В соответствии с 35 U.S.C. § 119(e) настоящая заявка испрашивает приоритет по заявке на патент США серийный номер 61/310,671, поданной 4 марта 2010 года. Содержание заявки США серийный номер 61/310,671 включено сюда посредством отсылки в полном объеме.
Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, который был представлен в формате ASCII с помощью EFS-Web и включен сюда посредством отсылки в полном объеме. Упомянутая копия ASCII-файла, созданная 11 февраля 2011 года, называется 38194601 (2).txt и имеет размер 9237 байт.
Уровень техники
Многие гетерологичные рекомбинантные белки продуцируются при экспрессии в бактериальных системах в неправильно свернутой нерастворимой форме в виде телец включения. Как правило, для растворения рекомбинантного белка в тельцах включения должны применяться денатурирующие реагенты. Белок затем должен быть ренатурирован в условиях, оптимизированных для правильной укладки белка. Усилия, затраченные на оптимизацию, а также медленный процесс рефолдинга и сниженные выходы продукции увеличивают стоимость и время производства рекомбинантных белков. Интерфероны проявляют противовирусную, антипролиферативную,
иммуномодулирующую и другие активности. Различают несколько типов интерферонов человека, в том числе, α, β и γ, на основе, например, их противовирусной и анти-пролиферативной активности. Секреция интерферона индуцируется сигналами, в том числе, вирусами, двухцепочечными РНК, другими полинуклеотидами, антигенами и митогенами. Интерферон-β представляет собой пример белка, который экспрессируется в рекомбинантной форме в бактериях, где он накапливается в тельцах включения. Человеческий интерферон-β 1b представляет собой регуляторный полипептид с молекулярной массой, составляющей около 22 кДа, и состоящий из 165 аминокислотных остатков. Он может продуцироваться многими клетками в организме, в частности, фибробластами, в ответ на вирусную инфекцию или воздействие других биопрепаратов. Он связывается с мультимерным рецептором клеточной поверхности. Продуктивное связывание с рецептором вызывает каскад внутриклеточных событий, ведущих к экспрессии генов, индуцируемых интерфероном-β, и запуску противовирусной, антипролиферативной и иммуномодулирующей активности. Интерферон-β 1b, а именно, Betaseron (h-IFN-β 1b C17S), был использован для лечения заболеваний, включая рассеянный склероз (MS), инфекционые гепатиты В и С, глиому и меланому. Было продемонстрировано, что интерферон-β уменьшает количество приступов, переносимых пациентами с рецидивирующим и ремиттирующим MS. Значительные количества интерферона β-1b требуются для терапевтического применения. Рекомбинантный интерферон-β 1b был получен с низкими выходами в клетках млекопитающих, в том числе, в человеческих фибробластах и клетках СНО. Как правило, экспрессии в животной клетке мешают технические трудности, в том числе, продолжительное время процесса, легкая загрязняемость культур, необходимость поддерживать жесткие условия культивирования и высокая стоимость среды культивирования. Когда было обнаружено, что гликопротеиновый компонент в целом не является необходимым для активности интерферона β, исследователи обратились к экспрессии рекомбинантного белка в бактериальной системе экспрессии Е. coli. Как уже отмечалось, тельца включения, образующиеся в E.coli, должны растворяться денатурацией, и интерферон-β должен подвергаться рефолдингу. Рефолдинг, который проходит медленно, увеличивает время процесса, повышает стоимость и снижает выход. На сегодняшний день ни для клеток-хозяев млекопитающих, ни для бактериальных клеток-хозяев не был описан способ быстрого и экономичного получения растворимого рекомбинантного интерферона-β с высокими выходами, без необходимости осуществления стадий денатурации и рефолдинга.
Раскрытие изобретения Настоящее изобретение относится к экспрессии интерферона в P. fluorescens и разработке нового способа экстракции активных белков из продукта ферментации с использованием мягких детергентов и без необходимости процесса рефолдинга.
В частности, настоящее изобретение относится к способу получения рекомбинантного белка интерферона I типа, причем упомянутый способ включает экспрессию рекомбинантного белка интерферона культивированием клетки-хозяина Pseudomonas или E.coli, содержащей экспрессионную конструкцию, содержащую кодирующую последовательность, которая была оптимизирована для экспрессии в клетке-хозяине, лизис клетки-хозяина, получение нерастворимой фракции и растворимой фракции на стадии лизиса, экстракцию нерастворимой фракции в неденатурирующих условиях экстракции и получение осадка экстракта и супернатанта экстракта из нерастворимой фракции, причем рекомбинантный белок в экстракте супернатанта присутствует в растворимой форме, активной форме или их комбинации без необходимости осуществления дополнительной стадии его ренатурации или рефолдинга. В вариантах выполнения изобретения неденатурирующие условия экстракции содержат наличие мягкого детергента. В некоторых вариантах выполнения изобретения мягкий детергент представляет собой цвиттерионный детергент.В определенных вариантах выполнения изобретения цвиттерионный детергент представляет собой Zwittergent 3-08, Zwittergent 3-10, Zwittergent 3-12 или Zwittergent 3-14. В вариантах выполнения изобретения неденатурирующие условия экстракции содержат от около 0,5% до около 2% Zwittergent 3-14. В некоторых вариантах выполнения изобретения мягким детергентом не является N-лауроил-саркозин (NLS).
В вариантах выполнения изобретения неденатурирующие условия экстракции содержат наличие мягкого детергента и дополнительно содержат хаотропный агент и космотропную соль. В некоторых вариантах выполнения изобретения хаотропный агент представляет собой мочевину или гуанидин гидрохлорид и космотропная соль представляет собой NaCl, KCl или (NH4)2SO4. В определенных вариантах выполнения изобретения неденатурирующие условия экстракции содержат от около 0,5 до около 2% Zwittergent 3-14; от около 0 до около 2 М мочевины; от около 0 до около 2 М NaCl; и рН составляет от около 6,5 до около 8,5. В вариантах выполнения изобретения неденатурирующие условия экстракции содержат: 1% Zwittergent 3-14, 2 М мочевины, 2 М NaCl и рН равен около 8,2. В других вариантах выполнения изобретения неденатурирующие условия экстракции дополнительно содержат от около 1% до около 40% масс/об. твердых веществ. В некоторых вариантах выполнения изобретения неденатурирующие условия экстракции дополнительно содержат около 5% масс/об. твердых веществ.
В вариантах выполнения изобретения рекомбинантный белок интерферон I типа представляет собой интерферон-β, интерферон-α, интерферон-κ, интерферон-τ или интерферон-ω. В определенных вариантах выполнения изобретения рекомбинантный белок интерферон I типа представляет собой интерферон-β или интерферон-α. В вариантах выполнения изобретения рекомбинантный белок интерферон I типа представляет собой интерферон-β, и упомянутый интерферон-β выбирают из группы, состоящей из: человеческого интерферона-β 1b и человеческого интерферона-β 1b C17S. В вариантах выполнения изобретения, в которых рекомбинантный белок интерферон I типа представляет собой интерферон-α, интерферон-α выбирают из группы, состоящей из: человеческого интерферона-α 2а и человеческого интерферона-α 2b. В других вариантах выполнения изобретения заявленный способ дополнительно содержит измерение количества рекомбинантного белка интерферона I типа в нерастворимой фракции и фракции супернатанта экстракта, причем количество рекомбинантного белка интерферона, определяемое во фракции супернатанта экстракта, составляет от около 10% до около 95% количества рекомбинантного белка интерферона, определяемого в нерастворимой фракции. В других вариантах выполнения изобретения способ дополнительно содержит измерение активности рекомбинантного белка, причем определено, что от около 40% до около 100% рекомбинантного белка, присутствующего в супернатанте экстракта, является активным. В соответствующих вариантах выполнения изобретения рекомбинантный белок представляет собой интерферон-β, и количество активного рекомбинантного белка определяют аффинной хроматографией на колонке с Blue Sepharose, анализом связывания с рецептором, анализом противовирусной активности или анализом цитопатического эффекта. В других вариантах выполнения изобретения рекомбинантный белок представляет собой интерферон-α, интерферон-β или интерферон-ω, и количество активного рекомбинантного белка определяют аффинной хроматографией на колонке с Blue Sepharose, анализом связывания с рецептором, анализом противовирусной активности или анализом цитопатического эффекта. Настоящее изобретение также относится к способам получения рекомбинантного белка интерферона I типа, причем упомянутый способ содержит экспрессию рекомбинантного белка интерферона культивированием клетки-хозяина Pseudomonas или E.coli, содержащей экспрессионную конструкцию, содержащую кодирующую последовательность, которая была оптимизирована для экспрессии в клетке-хозяине, лизис клетки-хозяина, получение нерастворимой фракции и растворимой фракции на стадии лизиса, экстракцию нерастворимой фракции в неденатурирующих условиях экстракции и получение осадка экстракта и супернатанта экстракта из нерастворимой фракции, причем рекомбинантный белок присутствует в экстракте супернатанта в растворимой форме, активной форме или их комбинации без необходимости осуществления дополнительной стадии его ренатурации или рефолдинга, причем рекомбинантный белок представляет собой интерферон-β, и причем дополнительно неденатурирующие условия экстракции оптимизированы с помощью информации, приведенной на фигуре 4В.
В вариантах выполнения изобретения рекомбинантный белок присутствует в супернатанте экстракта в концентрации, равной от около 0,3 грамма на литр до около 10 граммов на литр. В других вариантах выполнения изобретения клетку-хозяина культивируют в объеме, составляющем от около 1 до около 20 или более литров. В определенных вариантах выполнения изобретения клетку-хозяин культивируют в объеме, составляющем около 1 литра, около 2 литров, около 3 литров, около 4 литров, около 5 литров, около 10 литров, около 15 литров или около 20 литров.
В вариантах выполнения изобретения экспрессионная конструкция содержит индуцируемый промотор. В определенных вариантах выполнения изобретения экспрессионная конструкция содержит производное lac промотора и экспрессия интерферона индуцируется IPTG.
В вариантах выполнения изобретения клетку-хозяина выращивают при температуре, равной от около 25°C до 33°C, при значениях рН, составляющих от около 5,7 до около 6,5, и IPTG добавляют до конечной концентрации, составляющей от около 0,08 мМ до 0,4 мМ, причем OD575 достигает от около 80 до около 160. В определенных вариантах выполнения изобретения клетку-хозяина выращивают при температуре, равной около 32°C, при значениях рН, составляющих от около 5,7 до 6,25, и IPTG добавляют до конечной концентрации, составляющей около 0,2 мМ, причем OD575 достигает от около 120 до около 160.
В вариантах выполнения изобретения экспрессионная конструкция содержит высокоактивный сайт связывания рибосомы. В некоторых вариантах выполнения изобретения клетка-хозяин представляет собой штамм с делецией Lon протеазы и протеазы hslUV. В других вариантах выполнения изобретения интерферон I типа экспрессируется в цитоплазме клетки-хозяина. В соответствующих вариантах изобретения интерферон I типа представляет собой человеческий интерферон-β 1b или человеческий интерферон-β 1b C17S и экспрессируется в цитоплазме клетки-хозяина. Настоящее изобретение также относится к способам экстракции рекомбинантного белка интерферон I типа, причем рекомбинантный белок интерферон присутствует в нерастворимой фракции, упомянутая нерастворимая фракция получена после лизиса клетки-хозяина Pseudomonas или E.coli, экспрессирующей рекомбинантный белок интерферон, причем упомянутый способ содержит подвергание нерастворимой фракции воздействию неденатурирующих условий экстракции и получение осадка экстракта из нерастворимой фракции, причем упомянутый осадок экстракта содержит рекомбинантный белок интерферон, причем рекомбинантный белок интерферон находится в экстракте супернатанта в растворимой форме, активной форме или их комбинации без необходимости осуществления дополнительной стадии его ренатурации или рефолдинга.
В вариантах выполнения изобретения экстрагируемый рекомбинантный белок интерферон I типа представляет собой интерферон-β, интерферон-α, интерферон-κ, интерферон-τ или интерферон-ω. В некоторых вариантах выполнения изобретения рекомбинантный белок интерферон I типа представляет собой интерферон-β или интерферон-α. В вариантах выполнения изобретения рекомбинантный белок интерферон I типа представляет собой интерферон-β, и упомянутый интерферон-β выбирают из группы, состоящей из: человеческого интерферона-β 1b и человеческого интерферона-β 1b C17S. В других вариантах выполнения изобретения интерферон-α выбирают из группы, состоящей из: человеческого интерферона-α 2а и человеческого интерферона-α 2b. Изобретение дополнительно относится к способу получения нерастворимой фракции, содержащей рекомбинантный белок интерферон I типа, причем рекомбинантный белок интерферон экспрессируется в клетке-хозяине Pseudomonas или E.coli из нуклеиново-кислотной конструкции, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, которая является функционально связанной с производным lac промотора, причем упомянутый способ содержит выращивание клетки-хозяина при температуре от около 25°C до 33°C и при значениях рН, составляющих от около 5,7 до около 6,5, до OD600 (значениях оптической плотности при 600 нм), составляющих от около 80 до около 160, и индукцию клетки-хозяина IPTG в концентрации, составляющей от около 0,08 мМ до около 0,4 мМ, лизис клетки-хозяина и центрифугирование ее для получения фракции осадка, причем растворимый, активный или растворимый и активный рекомбинантный белок интерферон может быть получен экстрагированием фракции осадка в неденатурирующих условиях без необходимости осуществления дополнительной стадии его ренатурации или рефолдинга. В вариантах выполнения изобретения рекомбинантный белок интерферон I типа, содержащийся в нерастворимой фракции, представляет собой интерферон-β, интерферон-α, интерферон-κ или интерферон-ω. В определенных вариантах выполнения изобретения рекомбинантный белок интерферон I типа представляет собой интерферон-β или интерферон-α. В вариантах выполнения изобретения, в которых рекомбинантный белок интерферон I типа представляет собой интерферон-β, интерферон-β выбирают из группы, состоящей из: человеческого интерферона-β 1b и человеческого интерферона-β 1b C17S. В вариантах выполнения изобретения, в которых рекомбинантный белок интерферон I типа представляет собой интерферон-α, интерферон-α выбирают из группы, состоящей из: человеческого интерферона-α 2а и человеческого интерферона-α 2b. В вариантах выполнения изобретения в способе получения нерастворимой фракции, содержащей рекомбинантный белок интерферон I типа, температура, при которой выращивают клетку-хозяина, составляет около 32°C и концентрация IPTG составляет около 0,2 мМ.
Включение посредством отсылки
Все публикации, патенты и патентные заявки, упомянутые в данном описании, включены сюда посредством отсылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация, патент или патентная заявка была бы специально и отдельно указывалась включенной посредством отсылки.
