ГОТОВЫЙ К ПРИМЕНЕНИЮ СОСТАВ ДЛЯ ЛИПОСОМАЛЬНОЙ ИНЪЕКЦИИ ВИНКРИСТИНА СУЛЬФАТА Российский патент 2019 года по МПК A61K9/107 A61K31/475 A61P35/00 

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[1] Липосомальные составы химиотерапевтических агентов, таких как винкристин, могут проявлять более выраженную клиническую эффективность при лечении рака по сравнению с их неинкапсулированными формами. Фармацевтические составы наночастиц могут обеспечить продленное удерживание лекарственного средства in vivo, более длительные периоды полужизни в фармакокинетике и увеличение накопления в участках опухоли, что может привести к улучшению клинических результатов. Эти характеристики могут быть особенно привлекательными для лекарственных средств, влияющих на клеточный цикл, таких как винкристин, которые нарушают связывание тубулина во время клеточного митоза. Основное преимущество применения липосом заключается в возможности потенциально введения липосомальной инъекции винкристина сульфата (ЛИВС) без "потолка" (максимально возможной) дозы и даже с возможностью интенсификации дозы. При том, что неинкапсулированный винкристин назначается с учетом "потолка" дозы во избежание серьезной невропатологической токсичности, ограничивающей объем вводимой дозы.

[2] Эффективность липосомального состава, по-видимому, заключается в способности липосомы сохранять терапевтический агент и поддерживать химическую стабильность активного агента. Считается, что при применении липосом, состоящих из сфингомиелина-холестерина, как и в ЛИВС, эти резистентные к гидролизу липосомы обеспечивают терапевтически значимое время удерживания лекарственного средства. Однако химическая нестабильность винкристина может ограничивать стабильность ЛИВС в течение срока годности. Исследования стабильности, проводимые для препарата Марквибо (Marqibo), по всей видимости, демонстрируют, что разрушение ЛИВС происходило в течение 24 часов после разбавления при комнатной температуре. В актуальной утвержденной маркировке, соответствующей требованиям FDA, настоятельно рекомендуется введение препарата в течение 24 часов после разбавления. Учитывая ограничения долгосрочной стабильности, наблюдаемые у препарата ЛИВС, его готовят в аптеке непосредственно перед введением.

[3] Учитывая невозможность изготовления номинально стабильного, готового к применению состава, липосомальную инъекцию винкристина сульфата (ЛИВС) (0,16 мг/мл) готовят в аптеке из трех компонентов лекарственного средства, поставляемых в составе набора Марквибо® (Marqibo^® Kit). Три компонента лекарственного средства представляют собой инъекцию винкристина сульфата (ИВС), Фармакопея США (USP), липосомальную инъекцию сфингомиелина-холестерина (ЛИСХ) и инъекцию фосфата натрия (ИФН). Трехкомпонентный набор был выбран в качестве пригодного способа хранения лекарственной формы со сроком годности в течение как минимум 24 месяцев. Стабильность набора можно регулировать с помощью компонента набора с самым коротким сроком годности при температуре 2-8° C, например, инъекции винкристина сульфата.

[4] Поэтому может быть желательной разработка готового к применению состава во избежание необходимости многоэтапного приготовления препарата в аптеке; это упростит введение Марквибо и устранит необходимость приобретения вспомогательного оборудования, например, водяного термостата для разбавления, и сведет к минимуму вероятность ошибок при приготовлении медикаментозного препарата. Стабильность продукта ограничена разложением винкристина, главным образом с образованием N-десформилвинкристина (NFV). Это, по-видимому, самый существенный продукт разложения ЛИВС, а также ИВС, как компонента набора Марквибо. Постепенное увеличение количества этой примеси приводит к тому, что набор Марквибо и ИВС имеют срок годности 24 месяца.

[5] Винкристин представляет собой димерное соединение индолидингидроиндола, выделенное из листьев растения Vinca rosea. Алкалоид состоит из N-десметил-N-формил-виндолинового фрагмента, соединенного с видами велбанамина. Велбанамин, по-видимому, является наиболее устойчивым в солевой форме. Соли легко получают путем добавления теоретического количества кислоты к раствору алкалоидной свободной основы, однако, как отмечено выше, даже винкристиновые соли имеют ограниченную стабильность: 24 месяца при 4°C. N-деформилирование винкристина сульфата представляет собой значимый путь разложения винкристина. N-формамид размещается на N1 азоте деформированного гетероциклического соединения виндолина и, вероятно, расширяет карбонильную функцию амида в положении, уязвимом для нуклеофильной атаки или гидролиза. Другие несущественные пути разложения включают гидролитические трансформации винкристина, такие как 4-деацетилирование или потеря метилового эфира при 18° C последующим декарбоксилированием.

[6] Эта лабильность винкристина в свое время препятствовала разработке стабильных неинкапсулированных композиций винкристина компании-разработчику ИВС (Фармакопея США) Eli Lilly. Lilly стремилась разработать сублимированный или лиофилизированный состав инъекции винкристина сульфата. Разложение винкристина, по-видимому, приводило к отказу от этих лекарственных форм в пользу готового к применению раствора, содержащего винкристина сульфат. Винкристин чувствителен к тепловому, кислотному и светловому воздействию, которое обуславливает разложению препарата на виды N-десформилвинкрестина, а также на другие родственные примеси. Доказано, что окисление на воздухе может быть фактором, способствующим разложению, кроме того, продемонстрировано, что термическая стерилизация не совместима с ЛИВС или ИВС из-за образования примесей в результате разложения.

[7] Структурная сложность винкристина и часто непредсказуемая химическая чувствительность димера были главным препятствием для применения обычных типов вспомогательных веществ, традиционных для фармацевтических составов. Ученые компании Eli Lilly отметили, что при разработке составов ИВС наличие ионов хлорида должно быть сведено к минимуму, поскольку они могут оказывать "пагубное влияние на онколитические димеры барвинка". Пагубные эффекты ионов хлорида в лекарственных средствах встречаются редко. Хлорид натрия широко применяется в фармацевтических составах для получения желаемых изотонических свойств. В одном из сообщений утверждается, что доксорубицин и винкристин быстро разлагаются в 0,45% водном растворе хлорида натрия и растворе Рингера при 25°С до 37°С. Ион хлорида также обуславливал нестабильность противогрибкового препарата тимеросал в офтальмологических составах, содержащих хлорид натрия в качестве изотонического агента. Эти наблюдения подчеркивают уникальную и чрезмерную химическую чувствительность винкристина.

[8] Невозможность разработки готовых к применению составов для препарата Марквибо^® с длительным сроком годности, привели к поиску альтернативного способа введения ЛИВС, обусловившего необходимость разработки набора из трех флаконов. Набор из трех флаконов для приготовления раствора препарата Марквибо ^® и последующего его введения (с разбавлением в аптеке) получил разрешение на продажу от FDA в августе 2012 года.

[9] Разработка готовой к применению лекарственной формы существенно оптимизирует процесс введения Марквибо ^®. Компанией Inex, разработчиком препарата Марквибо, были предложены исследования для улучшения стабильности состава ЛИВС, при которых применяли лиофилизацию, платформы для нагрузки ионофорами или платформы для нагрузки липосом марганцем, или сульфатом магния. Эти предложения были основаны на применении способов инкапсуляции второго поколения, которые, как утверждается, были более мягкими или электронейтральными по отношению к липосоме по сравнению со способом градиента рН. Однако во время разработки Марквибо какого-либо стабильного готового к применению состава не получили. Поэтому по-прежнему существует потребность в готовом к применению составе ЛИВС.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[10] Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения включают в себя готовую к применению композицию винкристина, содержащую: непрерывную водную фазу, которая содержит первый водный буфер, липосомальную фазу, диспергированную в первом водном буфере, и стабилизирующий водный раствор, инкапсулированный как груз в липосомальной фазе; при этом стабилизирующий водный раствор содержит второй водный буфер и стабилизированный винкристин, растворенный в нем; при этом второй водный буфер содержит соль, имеющую по меньшей мере одно растворенное вещество, которое может переноситься из липосомальной фазы и оставлять положительно заряженное растворенное вещество или ион гидрония в стабилизирующем водном растворе, при этом положительно заряженное растворенное вещество или ион гидрония стабилизирует винкристин; и при этом непрерывная водная фаза и стабилизирующий водный раствор имеют разность рН, составляющую по меньшей мере 2 единицы рН.

[11] Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения включают в себя способ стабилизации винкристина в липосоме, включающий: диспергирование липосомальной фазы в непрерывной водной фазе, содержащей первый водный буфер; при этом липосомальная фаза содержит стабилизирующий водный раствор, инкапсулированный в липосомальной фазе; при этом стабилизирующий водный раствор содержит второй водный буфер и стабилизированный винкристин, растворенный в нем; при этом второй водный буфер содержит соль, имеющую по меньшей мере одно растворенное вещество, которое может переноситься из липосомальной фазы и оставлять положительно заряженное растворенное вещество или ион гидрония в стабилизирующем водном растворе, при этом положительно заряженное растворенное вещество или ион гидрония стабилизирует винкристин; и при этом непрерывная водная фаза и стабилизирующий водный раствор имеют разность рН, составляющую по меньшей мере 2 единицы рН.

