Изобретение относится к рекомбинантной плазмидной ДНК рЕТ21-IFN-γ, содержащей ген, кодирующий гамма-интерферон человека, штамму Е. COLI BL21/pET21-IFN-γ - продуценту рекомбинантного гамма-интерферона человека и способу его получения и может быть использовано в молекулярной биотехнологии и генной инженерии для получения гамма-интерферона (иммунного интерферона) человека.
Интерферон-гамма является мощным иммуностимулятором, воздействующим практически на все звенья иммунного ответа: как специфический клеточный и гуморальный иммунный ответ, так и факторы неспецифической защиты. Рекомбинантные интерфероны получают генно-инженерным методом путем культивирования бактериальных штаммов, содержащих в своем генетическом аппарате встроенную рекомбинантную плазмиду, несущую ген интерферона человека.
Применяемые молекулярно-генетические подходы позволяют разрабатывать наиболее оптимальные варианты штаммов продуцентов, уровень биосинтеза целевого продукта которых может составлять десятки процентов от общего количества протеинов в клетке. Максимальный выход продукта при производстве рекомбинантных белков обеспечивается использованием высококопийных плазмид, микроорганизмов-суперпродуцентов и оптимизацией условий их культивирования.
Ниже приведены ближайшие аналоги заявляемого изобретения.
Известен способ [патент США 4681930, МПК C07K 15/26, опубл. 21.07.1987], позволяющий получить интактный нативный ИНФ-γ, который включает несколько стадий: химический лизис клеток штамма-продуцента E. coli и одновременная солюбилизация ИНФ-γ из телец включения раствором 7М гуанидинхлорида; удаление нерастворившихся компонентов центрифугированием; 10-кратное разбавление целевой фракции буфером рН 9,5 и отделение образующегося осадка белков центрифугированием; фракционирование белков на силикагеле (NuGel-952 АС); и, наконец, аффинная хроматография на сорбенте с моноклональными антителами. Полученный продукт находится в растворе 20 мМ натрий-фосфатного буфера, содержащего 1М NaCl и 1М гуанидинхлорид (или 50% этиленгликоль), и представляет собой белок с молекулярной массой 18000, гомогенный по электорофорезу. Выход из 25 г клеток составляет 8 мг (25-32% от содержания в клеточном экстракте). Биологическая активность препарата по ингибированию цитопатического эффекта составляет 107 ед./мг белка.
Недостатком данного способа является то, что одновременное разрушение клеток и солюбилизация ИНФ-γ не дают возможности использовать одно из преимуществ образования телец включения, заключающееся в легком отделении балластных водорастворимых белков бактериальной цитоплазмы от нерастворимого целевого продукта простым центрифугированием. Использование иммунного сорбента для очистки белка очень дорого, нетехнологично, трудно масштабируемо. Требуется дополнительный сложный анализ конечного продукта на отсутствие онкогенного материала родительской миеломной клетки, используемой при получении моноклональных антител.
Известен способ получения рекомбинантного интерферона-гамма человека из трансформированных клеток Escherichia coli (рекомбинантный конститутивный штамм E. coli MH-1/pIFN-γ-trp2), содержащих рекомбинантный иммунный интерферон в виде нерастворимых тел включения, предусматривающий разрушение клеток, экстрагирование интерферона-гамма, центрифугирование и хроматографическую очистку с последующим выделением целевого продукта (патент РФ №2132386, МПК C12N 15/23, опубл. 27.06.1999 г.). Клетки разрушают ультразвуком в присутствии солей цинка и меди, нерастворимые тела включения отделяют центрифугированием, экстрагирование интерферона-гамма проводят смесью мочевины и хлористого лития, а хроматографическую очистку осуществляют в две стадии на катионообменнике СООН-Биохром К-1, представляющем собой гранулированный сополимер метакриловой кислоты и диметакрилата пентаэритрита, при этом на первой стадии элюирование проводят при рН 9,5, а на второй - при рН 6,0. Экстрагирование проводят 6-8М мочевиной в присутствии хлористого лития в концентрации 6М.
Недостатком используемого рекомбинантного штамма-продуцента является то, что в состав генетической конструкции введен триптофановый оперон, активирующий синтез целевого продукта только при дефиците триптофана в питательной среде, что затрудняет контроль его продукции в стандартных средах в способе получения интерферона-гамма.
Известна рекомбинантная плазмидная ДНК pTTg Km2, кодирующая синтез рекомбинантного иммунного интерферона человека, размером 4440 пар оснований (п.о.), состоящая из Hind III-EcoR I фрагмента ДНК размером 220 п.о. с последовательностью триптофанового промотора Escherichia coli; EcoR I Xba I фрагмента ДНК размером 20 п.о. с синтетической последовательностью участка связывания рибосом:
5' GAATCCAGGAGGAATCTAGA 3'
3' CTTAAGTCCTCCTTAGATCT 5',
Xba I Bam HI фрагмента ДНК размером 450 п.о. кодирующего иммунный интерферон человека с аминокислотной последовательностью, приведенной на фиг. 5; Bam HI-Sca I фрагмента ДНК размером 850 п.о. плазмиды РКК 233-3, содержащего последовательность терминатора транскрипции rrn ВТТ; Pst I-Pst I фрагмента ДНК размером 1500 п.о. плазмиды pUC 4K, кодирующего устойчивость к канамицину (kan); Bgl I-Hind III фрагмента ДНК размером 1400 п.о. плазмиды pUC 19 (патент РФ №2097428, МПК C12N 15/23, опубл. 23.12.1996 г.). Известен также штамм бактерий Escherichia coli ТЗg (НКМВ-58g) продуцент рекомбинантного иммунного интерферона человека и способ получения рекомбинантного иммунного интерферона человека (γ-интерферона). Способ предусматривает глубинное культивирование рекомбинантного штамма Е. coli продуцента γ-интерферона в питательной среде в условиях аэрации, выделение агрегированного белка с последующей его ренатурацией и очисткой от примесей, отличающийся тем, что в качестве рекомбинантного штамма используют штамм Е. coli ТЗg (ЦКМ B-58g), культивирование осуществляют на питательной среде с пониженным содержанием триптофана при рН 8 6, после прекращения удвоения клеток величину рН уменьшают до 6 5, агрегированный белок отмывают фосфатным буфером, растворяют в концентрированном растворе мочевины с цетавлоном, примеси из раствора ренатурированного γ-интерферона осаждают добавлением соли с двух- или трехзарядным анионом при величине рН раствора 7 9 с последующей хроматографией раствора на анионообменнике. Раствор γ-интерферона в мочевине дополнительно очищают с помощью обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии.