Краткое описание чертежей
Новые признаки изобретения изложены с подробностями в прилагаемой формуле изобретения. Лучшее понимание признаков и преимуществ настоящего изобретения может быть достигнуто обращением к последующему подробному описанию, в котором изложены иллюстративные варианты выполнения изобретения, использующие принципы изобретения, и в прилагаемых чертежах.
Фигура 1. Первоначальная оценка с помощью CGE белка IFN-β, восстановленного из штамма P. fluorescens PS530-001. А. Белок, анализ которого проводился в восстановительных условиях. В. Белок, анализ которого проводился в невосстанавливающих условиях.
Для обоих А и В:
Дорожка 1. Маркеры молекулярных масс с указанием их величин.
Дорожка 2. Осадок из первоначального центрифугирования после лизиса клеток (нерастворимая фракция).
Дорожки 3-5. Супернатант из первоначального центрифугирования после лизиса клеток (растворимая фракция).
Дорожки 6-9. Супернатант из центрифугирования после стадии экстракции. Дорожки 6 и 7 представляют собой результаты экстракции буфером PBS без 1% Zwittergent 3-14 и с 1% Zwittergent 3-14, соответственно, и дорожки 8 и 9 представляют собой результаты экстракции ацетатным буфером без 1% Zwittergent 3-14 и с 1% Zwittergent 3-14, соответственно.
Дорожки 10-13. Осадок после центрифугирования, проведенного после стадии экстракции. Дорожки 10 и 11 представляют собой результаты экстракции буфером PBS без 1% Zwittergent 3-14 и с 1% Zwittergent 3-14, соответственно, и дорожки 8 и 9 представляют собой результаты экстракции ацетатным буфером без 1% Zwittergent 3-14 и с 1% Zwittergent 3-14, соответственно.
Фигура 2. Блок-схема исследования, проведенного для оценки степени экстракции интерферона-β с использованием различных детергентов.
Фигура 3. Блок-схема предназначенного для статистического анализа исследования, проведенного для оценки степени экстракции интерферона-β с использованием различных условий экстракции, в том числе, ZWittergent 3-14.
Фигура 4. Результаты исследования, проведенного для оценки степени экстракции интерферона-β с использованием различных условий экстракции, в том числе, Zwittergent 3-14. А. Статистическая сводка. В. Диапазоны приемлемых условий экстракции.
Фигура 5. Зависимость продукции нерастворимого IFN-β от времени после индукции для повторенных ферментации.
Были нанесены результаты трех различных повторов.
Фигура 6. Зависимость продукции нерастворимого IFN-β от времени после индукции для варьирующих значений рН и оптической плотности (OD).
Были нанесены результаты трех различных повторов.
Фигура 7. Последовательность IFN-β 1b А. Аминокислотная последовательность IFN-β 1b C17S. (SEQ ID NO: 1) Последовательность показывает N-концевой метионин, который отсутствует в очищенном белке. В. Последовательность ДНК IFN-β с кодонами, оптимизированными для P. fluorescens. Данная последовательность кодирует аминокислотную последовательность, показанную на фигуре 7A. (SEQ ID NO: 2) С. Аминокислотная последовательность IFN-β 1b C17S без N-концевого метионина. (SEQ ID NO: 3)
Фигура 8. Последовательность IFN-α 2а. А. Аминокислотная последовательность IFN-α 2а. (SEQ ID NO: 4) В. Последовательность ДНК IFN-α 2а с кодонами, оптимизированными для P. fluorescens. (SEQ ID NO: 5)
Фигура 9. Последовательность IFN-α 2b. А. Аминокислотная последовательность IFN-α 2b. (SEQ ID NO: 6) В. Последовательность ДНК IFN-α 2b с кодонами, оптимизированными для P. fluorescens. (SEQ ID NO: 7)
Осуществление изобретения
Настоящее изобретение относится к способу получения больших количеств растворимого рекомбинантного белка интерферона в системе экспрессии Pseudomonas. В частности, данный способ устраняет необходимость в, как правило, требуемых денатурирующей стадии с последующей стадией ренатурации/рефолдинга.
Продукция рекомбинантного интерферона-β в бактериальных системах экспрессии было затруднена секвестрацией белка в нерастворимых тельцах включения. Для солюбилизации телец включения требуется денатурация, которая, в свою очередь, требует осуществления стадии рефолдинга, которая является дорогостоящей, отнимающей много времени, и уменьшает выход белка. Настоящее изобретение обходит необходимость стадии рефолдинга, относясь к способам получения и солюбилизации интерферона без обращения к денатурации.
Настоящее изобретение относится к способам получения рекомбинантного белка интерферона, который является растворимым, активным или как растворимым, так и активным, в бактериальной системе экспрессии, не подвергая белок стадии денатурации. В частности, описан неденатурирующий способ экстракции, позволяющий получать растворимый белок интерферон. Интерфероны, экспрессированные в бактериальных системах экспрессии, как правило, локализованы в нерастворимой фракции. В процессе экстракции по настоящему изобретению данную нерастворимую фракцию подвергают воздейстию экстракционных условий, которые включают в себя неденатурирующие концентрации мягких детергентов и продуцируют растворимый белок. Настоящее изобретение относится также к способам получения рекомбинантного интерферона белка, причем условия роста клетки-хозяина Pseudomonas оптимизированы для получения максимальных выходов растворимого рекомбинантного белка интерферона, особенно, когда применяется способ экстракции по изобретению. Описаны исследования влияния условий роста E.coli на продукцию растворимых белков. Растворимость данного белка при экспрессии в Pseudomonas может быть отличной от таковой в E.coli. Данное явление проиллюстрировано, например, в патентной заявке США Pub. №2006/0040352, "Экспрессия белков млекопитающих в Pseudomonas fluorescens", в которой параллельно сравниваются растворимые количества нескольких белков, полученных с использованием E.coli или P. fluorescens в качестве хозяина. Более того, имеется существенное различие между растворимостями различных белков даже в одном и том же хозяине, так как на растворимость сильно влияет структура белка, например, аминокислотная последовательность. Ранее сообщалось о попытках производить интерферон-β в E.coli, приводивших к получению белка, нуждающегося в рефолдинге. См., например, Russell-Harde, 1995, "The Use of Zwittergent 3-14 in the Purification of Recombinant Human Interferon-P Ser17 (Betaseron) et al., J. Interferon and Cytokine Res. 15:31-37, и Ghane, et al., 2008, "Over Expression of Biologically Active Interferon Beta Using Synthetic Gene in E. coli," J. of Sciences, Islamic Republic of Iran 19(3):203-209, обе публикации включены сюда посредством отсылки.
Данные способы дополнительно предусматривают оптимизированные условия роста, в том числе, температуру роста, оптическую плотность (OD) во время индукции промотора, концентрацию индуктора и значение рН. Приведенные условия экстракции включают в себя тип и концентрацию детергента, хаотропный агент, космотропную соль и значение рН. Приводятся определенные величины, а также оптимальные диапазоны параметров. Также приведены способы оптимизации условий экстракции с использованием приведенных диапазонов значений.
Условия бактериального роста
В вариантах выполнения настоящего изобретения условия бактериального роста оптимизированы с тем, чтобы увеличить количество растворимого белка интерферона, получаемого с использованием способов экстракции, как это предусмотрено в настоящем документе. Также рассматривается использование условий роста по настоящему изобретению в сочетании с другими условиями экстракции, например, другими способами, описанными и применяемыми в данной области техники.
Оптимальные условия роста, особенно применимые в сочетании со способами экстракции по изобретению, содержат: температуру от около 25°C до 33°C; значение рН от около 5,7 до около 6,5 и индукцию от около 0,08 мМ до 0,4 мМ IPTG, когда значение оптической плотности при 575 нм (OD575) культуры достигает от около 80 до около 160.
Уровень значения рН культуры можно поддерживать с помощью рН-буферов и способов, известных специалистам в данной области. Контроль уровня рН во время культивирования также может быть достигнут с помощью водного раствора аммиака. В некоторых вариантах выполнения изобретения значение рН культуры составляет от около 5,7 до около 6,5. В некоторых вариантах выполнения изобретения значение рН составляет 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4 или 6,5. В других вариантах выполнения изобретения значение рН составляет от 5,7 до 5,9, от 5,8 до 6,0, от 5,9 до 6,1, от 6,0 до 6,2, от 6,1 до 6,3 или от 6,2 до 6,5. В еще других вариантах выполнения изобретения значение рН составляет от 5,7 до 6,0, от 5,8 до 6,1, от 5,9 до 6,2, от 6,0 до 6,3, от 6,1 до 6,4 или от 6,2 до 6,5. В некоторых вариантах выполнения изобретения значение рН составляет от около 5,7 до около 6,25.
В вариантах выполнения изобретения температуру роста поддерживают от около 25°C до 33°C. В некоторых вариантах выполнения изобретения температура роста составляет около 25°C, около 26°C, около 27°C, около 28°C, около 29°C, около 30°C, около 31°C, около 32°C или около 33°C. В других вариантах выполнения изобретения температуру роста поддерживают от около 25°C до около 27°C, от около 25°C до около 28°C, от около 25°C до около 29°C, от около 25°C до около 30°C, от около 25°C до около 31°C, от около 25°C до около 32°C, от около 25°C до около 33°C, от около 26°C до около 28°C, от около 26°C до около 29°C, от около 26°C до около 30°C, от около 26°C до около 31°C, от около 26°C до около 32°C, от около 27°C до около 29°C, от около 27°C до около 30°C, от около 27°C до около 31°C, от около 27°C до около 32°C, от около 26°C до около 33°C, от около 28°C до около 30°C, от около 28°C до около 31°C, от около 28°C до около 32°C, от около 29°C до около 31°C, от около 29°C до около 32°C, от около 29°C до около 33°C, от 30°C до около 32°C, от 30°C до около 33°C, от около 31°C до около 33°C, от около 31°C до около 32°C, от около 30°C до около 33°C или от около 32°C до около 33°C.
Индукция
Как описано в настоящем документе далее, для контроля экспрессии рекомбинантного гена интерферона в экспрессионной конструкции могут быть применены индуцируемые промоторы. В случае производных или членов семейства промотора lac, например, промотора tac, вещество-эффектор представляет собой индуктор, такой как неметаболизируемый индуктор, подобный IPTG (изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид, также называемый "изопропилтиогалактозид"). В вариантах выполнения изобретения применяют производное lac промотора и экспрессию интерферона индуцируют добавлением IPTG до конечной концентрации, составляющей от около 0,08 мМ до 0,4 мМ, при плотности клеток, достигшей такого уровня, который определяется значением OD575 от около 80 до около 160.
В вариантах выполнения изобретения значение OD575 в момент индукции культуры составляет около 80, около 90, около 100, около 110, около 120, около 130, около 140, около 150, около 160, около 170 или около 180. В других вариантах выполнения изобретения значение OD575 составляет от около 80 до около 100, от около 100 до около 120, от около 120 до около 140, от около 140 до около 160. В других вариантах выполнения изобретения значение OD575 составляет от около 80 до около 120, от около 100 до около 140 или от около 120 до около 160. В других вариантах выполнения изобретения значение OD575 составляет от около 80 до около 140 или от около от 100 до 160. Плотность клеток может быть измерена другими способами и выражена в других единицах измерения, например, в клетках на единицу объема. Например, значение OD575 культуры Pseudomonas fluorescens, составляющее от около 80 до около 160, эквивалентно от около 8×1010 до около 1,6×1011 колониеобразующих единиц на мл или от 35 до 70 г/л сухого веса клеток. В вариантах выполнения изобретения плотность клеток в момент индукции культуры эквивалентна плотности клеток, которая определяется в настоящем документе поглощением при OD575, независимо от способа, используемого для определения плотности клеток, или единиц измерения. Специалист в данной области будет знать, как провести соответствующее перерасчет для любой клеточной культуры. В вариантах выполнения изобретения конечная концентрация IPTG в культуре составляет около 0,08 мМ, около 0,1 мМ, 0,2 мМ, около 0,3 мМ или около 0,4 мМ. В других вариантах выполнения изобретения конечная концентрация IPTG в культуре составляет от около 0,08 мМ до около 0,1 мМ, от около 0,1 мМ до около 0,2 мМ, от около 0,2 мМ до около 0,3 мМ, от около 0,3 мМ до около 0,4 мМ, от около 0,2 мМ до около 0,4 мМ или от около 0,08 мМ до около 0,2 мМ.
В вариантах выполнения изобретения интерферон экспрессируется индукцией промотора lac или его производного с помощью IPTG, лактозы или аллолактозы, способами, известными в данной области и описанными в литературе, например, в патенте США №7759109, "High density growth of T7 expression strains with auto-induction option", включенном сюда посредством отсылки в полном объеме.
В вариантах выполнения изобретения, в которых используется тип промотора, отличный от lac, как описано в настоящем документе и в литературе, могут быть применены другие индукторы или эффекторы.
После инициации индукции культуры выращивают в течение определенного периода времени, как правило, около 24 часов, в течение которого экспрессируется рекомбинантный белок интерферон. Клеточные культуры могут быть сконцентрированы центрифугированием, и культуральный осадок ресуспендирован в буфере или растворе, подходящем для последующей процедуры лизиса.
В вариантах выполнения изобретения клетки разрушают с помощью оборудования механического разрушения клеток при высоком давлении (которое является коммерчески доступным, например, микрофлюидизатор Microfluidics Microfluidizer, Constant Cell Disruptor, гомогенизатор Niro-Soavi или гомогенизатор APV-Gaulin). Любой подходящий способ лизиса клеток, известный в данной области, может быть применен для высвобождения нерастворимой фракции. Например, в вариантах выполнения изобретения могут быть применены химические и/или ферментативные реагенты лизиса клеток, такие как литический фермент, разрушающий клеточную стенку, и ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота). В способах по изобретению также рассматривается применение замороженных или ранее сохраненных культур. Перед лизисом культуры могут быть нормированы до одного и того же значения OD.
Центрифугирование осуществляют с помощью любого подходящего оборудования и способа. Центрифугирование культуры клеток или лизата в целях отделения растворимой фракции от нерастворимой фракции хорошо известно в данной области техники. Например, лизированные клетки могут быть центрифугированы при 20800×g в течение 20 минут (при 4°C), и супернатанты удалены вручную или с использованием систем автоматического удаления жидкости. Осадочную (нерастворимую) фракцию ресуспендируют в рН-буферном растворе, например, в фосфатном буферном растворе (PBS), рН 7,4. Ресуспендирование может быть осуществлено с помощью, например, оборудования, такого как лопастные насадки, соединенные с миксером, закрепленным сверху, цилиндрических магнитных мешалок, качающих шейкеров и т.д. "Растворимая фракция", т.е. растворимый супернатант, полученный после центрифугирования лизата, и "нерастворимая фракция", т.е. осадок, полученный после центрифугирования лизата, образуются в результате лизиса и центрифугирования культур. Данные две фракции могут также называться "первая растворимая фракция" и "первая нерастворимая фракция", соответственно.