[12] Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения включают способы лечения рака у млекопитающего, включающие введение терапевтического количества композиции, содержащей непрерывную водную фазу, которая содержит первый водный буфер, липосомальную фазу, диспергированную в первом водном буфере, и стабилизирующий водный раствор, инкапсулированный как груз в липосомальной фазе; при этом стабилизирующий водный раствор содержит второй водный буфер и стабилизированный винкристин, растворенный в нем; при этом второй водный буфер содержит соль, имеющую по меньшей мере одно растворенное вещество, которое может переноситься из липосомальной фазы и оставлять положительно заряженное растворенное вещество или ион гидрония в стабилизирующем водном растворе, при этом положительно заряженное растворенное вещество или ион гидрония стабилизирует винкристин; и при этом непрерывная водная фаза и стабилизирующий водный раствор имеют разность рН, составляющую по меньшей мере 2 единицы рН.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[13] На ФИГ.1 проиллюстрирован механизм инкапсулирования состава винкристина сульфата в липосому.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[14] В настоящем документе описаны композиции и способы, относящиеся к готовому к применению составу для липосомальной инъекции винкристина сульфата с повышенной стабильностью. Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения достигались путем замены лимоннокислого буфера, применяемого в существующей композиции, на сульфатно-аммониевый буфер (СА) и создания мультиплекса равновесий рН липосомальной мембраны, который увеличивает концентрацию стабильных видов винкристина сульфата (см. ФИГ. 1). Сульфат аммония, связанный с дополнительным внешним рН-буфером, может ограничивать разложение винкристина до N-десформилвинкристина, сохраняя при этом структурную и динамическую целостность сфингомиелин-холестериновой липосомы. Это может обеспечить эффективная нагрузка и удержание винкристина посредством трансмембранного способа. Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к способам лечения различных типов лимфом, таким как способы лечения рецидивирующих форм неходжкинской лимфомы. Как правило, готовая к применению композиция для стабилизации лекарственного средства согласно настоящему описанию может включать а себя непрерывную водную фазу, липосомальную фазу, диспергированную в непрерывной водной фазе, и стабилизирующий водный раствор, инкапсулированный как груз в липосомальной фазе.

[15] Непрерывная водная фаза может содержать первый водный буфер. Первый буфер может стабилизировать винкристин и может способствовать инкапсуляции винкристина. Например, непрерывная водная фаза с нейтральным или высоким значением рН, например, внешний фосфатный буфер, изображенный на ФИГ. 1, может обеспечить для винкристина пересечение липосомальной мембраны преимущественно в форме свободного основания. Напротив, стабилизирующий водный раствор, инкапсулированный в липосому, имеет достаточно низкое значение рН для обеспечения кислотно-основного равновесия винкристина, так что количество нейтрального винкристина внутри липосомы является незначительным. Например, это иллюстрируется равновесием между свободным основанием винкристина, сульфатом винкристина, аммиаком и сульфатом аммония, изображенным во внутреннем липосомальном растворе на ФИГ. 1. Это может обеспечить концентрационный градиент свободного основания винкристина между непрерывной водной фазой, которая может иметь более высокую концентрацию свободного основания винкристина, и стабилизирующим водным раствором, инкапсулированным в липосому, который может иметь незначительную концентрацию свободного основания винкристина. Этот градиент концентрации может приводить к миграции свободного винкристина из непрерывной водной фазы с высокой концентрацией свободного основания винкристина в стабилизирующий водный раствор внутри липосом, который имеет незначительную концентрацию нейтрального винкристина. Считается, что нагрузка винкристином приводится в движение из-за того, что солевая форма винкристина обычно не проходит через липосомальный барьер к непрерывной водной фазе, а нейтральный винкристин может проходить через липосомальный барьер к стабилизирующему водному раствору внутри липосомы.

[16] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения первый водный буферный раствор включает в себя любой буфер, который может буферизовать непрерывную водную фазу до значения рН, которое обеспечивает получение преимущественно нейтрального винкристина, например, но не ограничиваясь ими, соль, кислота или основание, в комбинации с конъюгатом кислоты или основания, такой как моноанионное конъюгатное основание, дианионное конъюгатное основание, трианионное конъюгатное основание, конъюгатное основание, конъюгатная кислота или любая смесь или их комбинация. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения любая вышеуказанная комбинация может содержаться в титровальной смеси. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения буфер представляет собой сульфатный буфер. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения буфер представляет собой фосфатный буфер (например, натрий-фосфатный буфер), бикарбонатный буфер, боратный буфер и т.д. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения первый водный буферный раствор может быть первичным растворителем-носителем или жидким носителем липосомальной фазы.

[17] Первый водный буфер может присутствовать в любой пригодной концентрации. Например, первый водный буфер может присутствовать в концентрации, которая делает буфер приблизительно изотоническим, например, от около 150 мМ до около 400 мМ или от около 250 мМ до около 350 мМ.

[18] Термин "липосома" включает в себя по меньшей мере самый широкий смысл, понятный специалисту в данной области техники, а также включает везикулы или наночастицы, состоящие из бислоя ламеллярной фазы, такого как липидный бислой. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения липосома или липосомальный слой образован любым веществом, которое является по существу нерастворимым в первом водном буферном растворе, включая любой материал, известный в данной области техники, применяемый для образования липосомальных наночастиц. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения липосомы содержат любой материал, который может образовывать везикулу, состоящую из липидного бислоя ламеллярной фазы. Липосомы могут содержать липиды, такие как фосфолипиды (например, фосфатидилхолины), сфинголипиды (например, сфингомиелин), гликолипиды, фосфоглицериды, полиэтиленгликоль, холестерин и т.д. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения липосомы содержат пэгилированные и/или непегилированные фосфатидилхолиновые липиды и/или фосфолипиды. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения липидный компонент некоторых липосом содержит любой хвост жирной кислоты, который может придавать полезные свойства липидному бислою липосомы, например, улучшенную эластичность, улучшенную нагрузку лекарственным средством и т.д.

[19] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения наночастицу или липосому применяют для создания барьера против растворения или для создания химического или осмотического градиента. Липосому или наночастицу можно применять для разделения двух водных растворов, имеющих по существу разные значения рН. Наночастицу можно также применять для разделения двух водных растворов, имеющих по существу аналогичные значения рН. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения наночастицу применяют для разделения двух растворов, содержащих по существу разные буферы. Липосому или наночастицу также можно применять для разделения двух растворов, содержащих по существу аналогичные буферы. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения липосому применяют для разделения двух водных растворов, имеющих как по существу разные значения рН, так и содержащих по существу разные буферные растворы. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения градиент, образованный разделением двух водных растворов, может повысить эффективность нагрузки липосомы или наночастицы. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения слой, образованный липосомой, описывается как липосомная фаза, липосомальная фаза или внутренняя фаза наночастиц.

[20] Термин "инкапсулированный груз" следует понимать как включающий в себя по меньшей мере самый широкий смысл, понятный специалисту в данной области техники, а также включает водную фазу, которая отделена от окружающей водной фазы липосомальным липидным бислоем.

[21] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения липосома инкапсулирует стабилизирующий водный раствор, который может содержать второй водный буфер и стабилизированный винкристин, растворенный в нем.

[22] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения второй водный буфер содержит любой буфер, который может буферизовать рН стабилизирующего водного раствора, который содержит соль аммония, например, сульфатно-аммониевый буфер, цитратно-аммониевый буфер, фосфатно-аммониевый буфер, бикарбонатно-аммониевый буфер, карбонатно-аммониевый буфер, боратно-аммониевый буфер и т. д. Считается, что аммониевый буфер может способствовать стабилизации винкристина, поддерживая стабилизирующий водный раствор при более низком значении рН с течением времени по сравнению с другими буферами, которые изначально обеспечивают аналогичный рН. Считается, что неаммониевые буферы с течением времени могут терять свою буферную емкость. При инкапсуляции лекарственного средства в липосому, может наблюдаться высокая концентрация лекарственного средства в липосоме, создавая сложные равновесия миграции ионов, которые при разбалансировании могут способствовать разложению винкристина. Неожиданно было обнаружено, что аммониевые буферы могут поддерживать более стабильные значения рН, чем другие буферы с первоначально подобными значениями pH. Это может быть связано с тем, что для таких систем, как та, которая проиллюстрирована на ФИГ. 1, свободный аммиак может выходить через липосомальный барьер, оставляя за собой протон, который таким образом стабилизирует значение рН внутри липосомы.

[23] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения стабилизированный терапевтически активный агент представляет собой любое лекарственное средство, которое можно стабилизировать в стабилизирующем водном растворе. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения стабилизированный терапевтически активный агент представляет собой противоопухолевое лекарственное средство, такое как, но не ограничиваясь им, винкристин.

[24] Винкристин может быть представлен следующей химической структурной формулой:

[25] Винкристин также может быть представлен химическим названием: (3aR, 3a1R, 4R, 5S, 5aR, 10bR) -метил-4-ацетокси-3a-этил-9-((5S, 7S, 9S) -5-этил-5 - гидрокси-9-(метоксикарбонил)-2,4,5,6,7,8,9,10-октагидро-1Н-3,7-метано [1]

азациклоундецино[5,4-b]индол-9-ил)-6-формил-5-гидрокси-8-метокси-3a,3a1,4,5,5a, 6,11, 12-октагидро-1H-индолизино[8,1-сd]карбазол-5-карбоксилат.

[26] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения второй водный буферный раствор способствует стабилизации винкристина, растворенного в стабилизирующем водном растворе. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения терапевтически активный агент является по существу более стабильным в стабилизирующем водном растворе, чем в первом водном буфере. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения винкристин является по существу более стабильным в стабилизирующем водном растворе, чем в первом водном буфере.

