ЛИПОСОМА, ИМЕЮЩАЯ ВНУТРЕННЮЮ ВОДНУЮ ФАЗУ, СОДЕРЖАЩУЮ СОЛЬ СУЛЬФОБУТИЛОВОГО ЭФИРА ЦИКЛОДЕКСТРИНА Российский патент 2016 года по МПК A61K9/127 A61K31/475 A61K31/4741 A61P35/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к липосоме, имеющей внутреннюю водную фазу, содержащую соль сульфобутилового эфира циклодекстрина, к способам производства липосомы и ее применению в получении лекарственного препарата для лечения опухолевых заболеваний.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Липосома в качестве носителя лекарственных препаратов имеет такие характеристики, как повышенная терапевтическая эффективность, пониженные побочные эффекты, целенаправленная доставка и замедленное высвобождение. В частности, в том случае, когда липосома используется в качестве носителя противоопухолевого препарата, то препарат можно доставить целенаправленно в область опухолей и, таким образом, он будет обладать пониженной токсичностью и повышенной эффективностью.

В клинике применяется много противоопухолевых препаратов, которые можно разделить на 5 групп: цитотоксические агенты, гормоны, модификаторы биологического ответа, моноклональные антитела и другие противоопухолевые препараты. Среди них цитотоксические агенты занимают наибольший объем рынка, и по механизму действия их можно разделить на 5 групп: (1) препараты, оказывающие влияние на химическую структуру ДНК, такие как алкилирующие агенты и препараты платины; (2) препараты, модифицирующие синтез нуклеиновой кислоты, такие как метотрексат и фторурацил; (3) препараты, влияющие на транскрипцию нуклеиновой кислоты, такие как доксорубицин и эпидоксорубицин; (4) препараты, действующие на синтез тубулина, такие как таксаны и алкалоиды барвинка; препараты, действующие на топоизомеразу, такие как камптотецин; (5) другие цитотоксические препараты. Среди них лекарственные препараты, относящиеся к группам (2) и (4), обладают специфическим действием на клеточный цикл, т.е. могут приводить к гибели клеток на определенных стадиях цикла пролиферации злокачественных опухолевых клеток. Винорелбин и топотекан входят в эти группы и интенсивно исследуются в настоящем изобретении.

Когда в липосому включают противоопухолевый препарат со специфическим для клеточного цикла действием, то необходимо регулировать высвобождение лекарственного препарата из липосомы с целью снижения токсичности и повышения эффективности. В случае слишком быстрого высвобождения из липосомы возможно следующее развитие событий: (1) часть препарата высвободится из липосомы до достижения области опухоли и элиминирует из крови слишком быстро для достижения области опухоли; (2) в свете того, что опухолевые клетки находятся в различных фазах цикла, то препарат, достигший области опухоли может не привести к гибели клеток с определенных стадий, что, в конечном итоге, приведет к пониженному воздействию препарата на опухолевые клетки и низкой терапевтической эффективности, но индуцирует токсическую реакцию в нормальных тканях. Таким образом, важно регулировать высвобождение лекарственного препарата из липосомы, особенно для препаратов со специфическим для клеточного цикла характером действия.

На высвобождение липосомального препарата оказывают влияние различные факторы, включая, среди прочего, размер частиц, состав липидной мембраны, внутреннюю водную фазу и способы нагрузки препаратом. Способы нагрузки липосом препаратом включают активную нагрузку препаратом и пассивную нагрузку препаратом. Как правило, пассивная нагрузка препаратом подходит для жирорастворимых препаратов, в то время как активную нагрузку обычно используют для водорастворимых препаратов. Поскольку винорелбин и топотекан оба представляют растворимые в воде, слабощелочные препараты, то для приготовления липосом с ними выбирают активную нагрузку. Обычно в данной области применяют три способа активной нагрузки препаратом: рН-градиентный способ, градиентный способ с сульфатом аммония и способ градиентного комплексообразования.

(1) рН-градиентный способ

Данный способ был разработан канадскими исследователями в 80 годах прошлого века. Они установили, что фармацевтические алкалоиды, такие как доксорубицин, могут активно транспортироваться и специфически агрегировать в липосомы в присутствии рН-градиента. Первый шаг в данном способе приготовления липосом заключается в выборе буфера для внутренней водной фазы и буфера для наружной фазы, что является критическим, поскольку буферы непосредственно определяют стабильность препарата при хранении и высвобождение препарата in vivo. Пустые липосомы получают гидратацией буфером для внутренней водной фазы. Полученная таким образом пустая липосома дополнительно обрабатывается для уменьшения размера частиц в желаемых пределах. Затем наружную фазу липосомы можно заменить с использованием определенных технических средств, таких как поперечный проточный диализ, колоночная хроматография и модуляция рН для получения трансмембранного рН-градиента между наружной и внутренней фазами. Нагрузку препаратом можно проводить при соответствующей температуре после образования трансмембранного градиента.

Также трансмембранный рН-градиент можно получить с использованием ионофора. Во время приготовления пустой липосомы соль двухвалентного металла, такого как сульфат марганца, инкапсулируют в липосому, и затем наружную фазу липосомы заменяют на буфер, содержащий ионофор, такой как А23187 и ЭДТА. Ионофор может специфически транспортировать двухвалентный ион на наружную сторону мембраны и транспортировать ионы Н⁺ внутрь липосомы. При использовании указанного способа также можно получить рН-градиент между внутренней и наружной стороной мембраны.

Интенсивно изучался механизм нагрузки липосом лекарственными препаратами с помощью рН-градиента. Среди трех липосомальных препаратов на основе производных антрациклина, имеющихся на рынке, два препарата было приготовлено с использованием активной нагрузки с рН-градиентом.