Возможно получить растворимый IFN-β с использованием способов экстракции в соответствии с изобретением из экспрессионных культур, полученных из культур, которые были выращены в условиях, где значения рН и оптической плотности (OD) в момент индукции не контролируются строго (см., например, пример 2). Оптимизация условий роста, как описано в настоящем документе, приводит к существенному увеличению продукции растворимого IFN-β.
Способ экстракции в неденатурирующих условиях
Было обнаружено, что большие количества растворимого белка интерферона могут быть получены из нерастворимой фракции с помощью способов экстракции в неденатурирующих условиях по настоящему изобретению.
Неденатурирующие условия экстракции, определяемые как особенно применимые для получения больших количеств растворимого рекомбинантного белка интерферона, содержат: мягкий детергент в неденатурирующей концентрации, например, Zwittergent 3-14 (от 0,5 до 2% масс/об.); хаотропный агент, например, мочевину (от 0 до 2М), и космотропную соль, например, NaCl (от 0 до 2М), в рН-буфере со значениями рН от 6,5 до 8,5 и концентрацию твердых веществ, составляющую от 5 до 20% масс/об.
После получения растворимой фракции и нерастворимой фракции, как описано выше, растворимый рекомбинантный белок интерферон экстрагируют из нерастворимой фракции инкубацией ресуспендированной нерастворимой фракции при неденатурирующих условиях экстракции, описанных в настоящем документе. После инкубации экстрагированную смесь центрифугируют для получения "супернатанта экстракта" (растворимая фракция супернатанта, полученная после экстракции и содержащая растворенный рекомбинантный белок) и "осадка экстракта" (нерастворимая фракция супернатанта, полученная после экстракции). Данные фракции также могут называться "вторая растворимая фракция" и "вторая нерастворимая фракция".
Условия экстракции
Множество различных параметров условий экстракции было оценено по их воздействию на количество растворимого белка, наблюдаемое в супернатанте экстракта, как описано в примере 3 настоящего документа. Было установлено, что растворимый белок интерферон обнаруживался, когда условия экстракции содержали любой из целого ряда различных детергентов при различных концентрациях, а также при варьировании других параметров. Тем не менее, некоторые параметры оказывали особенно сильное воздействие на количество произведенного растворимого белка.
В частности, условия экстракции, содержащие цвиттерионные детергенты (Zwittergents), давали лучшие выходы растворимых белков. В частности, применение цвиттерионных детергентов Zwittergent 3-08, Zwittergent 3-10, Zwittergent 3-12 и особенно Zwittergent 3-14 приводило к самым высоким выходам. N-лаурилсаркозин (NLS) давал значительный выход, однако на основе анализа сродства (связывание на аффинной колонке с Sepharose blue) было установлено, что полученный растворимый белок неактивен. Таким образом, термин "мягкие детергенты" для целей настоящего изобретения не включает в себя N-лаурилсаркозин.
Детергенты были испытаны при неденатурирующих концентрациях. Было установлено, что концентрация Zwittergent 3-14 (3-(N,N-диметилмиристиламмонио) пропансульфонат), составляющая по меньшей мере 0,5% (масс/об.), и предпочтительно 1%, что значительно выше критической концентрации мицеллообразования (которая составляет 0,01%), обеспечивает наиболее эффективную экстракцию растворимого белка интерферона. Таким образом, для применения в условиях экстракции по изобретению может рассматриваться применение неденатурирующих концентраций мягких детергентов, в частности, цвиттерионных детергентов, в особенности, Zwittergent 3-08, Zwittergent 3-10, Zwittergent 3-12 и Zwittergent 3-14, в особенности, Zwittergent 3-14, ноне NLS.
В других вариантах выполнения настоящего изобретения неденатурирующие условия экстракции содержат концентрацию Zwittergent 3-14, составляющую от около 0,5% до около 2% (масс/об.). В вариантах выполнения изобретения концентрация Zwittergent 3-14 составляет от около 0,5% до около 1%, от около 1% до около 1,5%, от около 1,5% до около 2% или от около 1% до около 2% масс/об. В некоторых вариантах выполнения изобретения концентрация Zwittergent 3-14 составляет около 0,5%, около 0,6%, около 0,7%, около 0,8%, около 0,9%, около 1,0%, около 1,1%, около 1,2%, около 1,3%, около 1,4%, около 1,5%, около 1,6%, около 1,7%, около 1,8%, около 1,9% или около 2,0% масс/об.
В других вариантах выполнения изобретения неденатурирующие условия экстракции содержат концентрации Zwittergent 3-08, Zwittergent 3-10 или Zwittergent 3-12, составляющие от около 0,5% до около 2% (масс/об.). В вариантах выполнения изобретения концентрация (масс/об.) Zwittergent 3-08, Zwittergent 3-10 или Zwittergent 3-12 составляет от около 0,5% до около 1%, от около 1% до около 1,5%, от около 1,5% до около 2% или от около 1% до около 2%. В некоторых вариантах выполнения изобретения концентрация (масс/об.) Zwittergent 3-08, Zwittergent 3-10 или Zwittergent 3-12 составляет около 0,5%, около 0,6%, около 0,7%, около 0,8%, около 0,9%, около 1,0%, около 1,1%, около 1,2%, около 1,3%, около 1,4%, около 1,5%, около 1,6%, около 1,7%, около 1,8%, около 1,9% или около 2,0%.
Мягкий детергент не вызывает разворачивания белка при низких концентрациях, например, 2% или меньше. Например, SDS и NLS, как правило, считаются сильными детергентами, так как они могут денатурировать белки при таких концентрациях. Неденатурирующая концентрация указывает на концентрацию реагента, при которой белки не денатурируются. Белки, которые не денатурируются во время обработки, не требуют рефолдинга.
В вариантах выполнения изобретения неденатурирующие условия экстракции по настоящему изобретению содержат от около 0,5 до около 2% Zwittergent 3-14; от около 0 до около 2 М мочевины; от около 0 до около 2 М NaCl; и причем значение рН составляет от около 6,5 до около 8,5.
В следующей таблице перечислены примеры распространенных детергентов, в том числе, ионных, неионных и цвиттер-ионных детергентов, и их свойства. Важной характеристикой детергента является его критическая концентрация мицеллообразования (CMC), которая имеет отношение к его способности солюбилизовать белок, а также легкость последующего удаления детергентов из белковых растворов.
Дополнительно было отмечено, что когда неденатурирующие условия экстракции содержали комбинацию хаотропного агента, мочевины, космотропной соли, NaCl, Zwittergent 3-14 и значения рН, поддерживаемого с помощью рН-буфера и попадающего в соотвествующий диапазон, выход после экстракции увеличивался в несколько раз, по сравнению с использованием только Zwittergent 3-14 (см. пример 3).
Хаотропные агенты разрушают трехмерную структуру белка или нуклеиновой кислоты, вызывая денатурацию. В вариантах выполнения изобретения неденатурирующие условия экстракции содержат низкие, неденатурирующие концентрации хаотропных агентов, например, мочевины или гидрохлорида гуанидина. В вариантах выполнения изобретения неденатурирующие условия экстракции содержат мочевину в концентрации от около 0,5 М до около 2 М или выше. Авторы наблюдали, что 6 М мочевина денатурирует IFN-β. Как правило, неденатурирующие концентрации мочевины и гидрохлорида гуанидина находятся ниже 3 М. В вариантах выполнения изобретения неденатурирующие условия экстракции содержат мочевину в концентрации от около 0,5 до 1 М, от около 1 до около 1,5 М, приблизительно от около 1,5 до около 2 М, от около 1 до около 2 М, около 0,5 М, около 0,6 М, около 0,7 М, около 0,8 М, около 0,9 М, около 1,0 М, около 1,1 М, около 1,2 М, около 1,3 М, около 1,4 М, около 1,5 М, около 1,6 М, около 1,7 М, около 1,8 М, около 1,9 М или около 2.0 M. В других вариантах выполнения изобретения условия экстракции содержат гуанидин гидрохлорид в концентрации от 0,5 до 2 М. В вариантах выполнения изобретения условия экстракции содержат гуанидин гидрохлорид в концентрации от 0,5 до 1 М, от 1 до 1,5 М, от 1,5 до 2 М, от 1 до 2 М, 0,5 М, около 0,6 М, около 0,7 М, около 0,8 М, около 0,9 М, около 1,0 М, около 1,1 М, около 1,2 М, около 1,3 М, 1,4 М, около 1,5 М, около 1,6 М, около 1,7 М, около 1,8 М, около 1,9 М или около 2.0 М.
Космотропные соли вносят вклад в стабильность и структуру взаимодействий между молекулами воды. Космотропные вещества благоприятствуют взаимодействию молекул воды, которое также стабилизирует межмолекулярные взаимодействия в макромолекулах, таких как белки. Любой подобный подходящий агент, как известно в данной области техники, может быть применен в условиях экстракции по настоящему изобретению. В вариантах выполнения изобретения неденатурирующие условия экстракции содержат космотропную соль, выбранную из NaCl, KCl и (NH4)2SO4. В некоторых вариантах выполнения изобретения NaCl присутствует в концентрации от около 0,15 до около 2М. В вариантах выполнения изобретения NaCl присутствует в условиях экстракции при концентрации от около 0,15 до около 0,5 М, от около 0,5 до около 0,75 М, от около 0,75 М до около 1 М, от около 1 М до около 1,25 М, от около 1,25 М до около 1,5 М, от около 1,5 М до около 1,75 М, от 1,75 М до около 2 М, от около 0,15 М до около 1 М, от около 1 М до около 1,5 M, от около 1,5 М до около 2 М, от около 1 М до около 2 М, около 0,15 М, около 0,25 М, около 0.5 М, около 0,6 М, около 0,7 М, около 0,8 М, около 0,9 М, около 1,0 М, около 1,1 М, около 1,2 М, около 1,3 М, около 1,4 М, около 1,5 М, около 1,6 М, около 1,7 М, около 1,8 М, около 1,85 М, около 1,9 М или около 2,0 М.
В других вариантах выполнения изобретения КС1 присутствует в неденатурирующих условиях экстракции в концентрации от около 0,15 до около 0,5 М, от около 0,5 до около 0,75 М, от около 0,75 М до около 1 М, от около 1 М до около 1,25 М, от около 1,25 М до около 1,5 М, от около 1,5 М до около 1,75 М, от 1,75 М до около 2 М, от около 0,15 М до около 1 М, от около 1 М до около 1,5 М, от около 1,5 М до около 2 М, от около 1 М до около 2 М, около 0,15 М, около 0,25 М, около 0.5 М, около 0,6 М, около 0,7 М, около 0,8 М, около 0,9 М, около 1,0 М, около 1,1 М, около 1,2 М, около 1,3 М, около 1,4 М, около 1,5 М, около 1,6 М, около 1,7 М, около 1,8 М, около 1,85 М, около 1,9 М или около 2,0 М.
В других вариантах выполнения изобретения (NH4)2SO4 присутствует в неденатурирующих условиях экстракции в концентрации от около 0,15 до около 0,5 М, от около 0,5 до около 0,75 М, от около 0,75 М до около 1 М, от около 1 М до около 1,25 M, от около 1,25 М до около 1,5 М, от около 1,5 М до около 1,75 М, от 1,75 М до около 2 М, от около 0,15 М до около 1 М, от около 1 М до около 1,5 М, от около 1,5 М до около 2 М, от около 1 M до около 2 М, около 0,15 М, около 0,25 М, около 0.5 М, около 0,6 М, около 0,7 М, около 0,8 М, около 0,9 М, около 1,0 М, около 1,1 М, около 1,2 М, около 1,3 М, около 1,4 М, около 1,5 М, около 1,6 М, около 1,7 М, около 1,8 М, около 1,85 М, около 1,9 М или около 2,0 М.
Условия экстракции оказались наиболее эффективными при значениях рН, поддерживаемом в пределах от 6,5 до 8,5. Применимыми рН-буферами являются рН-буферы, которые рекомендованы в текстах по стандартной очистке белков (например, Protein Purification: Principles and Practice, by Robert Scopes (Springer, 1993)) и могут использоваться в данном случае, в том числе Трис, Bis-Tris, фосфат, цитрат, ацетат, глицин, диэтаноламин, 2-амино-2-метил-1,3-пропандило, триэтаноламин, имидазол, гистидин, пиридин и т.д. Многие рН-буферы были описаны в литературе и имеются в продаже. В вариантах выполнения изобретения значения рН соотвествующие неденатурирующим условиям экстракции составляют около 6,5, около 6,6, около 6,7, около 6,8, около 6,9, около 7,0, около 7,1, около 7,2, около 7,3, около 7,4, около 7,5, около 7,6, около 7,8, около 7,9, около 8,0, около 8,1, около 8,2, около 8,3, около 8,4 или около 8,5. В других вариантах выполнения изобретения значения рН составляют от около 6,5 до около 6,8, от около 6,6 до около 6,9, от около 6,7 до около 7,0, от около 6,8 до около 7,1, от около 6,9 до около 7,2, от около 7,0 до около 7,3, от около 7,1 до около 7,4, от около 7,2 до около 7,5, от около 7,3 до около 7,6, от около 7,4 до около 7,7, от около 7,5 до около 7,8, от около 7,6 до около 7,9, от около 7,8 до около 8,1, от около 7,9 до около 8,2, от около от 8,0 до 8,3, от около 8,1 до 8,4 или от около 8,2 до около 8,5. В других вариантах выполнения изобретения значения рН составляют от около 6,5 до около 7,0, от около 7,0 до около 7,5 или от около 7,5 до около 8,0.