В данном случае недостатком плазмиды pTTgKm2 является то, что экспрессия гена человеческого интерферона гамма с триптофанового промотора запускается в средах с дефицитом триптофана, что затрудняет контроль его продукции в стандартных средах в способе получения интерферона-гамма.
Известна рекомбинантная плазмидная ДНК pGIF315 размером 3,15 т.п.н., кодирующая в клетках Escherichia coli рекомбинантный человеческий гамма-интерферон размером 144 а. о. с молекулярной массой 16,9 кДа, характеризующаяся следующими свойствами: содержит между двумя сайтами рестриктазы EcoRI промотор А2 и между сайтами рестриктаз EcoRI и KpnI промотор A3 фага Т7, между сайтами рестриктаз KpnI и XbaI рибосомосвязывающий сайт, между сайтами рестриктаз XbaI и BglII ген, кодирующий синтез рекомбинантного человеческого гамма-интерферона, между двумя сайтами рестриктазы XbaI терминатор транскрипции, имеет ген устойчивости к ампициллину (патент РФ №2214832, МПК C12N 15/23, опубл. 27.10.2003 г.). Способ получения рекомбинантного человеческого гамма-интерферона включает культивирование штамма Escherichia coli, трансформированного введением плазмиды pGIF315, кодирующей синтез гамма-интерферона, в жидкой питательной среде с последующим выделением и очисткой белка. При этом используют плазмиду pGIF315, культивирование проводят в питательной среде, не требующей дефицита каких-либо компонентов или добавления каких-либо индукторов для синтеза гамма-интерферона, после лизиса клеток осадок отмывают 1-3 М растворами мочевины и растворяют в 6-8 М растворе мочевины, полученный раствор наносят на катионообменный сорбент при рН 7,0-8,5 с элюцией буфером без мочевины с добавлением 180 мМ NaCl, чем достигается ренатурация гамма-интерферона. Получают гамма-интерферон в виде нерастворимых телец включений не менее 95%-ной электрофоретической чистоты, с отношением величины оптической плотности раствора 280/254 нм более 2,5 и удельной биологической активностью (1,5-2)×107. В качестве катионообменного сорбента используют сорбент, имеющий отрицательный заряд частиц при рН 7,0-9,0.
В данном изобретении не указан уровень синтеза гамма-интерферона и выход конечного чистого продукта.
Известна рекомбинантная плазмидная ДНК pTrcIFdL, кодирующая полипептид с активностью гамма-интерферона человека с мол. массой 3,06 Md (4,642 т.п.о.), состоящая из ClaI/HindIII-фрагмента ДНК плазмиды pTrcTEGF длиной 4,232 т.п.о., включающего trc-промотор E. coli, синтетический усилитель трансляции TREN гена 10 бактериофага Т7, терминатор транскрипции фага лямбда, ген bla β-лактамазы, определяющий устойчивость трансформированных плазмидой pTrcIFdL клеток к ампициллину, участок ori инициации репликации; фрагмента ДНК плазмиды pGFIFΔw размером 0,402 т.п.о., содержащего ген Ifg, кодирующий аминокислотную последовательность гамма-интерферона человека с делецией 10 С-концевых аминокислот и заменой Gln в положении 134 на Leu и фланкированного сайтами рестрикции ClaI и HindIII; содержащая уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, имеющими следующие координаты: EcoRI - 270, Kpn I - 286, Cla I - 377; HindIII - 787, XbaI - 340 (патент РФ №2399670, МПК C12N 15/23, опубл. 20.09.2010 г.). Для получения штамма-продуцента полипептида с биологической активностью гамма-интерферона человека компетентные клетки Escherichia coli штамма BL21(DE3) трансформируют рекомбинантной плазмидой pTrcIFdL с получением штамма Escherichia coli BL21(DE3)/pTrcIFdL.
Средний выход очищенного ИФН-гамма составляет 50 мг из 1 л культуры.