(2) Градиентный способ с сульфатом аммония

Способ с градиентом сульфата аммония был разработан израильскими учеными в начале 90 годов прошлого века. Процесс приготовления липосомы в данном способе аналогичен процессу в обычном способе с рН-градиентом. Вначале готовят пустую липосому с использованием сульфатно-аммонийного буфера. Затем сульфат аммония в наружной фазе липосомы удаляют, среди прочего, поперечно проточным диализом с образованием градиента сульфата аммония между внутренней и наружной стороной липидной мембраны. Затем проводят нагрузку лекарственным препаратом при нагревании. В первоначальных исследованиях было показано, что нагрузка препаратом с помощью градиента сульфата аммония может быть связана с разницей в рН между внутренней и наружной стороной фосфолипидной мембраны, вызванной трансмембранной диффузией свободного аммиака. Однако в результате точного теоретического анализа было показано, что нагрузка лекарственным препаратом с использованием способа с градиентом сульфата аммония может представлять сложный процесс двунаправленной диффузии, и образование рН-градиента является только одним из факторов.

Преимущество способа с градиентом сульфата аммония заключается в том, что примерно нейтральное значение рН водного раствора сульфата аммония не может привести к гидролизу избытка фосфолипидных молекул, поскольку для этого требуется относительно высокая температура, если для приготовления липосомы используют насыщенный фосфолипид. Липид подвергается гидролизу, когда используют традиционный способ с рН-градиентом. Кроме того, в условиях in vivo высвобождение лекарственного препарата из липосомы, приготовленной с использованием способа с градиентом аммония, может быть различным.

(3) Способ с градиентным комплексообразованием

В данном способе соль иона переходного металла, такого как сульфат меди или сульфат никеля, используют в буфере внутренней водной фазы для получения пустой липосомы. Затем ион металла снаружи липосомы удаляют, среди прочего, поперечным проточным диализом с образованием градиента ионов металла между внутренней и наружной стороной липидной мембраны. Далее проводят нагрузку липосомы препаратом при нагревании. Механизм нагрузки лекарственным препаратом заключается в том, что препарат образует стабильный комплекс с ионом переходного металла во внутренней водной фазе липосомы и таким образом удерживается в липосоме.

Сульфобутиловый эфир β-циклодекстрина (SBE-β-CD) представляет собой ионизированное производное β-циклодекстрина (β-CD), полученное Cydex в США в 90 годах прошлого века, которое является продуктом реакции замещения β-CD 1,4-бутансульфоном. Замещение может иметь место по гидроксильной группе в положениях 2, 3, 6 в глюкозной единице SBE-β-CD. SBE-β-CD представляет собой превосходный фармацевтический наполнитель, обладающий такими преимуществами, как хорошая растворимость в воде, низкая нефротоксичность и низкий гемолиз, и он разрешен FDA для применения в качестве наполнителя для инъекционных препаратов.

До настоящего времени SBE-β-CD использовали для солюбилизации включением нерастворимого лекарственного препарата, и он широко применялся в различных лекарственных формах, среди прочего, таких как инъекционный раствор, композиция для перорального введения, композиция для наружного применения. Chakraborty использовал SBE-β-CD для получения липосомального препарата амфотерицина В с использованием солюбилизации включением нерастворимого препарата с помощью SBE-β-CD (Therapeutic and hemolytic evaluation of in-situ liposomal preparation containing amphotericin-B complexed with different chemically modified β-cyclodextrins. J. Pharm. Pharmaceut. Sci., 2003, Vol. 6, №2).

Wang Zhixuan&Deng Yingjie et al. (Advances in liposome entrapped drug cyclodextrin complex delivery systems. Journal of Shenyang Pharmaceutical University, 2006, Vol. 23) опубликовали обстоятельный обзор по липосомам, включающим комплекс лекарственного препарата с циклодекстрином, который готовили получением комплекса нерастворимого препарата с водорастворимым циклодекстрином и инкапсулированием комплекса во внутреннюю водную фазу липосомы. Для нерастворимого лекарственного препарата трудно войти во внутреннюю водную фазу липосомы, в то время как комплексо-образование-включение с помощью циклодекстрина повышает растворимость в воде нерастворимого препарата и, таким образом, препарат легко включается в липосому. Основной целью инкапсулирования лекарственного препарата в липосому в виде комплекса с циклодекстрином является повышение растворимости нерастворимого препарата и в итоге нагрузка липосомы препаратом.

Липосомальные препараты винорелбина и топотекана, будучи лекарственными препаратами первой линии в химиотерапии опухолей, интенсивно исследовались. В настоящее время нагрузка липосом винорелбином и топотеканом изучалась многими исследовательскими группами. Однако при этом были выявлены следующие проблемы.

Компания Inex в Канаде проводила нагрузку липосом лекарственным препаратом с использованием сфингомиелина и холестерина в молярном соотношении 55:45 в качестве компонентов липидной мембраны, раствора сульфата магния в качестве внутренней водной фазы для получения пустой липосомы, затем транспортом ионов магния из мембраны липосомы с помощью ионофора А21387 и транспортом ионов Н⁺ внутрь липосомы и, таким образом, получением рН-градиента. Приготовленный таким образом липосомальный винорелбин имеет степень инкапсулирования, составляющую более 90%, и он стабилен при хранении при температуре 2-8°С в течение одного года (Optimization and characterization of sphingomyelin/cholesterol liposome formulation of vinorelbine with promising antitumor activity. Journal of Pharmaceutical Sciences, 2005, Vol. 94, № 5).

Канадская исследовательская группа, возглавляемая Bally, использовала 2 способа и получила липосомы с топотеканом с высокой степенью инкапсулирования. В первом способе DSPC и холестерин использовали в качестве липидной мембраны и раствор сульфата марганца в качестве внутренней водной фазы для получения пустой липосомы. Затем получали рН-градиент с использованием ионофора А23187 и проводили нагрузку липосом лекарственным препаратом. Принцип данного способа аналогичен принципу, использованному компанией Inex. Во втором способе использовали DSPC и холестерин в качестве липидной мембраны и раствор сульфата меди в качестве внутренней водной фазы для получения пустой липосомы. Однако нагрузку топотеканом проводили без добавления А23187, поскольку образовывался стабильный комплекс между ионом меди и топотеканом. Использованный в данном случае принцип представляет собой градиентное комплексообразование, описанное выше. Недостатком данного способа является то, что оставшийся ион металла в композиции может проявить токсический эффект в крови (An evaluation of transmembrane ion gradient-mediated encapsulation of topotecan within liposomes. Journal of Controlled Release, 96 (2004); Copper-topotecan complexation mediates drug accumulation into liposomes. Journal of Controlled Release, 114 (2006)).