Концентрация твердых веществ в неденатурирующих условиях экстракции также варьировалась. Данный параметр представляет количество твердого материала в инкубационной смеси экстракта. Концентрация твердых веществ может быть определена взвешиванием влажного осадка (например, нерастворимой фракции) и сравнением данной массы с общей массой экстракционной смеси. Конкретные концентрации твердых веществ можно получить концентрированием или разбавлением нерастворимой фракции. Высокие выходы после экстракции наблюдали в целом ряде концентраций твердых веществ, составляющих от 5% до 40% (масс/об.). В вариантах выполнения изобретения твердые вещества в неденатурирующих условиях экстракции присутствуют в концентрации (масс/об.), составляющей около 5%, около 7,5%, около 10%, около 12,5%, около 15%, около 17,5%, около 20%, около 22,5%, около 25%, около 27,5%, около 30%, около 32,5%, около 35%, около 37,5% или около 40%. В других вариантах выполнения изобретения изобретения твердые вещества в неденатурирующих условиях экстракции присутствуют в концентрации (масс/об.), составляющей от около 5% до около 7,5%, от около 7,5% до около 10%, от около 10% до около 12,5%, от около 12,5% до около 15%, от около 15% до около 17,5%, от около 17,5% до около 20%, от около 20% до около 22,5%, от около 22,5% до около 25%, от около 25% до около 27,5%, от около 27,5% до около 30%, от около 30% до около 32,5%, от около 32,5% до около 35%, от около 35% до около 37,5%, от около 37,5% до около 40%, от около 5% до около 10%, от около 10% до около 15%, от около 15% до около 20%, от около 20% до около 25%, от около 25% до около 30%, от около 35% до около 40%, от около 5% до около 15%, от около 5% до около 25%, от около 5% до около 30%, от около 5% до около 35%, от около 10% до около 20%, от около 20% до около 30%, от около 30% до около 40%, от около 5% до около 20% или от около 20% до около 40%.
В вариантах выполнения изобретения способы экстракции по изобретению объединены с методиками одновременного обогащения, такими как адсорбция, для дополнительного повышения выхода белка.
Растворенный белок может быть выделен или очищен от другого белка и клеточных обломков, например, центрифугированием и/или хроматографией, такой как гель-фильтрация, анионобменная или катионобменная хроматография, гидрофобная хроматография или аффинная хроматография. Интерфероны
Человеческие интерфероны подразделяют на три основных типа. Интерферон I типа: интерфероны (IFN) I типа связываются с определенным рецепторным комплексом на клеточной поверхности, известным как рецептор IFN-α (IFNAR), который состоит из цепей IFNAR1 и IFNAR2. Человеческие интерфероны I типа включают в себя IFN-α, IFN-β, IFN-κ и IFN-ω и IFN-ε. Интерферон II типа: интерфероны II типа (человеческий IFN-γ) связываются с IFNGR. Интерферон III типа: интерфероны III типа передают сигнал через рецепторный комплекс, состоящий из IL10R2 (также называемого CRF2-4) и IFNLR1 (также называемого CRF2-12).
Полагают, что человеческий интерферон I типа связывается с субъединицами двух рецепторов, IFNAR-1 и IFNAR-2, широко представленными на клеточной поверхности различных типов клеток. Вовлечение лиганда приводит к индукции фосфорилирования тирозинкиназами TYK2 и JAK-1, связанными с IFNAR-1 и IFNAR-2, соответственно. После фосфорилирования белки STAT отделяются от рецептора и образуют гомодимеры, а также гетеродимеры. После отделения димеры STAT ассоциируются с регуляторным фактором интерферонов-9 (interferon Responsive Factor 9 ((IRF-9)), который является ДНК-связывающим белком, образуя комплекс, называемый IFN-стимулируемый генный фактор-3 (IFN-stimulated gene factor-3 (ISGF-3)), который перемещается в ядро. Далее комплекс ISGF-3 связывается с ДНК-элементом, находящимся против хода транскрипции всех IFN-индуцируемых генов. Интерфероны I типа подробно описаны в литературе, например, в патенте США №7625555, "Recombinant human interferon-like proteins", включенном сюда посредством отсылки.
Интерфероны I типа имеют существенное структурное сходство, о чем свидетельствуют их последовательности и их общая способность связывания с рецептором. Согласно Kontsek, Р., 1994, "Human type I interferons: structure and function," Acta Virol. 38(6):345-60, включенной сюда посредством отсылки, человеческие интерфероны I типа (в настоящий момент известны 13) характеризуются общей степенью сходства последовательностей в 20%, что определяет идентичные вторичный и третичный фолдинг полипептидов. Дополнительно в публикации Kontsek сообщается, что трехмерные модели предполагают, что глобулярная структура интерферонов I типа состоит из связки пяти а-спиралей, которые могли бы образовать два полипептидных домена. Дисульфидная связь Cys 29-Cys 139 стабилизирует оба домена в биологически активной конфигурации. Полагают, что две консервативных гидрофильных области, связанные с аминокислотами (аа) 30-41 и 120-145, составляют основную структуру сайта узнавания рецептора в интерферонах I типа, и предполагается, что различные спектры биологических эффектов у человеческих интерферонов I типа обусловлены небольшими различиями последовательностей в сегментах аа 30-41 и 120-145 и вариабельными гидрофильными областями аа 23-26, 68-85 и 112-121. В более позднем сообщении Oritani и др., 2001, "Type I interferons and limitin: а comparison of structures, receptors, and functions," Cytokine Growth Factor Rev 12(4):337-48, включенном сюда посредством отсылки, описываются члены семейства IFN-α, IFN-β, IFN-pi, и IFN-tau. В документе также сообщается, что IFN-α и IFN-β обладают глобулярной структурой, состоящей из пяти a-спиралей, и обсуждается сравнительный анализ последовательностей, прототипная трехмерная структура, анализ с использованием моноклональных антител, а также конструирование гибридных молекул и сайт-направленный мутагенез.
Предусматривается продукция любого белка интерферона I типа с использованием способов по настоящему изобретению. Белки интерфероны I типа, которые могут быть получены с использованием способов по изобретению, включают, но не ограничиваются ими, человеческий IFN-α 2а и IFN-α 2b, человеческий IFN-α 1, человеческий IFN-κ (например, NM_020124, ААК63835, и описанный LaFleur, et al., 2001, "Interferon-kappa, a novel type I interferon expressed in human keratinocytes", J. Biol. Chem. 276 (43), 39765-39771, включено сюда посредством отсылки) и человеческий IFN-co (например, NM_002177, NP_002168, и описанный в патенте США №7470675, "Methods for treating cancer using interferon-ω-expressing polynucleotides," включено сюда посредством отсылки в полном объеме). Также предполагается продукция IFN-τ с помощью способов по изобретению. Аминокислотные последовательности и последовательности нуклеиновых кислот являются общедоступными, например, из GenBank.
Были описаны четырнадцать подтипов белков IFN-α: IFNA1, IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFNA8, IFNA10, IFNA13, IFNA14, IFNA16, IFNA17, IFNA21. IFN-α производится синтетически в качестве терапевтического агента, как пэгилированный интерферон альфа-2а и пэгилированный интерферон альфа-2b.
IFN-β (IFNB1 или IFN-β 1) представляет собой основной подтип β (см., например, запись GenBank NP002167.1, дающую последовательность зрелого пептида). Betaseron является аналогом человеческого IFN-β, в котором с помощью генно-инженерных способов произвели в положении 17 замену цистеина на серии, и известен как IFN-β 1b C17S (описанный в патенте США №4588585, "Human recombinant cysteine depleted interferon-β muteins," включено сюда посредством отсылки). Молекула представляет собой небольшой полипептид из 165 аминокислот, с одной дисульфидной связью, и производится как негликозилированный белок.
IFN-τ описан и последовательности IFN-τ раскрыты, например, в патенте США №7214367, "Orally-administered interferon-tau compositions and methods,", включенном сюда посредством отсылки в полном объеме.
Несколько интерферонов I типа утверждено FDA для применения при лечении заболевания у людей. В последующей таблице перечислены примеры препаратов интерферонов I типа. В вариантах выполнения изобретения любой из данных препаратов производят с использованием способов, как заявлено или описано в настоящем документе.
В вариантах выполнения изобретения варианты и модификации белков интерферонов I типа продуцируют с использованием способов по настоящему изобретению. Например, варианты IFN-β описаны в патенте США №6531122 "Interferon-β variants and conjugates" и в патенте США №7625555, оба включены сюда посредством отсылки. Конъюгаты включают в себя пегилированные интерфероны I типа, например, пегилированные агенты, приведенные в таблице 4, и интерфероны, связанные с непептидными фрагментами. Ожидается, что способы по изобретению будут применимы для всех интерферонов I типа из-за структурного сходства последних. Было найдено, что некоторые белки, не являющиеся структурно близкими, например, человеческий GCSF, служат плохими кандидатами для производства с помощью способов по настоящему изобретению. Когда GCSF продуцировали и экстрагировали с помощью способов, описанных в настоящем документе, то в виде растворимого белка экстрагировали менее чем 5% от количества белка GCSF в нерастворимой фракции (данные не представлены).
В целом, по отношению к аминокислотной последовательности, понятие "модификация" включает в себя замены, инсерции, удлинения, делеции и дериватизации в отдельности или в комбинации. В некоторых вариантах выполнения изобретения пептиды могут включать в себя одну или более модификаций "несущественного" аминокислотного остатка. В данном контексте "несущественный" аминокислотный остаток представляет собой остаток, который может быть изменен, например, удален или заменен, в новой аминокислотной последовательности без потери или существенного уменьшения активности (например, агонистическая активность) пептида (например, пептид-аналог). В некоторых вариантах выполнения изобретения пептиды могут включать в себя одну или более модификаций "существенного" аминокислотного остатка. В данном контексте "существенный" аминокислотный остаток представляет собой остаток, при изменении которого, например, удалении или замене, активность упомянутого пептида в новой аминокислотной последовательности существенно уменьшается или теряется. В таких вариантах выполнения изобретения, где изменен существенный аминокислотный остаток, модифицированный пептид может обладать активностью интерферона I типа, представляющего интерес, в способах по изобретению. Замены, инсерции и делеции могут находиться на N-терминальном или С-терминальном конце или могут находиться во внутренних участках белка. К примеру, белок может включать в себя 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более замен, расположенных как друг за другом, так и по длине всей пептидной молекулы. Отдельно или в сочетании с заменами, пептид может включать в себя 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более инсерций, опять же расположенных как друг за другом, так и по длине всей пептидной молекулы. Отдельно или в комбинации с заменами и/или инсерциями, пептид может также включать в себя 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше делеций, опять же расположенных как друг за другом, так и по длине всей пептидной молекулы. Пептид может также включать в себя 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более аминокислотных дополнений отдельно или в комбинации с заменами, инсерциями и/или делециями.
Замены включают в себя консервативные аминокислотные замены. "Консервативная аминокислотная замена" представляет собой замену, при которой аминокислотный остаток заменен на аминокислотный остаток, имеющий аналогичную боковую цепь или физико-химические характеристики (например, электростатические, связанные со способностью образовывать водородные связи, изостерические, гидрофобные свойства).
Аминокислоты могут быть как встречающимися в природе, так и имеющими неприродное (неестественное) происхождение. Семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи, известны в данной области техники. Данные семейства включают в себя аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислыми боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серии, треонин, тирозин, метионин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, триптофан), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Замены могут также включать в себя неконсервативные изменения.
Способы выбора оптимальных условий экстракции
В вариантах выполнения настоящего изобретения, результаты статистического анализа, как показано на фигуре 4 В, применяют для дальнейшей оптимизации условий экстракции в пределах диапазонов значений представленных параметров. Ожидается, что высокий уровень продукции растворимого белка всех интерферонов I типа будет наблюдаться при осуществлении изобретения с использованием любых значений в указанных пределах. Тем не менее, специалист в данной области может примененить способ, представленный фигурой 4 В, для оптимизации условий экстракции, с тем чтобы удовлетворить имеющуюся потребность.
Оценка продукта
Выход белка
Выход белка в нерастворимых и растворимых фракциях, как описано в настоящем документе, может быть определен способами, известными специалистам в данной области, например, капиллярным гель-электрофорезом (CGE) и Вестерн-блоттингом.
Применяемые меры выхода белка включают в себя, например, количество рекомбинантного белка на объем культуры (например, грамм или миллиграмм белка/литр культуры), процент или долю рекомбинантного белка, измеряемые в нерастворимом осадке, полученном после лизиса (например, количество рекомбинантного белка в экстракте супернатанта/количество белка в нерастворимой фракции), процент или долю активного белка (например, количество активного белка/количество белка, взятого для анализа), процент или доля от общего клеточного белка (total cell protein, tcp), количество белка/клетку и процент к сухой биомассе. В вариантах выполнения изобретения мера выхода белка, как описано в настоящем документе, основана на количестве растворимого белка или количестве активного белка или обоих полученных значениях.
В вариантах выполнения изобретения способы настоящего изобретения могут быть применены для получения выхода экстрагированного рекомбинантного белка, составляющего от около 0,3 грамма на литр до около 10 граммов на литр. В некоторых вариантах выполнения изобретения выход экстрагированного рекомбинантного белка составляет от около 0,3 грамма на литр до около 1 грамм на литр, от около 1 грамм на литр до 2 граммов на литр, от около 2 граммов на литр до около 3 грамма на литр, от около 3 граммов на литр до около 4 грамма на литр, от около 4 граммов на литр до около 5 граммов на литр, от около 5 граммов на литр до около 6 граммов на литр, от около 6 граммов на литр до около 7 граммов на литр, от около 7 граммов на литр около 8 граммов на литр, от около 8 граммов на литр до около 9 граммов на литр или от около 9 граммов на литр до около 10 граммов на литр. В вариантах выполнения изобретения экстрагированной выход белка составляет от около 1 грамма на литр до около 3 грамма на литр, около 2 граммов на литр до около 4 грамма на литр, около 3 граммов на литр до около 5 граммов на литр, около 4 граммов на литр около 6 граммов на литр, около 5 граммов на литр до около 7 граммов на литр, около 6 граммов на литр до около 8 граммов на литр, около 7 граммов на литр до около 9 граммов на литр или около 8 граммов на литр до 10 граммов на литр. В вариантах выполнения изобретения выход экстрагированного белка составляет от около 0,5 грамма на литр около 4 граммов на литр, от 1 грамм на литр до около 5 граммов на литр, от 2 грамма на литр до около 6 граммов на литр, от около 3 граммов на литр до около 7 грамм на литр, от около 4 граммов на литр до около 8 граммов на литр, от около 5 граммов на литр до около 9 граммов на литр или от около 6 граммов на литр до около 10 граммов на литр. В вариантах выполнения изобретения выход экстрагированного белка составляет от около 0,5 грамма на литр до около 5 граммов на литр, от около 1 грамм на литр до около 6 граммов на литр, от около 2 граммов на литр до около 7 граммов на литр, от около 3 граммов на литр до 8 граммов на литр, от около 4 граммов на литр до около 9 граммов на литр или от около 5 граммов на литр до около 10 граммов на литр.
