СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНТЕРФЕРОНА Российский патент 1997 года по МПК A61K38/19 

Изобретение относится к вирусологии и биотехнологии, может быть использовано при получении куриного аллантоисного интерферона для предупреждения и лечения заболеваний вирусной этиологии у кур.

Для профилактики вирусных заболеваний у кур в настоящее время повсеместно используют моно- и поливалентные вакцинные препараты.

В системе птицеводства используют несколько вакцинных препаратов: против болезни Марека, против болезни Гамбора, против псевдочумы и инфекционного паринготрахеита. Тем не менее, падеж птицы, обусловленный вирусными заболеваниями, в том числе болезнями Марека и Гамбора, имеют место во всех птичьих хозяйствах. Плановые ревакцинации против инфекционного ларинготрахеита также практически не гарантируют невосприимчивость к этому заболеванию. В птицехозяйствах регистрируются и вспышки псевдочумы, следствием которых является уничтожение всего поголовья. Таким образом, несмотря на неоднократное использование вакцинных препаратов, падеж птицы, обусловленный вирусными инфекциями, составляет от 10 и более процентов поголовья. Кроме того, в группах переболевших отмечают снижение яйценоскости, медленную и недостаточную прибавку в весе, что соответственно приводит к недополучению значительных количеств мяса кур.

Эффективного препарата для лечения вирусных заболеваний птиц практически нет. Используемый в таких случаях комплекс антибиотиков и сульфаниламидных препаратов мало эффективен при данном виде патологии.

Известен способ получения аллантоисного куриного интерферона, предусматривающий заражение 10-дневных развивающихся куриных эмбрионов вирусами гриппа типа А или B (штаммы PR, NWS). Сбор аллантоисной жидкости производят через 72 ч инкубации зараженных эмбрионов при 37^oC. После этого добавлением 2 взвеси куриных эритроцитов адсорбируют часть вирусных частиц, а для полной инактивации вируса интерферонсодержащую жидкость либо прогревают при 56^oC в течение 1 ч, либо проводят последовательно диализ сначала против цитратного буферного раствора (pH 2,2) в течение 18 ч, затем против фосфатного буферного раствора (pH 7,3) в течение 18 ч, а затем против фосфатного буферного раствора (pH 7,3) в течение 18 ч.

Однако в процессе такой обработки происходит резкое снижение противовирусной активности интерферона, которая составляет не более 100 ед/мл. Кроме того, высокая трудоемкость процесса приготовления конечного продукта делает этот метод мало пригодным для массового производства препарата [1]
Известен также способ получения аллантоисного куриного интерферона, предусматривающий заражение 9-дневных развивающихся куриных эмбрионов вирусом гриппа типа B/England/ с последующим сбором аллантоисной жидкости через 72 ч их инкубации при 37^oC. Инактивацию вируса в материале осуществляют добавлением соляной кислоты (до значений pH 2,2) с последующей нейтрализацией раствором едкого натрия через 16 ч [2] Однако этот способ позволяет получать аллантоисный куриный интерферон с противовирусной активностью 40-160 ед/мл.

Наиболее близким к заявляемому является способ получения аллантоисного интерферона, предусматривающий заражение 11-дневных развивающихся куриных эмбрионов вирусом гриппа типа B (штамм Lee) с последующим сбором аллантоисной жидкости после 48 ч их инкубации при температуре 37^oC и инактивацию вируса при 65^oC в течение 1 ч [3]
Ввиду того, что в способе, принятом в качестве прототипа, где инкубацию зараженных куриных эмбрионов проводят при 37^oC, а инактивирование вируса при 65^oC, происходят значительные потери активности интерферона, эти условия не позволяют получать высокоактивный аллантоисный куриный интерферон. При этом наиболее значительные потери интерферона имеют место при высокой активности полуфабриката.

Задача, на решение которой направлено изобретение, состоит в повышении выхода интерферона за счет изменения температуры инкубации зараженных куриных эмбрионов и этапа инактивация вируса.

В заявляемом способе получения аллантоисного интерферона, предусматривающем заражение 11-дневных развивающихся куриных эмбрионов вирусом гриппа B (штамм Lee), выделение целевого продукта и инактивирование вируса-индуктора в развивающихся куриных эмбрионах проводят при 33-35^oC, а инактивацию осуществляют обработкой инкубационной смеси бета-пропиолактоном в концентрации 5-11 мМ при 18-22^oC в течение 4-10 мин, что позволяет повысить выход интерферона и сократить продолжительность технологического цикла производственного процесса. Указанные показатели концентрации бета-пропиолактона и продолжительности обработки установлены на основании полной инактивации вируса-индуктора в образцах полуфабрикатов куриного интерферона. Увеличение либо уменьшение как концентрации инактивирующего агента, так и продолжительности обработки нецелесообразно из-за снижения активности интерферона.