Известен штамм Escherichia coli BL21(DE3)-pIE-gamma - продуцент интерферона гамма человека, ВКПМ В-11012 (Евразийский патент №23379, МПК C12N 15/23, опубл. 31.05.2016 г.). Способ получения препарата рекомбинантного интерферона гамма человека включающий культивирование рекомбинантного штамма E. coli - продуцента интерферона гамма в питательной среде, выделение агрегированного белка с последующей его ренатурацией и очисткой от примесей. В качестве рекомбинантного штамма используют штамм E. coli BL21(DE3)-pIE-gamma, после культивирования осуществляют индукцию экспрессии гена, кодирующего интерферон гамма человека, выделение агрегированного белка осуществляют в результате лизиса бактериальных клеток с последовательным использованием буфера 20 мМ трис-HCl рН 7.5, 5 мМ ЭДТА и 1 мМ феноксиметилсульфонилфторид и ультразвука, трехкратного отмывания телец включения 0.2 М дезоксихолятом натрия с последующей обработкой TEV-протеазой и пропусканием через мембранный фильтр, ренатурацию осуществляют с использованием 8 М раствора мочевины в буфере, содержащем 0.1 М Tris рН 8.0, 0.2 мМ ЭДТА, 0.5 М L-аргинин, после чего ренатурированный белок обессоливают раствором 20 мМ Tris-HCl рН 8.0, содержащим 100 мМ мочевину, очистку полученного раствора белка осуществляют на S-Sepharose колонке и S-100 колонке (2.5×80 см) с использованием соответствующих буферов, высокоочищенный раствор полученного непроцессированного безметионинового нативного рекомбинантного интерферона гамма человека смешивают с физиологически приемлемым носителем.
Во всех приведенных работах описаны штаммы, синтезирующие белок интерферон-гамма, формирующийся в тельцах включения, что усложняет процесс выделения и на стадии ренатурации приводит к потере как самого белка, так и его биологической активности.
Наиболее близким аналогом (прототипом) является мутантный ген IFN Δ 10, кодирующий полипептид с активностью гамма-интерферона человека (патент РФ №2105813, МПК C12N 15/23, опубл. 27.02.1998 г.). Известна рекомбинантная плазмида pIFN D10, обеспечивающая экспрессию гена IFN D 10 в Eschererichia coli, имеющая молекулярную массу 2,92 Mda (4421 п.о.), содержит: большой фрагмент EcoRI-Pst I плазмиды pBR 322 размером 3940 п.о. фрагмент Eco R 1-Pst 1 с геном IFN D 10 (481 п.о.) в качестве генетического маркера ген устойчивости к тетрациклину; уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, расположенными на следующих расстояниях от EcoRI сайта: Hind 111 29 п.о. BamHI 375 п.о. Pvu 11 - 2068 п.о. Pst 1-3609 п.о. EcoRI 4079 п.о. Известен также штамм Escherichia coli ВКПМ В-6663 продуцент полипептида, обладающего активностью гамма-интерферона человека.
Наиболее близким способом (патент РФ №2326944, МПК C12N 15/23, опубл. 20.06.2008 г.) является способ получения аналога рекомбинантного интерферона гамма человека, включающий культивирование штамма-продуцента Escherichia coli MH-1/pIFN D10, разрушение клеток ультразвуком, удаление клеточного дебриса и хроматографию на колонке с сорбентом. Для получения инокулята используют высокопродуктивные клоны, которые предварительно отбирают путем электрофоретического анализа в 15%-ном полиакриламидном геле в денатурирующих условиях на относительное содержание в трансформированных клетках целевого белка. Хроматографическую очистку продукта проводят на КМ-сефарозе сначала в линейном градиенте буферов 50 мМ трис-HCl, рН 8,3-50 мМ цитрат натрия, рН 6,5 с 0,5М NaCl, а затем в экспоненциальном градиенте 50 мМ цитрат натрия, рН 6,5-50 мМ трис-HCl, рН 8,3 с 1 М NaCl.
В данном прототипе рекомбинантная плазмида pIFNΔ10 и штамм-продуцент E. coli MH-l/pIFNΔ10 обеспечивают конститутивный биосинтез мутантного гамма-интерферона человека - дельтаферона. Синтезированный мутантный белок находится в клетке в форме растворимого белка на 90-95% и обладает антивирусной активностью 105-106 МЕ/мг.
Однако недостатком штамма-прототипа является невысокий уровень экспрессии белка (не более 15%), а также использование для культивирования штамма-продуцента питательной среды с дорогостоящим источником азотного питания - казаминовыми кислотами. Питательная среда с казаминовыми кислотами дороже среды для культивирования штамма описываемого в заявляемом изобретении примерно в 4-5 и более раз. Кроме того, удаление десяти аминокислотных остатков входящих в структуру интерферона гамма человека оказывают негативное влияние на некоторые физико-химические свойства. В частности повышается склонность к образованию агрегатов, что приводит к снижению стабильности препарата при длительном хранении.
Осуществление изобретения.
Техническим результатом заявляемого изобретения является расширение спектра средств и способов получения рекомбинантного белка гамма интерферона человека, сохранения его физико-химических свойств, повышение уровня экспрессии указанного белка и снижение затрат на технологию его получения, в том числе за счет упрощения и сокращения времени технологического процесса за счет получения белка в клетках E.coli в растворимой форме.
Указанный технический результат достигается тем, что создана рекомбинантная плазмидная ДНК pET21-IFN-γ размером 5811 п.н.,
обеспечивающая синтез полипептида, обладающего активностью гамма интерферона человека, имеющая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 и содержащая в своем составе:
- участок начала репликации П ori (стрелка указывает направление синтеза (+) цепи), имеющий координаты с 12 по 467 п. н.;
- ampR promotor (координаты с 494 по 598 п. н.) промотор гена бета-лактамазы;
- ген AmpR (координаты с 599 по 1459 п. н.), в качестве генетического маркера, определяющего устойчивость (кодирует бета-лактамазу) к ампициллину клеток бактерии E. coli, трансформированных рекомбинантной плазмидой pET21-IFN-γ;
- участок начала репликации ori (координаты с 1630 по 2218 п.н.)