В вариантах выполнения изобретения количество рекомбинантного белка интерферона, обнаруженное в экстрагированной фракции супернатанта, составляет от около 10% до около 95% количества рекомбинантного белка интерферона, обнаруженного в нерастворимой фракции. В вариантах вариантах выполнения изобретения данное количество составляет около 10%, около 15%, около 20%, около 25%, около 30%, около 35%, около 40%, около 45%, около 50%, около 55%, около 60%, около 65%, около 70%, около 75%, около 80%, около 85%, около 90% или около 95%. В вариантах выполнения изобретения данное количество составляет от около 10% до около 20%, от 20% до около 50%, от около 25% до около 50%, от около 25% до около 50%, от около 25% до около 95%, от около 30% до около 50%, от около 30% до около 40%, от около 30% до около 60%, от около 30% до около 70%, от около 35% до около 50%, от около 35% до около 70%, от около 35% до около 75%, от около 35% до около 95%, от около 40% до около 50%, от около 40% до около 95%, от около 50% до около 75%, от около 50% до около 95% или от около 70% до около 95%.
Выход белка, измеренный в неэкстрагированной нерастворимой фракции, как правило, выше, чем в супернатанте экстракта, так как материал теряется во время процедуры экстракции. Выходы из культур, полученных ферментацией,, как правило, выше, чем из культур НТР (High-throughput protein) малого объема.
"Процент от общего клеточного белка" представляет собой количество белка или полипептида в клетке-хозяине в виде процента от агрегированного клеточного белка. Определение процента от общего клеточного белка хорошо известно в данной области техники.
В вариантах выполнения изобретения количество белка интерферона, обнаруженное в полученной экстрагированной фракции супернатанта, составляет от около 1% до около 75% от общего клеточного белка. В некоторых вариантах выполнения изобретения полученный рекомбинантный белок составляет около 1%, около 2%, около 3%, около 4%, около 5%, около 10%, около 15%, около 20%, около 25%, около 30%, около 35%, около 40%, около 45%, около 50%, около 55%, около 60%, около 65%, около 70%, около 75%, от около 1% до около 5%, от около 1% до около 10%, от около 1% до около 20%, от около 1% до около 30%, от около 1% до около 40%, от около 1% до около 50%, от около 1% до около 60%, от около 1% до около 75%, моколо 2% до около 5%, от около 2% до около 10%, от около 2% до около 20%, от около 2% до около 30%, от около 2% до около 40%, от около 2% до около 50%, от около 2% до около 60%, от около 2% до около 75%, от около 3% до около 5%, от около 3% до около 10%, от около 3% до около 20%, от около 3% до около 30%, от около 3% до около 40%, от около 3% до около 50%, от около 3% до около 60%, от около 3% до около 75%, от около на 4% до около 10%, от около 4% до около 20%, от около 4% до 30%, от около 4% до около 40%, от около 4% до около 50%, от около 4% до около 60%, от около 4% до около 75%, от около 5% до около 10%, от около 5% до около 20%, от около 5% до около 30%, от около 5% до около 40%, от около 5% до около 50%, от около 5% до около 60%, от около 5% до около 75%, от около 10% до около 20%, от около 10% до около 30%, от около 10% до около 40%, от около 10% до около 50%, от около 10% до около 60%, от около 10% до около 75%, от около 20% до около 30%, от около 20% до около 40%, от около 20% до около 50%, от около 20% до около 60%, от около 20% до около 75%, от около 30% до около 40%, от около 30% до около 50%, от около 30% до около 60%, от около 30% до около 75%, от около 40% до около 50%, от около 40% до около 60%, от около 40% до около 75%, от около 50% до около 60%, от около 50% до около 75%, от около 60% до 75% или от около 70% до около 75% от общего клеточного белка.
Растворимость и активность
"Растворимость" и "активность" белка, хотя и являются связанными качествами, как правило, определяются различными способами. Растворимость белка, в частности, гидрофобного белка, указывает на то, что гидрофобные аминокислотные остатки неправильно расположены на поверхности свернутого белка. Активность белка, которая может быть оценена с использованием различных способов, например, как описано ниже, является еще одним показателем правильной конформации белка. "Растворимый, активный или обладающий обоими качествами" для целей настоящего изобретения относится к белку, который определяется как растворимый, активный или как растворимый, так и активный способами, известными специалистам в данной области.
Анализы активности интерферона
Анализы оценки активности белка интерферона известны в данной области и включают в себя анализы активности связывания, которые измеряют связывание интерферона со стандартным лигандом, например, с колонкой с Blue sepharose или с колонкой, содержащей определенное антитело.
Биологическая активность интерферонов может быть количественно оценена с помощью известных тестов, многие из которых имеются в продаже в виде комплектов. Было показано, что большинство или все виды интерферона вызывают аналогичное спектр биологических активностей в реактивных клетках in vitro, несмотря на существование различных рецепторов для интерферонов I типа и интерферонов II типа. Биологические активности, индуцированные IFN, включают в себя противовирусную активность, которая опосредуется через рецепторы клеток и зависит от активации сигнальных путей, экспрессии специфических генных продуктов и развития антивирусных механизмов.
Чувствительность клеток к IFN-опосредованной противовирусной активности варьирует и зависит от ряда факторов, включая тип клеток, экспрессию рецепторов IFN и расположенных в направлении по ходу транскрипции элементов эффекторного ответа, эффективность противовирусных механизмов и тип вируса, примененного для инфицирования клеток.
Анализы биологической активности включают в себя, например, анализы цитопатического эффекта (CPE), анализы противовирусной активности, анализы, которые измеряют ингибирование пролиферации клеток, регуляцию функциональной клеточной активности, регуляцию клеточной дифференциации и иммуномодуляции. Анализы активности репортерных генов включают в себя анализ на основе оценки активности репортерного гена люциферазы в клетке, описанный в настоящем документе в примерах.
В анализе активности репортерного гена промоторная область гена, реагирующего на IFN, связана с гетерологичным репортерным геном, например, люциферазы светлячка или щелочной фосфатазы, и трансфицирована в IFN-чувствительную клеточную линию. При воздействии IFN стабильно трансфицированные клеточные линии увеличивают экспрессию продукта репортерного гена в прямой зависимости от дозы IFN, причем считывание является мерой ферментативного действия данного продукта. Многие средства и комплекты для анализа активности имеются в продаже. Биологические анализы для интерферонов описаны, например, у Meager A, "Biological assays for interferons," 1 Mar 2002, J. Immunol. Methods 261(1-2):21-36, включено сюда посредством отсылки.
В вариантах выполнения изобретения активность представлена % активного белка в супернатанте экстракта по сравнению с общим анализируемым количеством. Данная величина основана на количестве белка, определенного анализом как активный, по отношению к общему количеству белка, взятого для анализа. В других вариантах выполнения изобретения активность представлена уровнем % активности белка по сравнению со стандартным, например, нативным белком. Данная величина основана на количестве активного белка в образце экстракта супернатанта по отношению к количеству активного белка в стандартном образце (причем в анализе используют такое же количество белка из каждого образца).
В вариантах выполнения изобретения от около 40% до около 100% рекомбинантного белка интерферона определяется как активный. В вариантах выполнения изобретения около 40%, около 50%, около 60%, около 70%, около 80%, около 90% или около 100% рекомбинантного белка интерферона определяется как активный. В вариантах выполнения изобретения от около 40% до около 50%, от около 50% до около 60%, от около 60% до около 70%, от около 70% до около 80%, от около 80% до около 90%, от около 90% до около 100%, от около 50% до около 100%, от около 60% до около 100%, от около 70% до около 100%, от около 80% до около 100%, от около 40% до около 90%, от около 40% до около 95%, от около 50% до около 90%, от около 50% до около 95%, от около 50% до около 100%, от около 60% до около 90%, от около 60% до около 95%, от около 60% до около 100%, от около 70% до около 90%, от около 70% до около 95%, от около 70% до около 100% или от около 70% до около 100% рекомбинантного белка интерферона определяется как активный.
В других вариантах выполнения изобретения от около 75% до около 100% рекомбинантного белка интерферона определяется как активный. В вариантах выполнения изобретения от около 75% до около 80%, от около 75% до около 85%, от около 75% до около 90%, от около 75% до около 95%, от около 80% до около 85%, от около 80% до около 90%, от около 80% до около 95%, от около 80% до около 100%, от около 85% до около 90%, от около 85% до около 95%, от около 85% до около 100%, от около 90%) до около 95%, от около 90% до 100% или от около 95% до около 100% рекомбинантного белка интерферона определяется как активный.
Системы экспрессии
Способы экспрессии гетерологичных белков, в том числе применимых регуляторных последовательностей (например, промоторов, лидеров секреции и сайтов связывания рибосом), в клетках-хозяевах Pseudomonas, а также в клетках-хозяевах, применимых в способах по настоящему изобретению, описаны, например, в патентной заявке США публикационный №2008/0269070 и в патентной заявке США серийный №12/610, 207, обе под названием " Method for Rapidly Screening Microbial Hosts to Identify Certain Strains with Improved Yield and/or Quality in the Expression of Heterologous Proteins", в патентной заявке США публикационный №2006/0040352, "Expression of Mammalian Proteins in Pseudomonas Fluorescens", и в патентной заявке США публикационный №2006/0110747, "Process for Improved Protein Expression by Strain Engineering," все включены сюда посредством отсылки во всей их полноте. Данные публикации также описывают бактериальные хозяйские штаммы, применимые в практике способов по изобретению, которые были разработаны для сверхэкспрессии модуляторов фолдинга или когда было необходимо введение мутаций протеаз, для того чтобы увеличить экспрессию гетерологичного белка. Лидерные последовательности подробно описаны в патентной заявке США публикационный №2008/0193974, "Bacterial leader sequences for increased expression", и в патентной заявке США публикационный №2006/0008877, "Expression systems with Sec-secretion", оба включены сюда посредством отсылки во всей их полноте, а также в патентной заявке США серийный №12/610,207.
Промоторы
Промоторы, применимые в соответствии с настоящим изобретением, могут представлять собой конститутивные промоторы или регулируемые промоторы. Распространенные примеры применимых регулируемых промоторов включают в себя промоторы из семейства, происходящего от промотора lac (т.е. промотор lacZ), особенно, промоторы tac и trc, описанные в патенте США №4551433 DeBoer, а также промоторы Ptacl6, Ptacl7, PtacII, PlacUV5, и T7lac. В одном варианте выполнения изобретения промотор не происходит из организма клетки-хозяина. В некоторых вариантах выполнения изобретения промотор происходит из организма E.coli.
Последовательности индуцируемого промотора могут быть применены для регулирования экспрессии интерферонов в соответствии со способами по изобретению. В вариантах выполнения изобретения индуцируемые промоторы, применимые в способах по настоящему изобретению, включают в себя таковые семейства, происходящего от промотора lac (т.е. промотор lacZ), особенно, промоторы tac и trc, описанные в патенте США №4551433 DeBoer, а также промоторы Ptacl6, Ptacl7, PtacII, PlacUV5, и T71ac. В одном варианте выполнения изобретения промотор не происходит из организма клетки-хозяина. В некоторых вариантах выполнения изобретения промотор происходит из организма E.coli.
Типичные примеры промоторов, отличных от lac-типа, применимых в системах экспрессии в соответствии с настоящим изобретением, включают в себя, например, промоторы, перечисленные в таблице 5.
См., например: J. Sanchez-Romero & V. De Lorenzo (1999) Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology (A. Demain & J. Davies, eds.) pp.460-74 (ASM Press, Washington, D.C.); H. Schweizer (2001) Current Opinion in Biotechnology, 12:439-445; и R. Slater & R. Williams (2000 Molecular Biology and Biotechnology (J. Walker & R. Rapley, eds.) pp.125-54 (The Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK)). Промотор, имеющий нуклеотидную последовательность промотора, нативную для выбранной бактериальной клетки-хозяина, также может быть применен для контроля экспрессии трансгена, кодирующего целевой полипептид, например, промотор антранилатного или бензоатного оперона Pseudomonas (Pant, Pben). Могут быть также применены тандемные промоторы, в которых более чем один промотор ковалентно связаны друг с другом, с одинаковыми или различными последовательностями, например, тандемный промотор Pant-Pben (межпромоторный гибрид) или тандемный промотор Plac-Plac или промоторы, происходящие из одинаковых или разных организмов.
Регулируемые промоторы используют промоторные регуляторные белки, для того чтобы контролировать транскрипцию гена, частью которого является промотор. Когда в настоящем документе используется регулируемый промотор, то соответствующий промоторный регуляторный белок также будет частью системы экспрессии по настоящему изобретению. Примеры промоторных регуляторных белков включают в себя: активирующие белки, например, белок-активатор катаболитных оперонов Е. coli, белок МаlТ; семейство транскрипционных активаторов AraC; репрессорные белки, например, белки LacI из Е. coli, и регуляторные белки двойного назначения, например, белок NagC из Е. coli. В данной области известны многие пары регулируемый промотор/ регуляторный белок, взаимодействующий с промотором. В одном варианте выполнения изобретения экспрессионные конструкции для целевого белка(ов) и гетерологичного белка, представляющего интерес, находятся под контролем одного и того же регуляторного элемента.
Промоторные регуляторные белки взаимодействуют с веществом-эффектором, т.е. веществом, которое обратимо или необратимо связывается с регуляторным белком, с тем чтобы белок либо высвободился или связался с по меньшей мере одной областью гена, регулирующей транскрипцию ДНК, которая находится под контролем промотора, тем самым разрешая или блокируя действие фермента транскриптазы в инициации транскрипции гена. Вещества-эффекторы классифицируются как индукторы или ко-репрессоры, и данные вещества включают в себя нативные вещества-эффекторы и неметаболизируемые вещества-индукторы. Многие трио регулируемый промотор/ регуляторный белок, взаимодействующий с промотором/вещество-эффектор известны в данной области. Хотя вещество-эффектор может быть применено на протяжении всего культивирования клеток или ферментации, в предпочтительном варианте выполнения изобретения, в котором используется регулируемый промотор, после выращивания биомассы клетки-хозяина до желаемого количества или плотности в культуру добавляют соответствующее вещество-эффектор, непосредственно или косвенно приводящее к экспрессии желаемого(ых) гена(ов), кодирующего(их) белок или полипептид, представляющий интерес.
В вариантах выполнения изобретения, где используют промотор семейства lac, ген lacI также может присутствовать в системе. Ген lacI, который, как правило, представляет собой конститутивно экспрессируемый ген, кодирует белок-репрессор LacI белка Lac, который связывается с оператором lac семейства промоторов lac. Таким образом, если используют промотор семейства lac, то ген lacI также может быть включен и экспрессироваться в системе экспрессии.
Промоторные системы, применимые в Pseudomonas, описаны в литературе, например, в патентной заявке США публикационный №2008/0269070, также упомянутой выше. Другие регуляторные элементы
В вариантах выполнения изобретения растворимые белки присутствуют в процессе продуцирования либо в цитоплазме или в периплазме клетки. Секреторные лидеры, применимые для целевых белков, описаны в настоящем документе в другом месте, а также в патентной заявке США публикационный №2008/0193974, в патентной заявке США публикационный №2006/0008877 и в патентной заявке США серийный №12/610,207, указанных выше.