[27] Стабилизирующий водный раствор содержит второй водный буфер. Второй водный буфер должен содержать соль, имеющую по меньшей мере одно растворенное вещество, которое может переноситься из липосомальной фазы. Когда растворенное вещество переносится из липосомальной фазы, оно оставляет положительно заряженное растворенное вещество или ион гидрония в стабилизирующем водном растворе. Таким образом, положительно заряженный ион растворенного вещества или иона гидрониума может стабилизировать винкристин. Существует ряд солей, которые могут переноситься из липосомальной фазы и оставляют положительно заряженное растворенное вещество или ион гидрония. Например, нейтрально заряженные основания могут переноситься из липосомальной фазы. Таким образом, для соли нейтрального основания, такого как аммиак, амины, аминокислоты, фосфины и т.д., нейтральное основание, например аммиак или амин, может переноситься из липосомальной фазы, а катион или ион гидрония из соли может оставаться в стабилизирующем водном растворе. Примеры пригодных стабилизирующих солей могут включать в себя, но не ограничиваются ими, соли аммиака или соли аминов, такие как метиламин, диметиламин, триметиламин, этиламин, диэтиламин, триэтиламин, этаноламин, диэтаноламин, триэтаноламин и т.д.

[28] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения терапевтически активный агент является по существу стабилизированным солью аммония во втором водном буфере. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения сульфатно-аммониевый буфер существенно снижает скорость разложения винкристина до десформилвинкристина. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения сульфат аммония по существу защищает винкристин от деформилирования. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения присутствие иона аммония может по существу обеспечить защиту винкристину от деформилирования. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения основным источником ионов аммония в растворе является сульфат аммония. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения буфер любой соли аммония может способствовать защите винкристина от деформилирования.

[29] Второй водный буфер может присутствовать в стабилизирующем водном растворе при значении рН, которое может способствовать стабилизации винкристина. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения второй водный буфер, такой как соль аммония, например, сульфат аммония. может присутствовать в концентрации от около 100 мМ до около 500 мМ, от около 200 мМ до около 400 мМ, от около 200 мМ до около 300 мМ, от около 250 мМ до около 300 мМ, от около 300 мМ до около 350 мМ или от около 250 мМ до около 350 мМ.

[30] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения непрерывная водная фаза или первый водный буфер имеет рН от около pH 5 до около pH 8,8 или около рН 9, от около pH 5 до около pH 6, от около pH 6 до около pH 7, от около pH рН от 7 до около pH 8, от около pH 7 до около pH 8,5, от около pH 7 до около pH 8,8 или около pH от рН 9, от около pH 7,2 до около pH 7,8, от около pH 7,4 до около pH 7,8, от около pH 7,8 до около pH 8,2, от около pH 8,8 до около pH 8,8, от около pH 8,4 до около pH 8,8, около pH 7,8, около pH 7,4, около pH 8, или ограниченное этими значениями или находится между любыми из этих значений.

[31] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения стабилизирующий водный раствор или второй водный буфер имеет рН от около рН 3 до около рН 5,5, от около рН 3 до около рН 4, от около рН 3,5 до около рН 4,5, от около рН 4 до около рН 5, около рН 4, или ограниченное этими значениями или находится между любыми из этих значений.

[32] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения разность рН или ΔpH между непрерывной водной фазой и стабилизирующим водным раствором или первым водным буфером и вторым водным буфером составляет от около 1 единицы рН до около 4 единиц рН, от около 2 единиц рН до около 3 единиц pH от около 1,5 единиц рН до около 2,5 единиц рН, от около 2,5 до около 3,5 единиц рН, от около 3 единиц рН до около 4 единиц рН, около 3,8 единиц рН или любую разность, ограниченную этими значениями или находящуюся между любыми из этих значений.

[33] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения ΔpH может способствовать повышению эффективности липосомальной инкапсуляции. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения ΔpH, пригодная для достижения приемлемой нагрузки на липосому, составляет от около 1 единицы рН до около 4 единиц рН, от около 2 единиц рН до около 3 единиц pH от около 1,5 единиц рН до около 2,5 единиц рН, от около 2,5 единиц рН до около 3,5 единиц рН, от около 3 единиц рН до около 4 единиц рН, около 3,8 единиц рН или любую разность, ограниченную этими значениями или находящуюся между любыми из этих значений.

[34] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения нагрузка липосомы активным ингредиентом может быть описана как трансмембранная потенциальная нагрузка. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения потенциал создается градиентом протонов, как описано выше, что приводит к накоплению терапевтического агента внутри липосомы.

[35] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения комбинация ΔpH, применяемых буферов и липосом приводит к балансу как характеристик, необходимых для надлежащей нагрузки терапевтически активным агентом, так и характеристик, которые минимизируют разложение терапевтически активного агента.

[36] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения описанная композиция включает в себя сульфатно-аммониевый буфер, который может создавать мультиплекс равновесий рН липосомальной мембраны, что приводит к увеличению концентрации стабильных видов винкристина сульфата (см. ФИГ. 1). Неожиданно было обнаружено, что описанное применение липосомальной композиции, характеризующейся равновесиями, полученными с помощью сульфата аммония, в комбинации с контролем миграции ионов дополнительным внешним буфером рН, ограничивает разложение винкристина до N-десформилвинкристина (NFV), но сохраняет структурную и динамическую целостность липосомы и обеспечивает эффективную нагрузку и удерживание винкристина посредством трансмембранного способа.

[37] N-десформилвинкристин может быть представлен структурной формулой:

[38] N-дезформилвинкристин также может быть представлен химическим названием (3aR, 3a1R, 4R, 5S, 5aR, 10bS)-метил-4-ацетокси-3a-этил-9-((5S, 7S, 9S) -5-этил-5-гидрокси-9-(метоксикарбонил)-2,4,5,6,7,8,9,10-октагидро-1Н-3,7-метано[1]азациклундецино[5,4-b] индол-9-ил)-5-гидрокси-8-метокси-3a,3a1,4,5,5a, 6,11,12-октагидро-1H-индолизино[8,1-cd]карбазол-5-карбоксилат.

[39] NFV иногда может образовываться даже тогда, когда существует градиент (т.е. pH 4 внутри и pH 7,5 снаружи) или если значения рН внутри и снаружи одинаковые (т.е. pH 4). Это может означать, что виды винкристина, которые могут быть восприимчивы к необратимой реакции деформилирования, могут быть сформированы внутри липосомы. Одним из возможных видов является нейтральный винкристин, который может быть восприимчивым к пути разложения винкристина. Одним из преимуществ композиций, описанных в настоящем документе, является их способность минимизировать образование видов винкристина, восприимчивых к разложению в липосоме.

[40] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения описанные в данном документе композиции можно вводить млекопитающему с целью лечения рака или с целью лечения рецидивирующего рака. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения рак включает в себя лимфому или лейкоз. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения млекопитающее могло ранее получать лечение по поводу рака.

[41] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения описанные в данном документе композиции могут быть включены в способы лечения неоплазии у млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения описанные в данном документе композиции могут быть включены в способы лечения рецидивных форм неоплазии у млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения описанные в данном документе композиции могут быть включены в способы лечения различных типов лимфом. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения описанную в данном документе композицию можно вводить с целью лечения неходжкинской лимфомы. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения описанную в данном документе композицию можно вводить с целью лечения рецидива неходжкинской лимфомы.

[42] В данном контексте термин "неоплазия" включает в себя по меньшей мере самый широкий смысл, понятный специалисту в данной области техники, а также включает в себя любой аберрантный рост клеток, опухоли, злокачественные выпоты, кисты и т.д. Примером неоплазии может быть множество типов клеток, включая без ограничения, неопластические клетки, эндотелиальные клетки или иммунологические клетки, такие как лейкоциты, миелоциты, лимфоциты и т.д.

[43] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения неоплазия, подлежащая лечению, представляет собой рак.

[44] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, в которых композиция представляет собой липосомальную инъекцию винкристина сульфата (ЛИВС), указанную композицию можно вводить млекопитающему с целью лечения рака или рецидивирующего рака. Композицию можно вводить в дозе от около 1 мг/м² до около 4 мг/м², от около 1,5 мг/м² до около 3 мг/м², от около 2 мг/м² до около 3 мг/м², около 2 мг/м² до около 2,5 мг/м², около 2 мг/м², около 1,5 мг/м², около 2,25 мг/м², около 2,5 мг/м², около 3 мг/м², около 2,0 мг/м², около 2,1 мг/м², около 2,2 мг/м², около 2,3 мг/м², около 2,4 мг/м² или около 1,9 мг/м². В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения ЛИВС вводят в комбинации с другими терапевтическими соединениями. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения ЛИВС вводят в комбинации с другими противоопухолевыми лекарственными средствами.

Пример 1. Низкое содержание свободного лекарственного средства, диализованный состав Марквибо.

[45] Стабильность липосомальной инъекции винкристина сульфата (ЛИВС) отражается в ее разложении до N-десформилвинкристина (NFV). В случае, если ЛИВС сформирована из набора, состоящего из 3 флаконов, может потребоваться введение в течение 24 часов из-за потенциальной разложения винкристина. При приготовлении ЛИВС также всегда получают 5% свободного винкристина. Свободный винкристин будет находиться во внешней буферной среде с рН 7,4. Однако считается, что винкристин является наиболее устойчивым в форме своей соли (pKa 5,0 и 7,4), а при значении рН 7,4 равновесия будут менее благоприятными для солевой формы по сравнению со значением рН 4,0 внутри липосомы. Может быть целесообразным изучить, в какой степени свободный винкристин способствовал образованию NFV и его влиянию на общую стабильность ЛИВС.