- ген белка репрессора lacI (координаты с 3648 п.н. по 4730 п.н.) - ДНК-связывающий белок, который ингибирует экспрессию генов E. coli и обеспечивает экспрессию целевого рекомбинантного белка IFN-γ после добавления индуктора изопропил-Р-Б-1-тиогалактопиранозида (IPTG);
- lacI promotor (координаты с 4731 по 4808 п.н.) промотор гена белка репрессора lacI;
- промотор фага Т7 (координаты с 5117 по 5135 п.н.), обеспечивающий экспрессию последовательности гена IFN-γ в прокариотических клетках E. coli;
- lac operator (координаты с 5136 по 5160 п.н.) оператор lac, участок с которым взаимодействует белок репрессор lacI;
- RBS (координаты с 5191 по 5196 п.н.) последовательность Шайно-Дальгарно;
- ген IFN-γ, имеющий координаты с 5208 по 5639 п.н., кодирующий рекомбинантный полипептид, экспрессируемый в прокариотической системе E. coli и обладающий активностью гамма интерферона человека;
- Т7 terminator (координаты с 5739 по 5786 п.н.) область терминатора транскрипции бактериофага Т7.
Использование рекомбинатной плазмиды, содержащей сильный индуцибельный промотор фага Т7, обеспечивает высокий и регулируемый уровень экспрессии белка интерферона гамма.
Указанный технический результат достигается также тем, что получен рекомбинантный штамм Escherichia coli BL21/pET21-IFN-γ - продуцент полипептида, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 и активность гамма-интерферона человека, трансформированный рекомбинантной плазмидной ДНК рЕТ21-IFN-γ по п. 1 формулы и депонированный в государственной коллекции бактерий, бактериофагов и грибов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора под регистрационным номером В-1387.
Указанный технический результат достигается также тем, что создан способ получения рекомбинантного гамма интерферона человека, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID N0:2, включающий инокулирование питательной среды LB рекомбинантным штаммом E. coli BL 21/pET21-IFN-γ по п. 2 формулы в объеме 1-2% от объема питательной среды, культивирование указанного штамма при температуре +37°С с подачей воздуха для аэрации суспензии клеток и ее перемешивании. На этапе достижения середины логарифмической фазы роста клеток штамма E. coli при оптической плотности OD550 1,0-1,5 температуру биомассы снижают с +37°С до +25,0±1,0°С и подают в суспензию клеток индуктор lac-оперон, в качестве которого используют изопропил-бета-О-тиогалактопиранозид в концентрации 0,05 мМ. Последующее культивирование биомассы клеток при указанной пониженной температуре осуществляют в течение не менее 8 часов с получением в клетках Е. Coli растворимого белка интерферона гамма. Полученную биомассу клеток отделяют центрифугированием. Разрушение клеток штамма-продуцента проводят при помощи ультразвука до снижения оптической плотности на 45-50% от ее исходного значения при длине волны 595 нм, клеточный дебрис отделяют центрифугированием и осветляют надосадочную фазу жидким сорбентом Аммофлок-25, а для хроматографической очистки растворимого белка интерферона гамма используют комбинацию ион-обменных хроматографий на SP- и Q-сефарозах.
Питательная среда LB содержит 10 г/л пептона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCl, 100 мкг/мл ампициллина натриевой соли. Уровень аэрации составляет: 0,8 объема воздуха/мин на 1,0 объем культуральной жидкости. Перемешивание суспензии клеток осуществляют при вращении мешалки со скоростью 100 об/мин.
Центрифугирование при отделении биомассы клеток Е. Coli осуществляют на проточной центрифуге при 19000 g, а клеточный дебрис от жидкой фазы отделяют центрифугированием при 12000 g, 45 мин, при температуре +4°С. Содержание жидкого сорбента Аммофлок-25 в надосадочной фазе раствора белка составляет 10% от объема указанной жидкой фазы. Созданные рекомбинантная плазмидная ДНК рЕТ21-IFN-γ и бактерия-продуцент на ее основе, подбор условий культивирования: снижение температуры культивирования клеток Е. coli/pET-IFN-γ после внесения ИПТГ - индуктора синтеза белка с 37°С до 25°С и последующим культивированием в течение 8-9 ч обеспечивает получение целевого белка интерферона гамма в клетках E. coli в растворимой форме без изменения его структуры и физико-химических свойств.
Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами. На фиг. 1 представлена нуклеотидная последовательность (SEQ ID N0:1) интеграционного вектора рЕТ21-IFN-γ. На фиг. 2 приведена аминокислотная последовательность (SEQ ID N0:2) белка IFN-γ. На фиг. 3 изображена генетическая карта плазмидного вектора pET21-INF-γ: Т7 promoter - промотор гена белка 10 фага Т7; Т7 tag - лидерная последовательность гена 10 бактериофага Т7; INF-γ - последовательность, кодирующая зрелый интерферон-гамма; Т7 terminator - терминатор бактериофага Т7. На фиг. 4 представлена электрофореграмма фракций клеточных белков бактерий E. coli BL21/pET21-IFN-γ после дезинтеграции и центрифугирования. Электрофорез в 12% ПААГ, окрашивание Кумасси G-250. Условные обозначения: Дорожки: 1, 3 - белки супернатанта после инкубации с ИПТГ при температуре 37°С, 25°С, соответственно; 2, 4 - осадки клеточных белков после инкубации с ИПТГ при температуре 37°С, 25°С. М-маркер молекулярной массы белков (17-250 кДа), Thermo Scientific #26619. На фиг. 5 представлена электрофореграмма белковых фракций, полученных в процессе очистки ИФН-γ. Электрофорез в 12% ПААГ, окрашивание Кумасси G-250. Условные обозначения: Дорожки: М - маркер молекулярной массы белков (17-250 кДа), 1 - лизат биомассы; 2 - осадок при осветлении; 3 - раствор белка после осветления Аммофлоком-25; 4 - конечный препарат (белок ИФН-γ).
