СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ АЦЕТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ НА СИНТЕЗ-ГАЗЕ Российский патент 2017 года по МПК C12N1/20 C12P7/06 C12N3/00 

Приоритет настоящего изобретения испрашивается на основании предварительных патентных заявок US 61/650098, 61/650093, 61/650077 и 61/650084, поданных 22 мая 2012 г. и во всей полноте в порядке ссылки включенных в настоящую заявку.

Область техники

В изобретении предложен способ, позволяющий культивировать бактерии на выбранном субстрате. Более точно, получают споры бактерий, после чего обеспечивают их прорастание в присутствии выбранного субстрата и среды.

Уровень техники

Ацетогенные микроорганизмы способны синтезировать этанол из окиси углерода (СО) путем ферментации газообразных субстратов. В результате ферментации с участием анаэробных микроорганизмов рода Clostridium образуется этанол и другие полезные продукты. Например, в патенте US 5173429 описан анаэробный микроорганизм Clostridium ljungdahlii (АТСС №49587), который синтезирует этанол и ацетат из синтез-газа. В патенте US 5807722 описаны способ и устройство для конверсии отходящих газов в органические кислоты и спирты с использованием Clostridium ljungdahlii (АТСС №55380). В патенте US 6136577 описаны способ и устройство для конверсии отходящих газов в этанол с использованием Clostridium ljungdahlii (АТСС №55988 и 55989).

Многие ацетогенные микроорганизмы малоприменимы для биопереработки в промышленном масштабе и, соответственно, нерентабельны в этих целях. Такие микроорганизмы имеют длительное время удвоения и низкую общую продуктивность. Кроме того, многие методы генетического воздействия (модификация, сверхэкспрессия трансгенов посредством интеграции или размножения эписомных плазмид) являются неэффективными, занимающими много времени, трудоемкими или несуществующими.

Ацетогенные микроорганизмы могут выращиваться с целью получения этанола из окиси углерода. Процесс выращивания может включать культивирование ацетогенных бактерий в возрастающих количествах СО в течение определенного времени. Существует потребность в способах более быстрого получения микроорганизмов и их применения для получения желаемых химикатов и топлива с использованием синтез-газа или других источников газообразного углерода.

Сущность изобретения

Предложен способ культивирования бактерий на выбранном субстрате, включающий уменьшение количества первого субстрата с целью преобразования по меньшей мере части бактерий в споры. Способ дополнительно включает добавление выбранного субстрата к спорам и обеспечение прорастания по меньшей мере части спор на выбранном субстрате.

Согласно другой особенности предложен способ культивирования бактерий в среде для продуцирования, включающий замену по меньшей мере части первой среды средой для продуцирования с целью преобразования по меньшей мере части бактерий в споры. Способ дополнительно включает обеспечение прорастания по меньшей мере части спор в среде для продуцирования.

Согласно другой особенности предложен способ культивирования бактерий на синтез-газе, включающий замену по меньшей мере части первого субстрата синтез-газом и замену по меньшей мере части первой среды средой для продуцирования с целью преобразования по меньшей мере части бактерий в споры. Способ дополнительно включает обеспечение прорастания спор в среде для продуцирования с синтез-газом.

Краткое описание чертежей

Перечисленные и другие особенности, признаки и преимущества различных особенностей способа станут яснее из описанных далее чертежей, на которых:

на фиг. 1 проиллюстрировано выращивание Butyribacterium methylotrophicum на синтез-газе путем обеспечения споруляции и прорастания после культивирования на метаноле и снижения рН,

на фиг. 2 проиллюстрировано выращивание Butyribacterium methylotrophicum на синтез-газе путем обеспечения споруляции и прорастания после культивирования на дрожжевом экстракте, метаноле и подкисления,

на фиг. 3 проиллюстрировано выращивание Butyribacterium methylotrophicum на синтез-газе после культивирования на дрожжевом экстракте и подкисления,

на фиг. 4 проиллюстрировано выращивание Butyribacterium methylotrophicum на синтез-газе после предшествующего выращивания Butyribacterium methylotrophicum на синтез-газе,

на фиг. 5 проиллюстрировано выращивание Clostridium autoethanogenum на синтез-газе после культивирования на дрожжевом экстракте и снижения рН,

на фиг. 6 проиллюстрировано выращивание Clostridium ljungdahlii на синтез-газе после культивирования на дрожжевом экстракте и снижения рН,

на фиг. 7 проиллюстрировано выращивание фементирующих синтез-газ Clostridium ljungdahlii на фруктозе.

Подробное описание изобретения

Следующее далее описание не следует считать ограничивающим, и оно имеет целью лишь изложение общих принципов примеров осуществления. Объем изобретения следует определять на основании формулы изобретения.

Описанные в изобретении способы обеспечивают ферментацию с высоким уровнем производительности по этанолу. Согласно этой особенности способ обеспечивает удельный STY (выход продукта за один проход в единицу) по меньшей мере около 1 грамма этанола/(л/сутки/грамм клеток), согласно другой особенности от около 1 до около 10, согласно другой особенности от около 2 до около 8, согласно другой особенности от около 3 до около 7 и согласно другой особенности от около 4 до около 6.

Определения

Если не указано иное, следующие термины, используемые в описании настоящего изобретения, имеют следующее значение согласно приведенным далее определениям в единственном или множественном числе.