[46] ЛИВС готовили из эквивалентных компонентов набора Марквибо, т.е. ИВС, ИФН и ЛИСХ. Свободный (неинкапсулированный) винкристин удаляли с помощью диализа с применением различных буферов в условиях разных значений рН. Варианты разных условий для исследования стабильности устанавливали на период 12 недель и анализировали ключевые критерии стабильности ЛИВС. При разных условиях проводили диализ с применением следующих внешних буферов:

a) Забуференный фосфатом раствор сахарозы, pH 7,4

b) Забуференный фосфатом солевой раствор (PBS) pH 7,4

c) Забуференные фосфатом растворы сахарозы, pH 4,0

d) Забуференные фосфатом растворы сахарозы, pH 5,0

Приготовление ЛИВС без внешнего винкристина с помощью внешнего буфера pH 4,0-7,4

[47] Проводили три отдельных инкапсулирования ЛИВС из компонентов набора (по 31 мл каждый) и объединяли. Образец после нагрузки удаляли для проведения анализа, а оставшийся объем образца делили на четыре части (по 21,75 мл каждый). Эти образцы помещали в диализные мембранные пакеты 6-8 кДа НОММ, 40 мм в ширину, Spectrapor № 1, и диализовали по отношению к 20 избыточным объемам с применением либо забуференного фосфатом солевого раствора (PBS), либо забуференных фосфатом растворов сахарозы, pH 7,4, для четырех обменов объема в течение 24 часов при комнатной температуре и в условиях, защищенных от света. Полученный PBS содержал 20 мМ фосфата натрия, 130 мМ хлорида натрия, рН 7,4. Забуференный фосфатом раствор сахарозы содержал 10% (мас./об.) сахарозы, 20 мМ фосфата натрия, рН 7,4. После диализа образцы из одного и того же буфера объединяли вместе, стерилизовали фильтрованием в асептических условиях с применением одноразовых шприцевых фильтров (Pall Acrodiscs, размер пор 0,2 мкм, мембраны Supor) и аликвотировали в отдельные стерильные пробирки (4,2 мл) для каждого момента времени (0, 2, 4, 8, 12 недель при 2-8°C; 2, 4, 8, 12 недель при комнатной температуре и 2 недели при 40°C).

Приготовление ЛИВС без внешнего винкристина с помощью внешних буферов с рН 4 и рН 5

Предварительные оценки малого масштаба

[48] Первоначальное тестовое исследование проводили для выяснения того, действительно ли произошел диализ Марквибо в условиях низкого значения рН. В общей сложности 8 мл продукта ЛИВС получали из набора флаконов Марквибо, как описано выше, и материал после нагрузки разделяли на аликвоты по 2 мл для диализа, помещали в диализные мембранные пакеты 6-8 кДа НОММ, 40 мм в ширину, Spectrapor № 1, и диализовали по отношению к 20 избыточным объемам, с применением растворов ИФН при рН 4, 5 или 6 для четырех обменов объема в течение 24 часов при температуре 2-8°C и в условиях, защищенных от света. После этого проводили анализ постдиализных образцов на содержание продукта без винкристина (Таблица 1), результаты которого показали, что диализ с внешним буфером, характеризующимся низким значением рН, является возможным.

Таблица 1. Влияние диализа на общего количество лекарственного средства и процентное количество свободного лекарственного средства для вариантов Марквибо.

Образец Общее количество лекарственного средства (пг/мл) % свободного лекарственного средства Марквибо после диализа при рН 4 166,7 0,4 Марквибо после диализа при рН 5 161,7 0,2 Марквибо после диализа при рН 6 165,4 0,3

Масштабирование вариантов диализа

[49] 50 мл раствора продукта ЛИВС готовили из флаконов набора Марквибо, как описано выше. Объем продукта после нагрузки разделяли на две части; каждую часть помещали в диализные мембранные пакеты 6-8 кДа НОММ, 40 мм в ширину Spectrapor № 1, и диализовали по отношению к 20 избыточным объемам, с применением забуференных фосфатом растворов сахарозы при рН 4 или 5, для четырех обменов объема в течение семидесяти двух часов при температуре 2-8°C и в условиях, защищенных от света. Образцы после диализа собирали, стерилизовали фильтрованием и аликвотировали в отдельные стерильные пробирки (3,5 мл) для каждого момента времени исследования стабильности (0, 2, 4, 8, 12 недель при 2-8°С и 2, 4 недели при комнатной температуре).

Протокол анализа стабильности

[50] В каждом моменте времени стабильности образцы анализировали на: pH (pH-метр Beckman Phi 360), осмоляльность (парофазный осмометр Wescor Inc. Vapro 5520), размер частиц общего и свободного винкристина и примеси, родственные для лекарственного средства.

Результаты

[51] Результаты стабильности при удалении свободного винкристина из внешнего буфера ЛИВС, приготовленной из состава из 3 флаконов, приведены в Таблице 2. Удаление свободного винкристина не улучшало стабильность ЛИВС. В течение 4 недель NFV удвоился в количестве при 4°C и за восемь недель скорость разложения составляла > 1,3% NFV/месяц для всех вариантов буфера и рН. Количество общего винкристина уменьшалось параллельно с образованием NFV. ЛИВС без свободного внешнего винкристина также соответствовала известным характеристикам химического разложения винкристина, при этом лекарство быстрее разлагалось при комнатной температуре, с удвоением процентного количества NFV в течение 2 недель. Эти показатели разложения являются аналогичными показателю 1,6% NFV/месяц, наблюдаемому при исследовании стабильности наборов из 3 флаконов Марквибо при 4°С, что обуславливало необходимость введения ЛИВС в течение 24 часов после разбавления из-за разложения винкристина до NFV.

[52] Результаты этих исследований диализа подтверждают, что инициатором стабильности ЛИВС является образование N-десформилвинкристина (NFV). Срок хранения ЛИВС будет определяться тем, насколько быстро NFV будет увеличиваться до уровней, превышающих пределы спецификации 3.0. Недостача общего винкристина коррелировала с наблюдаемым ростом уровня NFV. Содержание общих примесей не увеличивалось диспропорционально с ростом уровня NFV, который был отнесен в общие примеси. Каких-либо новых примесей не наблюдалось. Все варианты оставались в пределах допустимых критериев ЛИВС для рН, осмоляльности и размера частиц, причем для этих критериев не наблюдалось каких-либо тенденций к отклонению от спецификаций. Кроме того, замещение сахарозы в качестве изотонического агента на маннит, который присутствует в составе из 3 флаконов, не влияло на скорость разложения винкристина.

[53] Кроме того, результаты, приведенные в Таблице 2, продемонстрировали, что удаление свободного винкристина с помощью диализа с применением буферов с рН 4 и рН 5 не нарушало целостности липосомальной мембраны. Изменение величины градиента ΔpH не вызывало утечки содержимого липосом (что можно было бы ожидать при нарушении градиента pH-нагрузки). С течением времени содержание свободного винкристина оставалось постоянно низким во всех вариантах.

ТАБЛИЦА 2. Стабильность ЛИВС после диализа внешнего свободного лекарственного средства

Вариант буфера ЛИВС pH Стабильность, темп, °C Стабильность, время, нед. % своб. лек.
ср-ва Общий % лек.
ср-ва % NFV % NFV/мес PBS 7,4 4 12 0,10 93,0 6,4 1,3 PBS 7,4 КТ 12 0,22 76,1 22,8 6.7 Сахароза-PB 7,4 4 12 0,08 93,0 6,5 1,3 Сахароза-PB 7,4 КТ 12 0,12 76,1 22,7 6.7 Сахароза-PB 4,0 4 4 0,23 94,6 4.8 1,3 Сахароза-PB 4,0 КТ 4 0,37 88,6 10,3 8,1 Сахароза-PB 5.0 4 8 0,18 94,5 4,9 1,4 Сахароза-PB 5.0 КТ 8 0,33 88,7 10,4 8,2

Результаты этих исследований диализа демонстрируют, что разложение свободного внешнего винкристина не играет существенной роли в определении наблюдаемой стабильности ЛИВС, хотя она, вероятно, вносит незначительный вклад в общую стабильность ЛИВС. Эти результаты показывают, что деградация винкристина происходит внутри липосомы после разбавления ЛИВС, приготовленной из набора, состоящего из 3 флаконов. Поддержание градиента ΔpH между внутренней и внешней средой липосомы или удаление (или минимизация) ΔpH ЛИВС не улучшает стабильность винкристина внутри липосомы для состава из 3 флаконов.

Пример 2. Варианты липосом с ВКР с сульфатом аммония.