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Теоретический анализ, подбор праймеров для амплификации последовательности, кодирующей IFN-γ.
1.1 Теоретический анализ, подбор праймеров для амплификации последовательности, кодирующей IFN-γ, был проведен с помощью программного обеспечения SnapGene.
1.2. Синтез гена, кодирующего зрелый IFNγ с его встройкой в донорскую ДНК - матрицу (плазмиду pGH-IFN-γ) был проведен в коммерческой научно-производственной фирме ЗАО «Евроген» (г. Москва).
1.3. Подбор праймеров (табл. 1) для амплификации нуклеотидной последовательности гена, кодирующей IFN-γ, расчет условий и кинетики ПЦР нуклеотидной последовательности осуществляли с помощью программы SnapGene. Синтез праймеров был проведен в коммерческой научно-производственной фирме ООО «ДНК-Синтез» (г. Москва).
Пример 2. Создание ДНК-конструкции pET21-IFN-γ.
2.1. Амплификация методом ПЦР фрагмента ДНК, кодирующего IFN-γ
На матрице плазмиды pGH-IFN-γ, с использованием амплификатора «Mastercycler Gradient» (Eppendorf, Германия) методом ПЦР с помощью специфических праймеров (табл. 1) был амплифицирован район, кодирующий IFN-γ.
2.2. Выделение ДНК из агарозного геля.
После проведения ПЦР, очистку продуктов амплификации ДНК проводили фракционированием методом электрофореза в 0,8%-ном агарозном геле в Трис-ацетатном буфере (TAE×1), с бромистым этидием (EtBr) в концентрации 0,2 мкг/мл. После визуализации под УФ - излучением фрагменты ДНК необходимой длины, разделенные в агарозном геле (фиг. 3) вырезали из геля и элюировали при помощи набора Cleanup Standard (ЗАО «Евроген», г. Москва) в соответствии с рекомендациями производителя и ресуспендировали осадок в 20 мкл бидистиллированной воды.
2.3. Ферментативный гидролиз векторной плазмиды рЕТ21а(-) и ПЦР продукта (последовательности IFN-γ).
Для клонирования гена IFN-γ в составе вектора рЕТ21а(-) были использованы эндонуклеазы рестрикции CciNI и FauNDI (ООО «Сибэнзим», г. Новосибирск) с прилагаемыми к ним буферами. Реакционную смесь готовили в соответствии с активностью фермента (2-5 ед. акт. на 1 мкг ДНК) и концентрации плазмидной ДНК. Условия реакции: температура, состав буфера и длительность проведения ферментативного гидролиза ДНК подбирали в соответствии с инструкциями производителя.
Обработанные ферментами ПНР фрагмент, соответствующий гену IFN-γ и вектор рЕТ21а(-) разделяли с помощью электрофореза в 1% агарозном геле с последующим выделением с помощью набора Cleanup Standard (ЗАО «Евроген, г. Москва) в соответствии с инструкцией производителя.
2.4. Лигирование ПЦР продукта (последовательности IFN-γ) и векторной плазмиды рЕТ21а(-).
Реакцию лигирования проводили 30 минут при комнатной температуре, используя смесь из 2 мкг ампликонов с ДНК-матрицы, 1 мкг векторной плазмиды рЕТ21а(-) и 20 е.а. ДНК-лигазы фага Т4 (ООО «Сибэнзим», г. Новосибирск) в прилагаемом к коммерческому набору реакционном буфере. Полученный препарат ДНК конструкции pET21-IFN-γ (фиг.3, нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 1) использовали для трансформирования культуры компетентных клеток E.coli штамм BL21(DE3).
Пример 3. Получение производственного и рабочего штамма- продуцента E.coli BL21(DE3)/pET21-IFN-γ и определение уровня продуктивности
Для определения уровня индуцируемой экспрессии гамма-интерферона засевают 100 мкл рабочей бактериальной культурой (РБК) в пробирку с 5 мл жидкой среды LB, содержащей 10 г/л пептона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCl с добавкой ампициллина натриевой соли в концентрации 100 мкг/мл, инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 18 ч. Ночную культуру засевают в разведении 1:50 в 100 мл жидкой среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и растят до OD550 1,0 при 37°С на качалке при 160 об/мин. Добавляют раствор ИПТГ до концентрации 0,05 мМ и продолжают инкубацию в течение 8 ч.
Уровень продукции гамма-интерферона определяют электрофорезом в ПААГ по методу Лэммли. Отбирают 1 мл жидкой культуры продуцента, центрифугируют при 5000 об/мин 5 минут, осажденные клетки растворяют в 100 мкл лизирующего буфера с красителем бромфеноловым синим, прогревают 5 мин на кипящей водяной бане. Полученный лизат клеток анализируют электрофорезом в денатурирующих условиях в 12% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. Гель окрашивают Coomassie G-250, сканируют и проводят его денситометрию. По данным денситометрии содержание гамма-интерферона составляет не менее 30% от общего белка клетки (фиг. 4, аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 2).
Пример 4. Способ получения биомассы штамма-продуцента E.coli BL21 (DE3)/pET21 -IFN-γ
Инокулят для ферментации готовят засевом 100 мкл РБК в колбы с жидкой средой LB, содержащей 10 г/л пептона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 5г/л NaCl с добавлением ампициллина в концентрации 100 мкг/мл, инкубируя культуру на шейкере-инкубаторе при температуре 37°С в течение 18 ч и вносят в ферментер.