Исследователи в США использовали дистеароилфосфатидилхолин (DSPC), холестерин и конъюгат диастероилфосфатидилэтаноламина-метоксилполиэтиленгликоля (DSPE-мПЭГ) в качестве липидной мембраны, триэтиламиновую (TA) соль октасульфата сахарозы в качестве внутренней водной фазы для получения пустой липосомы. Затем TA соль октасульфата сахарозы удаляли с использованием, среди прочего, поперечного проточного диализа с образованием градиента TA соли октасульфата сахарозы и выполняли нагрузку препаратом. Принцип способа по существу идентичен принципу, который использовался в способе с градиентом сульфата аммония. Однако каждая молекула октасульфата сахарозы содержит 8 кислотных групп и может образовать прочный комплекс с винорелбином и, таким образом, винорелбин удерживается в липосоме. Период полураспада в плазме крови полученной таким образом липосомы с винорелбином составляет до 9,2 ч (Improved pharmacokinetics and efficacy of a highly stable nanoliposomal vinorelbine. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 2009, Vol. 328, № 1). Серьезная проблема данного способа заключается в том, что октасульфат сахарозы является физиологически активным соединением и активирует фактор роста фибробластов в условиях in vivo (Structural basis for activation of fibroblast growth factor signaling by sucrose octasulfate. Molecular and Cellular Biology, Oct., 2002, Vol. 22, № 20) и индуцирует серию физиологических эффектов. Следовательно, применение октасульфата сахарозы в качестве наполнителя для инъекционного препарата может представлять большой риск.

Компания Alza в США использует гидрогенизированный соевый фосфатидилхолин (HSPC), холестерин и DSPE-мПЭГ в качестве компонентов липидной мембраны, и полианионный полимер, такой как сульфат декстрана, сульфат протеогликана и сульфат целлюлозы во внутреннем водном пространстве. Затем поперечный проточный диализ используют для замены наружной фазы, и образуется полимерный градиент и происходит нагрузка лекарственным препаратом. Принцип способа аналогичен принципу, который используется в способе с градиентом сульфата аммония. Данный способ основан на образовании прочного комплекса полианионного полимера с топотеканом и, таким образом, лекарственный препарат удерживается в липосоме. Недостаток этого способа заключается в том, что полианионные полимеры являются физиологически активными веществами и с трудом поддаются метаболизированию в условиях in vivo, и таким образом, их следует дополнительно оценить в отношении безопасности (Liposome-entrapped topoisomerase inhibitors. Заявка на патент США № 6465008В1).

Из вышеприведенных данных становится очевидным, что исследования с липосомами, включающими слабощелочные лекарственные препараты, такие как винорелбин и топотекан, базируются на способе с рН-градиентом, общем способе с градиентом сульфата аммония и способе градиентного комплексообразования. Однако они тестировались только в лабораторных условиях, и использованные материалы имеют риск того, что: (1) полианионая соль, такая как триэтиламиновая соль октасульфата сахарозы и сульфата полимера, использованная в описанных выше исследованиях, являются физиологически активными веществами и не отвечают общему требованию о том, что наполнитель должен быть неактивным в физиологическом и фармакологическом отношении; (2) ион меди, ион никеля, ион марганца, использованные в вышеописанном способе градиентного комплексообразования, все являются ионами тяжелых металлов, и их присутствие в композиции представляет определенную опасность для человека. Кроме того, поскольку опухоли трудно лечить, и их лечение обычно занимает длительное время, то in vivo кумуляция ионов тяжелых металлов у пациента будет выше допустимых показателей.

Таким образом, по-прежнему требуется разработать новую липосому и соответствующий способ нагрузки ее лекарственным препаратом.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном аспекте настоящее изобретение относится к липосоме, содержащей бислойную мембрану и внутреннюю водную фазу, в которой внутренняя водная фаза содержит сульфобутиловый эфир циклодекстрина или его соль, и активное вещество.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение относится к липосоме, в которой сульфобутиловый эфир циклодекстрина представляет сульфобутиловый эфир α-циклодекстрина, сульфобутиловый эфир β-циклодекстрина или сульфобутиловый эфир γ-циклодекстрина.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение относится к липосоме, в которой каждая молекула сульфобутилового эфира циклодекстрина в среднем содержит примерно 6,5 сульфогрупп.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение относится к липосоме, в которой соль сульфобутилового эфира циклодекстрина образована сульфобутиловым эфиром циклодекстрина с одним или более из амина, иона металла и иона аммония.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение относится к липосоме, в которой соль сульфобутилового эфира циклодекстрина образована сульфобутиловым эфиром циклодекстрина с одним или более из аммиака (NH₃), триэтиламина (ТА), триэтаноламина (TEA), иона натрия, иона калия и иона кальция.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение относится к липосоме, в которой активное вещество является слабощелочным соединением, предпочтительно одним или более выбранным из винорелбина, винкристина, топотекана и иринотекана.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение относится к липосоме, в которой бислойная мембрана содержит фосфолипид, холестерин и гидрофильный модифицированный полимером липид.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу получения липосомы по настоящему изобретению, описанной выше, включающему:

(1) гидратацию порошка липидной фазы водным раствором сульфобутилового эфира циклодекстрина или его соли с образованием пустой липосомы, содержащей водный раствор сульфобутилового эфир циклодекстрина или его соли в качестве внутренней водной фазы;

(2) удаление соли сульфобутилового эфира циклодекстрина из наружной фазы пустой липосомы, полученной на стадии (1), с образованием анионного градиента;

(3) необязательно, если соль сульфобутилового эфира циклодекстрина представляет соль иона металла, то добавление ионофора иона металла в наружную фазу пустой липосомы, полученной на стадии (2), с образованием рН-градиента; и

(4) инкубацию пустой липосомы, полученной на стадиях (2) или (3), с активным веществом в водном растворе для инкапсулирования активного вещества в липосому.

Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к способу получения липосомы, в котором ионофор иона металла представляет ионофор А23187.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к липосомальному фармацевтическому препарату, содержащему липосому по одному из вариантов осуществления настоящего изобретения, описанных выше, и фармацевтически приемлемый носитель и/или наполнитель.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение относится к липосомальному фармацевтическому препарату, в котором носитель и/или наполнитель содержит осмотический регулятор и/или антиоксидант.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к применению липосомы по одному из вариантов осуществления настоящего изобретения, описанных выше, в производстве лекарственного препарата для лечения опухоли у пациента, где активное вещество в липосоме представляет одно или более из винорелбина, винкристина, топотекана и иринотекана.

Разработка новых способов зависит от изученности механизма традиционных способов нагрузки липосом лекарственным препаратом. Во-первых, тестировали способ с градиентом сульфата аммония, который включает следующий процесс: под действием различий в концентрации и рН, высококонцентрированный препарат в наружной фазе липосомы преодолевает сопротивление липидной мембраны (фосфолипидной бислойной мембраны) и переходит во внутреннюю водную фазу липосомы. Лекарственный препарат, перейдя во внутреннюю водную фазу, протонируется и преципитируется под действием SO₄ ^2-, и стабильно удерживается в липосоме. Для высвобождения препарата необходимо, чтобы он диссоциировал из преципитата и диффундировал из липосомы. Следовательно, микроскопическая структура и растворимость преципитата определяют скорость высвобождения препарата из липосомы и также определяют безопасность и эффективность композиции.

Микроскопическая структура и сложность преципитата, образованного препаратом и SO₄ ^2-, связаны с пространственной структурой и слабыми щелочными свойствами лекарственного препарата. Некоторые препараты, такие как доксорубицин гидрохлорид, способны образовать преципитат с SO₄ ^2- за счет их сильных щелочных свойств. Кроме того, молекулы лекарственного препарата могут «нагромождаться» друг на друга за счет квазипланарной структуры молекулы, и внутри липосомы образуется компактный удлиненный преципитат, который хорошо виден при микроскопии. Следовательно, доксорубицин гидрохлорид может прочно удерживаться в липосоме, и период полураспада t_1/2 его липосомальной композиции у мышей KM составляет более 15 ч. В противоположность другие препараты, такие как винорелбин и топотекан, являются слабощелочными соединениями и, таким образом, обладают низкой способностью преципитироваться с SO₄ ^2-, и молекулы препарата не могут «нагромождаться» друг на друга за счет непланарной структуры молекулы. Следовательно, значение t_1/2 у мышей KM составляет менее 5 ч, даже если липосома приготовлена с использованием такой же липидной композиции и способа получения, аналогичного описанному для доксорубицина гидрохлорида. Период полураспада является слишком коротким, и большая часть лекарственного препарата вытекает из липосомы в системе кровообращения, и он не может достичь области опухоли. Даже то относительно небольшое количество липосомального препарата, которое достигает области опухоли, будет высвобождаться очень быстро. Является нежелательным для противоопухолевого препарата с механизмом действия, специфическим для определенных стадий клеточного цикла, чтобы таким образом проявлялось его действие. В заключении можно отметить, что одним из критических факторов для высвобождения лекарственного препарата из липосом является сложность структуры преципитата, образованного лекарственным препаратом и анионом.

Слабые щелочные свойства препарата, такого как винорелбин и топотекан, не изменяются, и таким образом, является критическим фактором найти анионы, которые могут ассоциировать и образовывать компактный преципитат с лекарственным препаратом, и также полианионные соединения, обладающие сложной структурой, которые могут образовать стабильный комплекс с ним.

Экспериментально было показано, что с помощью настоящего изобретения можно достичь эффективного инкапсулирования препарата, обладающего слабощелочными свойствами, такого как винорелбин или топотекан. Результаты тестирования высвобождения в условиях in vitro и изучения фармакокинетики подтверждают, что по сравнению с композициями с обычной внутренней водной фазой на основе сульфата аммония, высвобождение липосомального препарата по настоящему изобретению существенно растянуто во времени. Настоящее изобретение также подходит для других противоопухолевых препаратов, таких как винкристин и иринотекан, которые, как и винорелбин и топотекан, обладают аналогичными слабощелочными свойствами.

Заявители настоящего изобретения «разрушили» традиционное представление об использовании способности SBE-β-CD образовывать комплексы включением, и использовали его полианионную природу для применения в качестве внутренней водной фазы липосомы и для активной нагрузки лекарственным препаратом. Применение соли сульфобутилового эфира циклодекстрина в качестве внутренней водной фазы для нагрузки препаратом базируется на принципе, аналогичном для использования сульфата аммония в качестве внутренней водной фазы, т.е. согласно которому анион во внутренней водной фазе образует преципитат с молекулой препарата и, таким образом, время высвобождения увеличивается. Однако каждая молекула сульфобутилового эфира циклодекстрина содержит в среднем 6,5 групп SO₃ ^2-, которые могут одновременно связываться с многочисленными молекулами препарата и образовывать более сложную структуру преципитата. Следовательно, достигается высокая степень инкапсулирования, и время удерживания препарата существенно увеличивается по сравнению с липосомой с внутренней водной фазой на основе сульфата аммония.

Липосома, приготовленная с использованием сульфобутилового эфира циклодекстрина по настоящему изобретению, полностью отличается от липосомы с обычным включением препарата под действием циклодекстрина. Настоящее изобретение не предназначается для решения проблемы растворимости нерастворимого препарата, а предназначено для увеличения времени удерживания в липосоме слабощелочного препарата и увеличения степени его инкапсулирования. В дополнении примеры в настоящем изобретении подтвердили, что степень инкапсулирования была низкой, когда липосому готовили только с использованием способности сульфобутилового эфира циклодекстрина образовывать комплексы включением, что не может отвечать требованиям для препаратов, применяемым в клинике.

Для получения липосомальных препаратов с хорошими свойствами вначале нужно приготовить соль сульфобутилового эфира циклодекстрина и затем приготовить липосому с использованием подходящего способа. Способ, использованный в настоящем изобретении, включает:

(А) Получение солей сульфобутилового эфира циклодекстрина: приготовление водного раствора сульфобутилового эфира циклодекстрина и получение соли с триэтиламином, триэтаноламином, аммиаком, гидроксидом натрия, гидроксидом калия или гидроксидом кальция.