Экспрессионная конструкция, применимая при реализации способов по настоящему изобретению, может включать в себя, в дополнение к последовательности, кодирующей белок, следующие регуляторные элементы, функционально связанные с ней: промотор, сайт связывания рибосомы (RBS), терминатор транскрипции и трансляционные старт- и стоп-сигналы. Применимые RBS могут быть получены из любого вида, применимого в качестве клеток-хозяев в системах экспрессии согласно, например, патентной заявке США публикационный №2008/0269070 и патентной заявке США серийный №12/610,207. Множество специфичных RNS, а также набор разнообразных консенсусных RBS известны, например, те, которые описаны в публикации и на которые ссылаются у D. Frishman et al., Gene 234(2):257-65 (8 Jul. 1999); и В. E. Suzek et al., Bioinformatics 17(12):1123-30 (December 2001). В дополнение, могут быть применены нативные или синтетические RBS, например, описанные в: ЕР 0207459 (синтетические RBS); О. Ikehata et al., Eur. J. Biochem. 181(3):563-70 (1989) (нативная RBS-последовательность AAGGAAG). Дополнительные примеры способов, векторов, и элементов трансляции и транскрипции и других элементов, применимых в настоящем изобретении, описаны, например, у Gilroy (патент США №5055294) и Gilroy et al. (патент США №5128130); Rammler et al. (патент США №5281532); Barnes et al. (патенты США. №№4695455 и 4861595); Gray et al. (патент США №4755465); и Wilcox (патент США №5169760).
Хозяйские штаммы
Бактерии-хозяева, включая Pseudomonas, и близко родственные бактериальные организмы предусмотрены для применения в реализации способов по изобретению. В некоторых вариантах выполнения изобретения клетка-хозяин Pseudomonas представляет собой Pseudomonas fluorescens. Клетка-хозяин может также представлять собой клетку E.coli. Pseudomonas и близко родственные бактерии, как правило, являются частью группы, определяемой как "подгруппа 1 грам(-)протеобактерий" или "грам-отрицательные аэробные палочки и кокки» (Buchanan and Gibbons (ред.) (1974) Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, pp.217-289). Хозяйские штаммы Pseudomonas описаны в литературе, например, в патентной заявке США публикационный №2006/0040352, приведенной выше.
Например, Pseudomonas как хозяева могут включать в себя клетки из рода Pseudomonas, Pseudomonas enalia (АТСС 14393), Pseudomonas nigrifaciensi (АТСС 19375) и Pseudomonas putrefaciens (АТСС 8071), которые были переклассифицированы, соответственно, как Alteromonas haloplanktis, Alteromonas nigrifaciens, и Alteromonas putrefaciens. Точно так же, например, Pseudomonas acidovorans (АТСС 15668) и Pseudomonas testosteroni (АТСС 11996) с тех пор были переклассифицированы как Comamonas acidovorans и Comamonas testosteroni, соответственно, и Pseudomonas nigrifaciens (АТСС 19375) и Pseudomonas piscicida (АТСС 15057) были переклассифицированы, соответственно, как Pseudoalteromonas nigrifaciens и Pseudoalteromonas piscicida.
Клетка-хозяин может быть выбрана из "подгруппы 16 грам-отрицательных протеобактерий". "Подгруппа 16 грам-отрицательных протеобактерий " определяется как группа протеобактерий следующих видов Pseudomonas (с номерами АТСС (American Type Culture Collection) или других депозитариев относящихся к примеру(ам) штамма(ов), приведенному(ым) в скобках): Pseudomonas abietaniphila (АТСС 700689); Pseudomonas aeruginosa (АТСС 10145); Pseudomonas alcaligenes (АТСС 14909); Pseudomonas anguilliseptica (ATCC 33660); Pseudomonas citronellolis (ATCC 13674); Pseudomonas flavescens (ATCC 51555); Pseudomonas mendocina (ATCC 25411); Pseudomonas nitroreducens (ATCC 33634); Pseudomonas oleovorans (ATCC 8062); Pseudomonas pseudoalcaligenes (ATCC 17440); Pseudomonas resinovorans (ATCC 14235); Pseudomonas straminea (ATCC 33636); Pseudomonas agarici (ATCC 25941); Pseudomonas alcaliphila; Pseudomonas alginovora; Pseudomonas andersonii; Pseudomonas asplenii (ATCC 23835); Pseudomonas azelaica (ATCC 27162); Pseudomonas beyerinckii (ATCC 19372); Pseudomonas borealis; Pseudomonas boreopolis (ATCC 33662); Pseudomonas brassicacearum; Pseudomonas butanovora (ATCC 43655); Pseudomonas cellulosa (ATCC 55703); Pseudomonas aurantiaca (ATCC 33663); Pseudomonas chlororaphis (ATCC 9446, ATCC 13985, ATCC 17418, ATCC 17461); Pseudomonas fragi (ATCC 4973); Pseudomonas lundensis (ATCC 49968); Pseudomonas taetrolens (ATCC 4683); Pseudomonas cissicola (ATCC 33616); Pseudomonas coronafaciens; Pseudomonas diterpeniphila; Pseudomonas elongata (ATCC 10144); Pseudomonasflectens (ATCC 12775); Pseudomonas azotoformans; Pseudomonas brenneri; Pseudomonas cedrella; Pseudomonas corrugata (ATCC 29736); Pseudomonas extremorientalis; Pseudomonas fluorescens (ATCC 35858); Pseudomonas gessardii; Pseudomonas libanensis', Pseudomonas mandelii (ATCC 700871); Pseudomonas marginalis (ATCC 10844); Pseudomonas migulae; Pseudomonas mucidolens (ATCC 4685); Pseudomonas orientalis; Pseudomonas rhodesiae; Pseudomonas synxantha (ATCC 9890); Pseudomonas tolaasii (ATCC 33618); Pseudomonas veronii (ATCC 700474); Pseudomonas frederiksbergensis; Pseudomonas geniculata (ATCC 19374); Pseudomonas gingeri; Pseudomonas graminis; Pseudomonas grimontii; Pseudomonas halodenitrificans; Pseudomonas halophila; Pseudomonas hibiscicola (ATCC 19867); Pseudomonas huttiensis (ATCC 14670); Pseudomonas hydrogenovora; Pseudomonas jessenii (ATCC 700870); Pseudomonas kilonensis; Pseudomonas lanceolata (ATCC 14669); Pseudomonas lini; Pseudomonas marginata (ATCC 25417); Pseudomonas mephitica (ATCC 33665); Pseudomonas denitrificans (ATCC 19244); Pseudomonas pertucinogena (ATCC 190); Pseudomonas pictorum (ATCC 23328); Pseudomonas psychrophila; Pseudomonas filva (ATCC 31418); Pseudomonas monteilii (ATCC 700476); Pseudomonas mosselii; Pseudomonas oryzihabitans (ATCC 43272); Pseudomonas plecoglossicida (ATCC 700383); Pseudomonas putida (ATCC 12633); Pseudomonas reactans; Pseudomonas spinosa (ATCC 14606); Pseudomonas balearica; Pseudomonas luteola (ATCC 43273);. Pseudomonas stutzeri (ATCC 17588); Pseudomonas amygdali (ATCC 33614); Pseudomonas avellanae (ATCC 700331); Pseudomonas caricapapayae (ATCC 33615); Pseudomonas cichorii (ATCC 10857); Pseudomonas ficuserectae (ATCC 35104); Pseudomonas fuscovaginae; Pseudomonas meliae (ATCC 33050); Pseudomonas syringae (ATCC 19310); Pseudomonas viridiflava (ATCC 13223); Pseudomonas thermocarboxydovorans (ATCC 35961); Pseudomonas thermotolerans; Pseudomonas thivervalensis; Pseudomonas vancouverensis (ATCC 700688); Pseudomonas wisconsinensis; и Pseudomonas xiamenensis.
[00125] Клетка-хозяин также может быть выбрана из "подгруппы 17 грам-отрицательных протеобактерий". "Подгруппа 17 грам-отрицательных протеобактерий" определяется как группа протеобактерий, известных в данной области как "флуоресцентные псевдомонады", включающая те, которые принадлежат, например, к следующим видам Pseudomonas: Pseudomonas azotoformans; Pseudomonas brenneri; Pseudomonas cedrella; Pseudomonas corrugata; Pseudomonas extremorientalis; Pseudomonas fluorescens; Pseudomonas gessardii; Pseudomonas libanensis; Pseudomonas mandelii; Pseudomonas marginalis; Pseudomonas migulae; Pseudomonas mucidolens; Pseudomonas orientalis; Pseudomonas rhodesiae; Pseudomonas synxantha; Pseudomonas tolaasii; и Pseudomonas veronii.
Оптимизация кодонов
Способы оптимизации кодонов для улучшения экспрессия в бактериальных хозяевах известны в данной области и описаны в литературе. Например, оптимизация кодонов для экспрессии в штамме-хозяине Pseudomonas описана, например, в патентной заявке США с публикационным №2007/0292918, "Codon Optimization Method", включенной сюда посредством отсылки в полном объеме.
Оптимизация кодонов для экспрессии в E.coli описана, например, у Welch, et al., 2009, PLoS One, "Design Parameters to Control Synthetic Gene Expression in Escherichia coli, 4(9): e7002, Ghane, et al., 2008, "Overexpression of Biologically Active Interferon В Using Synthetic Gene in E.coli," Journal of Sciences, Islamic Republic of Iran 19(3): 203-209, and Valente, et al., 2004, "Translational Features of Human Alpha 2b Interferon Production in Escherichia coli," Applied and Environmental Microbiology 70(8): 5033-5036, все включено сюда посредством отсылки.
Режим выращивания в ферментере
Систему экспрессии по настоящему изобретению можно культивировать в любом режиме выращивания в ферментере. Например, здесь могут быть применены периодический, периодический с подпиткой, полунепрерывный и непрерывный способы выращивания в ферментере.
В вариантах выполнения изобретения среда для выращивания в ферментере может быть выбрана из числа богатых сред, минимальных сред и сред с минеральными солями. В других вариантах выполнения изобретения выбрана либо минимальная среда или среда с минеральными солями. В некоторых вариантах выполнения изобретения выбрана среда с минеральными солями.
Среда с минеральными солями состоит из минеральных солей и источника углерода, такого как, например, глюкоза, сахароза или глицерин. Примеры сред с минеральными солями включают в себя, например, среду М9, среду для выращивания Pseudomonas (ATCC 179) и среду Davis и Mingioli (см. В D Davis & Е S Mingioli (1950) J. Bact. 60:17-28). Минеральные соли, применяемые для изготовления среды с минеральными солями, включают в себя те, которые выбраны из числа, например, фосфатов калия, сульфата или хлорида аммония, сульфата или хлорида магния, и микроэлементов, таких как хлорид кальция, борат и сульфаты железа, меди, марганца и цинка. Как правило, в среду с минеральными солями не входят органические источники азота, такие как пептон, триптон, аминокислоты или дрожжевой экстракт.Вместо этого используют источник неорганического азота, и он может быть выбран из числа, например, солей аммония, водного раствора аммиака и газообразного аммиака. Среда с минеральными солями, как правило, содержит в качестве источника углерода глюкозу или глицерин. По сравнению со средой с минеральными солями, минимальная среда может также содержать минеральные соли и источник углерода, но может быть дополнена, например, небольшими количествами аминокислот, витаминов, пептонов или других ингредиентов, хотя они добавляются в очень минимальных количествах. Среды могут быть приготовлены с использованием способов, описанных в данной области, например, в патентной заявке США публикационный №2006/0040352, на которую ссылаются в настоящем документе и которая включена посредством отсылки выше. Детали процедур выращивания и среды с минеральными солями, применимые в способах по настоящему изобретению, описаны у Riesenberg, D et al., 1991, "High cell density cultivation of Escherichia coli at controlled specific growth rate," J. Biotechnol. 20 (1):17-27.
Выращивание в ферментере может быть осуществлено в любом масштабе. Системы экспрессии по настоящему изобретению являются применимыми для экспрессии рекомбинантного белка в любом масштабе. Так, например, могут быть использованы ферментационные объемы микролитрового, сантилитрового и децилитрового масштаба, и могут быть использованы ферментационные объемы, составляющие 1 литр и больше. В вариантах выполнения изобретения ферментационный объем составляет около 1 литра или больше около 1 литра. В вариантах выполнения изобретения ферментационный объем составляет от около 1 литра до 100 литров.
В вариантах выполнения изобретения ферментационный объем составляет около 1 литра, около 2 литров, около 3 литров, около 4 литров, около 5 литров, около 6 литров, около 7 литров, около 8 литров, около 9 литров или около 10 литров. В вариантах выполнения изобретения ферментационный объем составляет от около 1 литра до 5 литров, от около 1 литра до 10 литров, от около 1 литра до 25 литров, от около 1 литра до 50 литров, от около 1 литра до 75 литров, от около 10 литров до 25 литров, от около 25 литров до 50 литров или от около 50 литров до 100 литров В других вариантах выполнения изобретения ферментационный объем находится на уровне или выше 5 литров, 10 литров, 15 литров, 20 литров, 25 литров, 50 литров, 75 литров, 100 литров, 200 литров, 500 литров, 1000 литров, 2000 литров, 5000 литров, 10000 литров или 50000 литров.
В то время как в настоящем документе были показаны и описаны предпочтительные варианты выполнения изобретения, специалисту в данной области очевидно, что такие варианты выполнения изобретения предоставляются только в качестве примера. Специалисты в данной области смогут осуществить многочисленные вариации, изменения и замены без отрыва от данного изобретения. Следует понимать, что в практической реализации изобретения могут быть применены различные альтернативы вариантам выполнения изобретения, описанным в настоящем документе. Предполагается, что последующая формула изобретения определяет объем изобретения и что способы и структуры в рамках данной формулы изобретения и ее эквивалентов покрываются таким образом.
Примеры
Пример 1: rIFN-β в образцах из высокопроизводительной системы экспрессии
В последующем эксперименте были сконструированы штаммы C17S, экспрессирующие интерферон IFN-β, и количество IFN-β в полученной нерастворимой фракции было определено количественно для каждого штамма. На основании полученных данных некоторые штаммы были отобраны для применения в оптимизации процесса экстракции в неденатурирующих условиях по настоящему изобретению.