Ферментацию проводят в ферментере вместимостью 100 л с объемом питательной среды 70-80 %, оснащенном системами измерения и регулирования температуры, скорости вращения мешалки и подачи воздуха для аэрации. Для засева используют посевной материал, полученный инкубацией в шейкере-инкубаторе при температуре 37±1°С в течение 16-18 ч. В ферментер со стерильной питательной средой LB, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл, вносят посевной материал в количестве, составляющем 1-2 % от объема питательной среды. В течение культивирования уровень аэрации 0,8 объема воздуха/мин: 1,0 объем культуральной жидкости, перемешивание 100 об/мин. В середине логарифмической фазы роста при OD550 1,0-1,5 КЖ охлаждают до 25,0±1,0°С подачей воды в рубашку ферментера, вносят индуктор синтеза белка - изопропил-бета-D-тиогалактопиранозид (ИПТГ) в концентрации 0,05 мМ, культивирование продолжают при данной температуре в течение 8-9 ч.
После завершения процесса ферментации биомассу отделяют центрифугированием на проточной центрифуге при 19000 об/мин.
Пример 5. Дезинтеграция биомассы
10 г влажных клеток штамма-продуцента Е. coli суспендируют в 100 мл буферного раствора: 20 мМ трис-НСl, pH 8.0, содержащего 1 мМ фенилметилсульфонилфторид (ингибитор протеиназ). Суспензию помещают в ледяную баню и стенки клеток разрушают при помощи ультразвука до снижения оптической плотности на 45-50% от ее исходного значения при длине волны 595 нм. Затем центрифугируют при 12000g в течение 45 мин при температуре 4°С.
Пример 6. Осветление раствора белка
Для первичной очистки и осветления раствора после центрифугирования применяют жидкий сорбент Амофлок-25. Для этого 10 мл Аммофлок-25 добавляют в супернатант, объемом 100 мл, содержащий целевой растворимый белок. После этого полученный раствор инкубируют 12 часов при 2-8°С и затем центрифугируют (12 000 g, 30 мин, 4°С). Пример 7. Ионообменная хроматография на последовательно соединенных колонках с сорбентами Q- и SP-сефарозой
Фракцию целевого белка, полученную в примере 3 наносят на соединенные последовательно колонки с ионообменными сорбентами Q- сефароза (20 мл) и SP-сефароза (20 мл), уравновешенные 20 мМ трис-НС1, pH 8.0. После нанесения раствора белка колонки промывают буфером 20 мМ трис-НС1, pH 8.0. Колонку с Q-сефарозой, на которой целевой белок не сорбируется, отсоединяют. Целевой белок элюируют с колонки с SP- сефарозой линейным градиентом 0 - 1 М NaCl в 20 мМ трис-НС1, pH 8.0. (фиг. 5). Фракции целевого белка с оптической плотностью от 0,25 о.е. анализируют при помощи электрофореза в денатурирующих условиях в 12 % полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (фиг. 5). Фракции, содержащие ИНФ-гамма объединяют и диализуют. Диализ ведут против буфера, содержащего 20 мМ трис-НСl, pH 8.0 и 50 мМ NaCl. Выход целевого белка составляет 50±5 мг (5 мг с 1 г биомассы). Раствор белка подвергают стерилизующей фильтрации и хранят при минус 20°С.
В таблице 2 представлен материальный баланс и выход ИНФ-гамма в процессе очистки из 10 г биомассы.
Пример 8. Определение специфической (противовирусной) активности
Специфическую (противовирусную) активность определяют микрометодом в 96-луночных планшетах с плоским дном, по подавлению цитопатического действия тест-вируса ЕМС штамма «Колумбия» в дозе 100 ЦПД50 (трехкратное разведение) в культуре клеток Л-68. В качестве контрольного препарата при определении противовирусной активности используют Ингарон (интерферон гамма человеческий рекомбинантный, лиофилизат), 100000 ME. Активность полученного препарата ИФН-γ составляет 1*105 МЕ/мг.
Таким образом, заявляемое техническое решение обеспечивает получение растворимой формы высокоочищенного рекомбинантного ИНФ-гамма в количествах не менее 5 мг с 1 г биомассы с высокой биологической чистотой.
По сравнению со штаммом-прототипом (уровень экспрессии белка ИФН-γ не более 15% от общего белка клеток), заявляемый штамм и технология получения белка позволяет получить большее количество интерферона (уровень экспрессии ИФН-γ до 40% от общего белка клеток). Кроме того, в предлагаемом изобретении по сравнению с прототипом отсутствует негативное влияние на физико-химические свойства белка гамма интерферона, который в меньшей степени подвергается агрегации и более стабильный при хранении.