(В) Приготовление липосом: растворение липидных наполнителей в органическом растворителе, удаление органического растворителя лиофилизацией и затем получение рыхлого липидного порошка, гидратация порошка липидной фазы водным раствором соли сульфобутилового эфира циклодекстрина с образованием пустой липосомы. Уменьшение размера пустой липосомы с помощью микроструйного аппарата или экструзионного аппарата высокого давления, удаление соли сульфобутилового эфира циклодекстрина в наружной фазе липосомы, среди прочего, диализом или колоночной хроматографией с образованием анионного трансмембранного градиента. В том случае, если соль сульфобутилового эфира циклодекстрина представляет соль иона металла, то необходимо добавление ионофора металла. Ионофор металла можно включить в фосфолипидную мембрану для обмена внутреннего иона металла и наружного иона водорода и, таким образом, образования рН-градиента. Затем получают липосомальный препарат инкубацией раствора лекарственного препарата и суспензии липосом.

Сульфобутиловый эфир циклодекстрина, использованный в данном изобретении, в настоящее время является промышленно доступным. Однако его можно получить в виде сыпучего материала с хорошим качеством и в количестве, отвечающем потребностям крупномасштабного производства.

В заключение в настоящем изобретении применение солей сульфобутилового эфира циклодекстрина в качестве внутренней водной фазы липосомы является полностью подходящим с учетом инкапсулирования лекарственного препарата, эффекта удерживания и низкой стоимости.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение иллюстрируется последующими примерами, которые приводятся только в качестве примера, и их не следует рассматривать в качестве ограничения объема настоящего изобретения.

В том смысле, в котором в данном документе используется термин «соотношение лекарственный препарат/липид», оно относится к соотношению массы препарата к фосфолипиду, и выражение «содержание DSPE-мПЭГ» относится к его молярному проценту в общем содержании фосфолипидных компонентов в бислойной мембране липосомы.

Пример 1

Общий способ получения липосом с сульфобутиловым эфиром циклодекстрина (SBE-CD) в качестве внутренней водной фазы

(с композицией SBE-CD)

HSPC, холестерин и DSPE-мПЭГ2000 c соотношением масс 3:1:1 смешивали и растворяли в 95% трет-бутиловом спирте. Органический растворитель удаляли лиофилизацией с получением рыхлого порошка липидов. Порошок гидратировали водным раствором сульфобутилового эфира β-циклодекстрина при 50-60°С и инкубировали в течение 1 ч с получением гетерогенных мультивезикулярных липосом. Размер липосомных частиц уменьшали с помощью микроструйного аппарата. Анион в наружной фазе пустой липосомы удаляли ультрафильтрацией с образованием динамичного трансмембранного градиента. К пустым липосомам добавляли водный раствор препарата при соответствующем соотношении препарат/липид и нагрузку препаратом проводили инкубацией при 60°С в течение 1 ч.

Пример 2

Общий способ получения липосом с триэтиламиновой солью сульфобутилового эфира циклодекстрина в качестве внутренней водной фазы (с композицией SBE-CD/TA)

HSPC, холестерин и DSPE-мПЭГ2000 c соотношением масс 3:1:1 смешивали и растворяли в 95% трет-бутиловом спирте. Органический растворитель удаляли лиофилизацией с получением рыхлого порошка липидов. Порошок гидратировали водным раствором триэтиламиновой соли сульфобутилового эфира циклодекстрина при 50-60°С и инкубировали в течение 1 ч с получением гетерогенных мультивезикулярных липосом. Размер липосомных частиц уменьшали с помощью экструзионного аппарата высокого давления. Анион в наружной фазе пустой липосомы удаляли ультрафильтрацией с образованием динамичного трансмембранного градиента. К пустым липосомам добавляли водный раствор препарата при соответствующем соотношении препарат/липид и нагрузку препаратом проводили инкубацией при 60°С в течение 1 ч.

Пример 3

Общий способ получения липосом с натриевой солью сульфобутилового эфира циклодекстрина в качестве внутренней водной фазы (с композицией SBE-CD/Na)

HSPC, холестерин и DSPE-мПЭГ2000 c соотношением масс 3:1:1 смешивали и растворяли в 95% трет-бутиловом спирте. Органический растворитель удаляли лиофилизацией с получением рыхлого порошка липидов. Порошок гидратировали водным раствором натриевой соли сульфобутилового эфира циклодекстрина при 50-60°С и инкубировали в течение 1 ч с получением гетерогенных мультивезикулярных липосом. Размер липосомных частиц уменьшали с помощью экструзионного аппарата высокого давления. Анион в наружной фазе пустой липосомы удаляли колоночной хроматографией и затем добавляли этанольный раствор никкомицина в соответствующем количестве (20 нг никкомицина/1 мг HSPC). Полученную смесь инкубировали при 60°С в течение 10 мин для обмена ионов водорода и ионов натрия через липосомальную мембрану с образованием рН-градиента. К пустым липосомам добавляли водный раствор препарата при соответствующем соотношении препарат/липид и нагрузку препаратом проводили инкубацией при 60°С в течение 1 ч.

Пример 4

Сравнение степени инкапсулирования липосом, содержащих различные водные фазы

Липосомы с различными лекарственными препаратами с 3 соответствующими водными фазами готовили, как описано в примерах 1, 2 и 3, с соотношением лекарственный препарат/липид 2:9,58 (смотри таблицу 1).

Таблица 1 Влияние внутрилипосомального захватывающего агента на нагрузку препаратом Препарат Степень инкапсулирования липосом, содержащих различные внутренние водные фазы (%) SBE-CD SBE-CD/TA SBE-CD/Na Митоксатрон гидрохлорид 7,6 48,5 77,6 Топотекан гидрохлорид 4,8 63,6 74,6 Иринотекан гидрохлорид 5,3 64,1 96,1 Доксорубицин гидрохлорид 11,3 63,5 91,8 Винорелбин битартрат 4,7 38,2 75,9 Винкристин сульфат 3,8 47,8 79,7 Заключение: как следует из данных по степени инкапсулирования липосом, содержащих SBE-CD в качестве внутренней водной фазы, то они имеют низкую степень инкапсулирования, в то время как высокая степень инкапсулирования достигалась при использовании SBE-CD/TA и SBE-CD/Na, указывая на то, что высокое инкапсулирование не достигается, если только рН-градиент не образуется посредством транспорта ионов. После поступления во внутреннюю водную фазу липосомы лекарственный препарат вначале протонируется и затем ассоциируется с SBE-CD, и нагрузка лекарственным препаратом, вряд ли, достигается, исключительно в зависимости от эффекта включения SBE-CD.