Термин "около", предшествующий любому численному значению, означает отклонение от указанного значения в реальных условиях, например в лаборатории, на экспериментальной установке или эксплуатационном объекте. Например, численное значение с предшествующим ему термином "около" применительно к ингредиенту смеси или измерению количества включает отклонение и степень точности, обычно применяемую при измерениях в экспериментальных условиях на промышленной установке или в лаборатории. Например, численное значение с предшествующим ему термином "около" применительно к компоненту продукта включает отклонение в зависимости от партий во множестве экспериментов на установке или в лаборатории и отклонение, присущее методу анализа. Независимо от использования термина "около" численные значения включают эквиваленты этих значений. Любое приведенное в описании численное значение с предшествующим ему термином "около" также может применяться в настоящем изобретении без термина "около".

Термином "синтез-газа" или "синтетический газ" называют газовую смесь, содержащую варьирующие количества окиси углерода и водорода. Примеры получения синтез-газа включают паровой реформинг природного газа или углеводородов с целью получения водорода, газификацию каменного угля и получение энергии путем газификации отходов на установках некоторых типов. Происхождение термина объясняется тем, что синтез-газ используется в качестве промежуточного продукта при получении заменителя природного газа (SNG) и производстве аммиака или метанола. Синтез-газа является горючим и часто используется в качестве источника топлива или промежуточного продукта при производстве других химикатов.

Термины "ферментация", "процесс ферментации" или "реакция ферментации" и т.п. относятся как к фазе роста, так и фазе биосинтеза продуктов. Согласно одной из особенностей ферментация означает конверсию СО в спирт.

Термин "плотность клеток" означает массу клеток микроорганизмов на единицу объема ферментационной среды, например грамм/литр.

Термин "рециркуляция клеток" означает отделение клеток микроорганизмов от ферментационной среды и возврат всех или части этих отделенных клеток микроорганизмов в ферментер. Обычно для отделения и используется фильтрационное устройство.

Ацетогенная культура

Согласно одной из особенностей способ включает культивирование или размножение бактерий в первой среде, которая может содержать первый субстрат. Первая среда может обеспечивать бактерии соответствующими источниками углерода и энергии и другими питательными элементами, включая факторы роста. Согласно этой особенности первая среда содержит такие компоненты, как витамины, микроэлементы и аминокислоты. Первая среда может содержать источники углерода, включая дрожжевой экстракт, углеводы, спирт, аминокислоты, пептон, пептиды, белок, жирные кислоты, липид и их смеси. Например, бактерии из коллекций культур, таких как АТСС, могут предоставляться с рекомендуемыми средами, которые содержат такие компоненты, как пептон, глюкоза, фруктоза, дрожжевой экстракт, аминокислоты, витамины и микроэлементы. Первая среда может обеспечивать компоненты, позволяющие быстро увеличивать плотность клеток. Согласно этой особенности первая среда может иметь рН от около 5,7 до около 7,0. Некоторые примеры первой среды, которая может использоваться, включают среду АТСС 1754 (http://www.atcc.org/Attachments/2940.pdf), среду АТСС 1136 (содержащую 0,1% дрожжевого экстракта, 50 мМ ацетата натрия и 100 мМ метанола, http://www.atcc.org/Attachments/2408.pdf), среду АТСС 1019 (http://www.atcc.org/Attachments/3112.pdf) и среду АТСС 1016 (http://www.atcc.org/Attachments/2299.pdf).

Согласно другой особенности первая среда и субстрат способны обеспечивать плотность клеток около 0,005 г/л или более, согласно другой особенности около 0,02 г/л или более, согласно другой особенности около 0,03 г/л или более, согласно другой особенности около 0,04 г/л или более, согласно другой особенности около 0,05 г/л или более, согласно другой особенности около 0,1 г/л или более, согласно другой особенности около 0,3 г/л или более, согласно другой особенности около 0,5 г/л или более, согласно другой особенности около 0,75 г/л или более и согласно другой особенности около 1,0 г/л или более.