--->
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Гамма интерферон
человека_16.03.2023.xml" softwareName="WIPO Sequence"
softwareVersion="2.2.0" productionDate="2023-03-16">
<ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>123456</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2023-03-16</FilingDate>
</ApplicationIdentification>
<ApplicantFileReference>123456</ApplicantFileReference>
<EarliestPriorityApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>1234567</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2023-03-16</FilingDate>
</EarliestPriorityApplicationIdentification>
<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное бюджетное учреждение
науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии
«Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Роспотребнадзора)</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>Federalnoe byudzhetnoe uchrezhdenie nauki
"Gosudarstvennyj nauchnyj tsentr virusologii i biotekhnologii
"Vektor" Federalnoj sluzhby po nadzoru v sfere zashchity
prav potrebitelej i blagopoluchiya cheloveka (FBUN GNTS VB
"Vektor" Rospotrebnadzora) (RU)</ApplicantNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">Рекомбинантная плазмидная ДНК
pET21-IFN-γ, содержащая ген, кодирующий гамма интерферон человека,
штамм E. coli BL21/pET21-IFN-γ - продуцент рекомбинантного гамма
интерферона человека и способ получения гамма интерферона
человека</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>5811</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..5811</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtg
gtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttccctt
cctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatt
tagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccc
tgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactg
gaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattg
gttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaatttca
ggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgt
atccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattca
acatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacg
ctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaaca
gcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgct
atgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcag
aatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattat
gcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaa
ggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctg
aatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgcagcaatggcaacaacgttgcgcaaac
tattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagt
tgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgag
cgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctaca
cgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaa
gcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaattt
aaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttcc
actgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctg
ctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctt
tttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttag
gccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgc
tgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcgg
tcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacc
tacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcgg
cagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtc
gggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaa
acgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgc
gttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccga
acgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcctgatgcggtattttctccttacgc
atctgtgcggtatttcacaccgcatatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagtta
agccagtatacactccgctatcgctacgtgactgggtcatggctgcgccccgacacccgccaacacccgc
tgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagc
tgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcagcgt
ggtcgtgaagcgattcacagatgtctgcctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttctccagaagcgt
taatgtctggcttctgataaagcgggccatgttaagggcggttttttcctgtttggtcactgatgcctcc
gtgtaagggggatttctgttcatgggggtaatgataccgatgaaacgagagaggatgctcacgatacggg
ttactgatgatgaacatgcccggttactggaacgttgtgagggtaaacaactggcggtatggatgcggcg
ggaccagagaaaaatcactcagggtcaatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggtgttccacagggt
agccagcagcatcctgcgatgcagatccggaacataatggtgcagggcgctgacttccgcgtttccagac
tttacgaaacacggaaaccgaagaccattcatgttgttgctcaggtcgcagacgttttgcagcagcagtc
gcttcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattctgctaaccagtaaggcaaccccgccagcctagccgg
gtcctcaacgacaggagcacgatcatgcgcacccgtggggccgccatgccggcgataatggcctgcttct
cgccgaaacgtttggtggcgggaccagtgacgaaggcttgagcgagggcgtgcaagattccgaataccgc
aagcgacaggccgatcatcgtcgcgctccagcgaaagcggtcctcgccgaaaatgacccagagcgctgcc
ggcacctgtcctacgagttgcatgataaagaagacagtcataagtgcggcgacgatagtcatgccccgcg
cccaccggaaggagctgactgggttgaaggctctcaagggcatcggtcgagatcccggtgcctaatgagt
gagctaacttacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctg
cattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgccagggtggtttttcttttc
accagtgagacgggcaacagctgattgcccttcaccgcctggccctgagagagttgcagcaagcggtcca
cgctggtttgccccagcaggcgaaaatcctgtttgatggtggttaacggcgggatataacatgagctgtc
ttcggtatcgtcgtatcccactaccgagatatccgcaccaacgcgcagcccggactcggtaatggcgcgc
attgcgcccagcgccatctgatcgttggcaaccagcatcgcagtgggaacgatgccctcattcagcattt
gcatggtttgttgaaaaccggacatggcactccagtcgccttcccgttccgctatcggctgaatttgatt
gcgagtgagatatttatgccagccagccagacgcagacgcgccgagacagaacttaatgggcccgctaac
agcgcgatttgctggtgacccaatgcgaccagatgctccacgcccagtcgcgtaccgtcttcatgggaga
aaataatactgttgatgggtgtctggtcagagacatcaagaaataacgccggaacattagtgcaggcagc
ttccacagcaatggcatcctggtcatccagcggatagttaatgatcagcccactgacgcgttgcgcgaga
agattgtgcaccgccgctttacaggcttcgacgccgcttcgttctaccatcgacaccaccacgctggcac
ccagttgatcggcgcgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacggcgcgtgcagggccagactggaggt
ggcaacgccaatcagcaacgactgtttgcccgccagttgttgtgccacgcggttgggaatgtaattcagc
tccgccatcgccgcttccactttttcccgcgttttcgcagaaacgtggctggcctggttcaccacgcggg
aaacggtctgataagagacaccggcatactctgcgacatcgtataacgttactggtttcacattcaccac
cctgaattgactctcttccgggcgctatcatgccataccgcgaaaggttttgcgccattcgatggtgtcc
gggatctcgacgctctcccttatgcgactcctgcattaggaagcagcccagtagtaggttgaggccgttg
agcaccgccgccgcaaggaatggtgcatgcaaggagatggcgcccaacagtcccccggccacggggcctg
ccaccatacccacgccgaaacaagcgctcatgagcccgaagtggcgagcccgatcttccccatcggtgat
gtcggcgatataggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtgatgccggccacgatgcgtccggcgtag
aggatcgagatctcgatcccgcgaaattaatacgactcactataggggaattgtgagcggataacaattc
ccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatgcaggacccatacgtacaagaag
cagaaaaccttaagaaatattttaatgcaggtcattcagatgtagcggataatggaactcttttcttagg
cattttgaagaattggaaagaggagagtgacagaaaaataatgcagagccaaattgtctccttttacttc
aaactttttaaaaactttaaagatgaccagagcatccaaaagagtgtggagaccatcaaggaagacatga
atgtcaagtttttcaatagcaacaaaaagaaacgagatgacttcgaaaagctgactaattattcggtaac
tgacttgaatgtccaacgcaaagcaatacatgaactcatccaagtgatggctgaactgtcgccagcagct
aaaacagggaagcgaaaaaggagtcagatgctgtttcgaggtcgaagagcatcccagtaagcggccgcac
tcgagcaccaccaccaccaccactgagatccggctgctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggctgc
tgccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctg
aaaggaggaactatatccggat</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>143</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..143</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q4">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>QDPYVQEAENLKKYFNAGHSDVADNGTLFLGILKNWKEESDRKIMQSQI
VSFYFKLFKNFKDDQSIQKSVETIKEDMNVKFFNSNKKKRDDFEKLTNYSVTDLNVQRKAIHELIQVMAE
LSPAAKTGKRKRSQMLFRGRRASQ</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<---
Изобретение относится к биотехнологии. Предложена рекомбинантная плазмидная ДНК pET21-IFN-γ, обеспечивающая синтез полипептида, обладающего активностью гамма-интерферона человека. Также предложена рекомбинантная бактерия Escherichia coli, являющаяся продуцентом полипептида, имеющего активность гамма-интерферона человека, и содержащая указанную рекомбинантную плазмидную ДНК. Также предложен способ получения рекомбинантного гамма-интерферона человека с использованием указанной бактерии. Изобретение обеспечивает расширение арсенала средств получения рекомбинантного белка гамма-интерферона человека, а также повышение уровня экспрессии указанного белка. 3 н.п. ф-лы, 5 ил., 2 табл., 8 пр.