Пример 5

Высвобождение винкристина из липосомальных композиций, содержащих различные внутренние водные фазы (SBE-CD/TA по сравнению с сульфатом аммония) в условиях in vitro

1. Образцы

Липосомы с винкристином готовили с соотношением лекарственный препарат/липид, составляющим 3:9,58, как описано в примере 2 для липосомы, содержащей SBE-CD/TA в качестве внутренней водной фазы, за исключением замены триэтиламиновой соли сульфобутилового эфира β-циклодекстрина на сульфат аммония, для липосомы, содержащей сульфат аммония в качестве внутренней водной фазы.

2. Условия оценки высвобождения

Образцы липосомальных композиций винкристина разбавляли в 10 раз буфером для высвобождения (5 мМ NH₄Cl/10 мМ гистидина/260 мМ глюкозы, рН 7,0) и переносили в мешочки для диализа. Диализ проводили против 200-кратного объема буфера для диализа в колбе для растворения. Тест оценки высвобождения проводили при 37°С, 75 об/мин. На различные временные точки (1; 2; 4; 6; 8; 24 ч) отбирали аликвотные порции для анализа.

3. Результаты

Таблица 2 Высвобождение винкристина из липосом с различными внутренними водными фазами Внутренняя водная фаза Скорость высвобождения препарата (%) 1 ч 2 ч 4 ч 6 ч 8 ч 24 ч t1/2 (ч) SBE-CD/TA 22 31 44 52 61 94 7,2 Сульфат аммония 26 62 91 7 98 99 1,1 Заключение: по сравнению с липосомой, содержащей сульфат аммония в качестве внутренней водной фазы, липосома, содержащая SBE-CD/TA в качестве внутренней водной фазы, обеспечивает значительное удлинение времени удерживания лекарственного препарата во внутренней водной фазе.

Пример 6

Высвобождение винорелбина из липосомальных композиций, содержащих SBE-CD/NH ₃ и сульфат аммония в качестве смешанной внутренней водной фазы в условиях in vitro

1. Образцы

Липосомы с винорелбином готовили с соотношением лекарственный препарат/липид, составляющим 3:9,58, как описано в примере 2, за исключением замены триэтиламиновой соли сульфобутилового эфира β-циклодекстрина на смешанный раствор SBE-CD/NH₃ и сульфата аммония, обозначенных как A-F в таблице 3.

Таблица 3 Композиции с липосомальным винорелбином, содержащие SBE-CD/NH₃ и сульфат аммония в качестве смешанной внутренней водной фазы Номер Концентрация (мМ) [H+] SBE-CD Сульфат аммония A 280,8 86,4 B 236,7 108,9 C 204,3 126,0 D 180,0 138,6 E 160,2 148,5 F 0 225,0

2. Условия оценки высвобождения

Образцы липосомальных композиций разбавляли в 10 раз буфером для высвобождения (2 мМ NH₄Cl/10 мМ гистидина/260 мМ глюкозы, рН 7,5) и переносили в мешочки для диализа. Диализ проводили против 200-кратного объема буфера для диализа в колбе для растворения. Тест оценки высвобождения проводили при 37°С, 75 об/мин. На различные временные точки (1; 2; 4; 6; 8 ч) отбирали аликвотные порции для анализа.

3. Результаты

Таблица 4 Высвобождение винорелбина из липосомальных композиций с различными внутренними водными фазами Время отбора проб (ч) Скорость высвобождения для липосом, содержащих различные внутренние водные фазы (%) A B C D E F 1 34,9 25,1 33,2 36,0 39,1 68,3 2 56,6 51,8 59,0 63,1 67,7 91,5 4 83,6 83,5 98,3 90,2 93,4 98,6 8 97,4 97,2 98,0 98,5 98,6 99,3 Заключение: липосомы, содержащие высокое относительное количество SBE-CD/NH₃ в смешанной внутренней водной фазе, показывали относительно замедленное высвобождение лекарственного препарата, указывая на то, что аммониевая соль SBE-CD может удлинить высвобождение лекарственного препарата.

Пример 7

Фармакокинетика липосом, содержащих сульфат аммония, различные аммониевые соли SBE-CD в качестве внутренней водной фазы

1. Образцы

Липосомы с винорелбином, винкристином и иринотеканом готовили с соотношением лекарственный препарат/липид, составляющим 2:9,58, как описано в примере 2, за исключением замены SBE-β-CD/TA c (NH₄)SO₄ на (NH₄)SO₄ в качестве внутренней водной фазы, как описано в примере 2 для SBE-CD/TA в качестве внутренней водной фазы, и как описано в примере 2, за исключением замены SBE-β-CD/TA с SBE-β-CD/NH₃ на SBE-CD/NH₃ в качестве внутренней водной фазы.

2. Животные и дозы

Данный пример проводили на мышах-самцах DBA/2, и доза составляла 10 мг/кг.

3. Результаты

Таблица 5 Фармакокинетика в плазме крови липосомальных композиций с различными внутренними водными фазами Внутренняя водная фаза Период полураспада липосом с различными лекарственными препаратами (ч) Винорелбин Винкристин Иринотекан SBE-CD/TA 4,4 67,3 8,6 SBE-CD/NH₃ 5,4 46,2 11,3 (NH₄)₂SO₄ 3,1 27,6 4,1 Заключение: как свидетельствуют результаты исследования фармакокинетики, по сравнению с липосомами, содержащими сульфат аммония в качестве внутренней водной фазы, липосомы с SBE-CD/NH₃ в качестве внутренней водной фазы имели существенно более длинный период полураспада.

Пример 8

Эффективность липосом с винорелбином, содержащих различные внутренние водные фазы, на модели опухоли LLC

1. Композиции

Композиция 1: SBE-CD/TA в качестве внутренней водной фазы, приготовленная, как описано в примере 2.