Согласно одной из особенностей используемые микроорганизмы включают ацетогенные бактерии. Примеры применимых ацетогенных бактерий включают бактерии рода Clostridium, такие как штаммы Clostridium ljungdahlii, описанные в том числе в WO 2000/68407, ЕР 117309, патентах US 5173429, 5593886 и 6368819, WO 1998/00558 и WO 2002/08438, штаммы Clostridium autoethanogenum (DSM 10061 и DSM 19630, депонированные в DSMZ, Германия), описанные в том числе в WO 2007/117157 и WO 2009/151342, Clostridium ragsdalei (P11, АТСС ВАА-622) и Alkalibaculum bacchi (СР11, АТСС ВАА-1772), описанные в том числе, соответственно, в патенте US 7704723 и докладе "Biofuels and Bioproducts from Biomass-Generated Synthesis Gas", Hasan Atiyeh от 29 апреля 2010 г. на Ежегодной Конференции по экспериментальной программе содействия исследовательским проектам в штате Оклахома (Oklahoma EPSCoR Annual State Conference), и Clostridium carboxidivorans (ATCC PTA-7827), описанные в патентной заявке US 2007/0276447. Другие применимые микроорганизмы включают микроорганизмы рода Moorella, в том числе Moorella sp. HUC22-1, и микроорганизмы рода Carboxydothermus. Каждый из указанных документов в порядке ссылки включен в настоящую заявку. Могут использоваться смешанные культуры из двух или более микроорганизмов. Некоторые примеры применимых бактерий включают Acetogenium kivui, Acetoanaerobium noterae, Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchi CP11 (ATCC BAA-1772), Blautia producta, Butyribacterium methylotrophicum, Caldanaerobacter subterraneous, Caldanaerobacter subterraneous paciflcus, Carboxydothermus hydrogenoformans, Clostridium aceticum, Clostridium acetobutylicum, Clostridium acetobutylicum P262 (DSM 19630, депонирована в DSMZ, Германия), Clostridium autoethanogenum (DSM 19630, депонирована в DSMZ, Германия), Clostridium autoethanogenum (DSM 10061, депонирована в DSMZ, Германия), Clostridium autoethanogenum (DSM 23693, депонирована в DSMZ, Германия), Clostridium autoethanogenum (DSM 24138, депонирована в DSMZ, Германия), Clostridium carboxidivorans P7 (ATCC PTA-7827), Clostridium coskatii (ATCC PTA-10522), Clostridium drakei, Clostridium ljungdahlii PETC (ATCC 49587), Clostridium ljungdahlii ERI2 (ATCC 55380), Clostridium ljungdahlii C-01 (ATCC 55988), Clostridium ljungdahlii 0-52 (ATCC 55889), Clostridium magnum, Clostridium pasteurianum (DSM 525, депонирована в DSMZ, Германия), Clostridium ragsdali P11 (ATCC BAA-622), Clostridium scatologenes, Clostridium thermoaceticum, Clostridium ultunense, Desulfotomaculum kuznetsovii, Eubacterium limosum, Geobacter sulfurreducens, Methanosarcina acetivorans, Methanosarcina barkeri, Morrella thermoacetica, Morrella thermoautotrophica, Oxobacter pfennigii, Peptostreptococcus productus, Ruminococcus productus, Thermoanaerobacter kivui и их смеси.

Споруляция

После помещения бактерий в первую среду и первый субстрат уменьшают количество первого субстрата. Также могут быть снижены концентрации компонентов и первого субстрата в первой среде. Согласно этой особенности первая среда может быть заменена средой для продуцирования. Согласно другим особенностям первый субстрат и выбранный субстрат могут не отличаться или отличаться друг от друга. Согласно одной из особенностей первая среда и первый субстрат могут быть заменены с максимальной скоростью, равной максимальной производительности насоса, используемого для подачи среды для продуцирования. Согласно другой особенности бактерии могут быть выделены из первой среды, например, в виде гранулы и перенесены непосредственно в среду для продуцирования.

Согласно другой особенности до споруляции может быть добавлен источник углерода для обеспечения плотности клеток около 0,005 г/л или более, согласно другой особенности около 0,02 г/л или более, согласно другой особенности около 0,03 г/л или более, согласно другой особенности около 0,04 г/л или более, согласно другой особенности около 0,05 г/л или более, согласно другой особенности около 0,1 г/л или более, согласно другой особенности около 0,3 г/л или более, согласно другой особенности около 0,5 г/л или более, согласно другой особенности около 0,75 г/л или более и согласно другой особенности около 1,0 г/л или более. Некоторые примеры источников углерода, которые могут добавляться, включают дрожжевой экстракт, спирт, углеводы, аминокислоты, пептон, пептиды, белок, жирные кислоты, липиды и их смеси.

Уменьшение количества первого субстрата позволяет обеспечить споруляцию по меньшей мере части бактерий. Споры образуются путем внутриклеточного деления в цитоплазме материнской клетки. Спорообразующие бактерии инициируют споруляцию в ответ на неблагоприятные изменения окружающей среды, такие как лимитирование питательными веществами. После формирования зрелые споры высвобождаются из материнских клеток (дополнительные подробности смотри у Bran и др., eds. Prokaryotic Development. Endospore-forming bacteria: an overview, ed. A.L. Sonenshein. 2000, American Society for Microbiology:Washington, D.C. 133-150; Cutting, S., ed. Molecular Biology Methods for Bacillus. Sporulation, germination and outgrowth, ed. W.L. Nicholson and P. Setlow. 1990, John Wiley and Sons: Sussex, England, 391-450, которые в порядке ссылки включены в настоящую заявку). Споры обычно имеют овальную или сферическую форму и являются более широкими, чем вегетативные клетки. Другие отличительные формы спор включают веретенообразную, булавовидную формы и структуры в форме теннисной ракетки.

Согласно этой особенности уменьшают количество первого субстрата до такой степени, чтобы обеспечить соотношение числа спор и числа клеток по меньшей мере около 0,05, согласно другой особенности по меньшей мере около 0,1 и согласно другой особенности по меньшей мере около 0,5. Количество спор может определяться известными способами, такими как, например, визуальный контроль и подсчет с использованием гемоцитометра.

Прорастание

В соответствии со способом в среду для продуцирования со спорами бактерий добавляют выбранный субстрат. Добавление выбранного субстрата позволяет обеспечивать прорастание спор. Существуют различные стадии на пути от прорастания спор до деления клеток, включающие (1) активацию спор; (2) стадию I прорастания, на которой вода частично регидратирует сердцевины спор; (3) стадию II прорастания, на которой происходит гидролиз наружного покрова, и возобновляется метаболизм; и (4) рост, во время которого происходит деление клеток (дополнительные подробности смотри у Setlow, P., Spore germination. Curr Opin Microbiol, 2003. 6: p. 550-556; Foster, S.J. et al. Pulling the trigger: the mechanism of bacterial sporegermination. Mol Microbiol, 1990. 4: p. 137-141; and Moir, et al., Spore germination. Cell Mol Life Sci, 2002. 59: p. 403-409, которые в порядке ссылки включены в настоящую заявку).