Конструирование и выращивание штаммов, экспрессирующих IFN-β
Последовательность, кодирующая IFN-β 1b, была сконструирована с использованием предпочтительных кодонов P. fluorescens для кодирования аминокислотной последовательности человеческого IFN-β, соответствующей препарату Betaseron. На фигуре 7 показаны аминокислотная последовательность и последовательность ДНК синтетического гена IFN-β (Betaseron).
Были сконструированы плазмиды, которые несут кодон-оптимизированный IFN-β, слитый с девятнадцатью секреторными лидерами P. fluorescens. Секреторные лидеры были включены для направления белка в периплазму, где он может быть восстановлен в правильно свернутой и активной форме. Кроме того, была сконструирована одна плазмида, которая несет кодон-оптимизированный IFN-β, предназначенный для цитоплазматической экспрессии.
Экспрессия IFN-β управлялась промотором Ptac, и трансляция инициировалась с сайта связывания рибосомы (RBS) высокой (Hi) или средней (Med) активности. Полученные 20 плазмид были трансформированы в 30 штаммов-хозяев P. fluorescens (16 штаммов с делецией по протеазам, 13 штаммов с сверхэкспрессией модуляторов фолдинга и 1 штамм дикого типа) для производства 600 экспрессионных штаммов (см. таблицы 6 и 7).
Модуляторы фолдинга, если они присутствовали, были закодированы на второй плазмиде, и экспрессия управлялась промотором, индуцируемым маннитом.
Тридцать штаммов-хозяев, несущие каждую из 20 плазмид, экспрессирующих IFN-β (всего 600 экспрессирующих хозяев), были выращены каждый в тройном повторе в 96-луночных планшетах. Образцы, собранные через 24 часов после индукции, были использованы для анализа.
Экспрессия IFN-β с помощью технологии экспрессии Pfenex в 96-луночном формате
Каждой плазмидой (табл.6) трансфицировали 30 штаммов-хозяев P. fluorescens (табл.7) следующим образом: двадцать пять микролитров компетентных клеток размораживали и переносили в 96-луночный электропорационный планшет (электропоратор ЕСМ630 ВТХ), и в каждую лунку добавляли 1 мкл плазмидной ДНК, полученной по протоколу выделения Miniprep.Клетки электропорировали при 2,5 кВ, 200 Ом, и 25 мкФ. Клетки суспендировали в 75 мкл среды HTP-YE с микроэлементами, переносили в 96-луночный планшет с глубокими лунками, содержащими 500 мкл среды с солями М9 и 1% глюкозы (посевная культура), и инкубировали при 30°C в течение 48 часов на шейкере при 300 об/мин и диаметре вращения платформы 50 мм.
Десять микролитров посевной культуры переносили трижды в лунки 96-луночных планшетов с глубокими лунками, причем каждая лунка содержала 500 мкл среды HTP-YE, и инкубировали, как прежде, в течение 24 часов. Изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) добавляли в каждую лунку до конечной концентрации, составляющей 0,3 мМ для индукции экспрессии IFN-β. При росте малых объемов культур в микролунках НТР определенное значение рН культуры не контролируется строго, и плотность клеток может немного отличаться от лунки к лунке. В каждую лунку добавляли маннит (Sigma, M1902) до конечной концентрации, составляющей 1%, для индукции экспрессии модуляторов фолдинга в штаммах, сверхэкспрессирующих модуляторы фолдинга, и температуру понижали до 25°C. Через двадцать четыре часа после индукции культуры собирали для анализа. Для нормировки оптической плотности клетки смешивали с стерильным 1X PBS, чтобы получить конечное значение OD600 (оптической плотности при 600 нм) равное 20, в конечном объеме, составляющем 400 мкл, помощью станции обработки жидкости Biomek (Beckman Coulter). Образцы собирали в кластерных стойках для пробирок.
Приготовление образцов и анализ SDS-CGE
Растворимые фракции (супернатанты, полученные после центрифугирования лизатов) и нерастворимые фракции (осадки, полученные после центрифугирования лизатов) приготовляли обработкой ультразвуком культур, нормированных по оптической плотности, с последующим центрифугированием. Замороженный, нормированный «бульон» культуры (400 мкл) оттаивали и обрабатывали ультразвуком в течение 3,5 минут. Лизаты центрифугировали при 20800×g в течение 20 минут при 4°C, и растворимые фракции удаляли вручную или с использованием систем автоматического удаления жидкости. Нерастворимые фракции замораживали, а затем оттаивали для повторного центрифугирования при 20080 х g в течение 20 минут при 4°C для удаления остаточного супернатанта. Нерастворимые фракции затем ресуспендировали в 400 мкл IX фосфатного буферного раствора (PBS), рН 7,4. Дополнительные разведения растворимых и нерастворимых фракций для анализа SDS-CGE проводили в IX фосфатном буферном растворе (PBS), рН 7,4. Растворимые и нерастворимые фракции готовили для анализа капиллярным SDS-гель-электрофорезом (CGE) (Caliper Life Sciences, Protein Express LabChip Kit, Part 760301) в присутствии дитиотреитола (DTT).
Нормализованные растворимые и нерастворимые фракции из каждой лунки из 600 штаммов, экспрессирующих IFN-β, анализировали анализом SDS-CGE в восстанавливающих условиях в одном повторе для растворимых фракций и нерастворимых фракций. IFN-β-сигнал не был обнаружен в растворимых фракциях. IFN-β-сигнал варьировал от отсутствия сигнала до более чем 400 мг/л в нерастворимых фракциях. Только пять из двадцати протестированных плазмид показали измеримый сигнал IFN-β в нерастворимых фракциях всех тридцати штаммов-хозяев: р530-001, р530-007, р530-011, р530-018 и р530-020. Интеграция IFN-β-сигнала с помощью программного обеспечения LabChip GX Caliper была выполнена во всех 150 штаммах, состоящих из пяти перечисленных выше плазмид в тридцати штаммах-хозяевах, и полученные данные были использованы для вычисления объемных выходов. Объемные выходы 150 проанализированных штаммов варьировали от 2 до 482 мг/л. Штаммы, несущие р530-020, достигали неизменно более высоких выходов IFN-β в нерастворимой фракции, чем другие экспрессионные штаммы, однако, белок мигрировал на SDS-CGE выше, чем ожидалось, указывая на то, что секреторный лидер не отщеплялся. Высокие выходы наблюдались также с двумя штаммами-хозяевами, несущими р530-001. Существенная разница в IFN-β в нерастворимой фракции не наблюдалась среди 30 штаммов, за исключением, возможно, одного штамма, DC441, штамма с делецией Lon протеазы и протеазы hslUV, который показал несколько более высокие выходы, чем другие 29 штаммов.
Подмножество 17 лучших экспрессионных штаммов (табл.8), за исключением штаммов, содержащих плазмиду р530-020, было отобрано для дальнейших анализов. Экспрессионные штаммы, содержащие плазмиду р530-020, были исключены из дальнейшего рассмотрения в данном эксперименте из-за потенциально непроцессированного лидера. Анализ SDS-CGE был проведен для растворимой и нерастворимой фракций данных штаммов. Количественная оценка результатов SDS-CGE показана в таблице 8. Концентрация белка IFN-β варьировала от 102 до более чем 482 мг/л. Основываясь на выходе в нерастворимой фракции и процессинге либо последовательности периплазматического лидера либо N-концевого Met из IFN-β, были выбраны штаммы, для того чтобы перейти к испытаниям при выращивании в ферментере.
PD=штамм с делецией протеазы, FMO=штамм, сверхэкспрессирующий модуляторы фолдинга
Пример 2. Экстракция IFN-β 1b из материала, полученного в высокопроизводительной системе экспрессии
IFN-β 1b был успешно экстрагирован из нерастворимых фракций культур высокопроизводительной системы экспрессии НТР, применяя условия экстракции, содержащие детергент Zwittergent 3-14.
Экспрессирующие в планшетах НТР культуры штаммов Pseudomonas fluorescens PS530-001, сверхэкспрессирующего цитоплазматический IFN-β 1b, и 530-220, сверхэкспрессирующего секретируемый IFN-β 1b (описано в примере 1), обрабатывали ультразвуком и центрифугировали для получения нерастворимой фракции и растворимой фракции. Осадки ресуспендировали в буфере для экстракции IX PBS, рН 7,4, или ацетате натрия при рН 4,5. Каждый буфер был протестирован с детергентом Zwittergent 3-14 при концентрации, равной 1% (масс/об.), или без детергента. Каждую из четырех комбинаций буфера и детергента инкубировали в течение 1-2 часов при комнатной температуре или ночь при 4°C на шейкере. После экстракции каждый образец центрифугировали в течение 20 минут при 20080×g при 4°C для получения второй нерастворимой фракции осадка (осадка экстракта) и второй растворимой фракции супернатанта (экстракта супернатанта). Первая нерастворимая фракция и первая растворимая фракция и фракция осадка экстракта и фракция супернатанта экстракта были проанализированы с помощью SDS-CGE. Результаты приведены на фигурах 1А и 1В. Как видно из дорожки 7, условия экстракции, включающие в себя буфер PBS и Zwittergent 3-14, дают растворимый IFN-β.
Пример 3. Оптимизация условий экстракции
Нерастворимые фракции ферментативных культур подвергались экстракции в условиях, содержащих различные детергенты.
Замороженную клеточную пасту, полученную из 1 л выращенной в ферментере культуры (выращенной при 32°C, рН 6,5, и индуцированной с помощью 0,2 мМ IPTG при оптической плотности при 575 нм (OD575), равной 100) штамма PS530-001, сверхэкспрессирующего рекомбинантный IFN-β 1b, ресуспендировали в лизисном буфере, содержащем 20 мМ фосфата натрия (JT Baker), рН 7,4, до конечной концентрации твердых веществ, равной 20% (масс/об.). Хорошо перемешанную суспензию клеток лизировали дважды с помощью Constant cell disruptor (Constant Systems, Inc.) при 38 kpsi. Лизат был разделен пополам и отцентрифугирован при 15000×g в течение 30 минут при 4°C (Beckman Coulter, PN # J-20, XPF). Осадки (содержащие IFN-P и клеточные обломки) ресуспендировали, и каждый осадок промывали или в буфере А (20 мМ фосфат натрия, рН 7,4) или в буфере В (20 мМ ацетата натрия, рН 4,0). Образцы разделяли центрифугированием при тех же условиях, что описаны для первого разделения. Супернатанты удаляли, и осадки снова ресуспендировали либо в буфере А или в буфере В при концентрации твердого вещества, равной 20%. Для каждого буфера двадцать аликвот, по 1 мл каждая, помещали в конические пробирки объемом 1,5 мл. Различные концентрации исходных растворов детергентов добавляли в конические пробирки. Все пробирки инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа или ночь (18 часов) при 4°C при непрерывном перемешивании. После экстракции растворы центрифугировали, и фракции супернатанта экстракта были проанализированы на концентрацию белка с помощью SDS-CGE. На фигуре 2 приводится блок-схема, показывающая, как выполняли подготовку образца и экстракцию.
Было найдено, что из тестированных детергентов Zwittergent 3-14 и N-лаурилсаркозин (NLS) давали лучшие выходы, независимо от буфера и инкубационного периода (табл.9). Однако, продукт, экстрагированный с помощью NLS, был неактивным, что определялось его неспособностью связываться либо с аффинной колонкой с Blue Sepharose или с катионообменной колонкой (SP HP) (данные не показаны). Было определено, что продукт, экстрагированный с помощью Zwittergent 3-14, является активным.
Оценка аналогов Zwittergent
С помощью подобных способов были оценены аналоги Zwittergent по их эффективности экстракции. Результаты представлены в таблице 10. Лучшие выходы наблюдали с Zwittergent 3-14. Zwittergent 3-12, Zwittergent 3-10, 3-08 и Zwittergent были также эффективны.
Оценка концентрации Zwittergent 3-14
Для эффективного растворения белков концентрация детергента, как правило, должна быть выше его величины CMC. Величина CMC Zwittergent 3-14 составляет около 0,01% (масс/об.). Были оценены условия экстракции, включающие натрий-фосфатный буфер при рН 7,4 с увеличивающимися концентрациями Zwittergent 3-14. Использованная клеточная паста была получена из штамма PS530-001, выращенного при 32°C, рН 6,5, и индуцированного с помощью 0,2 мМ IPTG при OD575, равной 100. Результаты, приведенные в таблице 11, показывают, что применение Zwittergent 3-14 при концентрации 1% (масс/об.) привело к самому высокому выходу экстракции.
Оценка дополнительных химических реагентов
Как показано в таблице 11, условия экстракции, включая Zwittergent 3-14 при концентрации, равной 1% (масс/об.) в натрий-фосфатном буфере при рН 7,4, давали 21% IFN-β 1b, обнаруженного в оригинальной нерастворимой фракции. Была проведена дополнительная оптимизация.
Некоторые хаотропные реагенты, такие как мочевина и гидрохлорид гуанидина, широко применялась в высоких концентрациях (например, от 6 до 8 М) в качестве сильного денатурирующего агента для солюбилизации телец включения. Хаотропные реагенты, такие как мочевина, могут увеличить критическую концентрацию мицеллообразования (CMC) детергентов и могут потенциально улучшить эффективность экстракции. Были оценены низкие концентрации мочевины (до 2 М) в условиях экстракции. Соли, например, NaCl, также могут влиять на CMC детергентов. Для варьируемых концентраций Zwittergent 3-14 оцененивалась возможная взаимосвязь между CMC детергента и наличием хаотропных реагентов и солей. Концентрация нерастворимых твердых веществ включения в условия экстракции также варьировалась. С учетом ранее полученных оценок, твердые вещества брались в концентрациях ниже, чем 20% (масс/об.).
Таким образом, было протестировано влияние варьирования следующих параметров на
эффективность экстракции.
Хлорид натрия: от 150 до 1850 мМ
Мочевина: от 0 до 2 М
Zwittergent 3-14: от 0,1 до 1,0% масс/об.
Сухой остаток: от 5 до 20% масс/об.
рН: от 6,5 до 8,5
Блок-схема на фигуре 3 описывает подготовку и экстракцию первой нерастворимой фракции осадка для данного оптимизационного исследования. На таблице 12 показан результат данного исследования. На фигурах 4А и 4В подводятся итоги и суммируется значение влияния каждого параметра на выход экстракции. Для оптимизации экстракции р-интерферона из нерастворимой фракции был применен дизайн двухуровневого, пятифакторного, двухфракционного факторного эксперимента. Для экспериментального проектирования и анализа было использовано программное обеспечение JMP (SAS Institute, Cary, NC). Программное обеспечение оценивает влияние отдельных факторов, а также их взаимодействия на экспериментальный выход (количество экстрагированного интерферона).