Композиция 2: Сульфат аммония в качестве внутренней водной фазы, приготовленная как описано в примере 2, за исключением замены SBE-β-CD/TA на сульфат аммония.

В обеих композициях соотношение лекарственный препарат/липид составляло 3:9,58, и содержание DSPE-мПЭГа2000 равнялось 0,5%.

2. Эксперименты

Собирали клетки злокачественной опухоли легких LLC и разводили средой DMEM. После разведения количество опухолевых клеток доводили до 2,0×10⁶ клеток/мл. Объем суспензии опухолевых клеток, составляющий 0,2 мл, содержащий примерно 4×10⁵ опухолевых клеток, вводили подкожно во внутреннюю часть плеча передней конечности мышам-самкам С57 в асептических условиях. Через 14 суток после прививки опухолевых клеток мышей произвольно распределяли по объему опухоли на три группы и липосомы вводили однократно внутривенно в дозе 10 мг/кг.

После введения липосомального препарата мышей содержали в обычных условиях. Определяли диаметр опухолей для оценки в динамике эффективности различных композиций. Объем опухолей (TV) определяли по следующей формуле:

TV = 1/2 × a × b², в которой a и b представляют соответственно длину и ширину опухоли.

Объем опухолей рассчитывали с использованием результатов определения размеров опухолей. Результаты эксперимента анализировали с использованием программного обеспечения SPSS 11.5 statistics.

3. Результаты

Таблица 6 Противоопухолевая эффективность липосом с винорелбином, содержащих различные внутренние водные фазы, на модели опухоли LLC (n=10; χ ± sd) Сутки после введения Объем опухолей (мм³) SBE-CD/TA Сульфат аммония 5% раствор глюкозы 0 785,0±343,0 692,2±259,3 780,8±353,3 1 1214,5±732,4 979,7±507,3 1154,8±618,0 2 1179,6±730,0 940,7±415,1 1378,2±753,2 3 1420,5±716,3 1116,8±503,5 1964,3±1004,2 4 1591,6±1056,1 1091,6±562,3** 2456,5±1170,1 6 1665,2±1121,3* 1353,7±631,6** 3173,9±1591,2 7 2034,7±1233,8* 1846,7±1051,5** 4117,7±2022,8 9 1939,0±1171,0** 2086,5±1446,8** 4715,0±2203,6 11 2605,2±1683,3** 3142,4±1643,0* 6307,6±3194,9 12 2893,5±1656,5** 3650,4±1931,8** 7562,9±3819,7 14 3793,5±2671,7** 5106,1±2465,1** 9464,8±4151,7 P<0,01; P<0,05 по сравнению с 5% раствором глюкозы в качестве контроля

По сравнению с 5% раствором глюкозы рост опухолей достоверно подавлялся, начиная с 4 суток, для липосом с сульфатом аммония в качестве внутренней водной фазы, и начиная с 6 суток, для липосом, содержащих SBE-CD в качестве внутренней водной фазы.

Рассчитывали относительную скорость пролиферации опухолевых клеток T/C (%) по следующей формуле: T/C % = TRTV/CRTV × 100%, в которой TRTV и CRTV представляют относительный объем опухолей (RTV) соответственно в опытной группе и группе отрицательного контроля. RTV = Vt/Vo. Vo означает объем опухолей на сутки 0 (начальная доза) и Vt означает объем опухолей на каждые сутки определения их размеров. В отношении относительной скорости пролиферации опухолевых клеток, то у мышей в группе с SBE-CD и группе с сульфатом аммония имело место самое низкое значение T/C % и оно составляло соответственно 51,8 и 31,1%. То есть противоопухолевая эффективность в группе с SBE-CD на модели злокачественной опухоли легких LLC была выше по сравнению с группой с сульфатом аммония.

Пример 9

Противоопухолевая эффективность липосом с топотеканом, содержащих различные внутренние водные фазы, на модели опухоли простаты RM-1

1. Композиции

Композиция 1: SBE-CD/TA в качестве внутренней водной фазы, приготовленная, как описано в примере 2.

Композиция 2: Октасульфат сахарозы в качестве внутренней водной фазы, приготовленная, как описано в примере 2, за исключением замены SBE-β-CD/TA на октасульфат сахарозы.

В обеих композициях соотношение лекарственный препарат/липид составляло 3:9,58, и содержание DSPE-мПЭГа2000 равнялось 0,5%.

2. Эксперименты

Собирали клетки злокачественной опухоли простаты RM-1 и разводили средой 1640. После разведения количество опухолевых клеток доводили до 2,0×10⁶ клеток/мл. Объем суспензии опухолевых клеток, составляющий 0,2 мл, содержащий примерно 4×10⁵ опухолевых клеток, вводили подкожно во внутреннюю часть плеча передней конечности мышам-самкам С57 в асептических условиях. Через 14 суток после прививки опухолевых клеток мышей произвольно распределяли по объему опухоли на группы и липосомы вводили однократно внутривенно в дозе 10 мг/кг.

После введения липосомального препарата мышей содержали в обычных условиях. Определяли диаметр опухолей для оценки в динамике эффективности различных композиций. Объем опухолей (TV) определяли по следующей формуле:

TV = 1/2 × a × b², в которой a и b представляют соответственно длину и ширину опухоли.

Объем опухолей рассчитывали с использованием результатов определения размеров опухолей. Результаты эксперимента анализировали с использованием программного обеспечения SPSS 11.5 statistics.