В соответствии со способом прорастания позволяет обеспечивать соотношение числа спор и числа клеток по меньшей мере около 0,04, согласно другой особенности по меньшей мере около 0,01 и согласно другой особенности по меньшей мере около 0,001. Согласно одной из особенностей, в которой выбранным субстратом является СО, способ позволяет обеспечивать удельное поглощение СО по меньшей мере около 0,25 ммоль/мин/грамм клеток, согласно другой особенности по меньшей мере около 0,50 ммоль/мин/грамм клеток, согласно другой особенности по меньшей мере около 0,75 ммоль/мин/грамм клеток и согласно другой особенности по меньшей мере около 1,0 ммоль/мин/грамм клеток.

Средами для продуцирования являются среды с более низкой концентрацией питательных веществ для роста. Среда для продуцирования может содержать источник углерода для роста бактерий, различные соли, которые могут варьировать в зависимости от видов бактерий и условий роста и обычно обеспечивают существенные элементы, такие как магний, азот, фосфор и серу, позволяющие бактериям синтезировать белок и нуклеиновые кислоты. Среда для продуцирования может иметь рН от около 5 до около 4,1. Согласно одной из особенностей углерод, обеспечиваемый средой для продуцирования, обеспечивается синтез-газом. Далее приведен один из примеров среды для продуцирования:

Согласно одной из особенностей среда содержит одно или несколько из следующего: источник азота, источник фосфора и источник калия. Среда может содержать любой из трех источников, любое их сочетание и согласно одной из важных особенностей содержит все три источника. Источник азота может включать источник азота, выбранный из группы, включающей хлорид аммония, фосфат аммония, сульфат аммония, нитрат аммония и их смеси. Источник фосфора может включать источник фосфора, выбранный из группы, включающей фосфорную кислоту, фосфат аммония, фосфат калия и их смеси. Источник калия может включать источник калия, выбранный из группы, включающей хлорид калия, фосфат калия, нитрат калия, сульфат калия и их смеси.

Согласно одной из особенностей среда содержит одно или несколько из следующего: железо, вольфрам, никель, кобальт, магний, серу и тиамин. Среда может содержать любой один из этих компонентов, любое их сочетание и согласно одной из важных особенностей содержит все эти компоненты. Источник железа может включать источник железа, выбранный из группы, включающей хлорид железа, сульфат железа и их смеси. Источник вольфрама может включать источник вольфрама, выбранный из группы, включающей вольфрамат натрия, вольфрамат кальция, вольфрамат калия и их смеси. Источник никеля может включать источник никеля, выбранный из группы, включающей хлорид никеля, сульфат никеля, нитрат никеля и их смеси. Источник кобальта может включать источник кобальта, выбранный из группы, включающей хлорид кобальта, фторид кобальта, бромид кобальта, йодид кобальта и их смеси. Источник магния может включать источник магния, выбранный из группы, включающей хлорид магния, сульфат магния, фосфат магния и их смеси. Источник серы может включать цистеин, сульфид натрия и их смеси.

Согласно одной из особенностей среда для продуцирования содержит источник углерода, который обеспечивается только выбранным субстратом, таким как, например, СО. Согласно этой особенности среда для продуцирования может содержать менее около 0,01 г/л источника углерода помимо углерода, обеспечиваемого выбранным субстратом. Примеры добавляемого углерода могут включать дрожжевой экстракт, спирт, пептиды, белок, жирные кислоты, липид и их смеси.

Синтез-газ

Может использоваться синтез-газа из любого известного источника. Согласно одной из особенностей источником синтез-газа может являться газификация углеродистых материалов. Газификация предусматривает частичное сжигание биомассы в условиях ограниченной подачи кислорода. Образующийся газ по большей части содержит СО и H₂. Согласно этой особенности синтез-газа содержит по меньшей мере около 10 мол. % СО, согласно одной из особенностей по меньшей мере около 20 мол. %, согласно одной из особенностей от около 10 до около 100 мол. %, согласно другой особенности от около 20 до около 100 мол. % СО, согласно другой особенности от около 30 до около 90 мол. % СО, согласно другой особенности от около 40 до около 80 мол. % СО и согласно другой особенности от около 50 до около 70 мол. % СО. Синтез-газ имеет молярное соотношение СО/СО2 по меньшей мере около 0,75. Некоторые примеры применимых способов и устройств для газификации описаны в заявках US 13/427144, 13/427193 и 13/427247, поданных 6 апреля 2011 г. и в порядке ссылки включенных в настоящую заявку.

Согласно другой особенности синтез-газом, используемым для размножения ацетогенных бактерий, может являться преимущественно СО. Используемый оборот "преимущественно СО" означает, что газ содержит по меньшей мере около 50 мол. % СО, согласно другой особенности по меньшей мере около 60 мол. % СО, согласно другой особенности по меньшей мере около 70 мол. % СО, согласно другой особенности по меньшей мере около 80 мол. % СО и согласно другой особенности по меньшей мере около 90 мол. % СО.

