM 001040624 NCALD 33 10 3,3 NM 017699 SIDT1 33 10 3,3 NM 213618 ST6GALNAC2 16 5 3,2 NR 002331 STAC 16 5 3,2 NM 001198526 TCHH 16 5 3,2 NM 052883 TXNRD3NB 16 5 3,2 NM 001164267 3 WDR53 132 40 3,3 NM 001214906 ZNF484 33 10 3,3 NM 006646 WBP11P1 102 31 3,3 NM 016481 C9orf156 85 26 3,3 NM 201446 EGFL7 447 136 3,3 NM 001159391 GUK1 190 58 3,3 NM 146387 MRPL4 279 85 3,3 NM 198475 FAM171A2 88 27 3,3 NM 019121 LRRC68 88 27 3,3 NM 001321 CSRP2 36 11 3,3 NM 134324 TBC1D10A 36 11 3,3 NM 007108 TCF7L2 72 22 3,3 NM 001145845 ROB01 219 67 3,3 NM 024585 ARMC7 130 40 3,3 NM 006123 IDS 75 23 3,3 NM 172251 MRPL54 189 58 3,3 NR 033488 5 ABHD16A 19 6 3,2 NM 052854 CREB3L1 19 6 3,2 NM 004137 KCNMB1 19 6 3,2 NM 004140 LLGL1 97 30 3,2 NM 058169 LOH12CR1 39 12 3,3 NM 002461 MVD 78 24 3,3 NM 019080 NDFIP2 19 6 3,2 NM 001135750 PSMG4 19 6 3,2 NR 024284 ZFHX2 19 6 3,2 NM 005529 HSPG2 844 260 3,2 NM 001003692 ZNF133 100 31 3,2 NM 183241 C9orf142 285 88 3,2 NM 018110 DOK4 187 58 3,2 NM 017679 BCAS3 126 39 3,2 NM 001064 TLCD1 42 13 3,2 NM 175630 DNMT3A 64 20 3,2 NM 001002913 PTRH1 64 20 3,2 NM 024591 CHMP6 222 69 3,2 NR 027271 C19orf23 22 7 3,1 NM 001080849 DNLZ 48 15 3,2 NM 014449 GPR162 48 15 3,2

NM 006423 RABAC1 48 15 3,2 NM 020145 SH3GLB2 121 38 3,2 NM 015681 B9D1 25 8 3,1 NM 024731 KLHL36 127 40 3,2 NM 178817 M RAP 25 8 3,1 NM 001144978 MTHFD2L 25 8 3,1 NM 016606 REEP2 25 8 3,1 NM 014442 SIGLEC8 25 8 3,1 NM 001168247 SMAGP 25 8 3,1 NM 005928 MFGE8 181 57 3,2 NM 022489 INF2 312 98 3,2 NM 001031714 INF2 312 98 3,2 NM 001198897 ACY1 105 33 3,2 NR 037505 MIR3940 54 17 3,2 NM 213598 ZNF552 54 17 3,2 NM 053064 GNG2 333 105 3,2 NM 001199580 SUV420H2 139 44 3,2 NM 001166209 SYS1 196 62 3,2 NM 015407 ABHD14A 85 27 3,1 NM 130781 RAB24 85 27 3,1 NM 018383 WDR46 57 18 3,2 NM 145249 IFI27L1 60 19 3,2 NM 032335 PHF6 91 29 3,1 NM 001008486 SLC44A1 91 29 3,1 NM 024832 RIN3 246 78 3,2 NM 001164638 ENDOV 31 10 3,1 NR 027712 PIP5K1P1 31 10 3,1 NM 018363 RNLS 63 20 3,2 NM 003239 THAP2 31 10 3,1 NM 014008 CCDC22 129 41 3,1 NM 001100418 C19orf60 97 31 3,1 NM 001733 C1R 97 31 3,1 NM 003098 SNX33 66 21 3,1 NM 006427 SIVA1 232 74 3,1 NM 001040134 PALM 166 53 3,1 NM 030945 C1QTNF3 34 11 3,1 NM 080750 DPH3P1 34 11 3,1 NM 001163213 FGFR3 34 11 3,1 NM 153835 GPR113 34 11 3,1 NM 001144925 MX1 34 11 3,1 NR 033799 2 NSFP1 34 11 3,1 NM 014596 2 ZP3 138 44 3,1 NM 005711 EDIL3 106 34 3,1 NM 033400 ZFP41 147 47 3,1 NM 001159846 MPND 78 25 3,1 NM 012121 CDC42EP4 196 63 3,1 NM 173674 DCBLD1 40 13 3,1 NM 022772 EPS8L2 40 13 3,1 NM 001099280 HEATR7A 40 13 3,1 NM 016619 PLAC8 81 26 3,1 NM 004920 AATK 124 40 3,1 NM 031454 SELO 168 54 3,1 NM 032626 RBBP6 127 41 3,1 NM 001198559 DNAJC27 87 28 3,1