3. Результаты

Таблица 7 Противоопухолевая эффективность липосом с топотеканом на модели опухолей RM-1 (n=10; χ ± sd) Сутки после введения Объем опухолей (мм³) SBE-CD/TA Октасульфат сахарозы Свободный топотекан 5% раствор глюкозы 0 220,1±70,1 218,8±67,3 223,0±65,7 219,6±60,2 2 339,2±145,0* 336,8±96,3* 484,0±154,7 468,9±137,7 4 397,3±234,4* 347,0±117,8** 606,0±183,1 765,3±415,2

6 483,1±253,6** 500,3±165,5** 1060,7±393,0 1376,9±689,3 8 690,2±656,7* 640,7±280,7** 1301,8±563,7 2082,9±1508,7 9 914,0±691,4* 734,2±343,6* 1628,5±835,4 2598,7±2148,2 13 1876,2±1931,9* 1247,8±858,7** 3592,9±1523,5 4499,4±2946,5 15 2833,9±3016,7* 2571,1±2844,9** 6639,3±2388,2 7504,9±4335,9 P<0,01; P<0,05 по сравнению с 5% глюкозы в качестве контроля

По сравнению с 5% раствором глюкозы, который использовали в качестве контроля, свободный топотекан не оказывал достоверного ингибирующего действия на рост опухолей (Р>0,05), в то время как рост опухолей достоверно подавлялся в двух группах с липосомами, содержащими различные внутренние водные фазы. Наблюдали достоверные различия для липосомальных препаратов по сравнению с введением свободного топотекана в одних и тех же дозах, в то время как достоверные различия между двумя липосомальными композициями по подавлению роста опухоли RM-1 отсутствовали.

Пример 10

Токсичность различных липосомальных композиций с топотеканом на мышах KM

1. Композиции

Композиция 1: SBE-CD/TA в качестве внутренней водной фазы, приготовленная, как описано в примере 2.

Композиция 2: Октасульфат сахарозы в качестве внутренней водной фазы, приготовленная, как описано в примере 2, за исключением замены SBE-β-CD/TA на октасульфат сахарозы.

В обеих композициях соотношение лекарственный препарат/липид составляло 3:9,58 и содержание DSPE-мПЭГа2000 равнялось 0,5%.

2. Эксперименты

Токсичность трех липосомальных препаратов и свободного препарата оценивали на мышах-самках KM, начиная с максимальной дозы, равной 40,6 мг/кг топотекана, и затем с последовательным снижением вводимой дозы в 1,25 раза (т.е. дозы оставляли 40,6; 32,5; 26,0; 16,6; 13,3 и 10,6 мг/кг). Наблюдали за общим состоянием мышей и животных взвешивали ежедневно в течение 14 суток.

Таблица 8 Токсичность липосомальных композиций с топотеканом с различными внутренними водными фазами Доза (мг/кг) Количество павших животных Количество животных с >15% потерей массы SBE-CD/TA Октасульфат сахарозы Свободный топотекан SBE-CD/TA Октасульфат сахарозы Свободный топотекан 40,6 1 2 1 2 2 2 32,5 1 2 - 2 2 1 26,0 - 2 - 2 2 - 20,8 - 2 - 2 2 - 16,6 - 2 - 2 2 - 13,3 - 1 - 2 1 - 10,6 - 1 - 2 1 -

Как показано в таблице 8, токсичность испытуемых препаратов в порядке возрастания была следующей: свободный топотекан < липосомы с SBE-CD/TA в качестве внутренней водной фазы < липосомы с октасульфатом сахарозы в качестве внутренней водной фазы. Липосомы с октасульфатом сахарозы вызывали гибель животных в относительно низкой дозе.

Заявители настоящего изобретения дополнительно приготовили липосомы с винорелбином, винкристином и иринотеканом, и аналогично оценивали их токсичность на мышах KM. Были получены результаты, аналогичные для топотекана. Токсичность препаратов в порядке возрастания была следующей: свободный лекарственный препарат < липосомы с SBE-CD/TA в качестве внутренней водной фазы < липосомы с октасульфатом сахарозы в качестве внутренней водной фазы. Липосомы с октасульфатом сахарозы вызывали гибель животных в относительно низкой дозе.

Изобретение относится к медицине и заключается в липосоме, содержащей бислойную мембрану и внутреннюю водную фазу. Внутренняя водная фаза содержит соль сульфобутилового эфира циклодекстрина, образованную сульфобутиловым эфиром циклодекстрина с одним или более из гидроксида аммония, триэтиламина и триэтаноламина, и активное вещество, выбранное из винорелбина, винкристина, топотекана и иринотекана. Изобретение относится также к способу получения указанной липосомы и к липосомальному фармацевтическому средству, содержащему указанную липосому. Технический результат заключается в регулировании высвобождения активного вещества из липосомы. 3 н. и 5 з.п. ф-лы, 10 пр., 8 табл.

1. Липосома для получения фармацевтического средства, содержащая бислойную мембрану и внутреннюю водную фазу, в которой внутренняя водная фаза содержит соль сульфобутилового эфира циклодекстрина и активное вещество, в которой соль сульфобутилового эфира циклодекстрина образована сульфобутиловым эфиром циклодекстрина с одним или более из гидроксида аммония, триэтиламина и триэтаноламина, и где активное вещество представляет собой одно или более из винорелбина, винкристина, топотекана и иринотекана.

2. Липосома по п. 1, в которой сульфобутиловый эфир циклодекстрина представляет сульфобутиловый эфир α-циклодекстрина, сульфобутиловый эфир β-циклодекстрина или сульфобутиловый эфир γ-циклодекстрина.

3. Липосома по п. 1, в которой сульфобутиловый эфир циклодекстрина в среднем содержит примерно 6,5 сульфогрупп на молекулу.

4. Липосома по п. 1, в которой бислойная мембрана содержит фосфолипид, холестерин и гидрофильный модифицированный полимером липид.

5. Способ получения липосомы по одному из пп. 1-4, включающий:
(1) гидратацию порошка липидной фазы водным раствором соли сульфобутилового эфира циклодекстрина с образованием пустой липосомы, содержащей водный раствор соли сульфобутилового эфира циклодекстрина в качестве внутренней водной фазы;
(2) удаление соли сульфобутилового эфира циклодекстрина из наружной фазы пустой липосомы, полученной на стадии (1), с образованием анионного градиента;
(3) инкубацию пустой липосомы, полученной на стадии (2), с активным веществом в водном растворе для инкапсулирования активного вещества в липосому.

6. Липосомальное фармацевтическое средство, содержащее липосому по одному из пп. 1-4, и фармацевтически приемлемый носитель и/или наполнитель.

7. Липосомальное фармацевтическое средство по п. 6, в котором носитель и/или наполнитель содержит осмотический регулятор и/или антиоксидант.

8. Липосома по одному из пп. 1-4 для лечения опухоли у пациента, где активное вещество в липосоме представляет одно или более из винорелбина, винкристина, топотекана и иринотекана.