Биореактор

Согласно одной из особенностей ферментация начинается с добавления среды в реакционный сосуд. Стерилизуют среду, чтобы удалить нежелательные микроорганизмы, и засевают реактор желаемыми микроорганизмами.

После засева устанавливают исходный расход подаваемого газа для обеспечения исходной популяции микроорганизмов. Анализируют выходящий газ с целью определения его содержания. Используют результаты анализа для регулирования расхода подаваемого газа. После достижения желаемых уровней удаляют из реактора жидкую фазу и клеточный материал и пополняют среду.

Примеры

Пример 1

Выращивание бактерий Butyribacterium methylotrophicum на синтез-газе после культивирования в метаноле и снижения рН.

Получение инокулята

Вырастили Butyribacterium methylotrophicum в пробирках для сыворотки (13 бутылочек по 25 мл) в среде ВМ. Среда ВМ имела следующий состав:

После автоклавирования:

Минеральный раствор Вульфа доступен в АТСС (добавка микроэлементов, номер по каталогу MD-TMS).

Витаминный раствор Вульфа доступен в АТСС (витаминная добавка, номер по каталогу MD-VS).

Протокол смешивания

Смешали ингредиенты с 1 по 8, автоклавировали, охладили в N₂, перенесли в анаэробную камеру, добавили ингредиенты с 9 по 11 (анаэробные и стерильные), довели рН до 7,2.

Биореактор

Засеяли в биореактор 325 мл бактерий Butyribacterium methylotrophicum, выращенных, как описано выше. Сначала добавили в биореактор (92,5 мл/л) метанол, чтобы повысить исходную плотность клеток (0,049 г/л) культуры. Постепенно заменили среду для выращивания средой для продуцирования (минимальной средой с низким рН, содержащей синтез-газ в качестве единственного источника углерода), как описано далее.

Этапы замены среды

Изменение скорости подачи среды для выращивания в реактор

Среда для продуцирования (получение которой описано в патенте US 7285402, в порядке ссылки включенном в настоящую заявку)

Как показано выше, дважды снижали содержание метанола в биореакторе на 50%, а затем полностью удалили его в течение 15 дней. Через два дня после удаления метанола из среды добавили MPFN (с никелем).

Результаты

Путем визуальных наблюдений получили следующие показания.

Контролировали параметры культуры, включая массу клеток, удельное поглощение СО и удельное поглощение H2. Как показано на фиг. 1, пример 4, через 450 часов началось увеличение удельного поглощения СО и удельного поглощения H₂.

Пример 2

Запуск реактора с замороженными бактериями Butyribacterium methylotrophicum, ранее выращенными на синтез-газе

Засеяли 600 мл замороженных Butyribacterium methylotrophicum, выращенных согласно Примеру 1, в 1400 мл среды для продуцирования. Исходная плотность клеток составляла 0,39 г/л. Контролировали расход СО, который составлял более 0,4 ммоль/мин/г в течение первых 24 часов.

Пример 3

Выращивание бактерий Butyribacterium methylotrophicum на синтез-газе после культивирования на дрожжевом экстракте, метаноле и подкисления

Получение инокулята

Вырастили в пробирках для сыворотки бактерии Butyribacterium methylotrophicum в содержащей дрожжевой экстракт среде с рН 7,2-7,4. Среда описана в статье Heiskanen и др. (2007) Enzyme and Microbial Technology, том 41, выпуск 3, стр. 362-367, которая в порядке ссылки включена в настоящую заявку.

Биореактор

Засеяли в биореактор с 1 литром описанной выше среды 100 мл бактерий Butyribacterium methylotrophicum, выращенных, как описано выше. Исходная плотность клеток составляла 0,04 г/л.

Чтобы повысить плотность клеток, добавили в биореактор дрожжевой экстракт, согласно следующему протоколу

Состав дрожжевого экстракта: 20% в деионизированной воде.

Добавили в биореактор уксуснокислый раствор, чтобы снизить рН. Далее приведен состав уксуснокислого раствора и протокол добавления.

Уксуснокислый раствор

Протокол добавления уксуснокислого раствора

Через 253,8 часа добавили метанол (26,92 мл 10% раствора), чтобы повысить плотность клеток. Постепенно заменили среду для выращивания средой для продуцирования (минимальной средой с низким рН, содержащей синтез-газ в качестве единственного источника углерода), как описано далее.

Изменение скорости подачи среды для выращивания в реактор

Результаты

Путем визуальных наблюдений получили следующие показания.

Контролировали параметры культуры, включая массу клеток, удельное поглощение СО и удельное поглощение H₂. Как показано на фиг.2, примерно через 450 часов началось увеличение удельного поглощения СО и удельного поглощения H₂.

Пример 4

Выращивание бактерий Butyribacterium methylotrophicum на синтез-газе после культивирования на дрожжевом экстракте и подкисления

Получение инокулята

Вырастили бактерии Butyribacterium methylotrophicum в пробирках для сыворотки в среде, описанной в Примере 3.

Биореактор

Засеяли в биореактор 350 мл бактерий Butyribacterium methylotrophicum, выращенных, как описано выше. Перенесли 350 мл упомянутого инокулята из Butyribacterium methylotrophicum в 1250 мл среды для выращивания, содержащей дрожжевой экстракт. Исходная среда для выращивания в реакторе имела следующий состав.