[54] Марквибо готовили путем совместного инкубирования компонентов набора Марквибо (ИВС, ЛИСХ и ИФН) в аптеке. Винкристина сульфатом, слабым основанием, нагружали липосому под действием трансмембранного градиента, созданного с помощью разности рН внутренней ЛИСХ с pH 4.0 и полученного липосомального внешнего ИФН-буфера с рН 7,4. Во время процесса нагрузки только нейтральная форма винкристина проходила через липосомальную мембрану и задерживалась внутри ЛИСХ в виде соли лимонной кислоты. Эта нагрузка с цитратным буфером обеспечивала более 95% нагрузки винкристином. Однако, после разбавления, внутренний винкристина цитрат является умеренно нестабильным, в результате чего в течение 24 часов происходило повышение уровня NFV, несмотря на значение рН 4,0 внутри липосомы, которое должно поддерживать винкристин в виде соли. Из проведенных ранее экспериментов по диализу свободного лекарственного вещества, описанных выше, можно сделать вывод о том, что разложение винкристина, по-видимому, происходит внутри липосомы, при этом отсутствуют признаки разложения внешнего винкристина в среде с рН 7,4 или винкристина, вытекающего из липосомы. Возможно, что буферная емкость цитрата внутри липосомы является неэффективной и может позволить протонам и растворенным ионам мигрировать через мембрану до такой степени, что дестабилизирует внутренний буфер рН 4,0 липосомы. С целью исследования этой возможности, буфер цитрата натрия в липосоме заменяли альтернативной "нагрузочной батареей". Была проведена серия экспериментов, в которых внутренним липосомальным буфером был раствор сульфата аммония (СА). Значение pH сульфата аммония 250 мМ составляет около 5,5. Однако внутри липосомы равновесие диссоциации между аммиаком и солью аммония позволяло нейтральным молекулам аммиака проходить через липосомальную мембрану, эффективно снижая внутренний рН в результате оставленных позади ионов водорода. Как следствие, значение внутреннего рН составляло около 4. Это равновесие может поддерживать винкристина сульфат, поскольку сульфатная соль лучше поддерживает равновесие внутри липосомальной среды препарата Марквибо, чем натрия цитрат (лимоннокислое равновесие). В этих экспериментах значение внешнего рН варьировалось от 5,5 до 8, поддерживая внутренний рН около 4,0 (в результате описанного выше аммиак/аммониевого равновесия). Значения моляльности или буферной емкости варьировали между 250 и 350 мМ СА, при этом изотонические компоненты, способствующие общей осмоляльности, варьировали с применением полиолов и ионных солей. Во всех экспериментах липосомы состояли из сфингомиелина и холестерина, по существу, в том же составе, что и в ЛИСХ. Единственное изменение заключалось в замене цитратного буфера на сульфатно-аммониевый буфер.

Процессы изготовления липосомы.

[55] В этом примере описаны общие способы, применяемые для продукции сфингомиелин-холестериновых липосом.

Расчет ингредиентов для целевой липосомы.

[56] Липосомальные мембраны Марквибо содержали сфингомиелин (СМ) и холестерин (ХОЛ) в весовом соотношении 2,5:1, при этом конечный продукт ЛИВС содержал 2,37 мг/мл СМ.

[57] В этих экспериментах целевая концентрация для не нагруженных лекарственным средством вариантов липосом была выбрана 43 мг/мл СМ для того, чтобы их было легко обрабатывать и успешно концентрировать для последующего этапа нагрузки лекарственным средством.

[58] Процессы обработки липосомального препарата следующие: для целевых 70 мл конечного продукта:

1. Гидратация (образование липосом)

[59] Растворение липидов. Исходные материалы липидов СМ и ХОЛ растворяли в этаноле. Для получения конечной концентрации в гидратированной фазе 15,7% (об./об.) применяли достаточное количество этанола. В приведенном выше примере 3 г СМ и 1,2 г ХОЛ взвешивали, смешивали вместе и растворяли в 13 мл этанола, имеющем крепость 200. Растворение достигалось путем нагревания этанольной липидной смеси в герметичном контейнере при 75°С до получения прозрачного этанольного раствора.

[60] Водная гидратация. Вышеуказанный приготовленный раствор липидов "гидратировали" путем быстрого выливания этанольного липидного раствора в водную фазу, которую ранее уравновесили до 65°С на водяной бане. В этом примере применяли 70 мл водной фазы, содержащей растворенные вещества, представляющие интерес, которые впоследствии инкапсулировали в липосомальный состав. Например, 350 мМ сульфата аммония или родственных солей. Полученную смесь инкубировали в течение 0,5-1 ч, перемешивая для полной гидратации липидов. Когда этанольный раствор липидов смешивали с водной фазой, растворитель этанола быстро разбавлялся, подвергая липиды воздействию воды, что приводило к тому, что липиды спонтанно образовывали липосомальные везикулы с гетерогенным распределением по размеру. Гидратация обеспечивала полноценную связь молекул воды с гидрофильными частями молекул.

2. Уменьшение размеров.

[61] После образования липосом везикулы имели такие размеры, что позволяло создавать популяцию липосом, имеющую однородный и предпочтительный диаметр частиц (в данном случае около 100 нм). Это достигалось путем экструзии липосомальной суспензии, созданной на этапе 1 выше, через мембраны с определенным размером пор под давлением. Экструзию проводили при 65°С, и прохождение липосом через поры мембраны облегчали этанолом, оставшимся от гидратации. В результате такой обработки липосомы приблизительно соответствовали диаметру применяемых мембранных пор. В этих исследованиях применяли экструдер Lipex (Northern Lipids), способный удерживать 100 мл общего объема; липосомальную суспензию пропускали через поликарбонатные мембраны диаметром 25 мм с размером пор 0,2 пм (три прохода) и 0,08 пк (пять проходов) с применением газообразного азота при давлении 100-400 фунтов на квадратный дюйм. (Whatman Nucleopore Track-Etched Membranes). Размер частиц липосом измеряли с помощью измерителя частиц ZetaPALS с применением динамического светорассеяния (Brookhaven Instruments Corporation).

3. Обмен внешнего буфера.

[62] На этом этапе внешнюю водную фазу (например, 350 мМ раствора сульфата аммония) заменяли на 10% раствор сахарозы или другой желательный буфер, такой как SPI, путем диализа или диафильтрации; одновременно удаляя этанол. В результате этого процесса устанавливался липосомальный градиент (т.е. сульфатно-аммониевый буфер внутри липосом и буфер 10% сахарозы снаружи липосом). В водной среде сульфат аммония в значительной мере диссоциирует на ионы аммония и сульфата. Являясь заряженными, ионы не могут проходить через липосомальную мембрану, однако ионы аммония также находятся в равновесии с водой и аммиаком, который являясь нейтральным газом, может проходить через липосомальную мембрану. Когда молекула аммиака покидает внутреннюю часть липосомы, позади нее остается протон, понижающий значение рН внутри липосомальной мембраны до около 4. Это устанавливает градиент ΔpH, при котором значение рН внутри липосомы составляет около 4,0, а значение рН снаружи липосомы представляет собой значение pH обменного буфера (например, 7.4). Этот градиент применяется для нагрузки липосомы винкристином. Протокол диафильтрации (для объемов продукта > 50 мл) представляет собой 15 обменов объема буфера с применением картриджа MidGee (модель UFP-300-E-3MA, 300 000 НОММ), подключенного к системе диафильтрации QuixStand (GE Healthcare Life Sciences). С целью проведения диализа (для объемов продукта <<50 мл) липосомальную суспензию помещали в молекулярно-пористую мембрану Spectrum Spectrapore с НОММ 6-8000 и суспендировали ее в 20 избыточных объемах буфера при комнатной температуре, при этом внешний буфер заменяли четыре раза в течение дня, включая один обмен, продолжающийся в течение ночи. После замены внешнего буфера измеряли содержание СМ в каждом препарате после диафильтрации с помощью анализа на фосфолипид-холин Stewart.

4. Нагрузка лекарственным средством.

[63] Нагрузку лекарственным средством осуществляли с учетом рекомендованного для ЛИВС соотношения "лекарственное средство - липиды" до достижения желаемого общего объема. Нагрузочную смесь ЛИВС составляли из 0,16 мг/мл винкристина, 2,37 мг/мл СМ (в качестве липосомального препарата) и доводили до желаемого общего объема с помощью внешнего липосомального буфера, применяемого согласно желаемому экспериментальному варианту. Нагрузку осуществляли путем смешивания внешнего буфера, лекарственного средства и липосомальных растворов (предварительно уравновешенных до комнатной температуры), и инкубирования смеси в течение 10 минут при 65°C на водяной бане с легким перемешиванием. Затем смесь снимали с водяной бани для охлаждения до комнатной температуры и хранили при 2-8°С.

5. Стерилизующая фильтрация и заполнение флакона

[64] Нерасфасованную липосомную суспензию, нагруженную лекарственным средством, можно стерилизовать с помощью обычных методов липосомальной стерилизации, таких как фильтрация в пригодные для хранения флаконы.

В ходе всего процесса применяли асептические/стерилизующие методики, при этом технологические операции выполняли в безвоздушном боксе биологической безопасности типа A/B3, класс II. Нерасфасованный продукт при комнатной температуре фильтровали через стерильные шприцевые фильтры Acrodiscs и диаметром 25 мм и размером пор 0,2 мкм, мембрану Supora (Pall Corp.), применяя с этой целью стерильный шприц объемом 10 мл с соединением Люэра (Luer). Нерасфасованный продукт фильтровали в объеме 10 мл в стерильные приемные контейнеры

[65] Препараты вариантов липосом изготавливали путем применения различных молярностей СА в качестве внутреннего липосомального буфера. Липосомы получали с помощью способов, описанных выше. Липосомы изготавливали со взвешенным сфингомиелином (СМ) и холестерином (ХОЛ), в двух повторениях, с получением конечного объема гидратации 70 мл с концентрацией СМ, составляющей 43 мг/мл и весового соотношения СМ/ХОЛ 2,5:1. Смеси липидов растворяли в 9,5 мл этанола при 75°С и гидратировали путем выливания этанольного липидного раствора в 70 мл предварительно нагретого до 65°С раствора СА, перемешивали в течение тридцати минут, получая конечную концентрацию этанола 12% об./об. Полученные таким образом липосомы сортировали по размеру путем последовательной экструзии через поликарбонатные мембраны с размером пор 0,2 пм (три прохода) и 0,08 пм (пять проходов) в экструдере Lipex (Northern Lipids). После экструзии каждый препарат подвергали диафильтрации в 10% растворе сахарозы (одновременно удаляя любой этанол) с осуществлением 15 обменов объема в картридже MidGee (модель UFP-300-E-3MA, 300 000 НОММ) и держателя QuixStand (GE Healthcare Life Sciences). После диафильтрации измеряли содержание СМ в каждом препарате с помощью анализа Stewart на фосфолипид-холин.