Причинно-следственная связь предложенных изменений с достигаемым результатом состоит в использовании как неизвестного ранее свойства повышения интерфероногенной активности вируса гриппа типа B (штамм Lee) при снижении температуры инкубации куриных эмбрионов, так и неизвестного ранее свойства индиферрентности бета-пропиолактона по отношению к аллантоисному интерферону. Известно, что при обработке бета-пропиолактоном полуфабриката человеческого лейкоцитарного интерферона противовирусная активность конечного продукта не снижалась [4] что позволяет использовать этот инактивирующий агент в технологическом цикле производства аллантоисного куриного интерферона.

Приведенные ниже примеры подтверждают целесообразность предложенных изменений технологического процесса для повышения выхода конечного продукта и сокращения продолжительности технологического цикла.

Пример 1. 180 шт. 11-дневных развивающихся куриных эмбрионов (по 20 на каждый из 9 различных температурных режимов) заражали вирусом гриппа типа B (штамм Lee) по 0,2 мл в аллантоисную полость (величина заражающей дозы составляет 10 тыс EID 50/0,2 мл) и инкубировали в течение 72 ч при температуре 29-37^oC. После этого аллантоисную жидкость собирали (от каждого температурного режима отдельный пул), центрировали при 1500 об/мин в течение 30 мин. Осадок сбрасывали, а в осветленную аллантоисную жидкость добавляли 5 мМ бета-пропиолактона и смесь выдерживали при температуре 18-22^oC в течение 4 мин.

В результате получали препараты аллантоисного интерферона с характеристиками, указанными в табл. 1.

Как видно из табл. 1, оптимальной температурой инкубации куриных эмбрионов оказался режим 33-35^oC, при котором отмечали максимальные показатели противовирусной активности (8-10 тыс. ЕД/мл).

Пример 2. 100 шт. 11-дневных развивающихся куриных эмбрионов (по 20 на каждую из пяти различных концентраций бета-пропиолактона) заражали вирусом гриппа типа B (штамм Lee) по 0,2 мл в аллантоисную полость (величина заражающей дозы составляла 10 тыс. EID 50/0,2 мл) и инкубировали в течение 72 ч при 34^oC.

После этого осветленную центрифугированием аллантоисную жидкость собирали, разделяли на 5 равных порций и добавляли к ним бета-пропиолактон в различных концентрациях. Смеси выдерживали при температуре 18-22^oC в течение 4 мин.

В результате получали препараты аллантоисного интерферона с характеристиками, указанными в табл. 2.

Как видно из табл. 2, оптимальная концентрация бета-пропиолактона при максимальном сохранении противовирусной активности и отсутствии инфекционного вируса в готовом препарате куриного аллантоисного интерферона находится в пределах от 5 до 11 мМ.

Пример 3. 100 шт. 11-дневных развивающихся куриных эмбрионов, по 20 на каждый из пяти вариантов продолжительности выдерживания каждый из пяти вариантов продолжительности выдерживания проб препарата куриного аллантоисного интерферона при температуре 18-22^oC заражали вирусом гриппа типа B (штамм Lee) по 0,2 мл в аллантоинсную полость (величина заражающей дозы составляет 10 тыс. EID 50/0,2 мл) и выдерживали в течение 72 ч при температуре 34^oC.

После этого осветленную центрифугированием аллантоисную жидкость собирали, добавляли к ней бета-пропиолактон в концентрации 5 мМ, разделяли на пять равных порций, которые выдерживали при 18-22^oC в различные по продолжительности промежутки времени.

В результате получали препараты куриного аллантоисного интерферона с характеристиками, указанными в табл. 3.

Как видно из табл. 3, оптимальным временным режимом выдерживания препарата куриного аллантоисного интерферона после обработки бета-пропиолактоном при полном сохранении противовирусной активности и отсутствии в нем инфекционного вируса оказался промежуток в течение 4-10 мин.

Как видно из табл. 1, 2 и 3, в запредельных режимах происходит неполная инактивация вируса или снижение выхода интерферона.