Исходная среда для выращивания

Раствор минеральных солей:(80 г/л NaCl, 100 г/л NH₄Cl, 10 г/л KCl, 10 г/л KH₂PO₄, 20 г/л MgSO₄⋅7H₂O, 4 г/л CaCl₂⋅H₂O)

После засева не наблюдалось измеримого потребления синтез-газа культурой. С целью повышения плотности клеток культуры добавили в реактор дрожжевой экстракт в указанные далее моменты времени. Постепенно довели рН в реакторе до 4,7 путем добавления уксуснокислого раствора (описанного выше), как указано далее. Также постепенно заменили среду в реакторе желаемой средой для продуцирования (описанной выше), как указано далее.

Добавление дрожжевого экстракта с целью увеличения исходной массы клеток в

реакторе

Состав дрожжевого экстракта: 20% в деионизированной воде.

Добавление уксуснокислого раствора с целью снижения рН в реакторе

Замена среды в реакторе средой для продуцирования с низким рН без дрожжевого экстракта

Результаты

Путем визуальных наблюдений получили следующие показания.

Контролировали параметры культуры, включая массу клеток, удельное поглощение СО и удельное поглощение Н₂. Как показано на фиг. 2, примерно через 600 часов началось увеличение удельного поглощения СО и удельного поглощения Н₂.

Пример 5

Засев биореактора, содержащего среду для продуцирования с низким рН, бактериями Butyribacterium methylotrophicum, ранее выращенными на синтез-газе

Хранили бактерии, полученные согласно Примеру 4, в пробирках для сыворотки в среде MES (без дрожжевого экстракта или фруктозы) в течение 28 дней. Регулярно проверяли эти пробирки для сыворотки с целью определения состава газовой фазы над жидкостью и при необходимости пополняли синтез-газом.

Засеяли в биореактор 210 мл бактерий Butyribacterium methylotrophicum, выращенных в упомянутых пробирках для сыворотки. Перенесли 210 мл Butyribacterium methylotrophicum в 1 литр среды для продуцирования (описанной выше), не содержащей дрожжевого экстракта или какого-либо органического углеродного субстрата. Исходная плотность клеток и рН культуры после засева составляли 0,03 г/л и 4,7 соответственно.

Скорости подачи среды для продуцирования в реактор

Результаты

Путем визуальных наблюдений получили следующие показания.

Контролировали параметры культуры, которые представлены на фиг. 4, включая массу клеток, удельное поглощение СО и удельное поглощение H₂.

Пример 6

Адаптация бактерий Clostridium autoethanogenum путем обеспечения споруляции и прорастания к использованию синтез-газа в среде с низким рН (без дрожжевого экстракта)

Получение инокулята

Получили инокулят инокулят Clostridium autoethanogenum следующим образом.

Среда для выращивания инокулята

Раствор минеральных солей: (80 г/л NaCl, 100 г/л NH₄Cl, 10 г/л KCl, 10 г/л KH₂PO₄, 20 г/л MgSO₄⋅7H₂O, 4 г/л CaCl₂⋅H₂O)

Биореактор

Засеяли в биореактор бактерии Clostridium autoethanogenum, выращенные в описанной выше среде, содержащей дрожжевой экстракт и фруктозу. Исходный рН культуры в реакторе составлял 4,7, а плотность клеток 0,03 г/л. После засева не наблюдалось измеримого потребления синтез-газа культурой.

Плотность клеток не увеличилась за первые 20 часов после засева. Добавили в реактор фруктозу и дрожжевой экстракт, как указано далее, чтобы сделать условия менее неблагоприятными и также увеличить исходную плотность клеток культуры. Дополнительно еще трижды засеяли в реактор бактерии, как указано далее. Это делалось с целью дальнейшего увеличения исходной плотности клеток в реакторе. Как указано далее, на протяжении эксперимента постепенно заменили среду в реакторе средой для продуцирования (описанной далее). За это время бактерии в реакторе образовывали споры и проросли, образовав культуру, способную использовать синтез-газ в минимальной среде с низким рН без дрожжевого экстракта и фруктозы. Поддерживали окислительно-восстановительный потенциал культуры в реакторе ниже 140 мВ путем добавления одного из двух описанных далее восстановителей.

Добавление дрожжевого экстракта с целью увеличения исходной массы клеток в реакторе

Состав дрожжевого экстракта: 20% в деионизированной воде

Добавление фруктозы с целью увеличения исходной массы клеток в реакторе

Состав фруктозы: 25% в деионизированной воде

Дополнительный засев реактора бактериями Clostridium autoethanosenum, выращенными в обогащенной среде

Составы восстановителей, использованных в эксперименте: 9 г/л NaOH, 40 г/л L-цистеин, 40 г/л Na₂S, H₂O, TiCl₃ (Sigma Aldrich 14010).

Результаты

Путем визуальных наблюдений получили следующие показания.

Контролировали проиллюстрированные на фиг. 5 параметры культуры, включая массу клеток, удельное поглощение СО и удельное поглощение H₂.

Пример 7

Адаптация бактерий Clostridium ljungdahli РЕТС путем обеспечения споруляции и прорастания к использованию синтез-газа в среде с низким рН (без дрожжевого экстракта)

Получение инокулята

Сначала вырастили инокулят Clostridium ljungdahli РЕТС в среде с рН 5,7, содержащей (0,1%) дрожжевой экстракт и (1%) фруктозы, как описано далее.