[66] Маломасштабные исследуемые нагрузки лекарственным средством вышеуказанных приготовленных липосом проводили либо с ИФН-буфером, доведенным до рН 5,5; 6,5 или 7,5, либо с забуференным фосфатом раствором сахарозы при рН 5,5; 6,5 или 7,5. Варианты нагрузки с менее 5% свободного винкристина выбирали для увеличения масштаба, при этом применяли ИФН-буфер при рН 6,5; 7,5 и забуференный фосфатом раствор сахарозы при рН

6,5. Для каждого варианта СА и буфера осуществляли более крупномасштабные нагрузки согласно описанной ранее процедуры приготовления препарата. Полученные лекарственные инкапсулированные липосомальные смеси стерилизовали фильтрованием и контролировали на стабильность на 0, 2, 4, 8, 12 неделе при 2-8° С и на 2, 4 неделе при комнатной температуре.

[67] В маломасштабных исследовательских экспериментах относительно сульфата аммония, описанных в экспериментальном разделе выше, изучали эффективность инкапсулирования вариантов СА. Эти результаты свидетельствуют о том, что сульфатно-аммониевый внутренний буфер, который обуславливает значение рН внутри липосомы около 4,0 в равновесных условиях, способен лучше нагружать липосому винкристином, если значение рН внешнего буфера составляет 6,5 или более и без применения полиола. Все варианты с применением внешнего буфера со значением pH 5,5 обуславливали менее чем 90% нагрузку; по-видимому, из-за недостаточного трансмембранного градиента ΔpH. Варианты буфера PBS обуславливали по меньшей мере 95% нагрузку липосом лекарственным средством, тогда как варианты, в которых применялась сахароза, имели неоднородные результаты, демонстрируя более широкий диапазон инкапсуляции, составляющий 89-95%. Оба варианта буферной емкости, 250 мМ и 350 мМ, продемонстрировали сходные тенденции инкапсуляции при применении разных вариантов рН и полиола. Масштаб всех исследований, в которых варианты продемонстрировали 95% нагрузку, был увеличен, и впоследствии проведен анализ на стабильность.

[68] Результаты более масштабных исследований 24-недельной стабильности липосом с сульфатно-аммониевым буфером приведены в Таблице 3. Все варианты поддерживали желаемый размер частиц ЛИВС и критерии осмоляльности. Значения pH и процент свободного винкристина также оставались неизменными в течение периода мониторинга стабильности. Сульфатно-аммониевый буфер не изменял характеристики проницаемости сфингомиелин-холестериновой липосомы. Повышенную стабильность по сравнению с составом из 3 флаконов Марквибо регистрировали у составов, содержащих 250 мМ и 350 мМ сульфата аммония с внешним буфером PBS с pH 7,5. Для этих вариантов скорость разложения составляла 0,2% NFV в месяц при температуре холодильного хранения. Этот показатель может предполагать срок хранения состава, составляющий около одного года. Кроме того, общее количество примесей увеличивалось только пропорционально увеличению % NFV. В большинстве случаев общее количество примесей характеризовалось показателями значительно ниже критериев ЛИВС, составляющих менее 6%.

[69] Липосомы с сульфатом аммония с внешним буфером pH 6,5 или липосомы, в которых буфер содержит полиольный изотонический агент, например сахарозу, характеризуются более низкими показателями стабильности по сравнению с вариантами, имеющими рН 7,5. Скорость разложения для этих вариантов варьировалась от 1,5 до

1,8 NFV процентов/месяц при температуре холодильного хранения (Таблица 3), при этом указанная скорость была аналогичной скорости разложения компонента ИВС существующего набора из 3 флаконов на основе цитрата (Таблица 2). Оба варианта, 250 мМ и 350 мМ, продемонстрировали сходные тенденции при изменениях рН и осмотического агента. Кроме того, во всех случаях, когда стабильность контролировали при комнатной температуре, наблюдали быстрое разложение винкристина. Только охлажденные образцы обеспечивали пригодные характеристики стабильности, благодаря составам, содержащим сульфат аммония.

[70] Для дальнейшей оценки отбирали такие липосомальные составы, содержащие винкристин с 250 мМ и 350 мМ сульфата аммония и ИФН с pH 7,4, которые соответствовали предварительным требованиям к сроку годности, разработанным для коммерческой, готовой к применению формы препарата.

Таблица 3. Сводная характеристика стабильности вариантов липосомального состава с сульфатом аммония при 4°C

Внутреннее содержание липосомы/внешний буфер мМ pH Стабильность, темп, °C Стабильность, время (нед) Размер частиц (нм) Осмоляльность (ммоль/
кг) Общий ВС
(мг/мл) % свободного % NFV % общ. примесей % NFV/мес СА/ИФН 250 6,5 4 24 93 543 159,88 1,22 11,15 11,87 1,47 СА/ИФН 250 7,5 4 24 94 550 176,75 2,35 3,29 4,27 0,23 СА/Сахароза PB 250 7,5 4 24 97 374 163,15 1,80 9,70 10,50 1,25 СА/ИФН 350 6,5 4 24 100 548 151,55 1,01 13,76 14,49 1,89 СА/ИФН 350 7,5 4 24 100 561 181,3 1,72 3,59 4,50 0,27 СА/Сахароза PB 350 7,5 4 24 101 376 157,69 1,11 12,00 12,81 1,62

ИФН - буфер для инъекции фосфата натрия (компонент набора Марквибо). Сахароза PB=10% сахароза в фосфатном буфере (без NaCl)

СА - сульфат аммония

Пример 3. Инкапсуляция ВКР с сульфатом аммония в липосомы и стабильность, получаемая при применении двухвалентных ионов и полиолов

[71] Проведена серия экспериментов, чтобы проанализировать, усиливают ли двухвалентные ионы или полиолы, содержащиеся в ЛИВС, инкапсулированный винкристин.

[72] Варианты липосомальных препаратов изготавливали с такой же липидной композицией, что и препарат Марквибо, инкапсулируя 200 мМ сульфата аммония либо с 200 мМ сульфата магния, либо с 200 мМ сульфата марганца; 200 мМ цитрата натрия и либо с 200 мМ сульфата магния, либо 200 мМ сульфата марганца. Каждый из этих препаратов подвергали диафильтрации в 10% сахарозе и анализировали концентрацию липидов, как описано выше. Кроме того, были изготовлены липосомы, содержащие 250 мМ сульфата аммония с 5% маннитом-20 мМ PB pH 7,4, ИФН pH 7,4 и ИФН pH 7,0 в липосоме. Нагрузку лекарственным средством проводили для каждого варианта, инкубируя его в течение 10 минут (стандартное условие) или 30 минут при 65°C в течение 10 минут.

[73] Результаты маломасштабных исследовательских экспериментов приведены в Таблице 4. Результаты нагрузки лекарственным средством при включении Mg2 или Mn2 во внутренний буфер липосомы и инкубировании либо в течение 10 минут (стандартное состояние), либо в течение 30 минут при 65°C, показали менее эффективную нагрузку по сравнению со стандартным приготовлением препарата из набора, состоящего из 3 флаконов. Наилучшие уровни нагрузки, составляющие 6-8% свободного лекарственного средства наблюдали при инкубировании в течение десяти минут, за исключением варианта "цитрат-Mg", который продемонстрировал 21% свободного лекарственного средства. Наличие ионов двухвалентного металла, по-видимому, приводит либо к нарушению равновесий градиента рН, либо к коллапсу мембранной проницаемости.

Таблица 4. Нагрузка лекарственным средством в образцах, содержащих ионы металла.

Образец Нагрузка 10 мин,
% свободного лекарственного средства Нагрузка 30 мин,
% свободного лекарственного средства Марквибо (контроль, 2 мл) 1 2 СА/Mg²⁺ 6 52 СА/Mn²⁺ 7 55 Цит/Mg²⁺ 21 80 Цит/Mn²⁺ 8 54

[74] Масштаб исследований, в которых вариант с сульфатом аммония и MgSO₄ продемонстрировал 6% свободного лекарственного средства после нагрузки, был увеличен, и впоследствии проведен анализ на стабильность. При увеличенном масштабе исследования этот вариант состава подтвердил ранее наблюдаемую слабую эффективность нагрузки липосом в присутствии двухвалентного иона; после разбавления регистрировали 38% свободного лекарственного средства (Таблица 5). Этот вариант смешанного градиента дополнительно подвергали повторному диализу для удаления внешнего свободного винкристина. Постдиализный вариант затем анализировали на стабильность. В течение 5 недель наблюдения уровни свободного лекарственного средства оставались неизменными, демонстрируя, что никакой дополнительной утечки препарата из липосомы не было. Однако наблюдалось быстрое разложение до NFV и потеря ВКР; что через 5 недель привело к уровню NFV, составляющему 12,2%. Это было в 62 раза быстрее, чем при применении липосомального состава, содержащего 250 мМ СА ИФН pH 7,4 (Таблица 5). Эти результаты продемонстрировали, что ЛИВС, содержащая двухвалентный сульфат, не обеспечивает улучшенной стабильности инкапсулированного винкристина.

[75] Состав СА с маннитом продемонстрировал скорость разложения, составляющую 0,17% NFV/месяц, по сравнению с составом, не содержащим полиола - 0,14% NFV/месяц (Таблица 5). Однако инкапсуляция только 93,4% винкристина была менее эффективной, чем при применении составов без полиола.

Таблица 5. Стабильность ЛИВС для дополнительных вариантов СА через 20 недель.