На основании приведенных выше данных, для экспериментов, описанных ниже, было выбрано оптимизированное условие экстракции: 1% (масс/об.) Zwittergent 3-14, 2 М мочевина, 2 М NaCl, 5% твердых веществ масс/об., буфер со значением рН от 7,5 до 8,5. Было найдено, что при использовании таких оптимизированных условий наблюдаемый выход экстракции (в супернатанте экстракта) составляет неизменно 90% или выше (т.е. 90% или более от количества рекомбинантного белка, измеренного в нерастворимой фракции).
Пример 4. Продукция rIFN-β 1b при выращивании в ферментерах большого масштаба
Продукция рекомбинантного белка человеческого β-интерферона (IFN-β 1b) в штамме PS530-001 Pseudomonas fluorescens по технологии Pfenex Expression Technology™ была успешно достигнута в ферментерах объемом 2 л. Были оценены несколько условий ферментации, в результате чего была получена величина экспрессии IFN-β 1b, достигающая 9,2 г/л
Ферментативные культуры выращивали в ферментерах объемом 2 л, содержащих среду с минеральными солями (как описано выше, а также, например, у Riesenberg, D., et al., 1991). Условия культивирования поддерживали при 32°C и рН 6,5 путем добавления водного раствора аммиака. Растворенный кислород поддерживали в избытке путем ускорения перемешивания и потока продуваемого воздуха и кислорода в ферментер. Глицерин добавлялся в культуру на во время выращивания для поддержания его в избытке. Данные условия поддерживали до достижения оптической плотности культуры (А575), нужной для индукции, и в это время IPTG был добавлен для инициации продукции IFN-β. Все факторы, такие как оптическая плотность при индукции, концентрациия IPTG, уровень рН и температура варьировали, чтобы определить оптимальные условия для экспрессии. Через 24 часов культуру из каждого ферментера собирали центрифугированием, и осадок клеток замораживали при -80°C. Ферментативные культуры индуцировали при OD575, равной 100, с помощью 0,2 мМ IPTG, при рН 6,5 и температуре 32°C. В повторах выращивания выход IFN-β составил 7,5, 8,4 и 7,9 г/л, как было определено с помощью SDS-CGE начальной нерастворимой фракции (фигура 5). Когда данные нерастворимые фракции подвергали экстракции (в условиях, включающих 1% (масс/об.) Zwittergent 3-14, 2 М мочевину, 2 М NaCl, 5% твердых веществ масс/об., и рН буфера, равный 8,2), то наблюдали растворимый IFN-p в супернатанте экстракта, составляющий 2,2, 2,4 и 2,6 г/л. Такие количества соответствуют среднему выходу экстракции, равному 31%.
Увеличение оптической плотности проведения индукции от 120 до 160 и уменьшение значения рН ферментации от 5,7 до 6,25 увеличивало титры IFN-β в начальной нерастворимой фракции от 8,8 до 9,2 г/л (фигура 6). Экстракция таких клеточных осадков (используя те же условия экстракции, что и для эксперимента, показанного на фигуре 5) давало в результате от 3,1 до 4,0 г/л IFN-β в экстрагированной фракции супернатанта, средний выход экстракции составлял 39% (таблица 13).
нерастворимого белка (г/л)
нерастворимого белка (г/л)
Пример 5. Анализ активности продукта экстракции IFN-β
Выращенная в ферментере культура штамма PS530-001 Pseudomonas fluorescens (1 л ферментации при 32°C, рН 6,0, индуцированной при OD575, равной 100, с использованием 0,2 мМ IPTG) центрифугировали и супернатант отбрасывали. Клеточную пасту ресуспендировали в 20 мМ Трис-буфере, рН 8,2 (в соотношении 1:4) и лизировали, пропуская через микрофлюидизатор Microfluidics M110Y при 15000 psi. Лизат центрифугировали и растворимую фракцию отбрасывали. Нерастворимую фракцию смешивали с буфером для экстракции (20 мМ Трис, 2 М NaCl, 2 М мочевины, 1% Zwittergent 3-14, рН 8,2) при комнатной температуре в течение 1 часа и центрифугировали для получения фракции супернатанта экстракта и фракции осадка экстракта. Выход экстракции IFN-β (IFN-β во фракции супернатанта экстракта /IFN-β в начальной нерастворимой фракции) был близок к 100% (>99%), базируясь на анализе SDS-CGE (данные не представлены).
Супернатант экстракта фильтровали и наносили на колонку GE Healthcare Blue Sepharose объемом 5 мл, уравновешенную буфером 20 мМ Трис, 2 М NaCl, рН 8,2. Колонку промывали тем же буфером, и IFN-β элюировали буфером 20 мМ Трис, 2 М NaCl, 50% пропиленгликоля, рН 8,2. Белок в собранном элюате был проанализирован с помощью SDS-CGE, и было установлено, что он представляет собой более 98% чистого IFN-β. Аликвоты собранного элюата были переведены в буфер С (5 мМ глицин, рН 3,0) и буфер D (5 мМ аспарагиновой кислоты, 9% трегалозы, рН 4,0).
Образцы, переведенные в новые буферы, были проанализированы с помощью SDS SDS-CGE, а также анализом, использующим клетки (PBL Interferon Source, # 51100-1). В использующем клетки анализе применяется линия клеток человека (PIL5), сенсибилизированных рецептором к IFN I типа. IFN-β связывается с рецептором, который передает сигнал через путь сигнальной трансдукции Jak1/STATl, активируя транскрипцию ISG15-люциферазы с помощью чувствительного к интерферону респонсивного элемента (ISRE). При этом следовали инструкциям, приложенным к набору для использующего клетки анализа, соответствующим протоколу производителя (51100 rev01). Сигнал считывали с помощью обычных планшетных ридеров детектированием люминесценции. В таблице 14 суммированы результаты анализа с помощью SDS-CGE и анализа, использующего клетки, которые указывают, что IFN-β в образцах был полностью активным.
Пример 6. Продукция IFN-α 2а и 2b в образцах из высокопроизводительной системы экспрессии
Были сконструированы последовательности, кодирующие IFN-α 2а и IFN-α 2b, с использованием предпочтительных кодонов P. fluorescens для кодирования человеческих белков. На фигуре 8 показаны последовательность аминокислот и последовательность ДНК синтетического гена IFN-α 2а, и на фигуре 9 показаны последовательность аминокислот и последовательность ДНК синтетического гена IFN-α 2b. Плазмиды, экспрессирующие белки, были сконструированы и трансформированы в различные штаммы-хозяева. Экспрессионные штаммы были испытаны на их способность экспрессировать рекомбинантный белок с использованием анализа НТР, как описано в настоящем документе в связи с IFN-β. Для исследования выращивания в ферментере было выбрано подмножество экспрессионных штаммов.
Отобранные штаммы выращивали и индуцировали в соответствии с настоящим изобретением. Клетки центрифугировали, лизировали и снова центрифугировали, как описано в настоящем документе для IFN-β. Результирующую нерастворимую фракцию и первую растворимую фракцию экстрагировали с использованием условий экстракции, описанных в настоящем документе. Получившиеся супернатанты IFN-α 2а и IFN-α 2b в экстракте количественно оценивали с использованием SDS-CGE (данные не представлены).
Пример 7. Экстракция IFN-α 2а и 2b из материала, полученного в высокопроизводительной системе экспрессии
Первую нерастворимую фракцию, полученную, как описано в примере 6, экстрагировали с использованием условий экстракции, описанных в настоящем документе. IFN-α 2а и 2b в результирующих вторых растворимых фракциях оценивали с помощью CGE и анализа биологической активности.
Пример 8. Продукция IFN-α 2а и 2b из выращивание в ферментерах большого масштаба
Экспрессирующие IFN-α 2а и 2b штаммы, выбранные с помощью анализа НТР, выращивают в ферментерах объемом 2 л с использованием оптимизированных условий ферментации по настоящему изобретению, например, как описано в примере 4. Первую нерастворимую фракцию экстрагируют с использованием способов по настоящему изобретению, например, как описано в примере 4. Белок IFN-α 2а и 2b, присутствующий в первой нерастворимой и второй растворимой фракциях, оценивают с помощью CGE и сравнивают.
Пример 9. Анализ продукта экстракции на IFN-α 2а и 2b
Продукт экстракции, полученный в примере 8, анализируют на биологическую активность IFN-α 2а и 2b.
Настоящее изобретение относится к области продукции рекомбинантных белков в бактериальных хозяевах. Изобретение дополнительно относится к экстракции растворимого, активного рекомбинантного белка из нерастворимой фракции без применения денатурации и без необходимости в стадии рефолдинга. В частности, настоящее изобретение относится к производственному способу получения больших количеств растворимого рекомбинантного белка интерферона I типа из бактериального хозяина. 18 з.п. ф-лы, 9 ил., 14 табл., 9 пр.
1. Способ получения рекомбинантного интерферона-β, причем упомянутый способ включает:
экспрессию рекомбинантного интерферона-β культивированием клетки-хозяина Pseudomonas или E. coli, содержащей экспрессионную конструкцию, причем упомянутая экспрессионная конструкция содержит нуклеиновую кислоту, содержащую кодирующую последовательность для интерферона-β, которая была оптимизирована для экспрессии в клетке-хозяине;
лизис культивированной клетки-хозяина;
получение нерастворимой фракции и растворимой фракции из лизированной клетки-хозяина;
экстрагирование нерастворимой фракции подверганием ее неденатурирующим условиям экстракции, причем упомянутые неденатурирующие условия экстракции включают цвиттерионный детергент в концентрации от около 0,5% до около 2% и космотропную соль; и
получение осадка экстракта и супернатанта экстракта из экстрагированной нерастворимой фракции;
причем рекомбинантный интерферон-β в супернатанте экстракта присутствует в растворимой форме, активной форме или их комбинации, без необходимости осуществления дополнительной стадии его ренатурации или рефолдинга.
2. Способ по п. 1, в котором кодирующая последовательность для интерферона-β является функционально связанной с производным промотора lac, причем культивирование включает:
выращивание клетки-хозяина при температуре от около 25°C до около 33°C и при значении pH от около 5,7 до около 6,5, до значения OD600, равного от около 80 до около 160, и
индукцию клетки-хозяина при концентрации IPTG, равной от около 0,08 мМ до около 0,4 мМ.
3. Способ по п. 1, в котором цвиттерионный детергент представляет собой Zwittergent 3-08, Zwittergent 3-10, Zwittergent 3-12, Zwittergent 3-14 или CHAPS.
4. Способ по п. 3, в котором неденатурирующие условия экстракции включают от около 0,5% до около 2% Zwittergent 3-14.
5. Способ по п. 1, в котором неденатурирующие условия экстракции дополнительно включают хаотропный агент.
6. Способ по п. 5, в котором хаотропный агент представляет собой мочевину или гидрохлорид гуанидина.
7. Способ по п. 1, в котором космотропная соль представляет собой NaCl, KCl или (NH4)2SO4.
8. Способ по п. 1, в котором неденатурирующие условия экстракции включают: от около 0,5 до около 2% Zwittergent 3-14; от 0 до около 2М мочевины; от 0,15 до около 2М NaCl и в котором значения pH составляют от около 6,5 до около 8,5.
9. Способ по п. 7, в котором неденатурирующие условия экстракции включают: около 1% Zwittergent 3-14; около 2М мочевины; около 2М NaCl; и в котором значение pH составляет около 8,2.
10. Способ по п. 1, в котором неденатурирующие условия экстракции дополнительно включают от около 1% до около 40% масс/об. твердых веществ.
11. Способ по п. 9, в котором неденатурирующие условия экстракции дополнительно включают около 5% масс/об. твердых веществ.
12. Способ по п. 11, в котором рекомбинантный интерферон-β выбирают из группы, состоящей из: человеческого интерферона-β 1b и человеческого интерферона-β 1b C17S.
13. Способ по п. 1, дополнительно включающий измерение количества рекомбинантного интерферона-β в образце нерастворимой фракции, причем упомянутый образец нерастворимой фракции получен до экстрагирования нерастворимой фракции, и измерение количества рекомбинантного интерферона-β в образце супернатанта экстракта, причем упомянутый образец супернатанта экстракта получен после экстрагирования нерастворимой фракции, причем количество рекомбинантного белка интерферона, обнаруженное в образце супернатанта экстракта, полученном после экстрагирования нерастворимой фракции, составляет от около 10% до около 95% количества рекомбинантного интерферона, измеренного в образце нерастворимой фракции, полученном до экстрагирования нерастворимой фракции.
14. Способ по п. 1, дополнительно включающий измерение активности рекомбинантного интерферона-β в образце супернатанта экстракта, причем упомянутый образец супернатанта экстракта получен после экстрагирования нерастворимой фракции, в котором определяется, что от около 40% до около 100% рекомбинантного интерферона-β, присутствующего в образце супернатанта экстракта, полученном после экстрагирования нерастворимой фракции, является активным, или в котором от около 75% до около 100% рекомбинантного интерферона-β, присутствующего в образце супернатанта экстракта, полученном после экстрагирования нерастворимой фракции, является активным при сравнении с количеством активного интерферона-β в стандартном образце, содержащем то же самое количество рекомбинантного интерферона-β, что и образец супернатанта экстракта, полученный после экстрагирования нерастворимой фракции.
15. Способ по п. 14, в котором количество активного рекомбинантного интерферона-β определяется аффинной хроматографией на колонке с Blue Sepharose, анализом связывания с рецептором, анализом противовирусной активности или анализом цитопатического эффекта.
16. Способ по п. 1, в котором рекомбинантный интерферон-β в супернатанте экстракта присутствует в концентрации, составляющей от около 0,3 грамма на литр до около 10 граммов на литр.
17. Способ по п. 1, в котором клетка-хозяин представляет собой штамм с делецией Lon протеазы и протеазы hslUV.
18. Способ по п. 1, в котором интерферон-β экспрессируется в цитоплазме клетки-хозяина.
19. Способ по п. 12, в котором интерферон-β представляет собой человеческий интерферон-β 1b или человеческий интерферон-β 1b C17S, и в котором человеческий интерферон-β 1b или человеческий интерферон-β 1b C17S экспрессируется в цитоплазме клетки-хозяина.
| PETERNEL S | |||
| et al.," Enegineering inclusion for non denaturing extraction of functional proteins", Microb Cell Fact | |||
| Станок для изготовления деревянных ниточных катушек из цилиндрических, снабженных осевым отверстием, заготовок | 1923 |
|
SU2008A1 |
| EP 1939212 A1, 02.07 | |||
| Станок для изготовления деревянных ниточных катушек из цилиндрических, снабженных осевым отверстием, заготовок | 1923 |
|
SU2008A1 |
| US 5240834 A, 31.09.1993 | |||
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНТЕРФЕРОНА | 1994 |
|
RU2098124C1 |