1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pET21-IFN-γ размером 5811 п.н., обеспечивающая синтез полипептида с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2, обладающего активностью гамма-интерферона человека, имеющая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 и содержащая в своем составе:
- участок начала репликации f1 ori, имеющий координаты с 12 по 467 п.н.;
- ampR promotor - промотор гена бета-лактамазы, имеющий координаты с 494 по 598 п.н.;
- ген AmpR, кодирующий бета-лактамазу, используемый в качестве генетического маркера, определяющего устойчивость к ампициллину клеток бактерий E. coli, трансформированных рекомбинантной плазмидой рЕТ21-IFN-γ и имеющий координаты с 599 по 1459 п н.;
- участок начала репликации ori, имеющий координаты с 1630 по 2218 п.н.;
- ген белка репрессора lacI - ДНК-связывающий белок, который ингибирует экспрессию генов E. coli и обеспечивает экспрессию целевого рекомбинантного белка IFN-γ после добавления индуктора изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG) и имеющий координаты с 3648 по 4730 п.н.;
- lacI promotor - промотор гена белка репрессора lacI, имеющий координаты с 4731 по 4808 п.н.;
- промотор фага Т7, обеспечивающий экспрессию последовательности гена IFN-γ в прокариотических клетках E. coli и имеющий координаты с 5117 по 5135 п.н.;
- lac operator - оператор lac, являющийся участком с которым взаимодействует белок репрессор lacI и имеющий координаты с 5136 по 5160 п.н.;
- RBS, являющийся последовательностью Шайно-Дальгарно, имеющей координаты с 5191 по 5196 п н.;
- ген IFN-γ, имеющий координаты с 5208 по 5639 п.н., кодирующий рекомбинантный полипептид, экспрессируемый в прокариотической системе E. coli и обладающий активностью гамма-интерферона человека;
- Т7 terminator - область терминатора транскрипции бактериофага Т7, имеющий координаты с 5739 по 5786 п.н.
2. Рекомбинантная бактерия Escherichia coli - продуцент полипептида с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2, имеющего активность гамма-интерферона человека, содержащая рекомбинантную плазмидную ДНК рЕТ21-IFN-γ по п. 1.
3. Способ получения рекомбинантного гамма-интерферона человека, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, включающий инокулирование питательной среды LB, содержащей 10 г/л пептона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCl с добавлением ампициллина натриевой соли в концентрации 100 мкг/мл, рекомбинантной бактерией E. coli по п. 2 в объеме 1-2% от объема питательной среды, культивирование указанного штамма при температуре +37°С, подаче воздуха для аэрации суспензии клеток в количестве 0,8 объема воздуха/мин на 1,0 объем культуральной жидкости и ее перемешивании при вращении мешалки со скоростью 100 об/мин; на этапе достижения середины логарифмической фазы роста рекомбинантных клеток бактерии E. coli при оптической плотности OD550 1,0-1,5 температуру биомассы снижают с +37°С до +24,0-26,0°С и подают в суспензию клеток индуктор lac-оперона, в качестве которого используют изопропил-бета-D-тиогалактопиранозид в концентрации 0,05 мМ, с последующем культивированием биомассы клеток при указанной пониженной температуре в течение 8-9 часов с получением в клетках Е. coli растворимого белка интерферона гамма; полученную биомассу клеток отделяют центрифугированием на проточной центрифуге при 19000 g, разрушение клеток штамма-продуцента проводят при помощи ультразвука со снижением оптической плотности до 45-50% от ее исходного значения при длине волны 595 нм, клеточный дебрис отделяют от жидкой фазы центрифугированием при 12000 g 45 мин при температуре +4°С и осветляют надосадочную фазу жидким сорбентом Аммофлок-25, используемом в концентрации 10% от объема указанной жидкой фазы, а для хроматографической очистки растворимого белка интерферона гамма последовательно используют ионообменную хроматографию на Q и SP-сефарозах, уравновешенных 20 мМ трис-HCl при рН 8,0 с последующей элюцией целевого белка с колонки с SP-сефарозой.