Разбавили дрожжевой экстракт и фруктозу в указанном инокуляте путем переноса этих культур (160 мл) в такую же среду для выращивания (1000 мл) без дрожжевого экстракта и фруктозы. После инкубации в течение 5 дней при 37°С перенесли 930 мл этой культуры в реактор для выращивания, содержащий 1200 мл минимальной среды, описанной далее. Через 16 дней инкубации перенесли 200 мл этой культуры в другой реактор, содержащий 1200 мл такой же минимальной среды. Исходный рН культуры в реакторе составлял 5,4, а исходная плотность клеток 0,05 г/л.

Среды, использованные для выращивания бактерий для засева

Маточный раствор минеральных солей: (80 г/л NaCL, 100 г/л NH₄Cl, 10 г/л KCL, 10 г/л KH₂PO₄, 20 г/л MgSO₄⋅7H₂O, 4 г/л CaCl₂⋅H₂O)

Состав восстановителя: 9 г/л NaOH, 40 г/л L-цистеин, 40 г/л Na₂S, 1л H₂O.

Среда для продуцирования

0,15 г/л KCl, 0,5 г/л MgCl₂⋅6H₂O, 0,2 CaCl₂⋅2H₂O, 2 г/л NH₄Cl, 0,6 г (NH₄)₂HPO₄, 0,2 г/л NaCl, 0,45 г/л цистеина; 10 мл/л добавки микроэлементов (100 мл/л 85% H₃PO₄, 0,3 г/л MgSO₄⋅7H₂O, 0,5 г/л MnSO₄⋅H₂O, 1 г/л NaCl, 0,1 г/л FeSO₄⋅7H₂O, 0,1 г/л Co(NO₃)₂⋅6H₂O, 0,1 г/л CaCl₂, 0,1 г/л ZnSO₄⋅7H₂O, 0,01 г/л CuSO₄⋅5H₂O, 0,02 г/л AIK(SO₄)₂⋅12H₂O, 0,01 г/л H₃BO₃, 0,01 г/л Na₂MoO₄⋅2H₂O, 0,001 г/л Na₂SeO₃, 0,01 г/л Na₂WO₄⋅2H₂O, 0,02 г/л NiCl₂⋅6H₂O); 10 мл/л витаминов (0,002 г/л фолиевой кислоты, 0,01 г/л пиридоксина гидрохлорида, 0,005 г/л рибофлавина, 0,026 г/л биотина, 0,065 г/л тиамина, 0,005 г/л никотиновой кислоты, 0,0353 г/л пантотената кальция, 0,0001 г/л витамина В12, 0,005 г/л р-аминобензойной кислоты, 0,005 тиоктовой кислоты, 0,9 г/л монокалийфосфата).

Биореактор

С целью увеличения плотности клеток культуры добавили в реактор фруктозу в указанные далее моменты времени. Как показано далее, постепенно увеличивали скорость подачи (минимальной) среды в реактор, чтобы обеспечить культуры питательными элементами, разбавить фруктозу в среде для выращивания, а также снизить рН культуры до 4,9 (с 5,4).

Добавление фруктоза с целью увеличения исходной массы клеток в ревкторе

Состав фруктозы: 20% в деионизированной воде

Скорость подачи среды для продуцирования в реактор

Результаты

Путем визуальных наблюдений получили следующие показания.

Контролировали проиллюстрированные на фиг. 6 параметры культуры, включая массу клеток, удельное поглощение СО и удельное поглощение H₂.

Пример 8

Обратная адаптация бактерий Clostridium ljungdahli

Вырастили бактерии Clostridium ljungdahli в пробирках для сыворотки, содержащих 30 мл описанной далее среды для выращивания (с рН доведенным до 5,7) с фруктозой или без фруктозы и с добавлением или без добавления синтез-газа. Вырастили культуры С.ljungdahli в инкубаторе со встряхиванием (60 об/мин) при 37°С. Перенесли бактерии С.ljungdahli, растущие в указанной среде для выращивания с использованием синтез-газа в качестве источника углерода и энергии, в пробирку (с фруктозой), содержащую такую же среду для выращивания, но с добавлением 1% фруктозы. В этой пробирке отсутствовал синтез-газ. В целях сравнения также перенесли бактери C.ljungdahli, использующие синтез-газ в качестве источника углерода и энергии, в пробирку (с синтез-газом), содержащую синтез-газ и среду для выращивания (без фруктозы).

Как указано далее и показано на фиг. 7, до начала роста с использованием фруктозы в качестве источника углерода и энергии ферментирующие синтез-газ бактерии С.ljungdahli, перенесенные во фруктозу, прошли цикл споруляции и прорастания. Путем визуальных наблюдений получили следующие показания.

Среда, использованная для выращивания бактерий: 10 г/л MES, 12,5 мл/л маточного раствора минеральных солей (80 г/л NaCl, 100 г/л NH₄Cl, 10 г/л KCl, 10 г/л KH₂PO₄, 20 г/л MgSO₄⋅7H₂O, 4 г/л CaCl₂⋅H₂O), 10,0 мл/л добавки микроэлементов АТСС, 10,0 мл/л витаминной добавки АТСС, 10,0 мл/л восстановителя, 0,001 г/л резазурина. Маточный раствор минеральных солей: (80 г/л NaCl, 100 г/л NH₄Cl, 10 г/л KCl, 10 г/л KHPO₄, 20 г/л MgSO₄⋅7H₂O, 4 г/л CaCl₂⋅H₂O).