Получение интерферона заявляемым способом поясняется следующим примером:
100 шт. 11-дневных развивающихся куриных эмбрионов заражали вирусом гриппа B (штамм Lee) по 0,2 мл в аллантоисную полость (величина заражающей дозы составляет 10 тыс. EID 50/0,2 мл) и инкубировали в течение 72 ч при 34^oC.

После этого в осветленную центрифугированием аллантоисную жидкость добавляли бета-пропиолактон в концентрации 5 мМ и выдерживали при 18-22^oC в течение 5 мин.

В результате получали препарат куриного аллантоисного интерферона с противовирусной активностью 10000 Ед/мл. в котором отсутствует инфекционный вирус.

В табл. 4 представлены сравнительные характеристики предлагаемого технического решения и прототипа. При этом сведения о прототипе получены на основании результатов 8 опытов его получения в лабораторных условиях, а данные по предлагаемому способу получены по результатам 10 опытов его получения в тех же условиях.

Как видно из приведенных примеров, проиллюстрированных табличным материалом, использование предлагаемого способа обеспечивает повышение выхода целевого продукта за счет заражения 11-дневных развивающихся куриных эмбрионов вирусом гриппа B (штамм Lee), инкубации их в течение 72 ч при температуре 33-35^oC, обработки целевого продукта бета-пропиолактоном в концентрации 5-1 мМ в течение 4-10 мин при 18-22^oC.

В предлагаемом способе изменение температурного режима инкубации развивающихся куриных эмбрионов с вирусом-индуктором на 33-35^oC приводит к увеличению в 8-10 раз выработки аллантоисного куриного интерферона, а инактивация полученного препарата бета-пропиолактоном в указанных режимах полностью сохраняет его противовирусную активность.

Достигнуто также упрощение способа за счет отпавшей необходимости в нейтрализации полуфабриката (из технологического цикла исключен этап обработки его кислотой), а также в использовании холодильного оборудования (как видно из приведенных выше примеров, операция инактивирования вируса производится при температуре 18-22^oC).

Получаемый предлагаемым способом препарат не содержит бета-пропиолактона, так как, общеизвестно, что последний быстро разлагается на биологически нейтральные продукты. Именно поэтому бета-пропиолактон и был известен как дезинфектант при получении микробных препаратов медицинского назначения [5] Не было лишь известно, что он (при каких бы то ни было условиях) индифферентен к куриному аллантоисному интерферону.

Таким образом, среди значительного количества средств химической денконтаминации препаратов интерферона обнаружен эффективный инактиватор вирусов, не снижающий противовирусную активность куриного интерферона, что при сокращенной продолжительности технологического цикла позволяет повысить выход конечного продукта без потери его противовирусной активности.

Источники информации:
1. З. В. Ермольева. "Антибиотики, интерферон, бактериальные полисахариды", 1968, М. с. 271-291.

2. K.H. Fantes. J. gen. Virol. 1967, 1, с. 257-267.

3. K. Cantell, M. Valle, R. Schakir, J.J. Saukkonen, E. Uroma. Ann, Med. exp. Fenn. 1965, v. 43, р. 125-131.

4. Авторское свидетельство СССР N 1575364, 1990.

5. А.Н. Шкидченко, Л.В. Малишевская. Применение бета-пропиолактона с целью стерилизации аппаратуры для культивирования микроорганизмов. "Прикл. биохим. и микробиол.", 1973, т. IX, вып. 1, с. 130-133.

Изобретение относится к вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при получении куриного аллантоисного интерферона для предупреждения и лечения вирусных инфекций у кур. Получен эффективный инактиватор вирусов, не снижающий противовирусную активность куриного интерферона, при сокращенной продолжительности технологического цикла способ позволяет повысить выход целевого продукта. Куриный аллантоисный интерферон с высокой противовирусной активностью получают путем культивирования зараженных штаммов Lee вируса гриппа B куриных эмбрионов при температуре 33-35^oC, а последующую инактивацию вируса проводят обработкой бета-пропиолактоном в концентрации 5-11 мМ в течение 4-10 мин при 18-22^oC. 4 табл.

Способ получения интерферона, предусматриваюший инкубацию развивающихся куриных эмбрионов, зараженных вирусом-индуктором штаммом L ее вируса гриппа В, с последующим выделением целевого продукта и инактивированием вируса, отличающийся тем, что культивирование вируса-индуктора проводят в развивающихся куриных эмбрионах при температуре инкубации 33 35^oС, а инактивацию вируса-индуктора проводят обработкой инкубационной смеси бета-пропиолактоном в концентрации 5 11 мм в течение 4 10 мин при 18 - 22^oС.