Варианты СА pH Стабильность, темп, °C Стабильность, время, нед. % своб. лек. ср-ва Общий % лек.
ср-ва % NFV % NFV/
мес 200 мМ СА/MgSО₄ 7,4 4 5 38,1* 22,4 14,4 250 мМ СА/Маннит-
PB 7,39 4 20 6,92 95,36 2,88 0,17 250 мМ СА/ИФН 7,39 4 20 2,85 95,32 3,44 0,27 250 мМ СА/ИФН 7,01 4 20 2,03 93,85 4,97 0,55

*После первоначальной слабой нагрузки вариант диализовали для удаления свободной ИВС, так что T=0 имел 2,81% NF

Варианты осуществления настоящего изобретения

Вариант осуществления 1. Композиция, содержащая: непрерывную водную фазу, которая содержит первый водный буфер, липосомальную фазу, диспергированную в первом водном буфере, и стабилизирующий водный раствор, инкапсулированный как груз в липосомальной фазе; при этом стабилизирующий водный раствор содержит второй водный буфер и стабилизированный винкристин, растворенный в нем; при этом второй водный буфер содержит соль, имеющую по меньшей мере одно растворенное вещество, которое может переноситься из липосомальной фазы и оставлять положительно заряженное растворенное вещество или ион гидрония в стабилизирующем водном растворе, при этом положительно заряженное растворенное вещество или ион гидрония стабилизирует винкристин; и при этом непрерывная водная фаза и стабилизирующий водный раствор имеют разность рН, составляющую по меньшей мере 2 единицы рН.

Вариант осуществления 2. Способ стабилизации винкристина в липосоме, включающий: диспергирование липосомальной фазы в непрерывной водной фазе, содержащей первый водный буфер; при этом липосомальная фаза содержит стабилизирующий водный раствор, инкапсулированный как груз в липосомальной фазе; при этом стабилизирующий водный раствор содержит второй водный буфер и стабилизированный винкристин, растворенный в нем; при этом второй водный буфер содержит соль, имеющую по меньшей мере одно растворенное вещество, которое может переноситься из липосомальной фазы и оставлять положительно заряженное растворенное вещество или ион гидрония в стабилизирующем водном растворе, при этом положительно заряженное растворенное вещество или ион гидрония стабилизирует винкристин; и при этом непрерывная водная фаза и стабилизирующий водный раствор имеют разность рН, составляющую по меньшей мере 2 единицы рН.

Вариант осуществления 3. Композиция или способ по варианту осуществления 1 или 2, отличающийся тем, что второй водный буфер содержит соль аммония.

Вариант осуществления 4. Композиция или способ по варианту осуществления 1, 2 или 3, отличающийся тем, что первый водный буфер содержит раствор фосфатного буфера.

Вариант осуществления 5. Композиция или способ по варианту осуществления 1, 2, 3 или 4, отличающийся тем, что липосомальная фаза содержит сфингомиелин-холестериновую липосому.

Вариант осуществления 6. Композиция или способ по варианту осуществления 1, 2, 3, 4 или 5, отличающийся тем, что второй водный буфер содержит сульфат аммония.

Вариант осуществления 7. Композиция или способ по варианту осуществления 1, 2, 3, 4, 5 или 6, отличающийся тем, что винкристин содержит винкристина сульфат.

Вариант осуществления 8. Композиция или способ по варианту осуществления 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7, отличающийся тем, что рН стабилизирующего водного раствора составляет от около 3 до около 5.

Вариант осуществления 9. Композиция или способ по варианту осуществления 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8, отличающийся тем, что рН непрерывной водной фазы составляет от около 5 до около 8.

Вариант осуществления 10. Композиция по варианту осуществления 9, отличающаяся тем, что рН непрерывной водной фазы составляет от около 7 до около 8,8.

Вариант осуществления 11. Композиция по варианту осуществления 10, отличающаяся тем, что рН непрерывной водной фазы составляет от около 7,5 до около 8,8.

Вариант осуществления 12. Композиция или способ по варианту осуществления 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11, отличающийся тем, что липосома является устойчивой к гидролизу.

Вариант осуществления 13. Композиция или способ по варианту осуществления 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12, отличающийся тем, что винкристин является более стабильным в стабилизирующем водном растворе, чем в непрерывной водной фазе.

Вариант осуществления 14. Композиция или способ по варианту осуществления 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,

8, 9, 10, 11, 12 или 13, отличающийся тем, что отношение непрерывной водной фазы и стабилизирующего водного раствора является таковым, что смешивание двух фаз приведет к объединенной водной фазе с рН от около 6 до около 8,8.

Вариант осуществления 15. Композиция или способ по варианту осуществления 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14, отличающийся тем, что соль аммония присутствует во втором водном буфере в концентрации от около 150 мМ до около 350 мМ.

Вариант осуществления 16. Композиция или способ по варианту осуществления 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15, отличающийся тем, что соль аммония представляет собой сульфат аммония.

Вариант осуществления 17. Способ лечения рака у млекопитающего, включающий введение терапевтического количества композиции по варианту осуществления 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16, млекопитающему, имеющего для этого показания.

Вариант осуществления 18. Способ по варианту осуществления 17, отличающийся тем, что рак представляет собой лимфому, лейкоз или миелому.

Вариант осуществления 19. Способ лечения рецидива рака у млекопитающего, включающий введение указанному млекопитающему композиции по вариантам осуществления 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16.

Вариант осуществления 20. Способ по варианту осуществления 19, отличающийся тем, что рецидив рака представляет собой лимфому, лейкоз или миелому.

Вариант осуществления 21. Способ по варианту осуществления 17, 18, 19 или 20, отличающийся тем, что млекопитающее ранее получало по меньшей мере одну схему лечения, сочетающую в себе несколько агентов.

Вариант осуществления 22. Способ по варианту осуществления 17, 18, 19, 20 или 21, дополнительно включающий совместное введение по меньшей мере одного другого химиотерапевтического агента.

Вариант осуществления 23. Способ по варианту осуществления 17, 18, 19, 20, 21 или 22, отличающийся тем, что млекопитающее является человеком.

Вариант осуществления 24. Способ защиты винкристина от деформилирования, включающий смешивание винкристина с буфером соли аммония.

Вариант осуществления 25. Способ по варианту осуществления 23, отличающийся тем, что винкристин вводят в дозе от около 1,5 мг/м² до около 2,5 мг/м².

[76] Если не указано иное, все числа, выражающие количества ингредиентов, свойства, такие как молекулярная масса, условия реакции и т.д., используемые в настоящем описании и формуле изобретения, следует понимать как модифицированные во всех случаях термином "около". Соответственно, если не указано иное, числовые параметры, изложенные в настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения, являются приближенными значениями, которые могут изменяться в зависимости от требуемых свойств, которые должны быть получены в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения. По меньшей мере и не в качестве попытки ограничить применение доктрины эквивалентов к объему формулы изобретения, каждый числовой параметр следует по меньшей мере рассматривать в свете количества приведенных значащих цифр и с применением обычных методов округления. Несмотря на то, что числовые диапазоны и параметры, определяющие широкий объем настоящего изобретения, являются приближениями, численные значения в конкретных примерах указаны как можно точнее. Однако любое числовое значение по своей сути содержит определенные ошибки, неизбежно возникающие в результате стандартного отклонения в ходе соответствующих экспериментальных измерений. В одном варианте осуществления настоящего изобретения термины "около" и "приблизительно" относятся к числовым параметрам в пределах 10% от указанного диапазона.

[77] В контексте описания изобретения вариантов реализации настоящего изобретения (особенно в контексте последующей формулы изобретения) термины в единственном числе относятся как к единственному, так и множественному числу, если не указано иное или явно противоречит контексту. Приведение диапазонов значений в настоящем описании предназначено исключительно с целью упрощения ссылки по отдельности на каждое отдельное значение внутри диапазона. Если не указано иное, каждое отдельное значение включено в настоящее описание, как если бы оно было представлено отдельно. Все описанные в настоящем документе способы могут быть осуществлены в любом подходящем порядке, если не указано иное или это явно не противоречит контексту. Любые примеры или применение иллюстративной формы (например, "такой как") в настоящем документе предназначено исключительно для лучшего освещения вариантов осуществления настоящего изобретения и не накладывает ограничений на объем настоящего изобретения. Никакую формулировку в настоящем описании не следует понимать в качестве указывающей на какой-либо отсутствующий в формуле изобретения элемент, существенный для практического осуществления вариантов настоящего изобретения.

[78] Группировки альтернативных элементов или вариантов осуществления, описанных в настоящем документе, не должны толковаться как ограничивающие. Каждый представитель группы может иметь ссылку и содержаться в формуле изобретения отдельно или в любой комбинации с другими представителями группы или другими элементами, описанными в настоящем документе. Предполагается, что один или большее количество представителей группы могут быть включены или удалены из группы по соображениям удобства и/или патентоспособности. Когда происходит такое включение или удаление, считается, что настоящее изобретение содержит группу, модифицированную таким образом, что соблюдается соответствие письменному описанию всех групп Маркуша, используемых в прилагаемой формуле изобретения.

[79] Описанные в настоящем документе определенные варианты осуществления включают в себя лучший способ реализации на практике вариантов настоящего изобретения, известный автору. Несомненно, изменения этих описанных вариантов осуществления настоящего изобретения станут очевидными для специалистов в данной области техники после прочтения вышеприведенного описания. Автор ожидает, что квалифицированные специалисты будут применять такие варианты соответствующим образом, но при этом автор предполагает, что варианты настоящего изобретения на практике могут осуществляться иначе, чем конкретно описано в данном документе. Соответственно, настоящее изобретение включает в себя все модификации и эквиваленты предмета, указанного в формуле изобретения, прилагаемой к настоящему документу, как это разрешено применяемым законодательством. Более того, любая комбинация описанных выше элементов во всех возможных вариантах входит в объем настоящего изобретения, если в данном документе не указано иное или это явно не противоречит контексту.