Состав восстановителя: 9 г/л NaOH, 40 г/л L-цистеина, 40 г/л Na₂S, 1 л H₂O.

Хотя рассмотренное изобретение описано со ссылкой на конкретные варианты его осуществления, примеры и применения, специалисты в данной области техники могут внести в него множество модификаций и изменений, не выходящих за пределы его объема, согласно формуле изобретения.

Предложен способ культивирования ацетогенных бактерий на синтез-газе. Способ включает культивирование ацетогенных бактерий на первом субстрате для получения плотности клеток по меньшей мере около 0,005 г/л. При этом первый субстрат включает источник углерода, выбранный из группы, состоящей из дрожжевого экстракта, углеводов, спирта, аминокислот, пептона, пептидов, белка, жирных кислот, липидов и их смесей. Осуществляют споруляцию ацетогенных бактерий путем замены по меньшей мере части первого субстрата синтез-газом, содержащим по меньшей мере 10% мол. СО, и замены по меньшей мере части первой среды средой для продуцирования для преобразования по меньшей мере части бактерий в споры с дальнейшим прорастанием спор в среде для продуцирования при рН около 4,1-5 с использованием синтез-газа, содержащего по меньшей мере около 10% мол. СО. При этом споруляция обеспечивает соотношение числа спор к числу клеток по меньшей мере около 0,05. Изобретение обеспечивает удельное поглощение СО по меньшей мере около 0,25 мМ/мин/грамм клеток и производительность (STY) около 1 г или более этанола/(л в день на грамм клеток). 4 з.п. ф-лы, 7 ил., 1 табл., 8 пр.

1. Способ культивирования ацетогенных бактерий на синтез-газе, включающий:

культивирование ацетогенных бактерий на первом субстрате для получения плотности клеток по меньшей мере около 0,005 г/л, причем первый субстрат включает источник углерода, выбранный из группы, состоящей из дрожжевого экстракта, углеводов, спирта, аминокислот, пептона, пептидов, белка, жирных кислот, липидов и их смесей;

споруляцию ацетогенных бактерий путем замены по меньшей мере части первого субстрата синтез-газом, содержащим по меньшей мере 10% мол. СО, и замены по меньшей мере части первой среды средой для продуцирования для преобразования по меньшей мере части бактерий в споры, причем споруляция обеспечивает соотношение числа спор к числу клеток по меньшей мере около 0,05; и

прорастание спор в среде для продуцирования при рН около 4,1-5 с использованием синтез-газа, содержащего по меньшей мере около 10% мол. СО, для обеспечения удельного поглощения СО по меньшей мере около 0,25 мМ/мин/грамм клеток и производительности (STY) около 1 г или более этанола/л в день на грамм клеток.

2. Способ по п.1, в котором синтез-газ имеет молярное соотношение СО/СО₂ по меньшей мере около 0,75.

3. Способ по п.1, в котором ацетогенные бактерии выбраны из группы, состоящей из Acetogenium kivui, Acetoanaerobium noterae, Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchi CP11 (ATCC BAA-1772), Blautia producta, Butyribacterium methylotrophicum, Caldanaerobacter subterraneous, Caldanaerobacter subterraneous pacificus, Carboxydothermus hydrogenoformans, Clostridium aceticum, Clostridium acetobutylicum, Clostridium acetobutylicum P262 (DSM 19630, депонирована в DSMZ, Германия), Clostridium autoethanogenum (DSM 19630, депонирована в DSMZ, Германия), Clostridium autoethanogenum (DSM 10061, депонирована в DSMZ, Германия), Clostridium autoethanogenum (DSM 23693, депонирована в DSMZ, Германия), Clostridium autoethanogenum (DSM 24138, депонирована в DSMZ, Германия), Clostridium carboxidivorans P7 (ATCC PTA-7827), Clostridium coskatii (ATCC РТА-10522), Clostridium drakei, Clostridium ljungdahlii PETC (ATCC 49587), Clostridium ljungdahlii ERI2 (ATCC 55380), Clostridium ljungdahlii C-01 (ATCC 55988), Clostridium ljungdahlii O-52 (ATCC 55889), Clostridium magnum, Clostridium pasteurianum (DSM 525, депонирована в DSMZ, Германия), Clostridium ragsdali P11 (ATCC BAA-622), Clostridium scatologenes, Clostridium thermoaceticum, Clostridium ultunense, Desulfotomaculum kuznetsovii, Eubacterium limosum, Geobacter sulfurreducens, Methanosarcina acetivorans, Methanosarcina barkeri, Morrella thermoacetica, Morrella thermoautotrophica, Oxobacter pfennigii, Peptostreptococcus productus, Ruminococcus productus, Thermoanaerobacter kivui и их смесей.

4. Способ по п.1, в котором прорастание обеспечивает соотношение числа спор и числа клеток около 0,04 или менее.

5. Способ по п.1, в котором среда для продуцирования содержит по меньшей мере один или более из:

по меньшей мере около 112 мг азота на грамм клеток,

по меньшей мере около 10,5 мг фосфора на грамм клеток или

по меньшей мере около 26 мг калия на грамм клеток.