[80] Конкретные варианты осуществления настоящего изобретения, описанные в данном документе, могут быть дополнительно ограничены в формуле изобретения, состоящей или состоящей по существу из формулировок. При применении в формуле изобретения, как поданной, так и дополненной посредством поправок, переходный термин "состоящий из" исключает любой элемент, этап или ингредиент, не указанный в формуле изобретения. Переходной термин "состоящий по существу из", ограничивает объем формулы изобретения на указанные материалы или этапы, а также на те элементы, которые не оказывают существенного влияния на основную и новую характеристику (характеристики). Варианты осуществления такого изобретения, заявленные в формуле изобретения таким образом, по своей сути или прямо описаны и включены в настоящий документ.

[81] Кроме того, если были сделаны какие-либо ссылки на патенты и печатные публикации по тексту всего этого описания, каждая из этих ссылок и печатных публикаций отдельно включена в настоящим документ посредством ссылки во всей своей полноте.

[82] В заключение, следует понимать, что описанные в данном документе варианты осуществления иллюстрируют принципы настоящего изобретения. Другие модификации, которые могут быть осуществлены, входят в объем настоящего изобретения. Таким образом, в качестве примера, но не ограничения, альтернативные конфигурации вариантов осуществления настоящего изобретения можно применять согласно приведенным в данном документе инструкциям. Соответственно, настоящее изобретение не ограничивается тем, что продемонстрировано и описано в данном документе.

Группа изобретений относится к химико-фармацевтической промышленности и представляет собой способ лечения рака и рецидива рака у млекопитающего, включающий введение терапевтического количества композиции винкристина. Готовая к применению композиция винкристина содержит непрерывную водную фазу, содержащую первый водный буфер, диспергированную в первом водном буфере липосомальную фазу и стабилизирующий водный раствор, инкапсулированный в качестве содержимого в липосомальной фазе; при этом стабилизирующий водный раствор содержит второй водный буфер и растворенный в нем стабилизированный винкристин; при этом второй водный буфер содержит соль, имеющую по меньшей мере одно растворенное вещество, которое может переносить из липосомальной фазы и оставлять положительно заряженное растворенное вещество или ион гидрония в стабилизирующем водном растворе, при этом положительно заряженное растворенное вещество или ион гидрония стабилизирует винкристин. При этом разность уровней рН непрерывной водной фазы и стабилизирующего водного раствора, который имеет достаточно низкий рН для обеспечения кислотно-основного равновесия винкристина, составляет по меньшей мере 2 единицы рН. Также группа изобретений включает способ стабилизации винкристина в липосоме. Группа изобретений позволяет получить стабильную готовую к применению фармацевтическую композицию без многоэтапного приготовления препарата. 4 н. и 33 з.п. ф-лы, 1 ил., 5 табл., 3 пр.

1. Готовая к применению композиция винкристина для лечения рака и лечения рецидива рака, которая содержит:

непрерывную водную фазу, содержащую первый водный буфер, диспергированную в первом водном буфере липосомальную фазу и стабилизирующий водный раствор, инкапсулированный в качестве содержимого в липосомальной фазе; при этом стабилизирующий водный раствор содержит второй водный буфер и растворенный в нем стабилизированный винкристин;

при этом второй водный буфер содержит соль, имеющую по меньшей мере одно растворенное вещество, которое может переносить из липосомальной фазы и оставлять положительно заряженное растворенное вещество или ион гидрония в стабилизирующем водном растворе, при этом положительно заряженное растворенное вещество или ион гидрония стабилизирует винкристин; и

при этом разность уровней рН непрерывной водной фазы и стабилизирующего водного раствора составляет по меньшей мере 2 единицы рН,

и при этом уровень рН непрерывной водной фазы составляет приблизительно от 7 приблизительно до 9 и стабилизирующий водный раствор имеет достаточно низкий рН для обеспечения кислотно-основного равновесия винкристина.

2. Композиция по п. 1, в которой второй водный буфер содержит соль аммония.

3. Композиция по п. 1 или 2, в которой первый водный буфер содержит раствор фосфатного буфера.

4. Композиция согласно любому из пп. 1-3, в которой липосомальная фаза содержит сфингомиелин-холестериновую липосому.

5. Композиция согласно любому из пп. 1-4, в которой второй водный буфер содержит сульфат аммония.

6. Композиция согласно любому из пп. 1-5, в которой винкристин содержит винкристина сульфат.

7. Композиция согласно любому из пп. 1-6, в которой уровень рН непрерывной водной фазы составляет приблизительно от 7 приблизительно до 8,8.

8. Композиция согласно любому из пп. 1-7, в которой уровень рН непрерывной водной фазы составляет приблизительно от 7,5 приблизительно до 8,8.

9. Композиция согласно любому из пп. 1-8, в которой уровень рН стабилизирующего водного раствора составляет приблизительно от 3 приблизительно до 5.

10. Композиция согласно любому из пп. 1-9, в которой винкристин находится в форме сульфатной соли.

11. Композиция согласно любому из пп. 1-10, в которой липосома является устойчивой к гидролизу.

12. Композиция согласно любому из пп. 1-11, в которой винкристин имеет более высокую стабильность в стабилизирующем водном растворе, чем в непрерывной водной фазе.

13. Композиция согласно любому из пп. 1-12, в которой соотношение непрерывной водной фазы и стабилизирующего водного раствора таково, что в результате смешивания двух фаз образуется объединенная водная фаза с уровнем рН приблизительно от 6 приблизительно до 8,8.

14. Композиция по п. 2, в которой аммониевая соль присутствует во втором водном буфере в концентрации приблизительно от 150 мМ приблизительно до 350 мМ.

15. Композиция по п. 14, в которой соль аммония представляет собой сульфат аммония.

16. Способ лечения рака у млекопитающего, включающий введение нуждающемуся в этом млекопитающему терапевтического количества композиции согласно любому из пп. 1-15.

17. Способ по п. 16, в котором рак представляет собой лимфому, лейкоз или миелому.

18. Способ по п. 16 или 17, в котором винкристин вводят в дозе приблизительно от 1,5 мг/м² приблизительно до 2,5 мг/м².

19. Способ лечения рецидива рака у млекопитающего, включающий введение указанному млекопитающему композиции согласно любому из пп. 1-15.

20. Способ по п. 19, в котором рецидив рака представляет собой лимфому, лейкоз или миелому.

21. Способ по п. 19 или 20, в котором млекопитающее ранее получало лечение в виде по меньшей мере одной схемы введения с комбинацией нескольких агентов.

22. Способ согласно любому из пп. 19-21, в котором указанную липосому с инкапсулированным винкристином вводят с помощью по меньшей мере одного дополнительного химиотерапевтического агента.

23. Способ согласно любому из пп. 16-22, в котором млекопитающее является человеком.

24. Способ стабилизации винкристина в липосоме, содержащий:

диспергирование липосомальной фазы в непрерывной водной фазе, содержащей первый водный буфер;

при этом липосомальная фаза содержит стабилизирующий водный раствор, инкапсулированный в липосомальную фазу;

при этом стабилизирующий водный раствор содержит второй водный буфер и растворенный в нем стабилизированный винкристин;

при этом второй водный буфер содержит соль, имеющую по меньшей мере одно растворенное вещество, которое может переносить из липосомальной фазы и оставлять положительно заряженное растворенное вещество или ион гидрония в стабилизирующем водном растворе, при этом положительно заряженное растворенное вещество или ион гидрония стабилизирует винкристин; и

при этом разность уровня рН непрерывной водной фазы и стабилизирующего водного раствора составляет по меньшей мере 2 единицы рН, и при этом уровень рН непрерывной водной фазы составляет приблизительно от 7 приблизительно до 9 и стабилизирующий водный раствор имеет достаточно низкий рН для обеспечения кислотно-основного равновесия винкристина.

25. Способ по п. 24, в котором второй водный буфер содержит соль аммония.

26. Способ по п. 24 или 25, в котором первый водный буфер содержит раствор фосфатного буфера.

27. Способ согласно любому из пп. 24-26, где липосомальная фаза содержит сфингомиелин-холестериновую липосому.

28. Способ согласно любому из пп. 24-27, в котором второй водный буфер содержит сульфат аммония.

29. Способ согласно любому из пп. 24-28, в котором винкристин содержит винкристина сульфат.

30. Способ согласно любому из пп. 24-29, в котором уровень рН непрерывной водной фазы составляет приблизительно от 7 приблизительно до 8,8.

31. Способ согласно любому из пп. 24-30, в котором уровень рН непрерывной водной фазы составляет приблизительно от 7,5 приблизительно до 8,8.

32. Способ согласно любому из пп. 24-31, в котором уровень рН стабилизирующего водного раствора составляет приблизительно от 3 приблизительно до 5.

33. Способ согласно любому из пп. 24-32, в котором винкристин находится в форме сульфатной соли.

34. Способ согласно любому из пп. 24-33, в котором липосома является устойчивой к гидролизу.

35. Способ согласно любому из пп. 24-34, в котором винкристин имеет более высокую стабильность в стабилизирующем водном растворе, чем в непрерывной водной фазе.

36. Способ согласно любому из пп. 24-35, в котором отношение непрерывной водной фазы и стабилизирующего водного раствора таково, что в результате смешивания двух фаз образуется объединенная водная фаза с уровнем рН приблизительно от 6 приблизительно до 8,8.

37. Способ по п. 25, в котором соль аммония присутствует во втором водном буфере в концентрации приблизительно от 150 мМ приблизительно до 350 мМ.